Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів

Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів

Представлено результати експериментів з дослідження in vitro реакції астроцитів щурів (клітини DITNC) на додавання до середовища інкубації відомих антагоністів тіаміну (вітаміну В1). Використано такі антагоністи тіаміну: ампроліум, піритіамін та окситіамін. Результати дослідження на основі конфокаль...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :Біополімери і клітина
Дата:2006
Автори: Чорний, С.А., Пархоменко, Ю.М.
Формат: Стаття
Мова:Ukrainian
Опубліковано: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2006
Теми:
Клітинна біологія
Онлайн доступ:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156773
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів / С.А. Чорний, Ю.М. Пархоменко // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 4. — С. 290-298. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156773
record_format dspace
spelling Чорний, С.А.
Пархоменко, Ю.М.
2019-06-18T20:22:02Z
2019-06-18T20:22:02Z
2006
Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів / С.А. Чорний, Ю.М. Пархоменко // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 4. — С. 290-298. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.
0233-7657
DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00073B
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156773
576.6 577 16
Представлено результати експериментів з дослідження in vitro реакції астроцитів щурів (клітини DITNC) на додавання до середовища інкубації відомих антагоністів тіаміну (вітаміну В1). Використано такі антагоністи тіаміну: ампроліум, піритіамін та окситіамін. Результати дослідження на основі конфокальної лазерної сканувальної флуоресцентної мікроскопії показали, що інкубація клітин протягом 72 год з окситіаміном або піритіаміном призводить до вакуолізації клітинної мембрани, переміщення внутріиіньомембранних фосфоліпідів на зовнішню поверхню мембрани та транслокації розщепленої каспази З до клітинного ядра. Методами імунофлуоресценції та Вестерн-блот-аналізу виявлено розщеплення каспази З в клітинах, інкубованих з піритіаміном та окситіаміном у концентраціях 100 мкМ. Ці дані підтверджують той факт, що інкубація клітин DITNC з піритіаміном та окситіаміном активує процеси апоптозу. За тих самих умов ампроліум не впливав значно на клітини DITNC.
The experimental results of in vitro investigation of rat astrocytes (DITNC cells) reaction to the addition of well-known thiamine (vitamin B1) antagonists into the incubation medium are represented in the work. The following antagonists of thiamine - amprolium, pyrithiamine, and oxythiamine were used. Confocal laser scanning fluorescent microscopy has revealed that 72 hours incubation of cells with oxythiamine or pyrithiamine results in cell membrane vacuolization, externalization of membrane phospholipids and translocation of cleaved caspase 3 to the nucleus. Cleavage of caspase 3 in the cells that incubated with 100 µM concentration of oxythiamine and pyrithiamine was determined by Western blot and imunofluorescence methods. These data prove that incubation of DITNC cells with oxythiamine and pyrithiamine caused the activation of apoptosis processes. At the same conditions amprolium did not influence DITNC cells significantly.
Представлены результаты экспериментов по исследованию in vitro реакции астроцитов крыс (клетки DITNC) на добавление в среду инкубации известных антагонистов тиамина (вита­мина В1). Использовали следующие антагонисты тиамина: ампролиум, пиритиамин и окситиамин. Результаты исследо­вания на основе конфокальной лазерной сканирующей флу­оресцентной микроскопии показали, что инкубация клеток на протяжении 72 ч с окситиамином или пиритиамином приво­дит к вакуолизации клеточной мембраны, переходу внутри-мембранных фосфолипидов на внешнюю поверхность мембра­ны и транслокации расщепленной каспазы 3 в клеточное ядро. Методами иммунофлуоресценции и Вестерн-блот-анализа вы­явлено расщепление каспазы 3 в клетках, инкубированных с пиритиамином и окситиамином в концентрациях 100 мкМ. Эти данные подтверждают тот факт, что инкубация DITNC клеток с пиритиамином и окситиамином активирует процес­сы апоптоза В тех же условиях ампролиум не влиял значи­тельно на клетки DITNC.
Автори щиро вдячні д-ру Фернандо А. Гонзалесу (Пуерто Ріко, США) за допомогу у виконанні даної роботи.
uk
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Біополімери і клітина
Клітинна біологія
Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів
Активация апоптоза антагонистами тиамина в астроцитах крыс
Apoptosis activation in rat astrocyte cells caused by antagonists of thiamine
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів
spellingShingle Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів
Чорний, С.А.
Пархоменко, Ю.М.
Клітинна біологія
title_short Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів
title_full Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів
title_fullStr Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів
title_full_unstemmed Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів
title_sort активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів
author Чорний, С.А.
Пархоменко, Ю.М.
author_facet Чорний, С.А.
Пархоменко, Ю.М.
topic Клітинна біологія
topic_facet Клітинна біологія
publishDate 2006
language Ukrainian
container_title Біополімери і клітина
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Активация апоптоза антагонистами тиамина в астроцитах крыс
Apoptosis activation in rat astrocyte cells caused by antagonists of thiamine
description Представлено результати експериментів з дослідження in vitro реакції астроцитів щурів (клітини DITNC) на додавання до середовища інкубації відомих антагоністів тіаміну (вітаміну В1). Використано такі антагоністи тіаміну: ампроліум, піритіамін та окситіамін. Результати дослідження на основі конфокальної лазерної сканувальної флуоресцентної мікроскопії показали, що інкубація клітин протягом 72 год з окситіаміном або піритіаміном призводить до вакуолізації клітинної мембрани, переміщення внутріиіньомембранних фосфоліпідів на зовнішню поверхню мембрани та транслокації розщепленої каспази З до клітинного ядра. Методами імунофлуоресценції та Вестерн-блот-аналізу виявлено розщеплення каспази З в клітинах, інкубованих з піритіаміном та окситіаміном у концентраціях 100 мкМ. Ці дані підтверджують той факт, що інкубація клітин DITNC з піритіаміном та окситіаміном активує процеси апоптозу. За тих самих умов ампроліум не впливав значно на клітини DITNC. The experimental results of in vitro investigation of rat astrocytes (DITNC cells) reaction to the addition of well-known thiamine (vitamin B1) antagonists into the incubation medium are represented in the work. The following antagonists of thiamine - amprolium, pyrithiamine, and oxythiamine were used. Confocal laser scanning fluorescent microscopy has revealed that 72 hours incubation of cells with oxythiamine or pyrithiamine results in cell membrane vacuolization, externalization of membrane phospholipids and translocation of cleaved caspase 3 to the nucleus. Cleavage of caspase 3 in the cells that incubated with 100 µM concentration of oxythiamine and pyrithiamine was determined by Western blot and imunofluorescence methods. These data prove that incubation of DITNC cells with oxythiamine and pyrithiamine caused the activation of apoptosis processes. At the same conditions amprolium did not influence DITNC cells significantly. Представлены результаты экспериментов по исследованию in vitro реакции астроцитов крыс (клетки DITNC) на добавление в среду инкубации известных антагонистов тиамина (вита­мина В1). Использовали следующие антагонисты тиамина: ампролиум, пиритиамин и окситиамин. Результаты исследо­вания на основе конфокальной лазерной сканирующей флу­оресцентной микроскопии показали, что инкубация клеток на протяжении 72 ч с окситиамином или пиритиамином приво­дит к вакуолизации клеточной мембраны, переходу внутри-мембранных фосфолипидов на внешнюю поверхность мембра­ны и транслокации расщепленной каспазы 3 в клеточное ядро. Методами иммунофлуоресценции и Вестерн-блот-анализа вы­явлено расщепление каспазы 3 в клетках, инкубированных с пиритиамином и окситиамином в концентрациях 100 мкМ. Эти данные подтверждают тот факт, что инкубация DITNC клеток с пиритиамином и окситиамином активирует процес­сы апоптоза В тех же условиях ампролиум не влиял значи­тельно на клетки DITNC.
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156773
citation_txt Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів / С.А. Чорний, Ю.М. Пархоменко // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 4. — С. 290-298. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.
work_keys_str_mv AT čorniisa aktivacíâapoptozuantagonístamitíamínuvastrocitahŝurív
AT parhomenkoûm aktivacíâapoptozuantagonístamitíamínuvastrocitahŝurív
AT čorniisa aktivaciâapoptozaantagonistamitiaminavastrocitahkrys
AT parhomenkoûm aktivaciâapoptozaantagonistamitiaminavastrocitahkrys
AT čorniisa apoptosisactivationinratastrocytecellscausedbyantagonistsofthiamine
AT parhomenkoûm apoptosisactivationinratastrocytecellscausedbyantagonistsofthiamine
first_indexed 2025-11-25T23:55:29Z
last_indexed 2025-11-25T23:55:29Z
_version_ 1850584202796335104
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2006. Т. 22. № 4 КЛІТИННА БІОЛОГІЯ Активація апоптозу антагоністами тіаміну в астроцитах щурів С. А. Чорний, Ю. М. Пархоменко Інститут біохімії ім. Палладіна НАН України Вул. Леонтовича 9, Київ, 01601 , Україна s c h l 982@yahoo.com Представлено результати експериментів з дослідження in vitro реакції астроцитів щурів (клітини DITNC) на додавання до середовища інкубації відомих антагоністів тіаміну (вітаміну В і). Використано такі антагоністи тіаміну: ампроліум, піритіамін та окситіамін. Результати дослідження на основі конфокальної лазерної сканувальної флуоресцентної мікроскопії показали, що інкубація клітин протягом 72 год з окситіаміном або піритіаміном призводить до вакуолізації клітинної мембрани, переміщення внутріиіньомембранних фосфоліпідів на зовнішню поверхню мембрани та транслокації розщепленої каспази З до клітинного ядра. Методами імунофлуо- ресценції та Вестерн-блот-аналізу виявлено розщеплення каспази З в клітинах, інкубованих з піритіаміном та окситіаміном у концентраціях 100 мкМ. Ці дані підтверджують той факт, що інкубація клітин DITNC з піритіаміном та окситіаміном активує процеси апоптозу. За тих самих умов ампроліум не впливав значно на клітини DITNC. Ключові слова: антагоністи тіаміну, окситіамін, піритіамін, ампроліум, апоптоз. Вступ. Біологічно активна форма вітаміну Bj (тіа­ міну) — тіаміндифосфат (TDP) є коферментом де­ кількох ферментів вуглеводного обміну. Тому, бе­ ручи до уваги можливі метаболічні ушкодження в клітинах при дефіциті тіаміну та його кофермент- ної форми, доцільно припустити, що окиснюваль- ний стрес і супутній ацидоз є основними причина­ ми нейродегенеративних змін і загибелі клітин, які спостерігаються за цих умов [1—9] . Однак, згідно із сучасними уявленнями, для нормального функ­ ціонування і підтримки життєдіяльності нервових клітин велике значення мають не лише кофер- ментні, а й так звані некоферментні функції тіа­ міну [10, 11]. Про це свідчать дані щодо участі TDP і тіамінтрифосфату (ТТР) у функціонуванні регуляторних ферментів піруватдегідрогеназного комплексу (кінази та фосфатази) [12] , участі ТТР як донора фосфату у фосфорилюванні одного із білків ацетил хол інового рецептора [13] , можливого © Ч О Р Н И Й С. А., П А Р Х О М Е Н К О Ю. М., 2 0 0 6 залучення похідних тіаміну до регуляції функцій інших рецепторних систем. На жаль, питання сто­ совно некоферментних механізмів причетності тіа­ міну до функціонування клітин досліджено недо­ статньо. Але це не виключає можливості прямого (не опосередкованого коферментною функцією TDP) втручання тіаміну і його біологічно активних похідних у регуляцію процесів клітинного циклу. З'ясування цього питання є актуальним через те, що функціональні порушення залежних від тіаміну процесів в організмі людини при дефіциті вітаміну В, можуть бути одним із важливих патогенетичних факторів таких захворювань, як хвороба Альцгей- мера [14, 15] , синдром Верніке-Корсакова (енце- фаломієлопатія Верніке) [4, 16, 17] та ін. Одним із експериментальних підходів при дослідженні по­ дібних механізмів може бути використання аго- ністів та антагоністів тіаміну. Метою цієї роботи є порівняльне дослідження дії на клітини астроцитів культури DITNC трьох 290 mailto:982@yahoo.com АКТИВАЦІЯ А П О П Т О З У АНТАГОНІСТАМИ ТІАМІНУ В А С Т Р О Ц И Т А Х класичних антагоністів тіаміну: піритіаміну (ПТ), окситіаміну (ОТ) та ампроліуму (AM), здатних пригнічувати різні ланки обміну вітаміну. Оскільки попередніми дослідами показано, що вищезазна­ чені сполуки інгібують проліферацію цих клітин, нас цікавило, перш за все, за яким механізмом відбувається загибель клітин під впливом анта­ гоністів тіаміну. Цю роботу ми розглядаємо як перший етап вивчення ролі тіаміну в регуляції процесів клітинного циклу. Матеріали і методи. Культура клітин. Дослід­ ження проведено на культурі клітин DITNC (пер­ винні астроцити мозку щурів, штучно отриманих трансфекцією двох різних генів, гліального кислого фібрилярного білка людини та гена SV40) [18] . Ці клітини культивували в середовищі DMEM («Sig- ma», США) з додаванням 5 % сироватки ембріона великої рогатої худоби (FCIII) («Sigma») та ан­ тибіотиків (1 % стрептоміцину та 1 % пеніциліну) («Sigma»). В дослідах клітини культивували в сере­ довищі DMEM із додаванням 1 % FCIII та одного з трьох антагоністів тіаміну: AM, ОТ або ПТ («Sigma) в концентрації 100 мкМ. Культивування клітин тривало 72 год (температура 37 °С) за присутності 5 % С 0 2 . Діючі концентрації анта­ гоністів та час інкубації підібрано на підставі попе­ редніх дослідів із визначення кількості клітин, які виживали за умов експерименту, методом спектро­ фотометричного аналізу дегідрогеназної активності з МТТ реагентом (неопубліковані дані). Щоб отри­ мати картину класичного апоптозу (позитивний контроль), клітини інкубували в середовищі DMEM з додаванням 1 % FCIII та 4 мкМ стауроспорину («Sigma») протягом 24 год. Негативним контролем слугували клітини, які інкубували у вищезгадано­ му середовищі без додавання будь-якого чинника. Конфокальна лазерна флуоресцентна мікро­ скопія. Ознаки клітинного апоптозу виявляли за допомогою специфічного імунофлуоресцентного барвника — Annexin V-Alexa Fluor-568 («Моїесиїаг Probes», США), ЯКИЙ зв'язується з фосфатидилсе- рином, транслокованим на зовнішню сторону мем­ брани в разі апоптозу [19] . Після інкубації пред­ метне скло з клітинами поміщали в анексинзв'язу- вальний буфер, потім додавали флуоресцентний барвник Annexin V. Для забарвлення нуклеїнових кислот клітини обробляли барвником SYTOX Gre­ en stain («Моїесиїаг Probes»). Стан клітин оцінюва­ ли за допомогою сканувального лазерного конфо­ кального мікроскопа Zeiss LSM-5 Pascal (Німеччи­ на) при хЮ, х 4 0 та хІОО з використанням імерсій­ ного масла. Емісію барвника SYTOX Green stain спостерігали через ВР505-530 фільтр за допомогою аргонового лазера, емісію йодистого пропідіуму та барвника Annexin V-Alexa Fluor 568 — через LP560 фільтр за допомогою неонового лазера. Для визначення в клітинах продукту розщеп­ лення каспази 3 — великого фрагмента розміром 19 кДа [7] методом імунофлуоресценції препарати готували так само, як і в попередньому досліді [19] , але замість барвника використовували полі- клональні антитіла до розщепленої каспази 3, зв'я­ зані з флуоресцеїном («Сеіі Signaling Technology*, США) у співідношенні 1:100. Згідно з інформацією компанії-виробника, ці антитіла отримано імуніза­ цією кролів синтезованим пептидом, який від­ повідає амінокислотним залишкам навколо аспа­ рагіну 175, — ділянки розщеплення каспази 3 у щурів. Клітинну локалізацію розщепленої каспази З оцінювали за допомогою сканувального лазерного конфокального мікроскопа Zeiss при збільшенні в 10 разів з використанням імерсійного масла. Емісію антитіл, зв'язаних з флуоресцеїном, спостерігали через ВР505-530 фільтр за допомогою аргонового лазера. Вестерн-блот-аналіз. Розщеплення каспази З також визначали методом Вестерн-блот-аналізу [8 ] , використовуючи первинні поліклональні ан­ титіла: «rabbit anti-rat» до розщепленої каспази З, «rabbit anti-rat» до каспази 3 та вторинні ан­ титіла — «goat anti-rabbit» IgG, кон'юговані з пе- роксидазою хрону, придбані у «Сеіі Signaling Tech- nology». Перед інкубацією клітини розсівали у шестикоміркові планшети, у кожній комірці по 1 млн клітин (умови інкубації див. вище). Після інкубації планшети з клітинами переносили на лід і додавали в кожну комірку по 50 мкл буфера для лізису. Клітини суспендували в буфері, потім пере­ носили в 1,5 мл-пробірки і витримували протягом 1 год (4 °С). Центрифугували при 13000 g за температури 4 °С упродовж 10 хв на центрифузі Beckman Coulter (США). Надосадову рідину відби­ рали, переносили в нові пробірки і додавали буфер, який містив 187,5 мкМ трис-НСІ, рН 6,8, 6 %-й DS-Na, 0,003 %-й бромфеноловий синій, 1,8 %-й /ї-меркаптоетанол, кількість буфера складала поло­ вину об'єму зібраної надосадової рідини. Суміш кип'ятили протягом 5 хв, потім швидко охолоджу­ вали до температури 4 °С. Кількість білка в пробах 291 Ч О Р Н И Й С. А., П А Р Х О М Е Н К О Ю. М. визначали методом Бредфорда [23] , наносили по 100 мкг у лунку на 10 %-й поліакриламідний гель, в окрему лунку вносили 5 мкл розчину маркерів і проводили диск-електрофорез. За допомогою апа­ рату для напівсухого перенесення Trans Blot SD («Semi Dry Transfer Cell», «Віо-Rad», США) розді­ лені білки і маркери з геля переносили на нітро­ целюлозну мембрану протягом 1,5 год за постійної напруги 15 В. Мембрану переносили у буфер для блокування (5 % знежиреного молока в TBST буфері, рН 7,4—7,6) та інкубували упродовж 1 год, інтенсивно перемішуючи за кімнатної температури. Склад TBST буфера: 100 мкМ трис-НСІ, 1 М NaCl, 0,1 %-й твін 20 («Sigma»). Далі мембрану проми­ вали один раз у TBST-буфері, додавали 10 мл буфера для блокування та по 10 мкл (1:1000) первинних антитіл до розщепленої та нерозщепле- ної каспази 3 і інкубували протягом 17 год за температури 4 °С при інтенсивному перемішуванні. Після зупинки інкубації мембрану промивали тричі по 5 хв у буфері TBST і додавали 20 мл буфера для блокування і 10 мкл (1:2000) вторинних антитіл. Мембрану інкубували (1 год) за кімнатної темпе­ ратури, промивали буфером TBST тричі по 5 хв. Нітроцелюлозну мембрану занурювали на 5 хв у розчин для виявлення білків, який готували, змі­ шуючи 0,5 мл LumiGLOTM (хемілюмінесцентний субстрат («PIERCE Biotechnology*, США)), 0,5 мл Н 2 0 2 та 0,9 мл дистильованої води. Хемілюмінес­ центне мічення білків сканували за допомогою приладу GS-525 («Моїесиїаг Imager», США). Резу­ льтати аналізували за допомогою програми Quan­ tity One software («Віо-Rad»), яка дозволяє визна­ чати відносну інтенсивність забарвлення білкових смуг у контрольній та дослідних пробах. При цьому отримані показники відносної інтенсивності забар­ влення смуг у дослідних зразках виражали у від­ сотках стосовно показників відносної інтенсивністі забарвлення смуг контрольних проб. Статистична обробка результатів. Дані у трьох повторностях статистично оброблено за допо­ могою програм Quantity One («Віо Rad») і Prizm 4 («Graph Pad», США) та подано у вигляді графіка, побудованого на основі отриманих середньоариф­ метичних і стандартних відхилень, перерахованих у відсотки відносно 100 % контролю. Достовірність різниці середніх (р) визначали за критерієм Ст'ю- дента. Результати і обговорення. Першим кроком у виявленні ознак апоптозу клітин DITNC при їхній інкубації з антагоністами тіаміну було проведення конфокальної лазерної флуоресцентної мікроскопії необроблених і оброблених стауроспорином клітин для встановлення негативного та позитивного кон- тролів на апоптоз (рис. 1). Відомо, що стауроспо- рин спричинює клітинний апоптоз уже через 24 год інкубації [20] , тому саме такі клітини використо­ вували як позитивний контроль на апоптоз. Як видно із даних рис. 1, б, у разі негативного контролю клітини не реагують з барвником An­ nexin V-Alexa Fluor-568. Ядра цих клітин залиши­ лися морфологічно не зміненими з чітко виражени­ ми ядерцями (рис. 1, а). Всі ознаки свідчать про відсутність апоптозу клітин у цій культурі. У той же час інкубація клітин з 4 мкМ стауроспорином дає позитивне забарвлення на Annexin V і викли­ кає деструкцію ядер у клітинах DITNC протягом 1 доби (рис. 1). Після встановлення позитивного та негативно­ го контролів на апоптоз здійснено конфокальну лазерну флуоресцентну мікроскопію клітин, інку- бованих протягом 72 год з антагоністами тіаміну (рис. 2). Як свідчать результати аналізу, AM в концентрації 100 мкМ не викликав морфологічних змін в ядрах клітин, також не спостерігалося транс- локації фосфатидилсерину на зовнішній бік мемб­ рани (рис. 2, А). Зовнішній вигляд клітин залишав­ ся подібним до негативного контролю на апоптоз. На відміну від AM інкубація клітин з ОТ у тій же концентрації викликала чітку реструктуризацію клітинних мембран (рис. 2, Б, б). Кількість пози­ тивно забарвлених Annexin V клітин у полі зору мікроскопу при *40 становила приблизно 89 %. Відсутність ядерець свідчить про початок деградації ядер. Інкубація клітин з ПТ, як і в разі з ОТ, спричинює деструктуризацію плазматичних мемб­ ран у приблизно 87 % клітин, що підтверджують дані, наведені на рис. 2, В. Чітко видно відсутність ядерець та спрямованість забарвленості фосфати­ дилсерину назовні клітини, тобто інкубація зі 100 мкМ ПТ дає той самий ефект на DITNC клітини, як із 100 мкМ ОТ. Відомо, що при апоптозі відбувається вакуо- лізація клітинної мембрани [19] . Враховуючи це, для детальнішого аналізу змін у структурі плазма­ тичних мембран клітин за допомогою конфокаль­ ного мікроскопу було зроблено декілька знімків у 100-кратному збільшенні (рис. 3). Аналіз дії ОТ, ПТ та стауроспорину при такому збільшенні вия- 292 АКТИВАЦІЯ А П О П Т О З У АНТАГОНІСТАМИ ТІАМІНУ В А С Т Р О Ц И Т А Х а б А Рис. 1. Конфокальна лазерна флуо­ ресцентна мікроскопія необроблених та оброблених стауроспорином клі­ тин DITNC: А — негативний конт­ роль на апоптоз (необроблені клі­ тини) ; Б — позитивний контроль на апоптоз (клітини, оброблені 4 мкМ стауроспорином) {а — забарвлення Д Н К ядра Суtoxygreen барвником; б — забарвлення зовнішнього мемб­ ранного фосфатидилсерину барвни­ ком Annexin V-Alexa Fluor-568). *40 вив вакуолізацію клітинних мембран, тобто в аст­ роцитів дефіцит тіаміну, викликаний ОТ та ПТ, на третій день спричиняє ознаки, характерні для ран­ ніх стадій апоптозу. Майже всі відомі шляхи розвдтку апоптозу потребують розщепленої каспази 3. Щоб виявити, чи активується каспаза 3 в клітинах при інкубації їх з антагоністами тіаміну, ми провели дослідження з використанням імунофлуоресцентного аналізу (ІФА) та Вестерн-блотингу з антитілами до роз­ щепленої каспази 3. На рис. 4 зображено дані, отримані в резуль­ таті ІФА DITNC клітин на 3-й день інкубації зі 100 мкМ AM, ОТ і ПТ. Вони свідчать, що при дії ПТ та ОТ каспаза 3 транслокується до ядра так само, як при обробці клітин 4 мкМ стауроспори­ ном. 100 мкМ AM не впливав на активацію роз­ щеплення каспази 3 та її транслокацію до ядра, як це має місце в необроблених клітинах. Для під­ твердження даних, отриманих за допомогою ІФА, контрольні DITNC клітини та ті, що інкубували з антагоністами тіаміну, проаналізовано за методом Вестерн-блотингу на присутність розщепленої кас­ пази 3. Розщеплену та нерозщеплену каспазу З ідентифікували за допомогою специфічних антитіл (див. «Матеріали і методи»). На рис. 5 наведено результати Вестерн-блот- аналізу зразків білків, одержаних з клітин, які обробляли антагоністами тіаміну. На графіку зоб­ ражено результати кількісної оцінки інтенсивності забарвлення смуг, одержаних після Вестерн-блот- аналізу, яку проводили відносно інтенсивності смуг контролю. Аналіз з антитілами до розщепленої каспази З показав, що інкубація клітин за присутності ПТ або ОТ призводить до підсилення розщеплення каспази 3, яке супроводжутєься збільшенням від­ носної інтенсивності смуг, що відповідають великій субодиниці розміром 19 кДа. Дія П Т та ОТ була подібною до такої стауроспорину, проте у випадку 293 Ч О Р Н И М С. А , П А Р Х О М Е Н К О Ю . М. А Рис . 2. Конфокальна лазерна флуо­ ресцентна мікроскопія DITNC клітин на третій день інкубації після оброб­ ки 100 мкМ ампроліумом (А), ок­ ситіаміном (Б) та піритіаміном (В) (а — забарвлення Д Н К ядра Cytoxy- grccn барвником; б—забарвлення зовнішнього мембранного фосфати- дилсерину барвником Annexin V- Alexa Fluor-568) . *40 останнього ми не знайшли слідів нерозщепленої каспази 3. Цей феномен можна пояснити тим, що стауроспорин є швидкодіючим активатором апопто­ зу і через 24 год відбувається майже повне розщеп­ лення каспази 3 [20]. Слід відмітити, що за умов нашого експери­ менту рівень відносної інтенсивності смуг нероз­ щепленої каспази 3 після інкубації клітин за при­ сутності П Т або ОТ близький до такого ж показни­ ка для контрольних клітин. Подібну картину 294 А К Т И В А Ц І Я А П О П Т О З У А Н Т А Г О Н І С Т А М И ТІАМІНУ В А С Т Р О Ц И Т А Х Рис. 3. Ознаки вакуолізації мембран DITNC клітин після впливу: а— 100 мкМ окситіаміну (3-й день інкубації); б— 100 мкМ пірітіаміну (3-й день інкубації); в— 4 мкМ стауроспорину (1-й день інкубації). Знімки отримано методом конфокальної лазерної флуоресцентної мікроскопії з використанням барвника Annexin V-Alexa Fluor-568. xlOO г д спостерігали й інші дослідники, які використовува­ ли різні індуктори апоптозу на культурах ракових клітин [21 ], дехто з них припускає, що ці чинники можуть підвищувати рівень експресії гена згадано­ го білка [22 |. Наведені на рис. 5 дані свідчать, що Р и с . 4. І м у н о ф л у о р е с ц е н т н и й а н а л і з транслокації розщепленної каспази 3 до ядер у DITNC клітин після інкубації з антагоністами тіаміну. Знімки зроблено при збільшенні у 10 разів на конфокально­ му лазерному мікроскопі. Забарвлення от­ римано за допомогою антитіл (зв 'язаних з флуоресцеїном) до розщепленої каспази 3: а — необроблені клітини (негативний кон­ троль) ; б — дія 100 мкМ піритіаміну; в — дія 100 мкМ ампроліуму; г — дія 100 мкМ окситіаміну; д — дія 4 мкМ стауроспорину (інкубація з клітинами протягом 24 год) як позитивний контроль на апоптоз необроблені клітини також містять невелику кіль­ кість розщепленої каспази 3. Цей факт можна пояснити тим, що процеси апоптозу проходять на певному фізіологічному рівні в кожній популяції клітин. 295 Ч О Р Н И Й С. А., П А Р Х О М Е Н К О Ю . М. к Да 40 зо 20 10 _> м с, % 400 - 300 - 200 100 - 2 З К ас паза З, 35 кДа Розщеплена к ас паз а З, 19кДа Рис. 5. Вестерн-блот-аналіз впливу антагоністів тіаміну на розщеплення каспази З у DITNC клітинах з вико­ ристанням антитіл до роз­ щепленої і нерозщепленої каспази 3 (див. «Матеріали і методи»): а — знімок ні­ троцелюлозної мембрани, який зображує зв 'язування каспази 3 та її великої суб- одиниці (19 кДа) у вигляді смуг; б — графік співвідно­ шення відносної інтенсив­ ності забарвлення смуг на знімку {а), які відповіда­ ють розщепленій каспазі З зразків, до відносної інтен­ сивності забарвлення конт­ рольної смуги (необроблені кл ітини) ; У —-дія 100 мкМ піритіаміну; 2 — д і я 100 мкМ окситіаміну; 3 — дія 100 мкМ ампроліуму; 4 — контроль; 5 — дія 4 мкМ стауроспорину; М — мар­ кер; С, % — розщеплення каспази 3 за умов дефіциту тіаміну (% відносно конт­ ролю); * * р < 0 , 0 1 ; * р < 0,5 Дефіцит тіаміну, викликаний інкубацією клі­ тин в середовищі з П Т та ОТ, призводить до інтенсифікації розщеплення каспази 3 відповідно до 350,18±53,95 % (р < 0,01) і 268 ,14±26,73 % (р < 0,5) порівняно з контролем. Різниця між ефе­ ктом цих двох сполук відносно контролю є до­ стовірною (р < 0,01 і р < 0,5) та приблизно в три рази перевищує дані контролю. Ці дані свідчать про майже однаковий вплив П Т та ОТ на акти­ вацію апоптозу у клітин DITNC. У той же час при інкубації клітин з AM рівень розщеплення каспази З становить лише 123,40±34,68 % (р < 0,5) від контролю, тобто різниця з останнім не є суттєвою. Аналізуючи дані, отримані у цьому дослід­ женні, слід брати до уваги специфіку дії кожного з використаних антагоністів на обмін тіаміну. Так, AM є інгібітором транспорту тіаміну. Блокуючи транспорт вітаміну до клітини, він не проникає далі і не втручається у внутрішньоклітинний обмін тіаміну і його фосфатів. Тобто протягом інкубації клітин у середовищі з цією сполукою вони викори­ стовують переважно той пул тіаміну, що міститься у вихідних клітинах. Як випливає з одержаних даних, його досить для підтримання життєдіяль­ ності клітин за умов нашого експерименту. Піри- тіамін також конкурує з тіаміном при транспорту­ ванні, але до того ж він проникає крізь плазматич­ ну мембрану і взаємодіє з тіамінкіназою, першим ферментом на шляху внутрішньоклітинного обміну тіаміну. Це похідне є сильним інгібітором тіамін- кікази і відповідно синтезу коферменту — TDP [24]. Згідно з даними літератури, він здатний також утворювати антикофермент — піритіамінди- фосфат, але в незначній кількості і його гальму- вальний вплив на TDP-залежні ферменти є слаб­ ким. Між тим, саме піритіамін є найсильнішим 296 АКТИВАЦІЯ А П О П Т О З У АНТАГОНІСТАМИ ТІАМІНУ В А С Т Р О Ц И Т А Х антагоністом вітаміну В ; і на відміну від інших антагоністів у дослідах in vivo на тваринах він майже повністю імітує неврологічні ускладнення, що розвиваються при паралітичній формі бері-бері. Як і піритіамін, окситіамін здатний проникати крізь плазматичну мембрану. Він також взаємодіє з тіамінкіназою (але майже не гальмує її) і здатний утворювати антикофермент окситіаміндифосфат і далі — окситіамінтрифосфат. Тобто це похідне спричинює «найглибше» гальмування фермента­ тивних реакцій, залежних від TDP [24]. Таким чином, якщо оцінювати з позиції коферментних механізмів дію на клітинний метаболізм двох анта­ гоністів тіаміну — піритіаміну і окситіаміну — саме останній має викликати виразніший оксидативний стрес у клітинах за інших рівних умов. Узагальнюючи вищевикладені результати до­ слідження впливу трьох антагоністів тіаміну на життєздатність астроцитів, можна зробити висно­ вок стосовно того, що ПТ і ОТ, які є антагоністами вітаміну В! на рівні його участі у певних процесах внутрішньоклітинного метаболізму, викликають апоптоз у досліджуваних клітин. AM, дія якого обмежується пригніченням транспорту тіаміну в клітини, за умов експерименту не викликав апоп­ тозу в астроцитів. Для з'ясування механізму участі тіаміну та його похідних у сигнальних механізмах клітини потрібні подальші дослідження, у тому числі дослідження на інших типах клітин, зокрема, враховуючи високу нейротропність тіаміну, на ней- рональних клітинах. Автори щиро вдячні д-ру Фернандо А. Гонза- лесу (Пуерто Ріко, США) за допомогу у виконанні даної роботи. S. A. Chornyy, Yu. М. Parkhomenko Apoptosis activation in rat astrocyte cells caused by antagonists of thiamine Summary The experimental results of in vitro investigation of rat astrocytes (DITNC cells) reaction to the addition of well-known thiamine (vitamin Bj) antagonists into the incubation medium are repre­ sented. The following antagonists of thiamine — amprolium, pyri- thiamine, and oxythiamine were used. Confocal laser scanning fluorescent microscopy has revealed that 72 hours incubation of cells with oxythiamine or pyrithiamine results in cell membrane vacuo­ lization, externalization of membrane phospholipids and trans­ location of cleaved caspase 3 to the nucleus. Cleavage of caspase 3 in the cells that incubated with 100 juM concentration of oxy­ thiamine and pyrithiamine was determined by Western blotting and imunofluorescence methods. These data prove that incubation of DITNC cells with oxythiamine and pyrithiamine caused the activa­ tion of apoptosis processes. At the same conditions amprolium did not influence DITNC cells significantly. Keywords: thiamine antagonists, oxythiamine, pyrithiamine, amorolium, apoptosis. S. A. Chornyy, Yu. M. Parkhomenko Apoptosis activation in rat astrocyte cells caused by antagonists of thiamine Summary The experimental results of in vitro investigation of rat astrocytes (DITNC cells) reaction on adding into the medium of incubation well-known thiamine (vitamin B{) antagonists are represented in the work. The following antagonists of thiamine — amprolium, pyrithiamine and oxythiamine were used. Confocal laser scanning fluorescent microscopy has revealed that 72 hours cells incubation with oxythiamine or pyrithiamine results in cell membrane blebbing, externalization of membrane phospholipids and translocation of cleaved caspase 3 to the nucleus. Cleavage of caspase 3 in cells that incubated with 100 iM concentration of oxythiamine and pyrithiamine was determined by Western blot and imunofluorescence methods. These data suggest that incubation of DITNC cells with oxythiamine and pyrithiamine caused activation of apoptosis process. In the same conditions amprolium did not significantly influence on DITNC cells. Key words: thiamine antagonists, oxythiamine, pyrithiamine, amorolium, apoptosis. С. А. Чорный, Ю. M. Пархоменко Активация апоптоза антагонистами тиамина в астроцитах крыс Резюме Представлены результаты экспериментов по исследованию in vitro реакции астроцитов крыс (клетки DITNC) на добавление в среду инкубации известных антагонистов тиамина (вита­ мина В{). Использовали следующие антагонисты тиамина: ампролиум, пиритиамин и окситиамин. Результаты исследо­ вания на основе конфокальной лазерной сканирующей флу­ оресцентной микроскопии показали, что инкубация клеток на протяжении 72 ч с окситиамином или пиритиамином приво­ дит к вакуолизации клеточной мембраны, переходу внутри- мембранных фосфолипидов на внешнюю поверхность мембра­ ны и транслокации расщепленной каспазы 3 в клеточное ядро. Методами иммунофлуоресценции и Вестерн-блот-анализа вы­ явлено расщепление каспазы 3 в клетках, инкубированных с пиритиамином и окситиамином в концентрациях 100 мкМ. Эти данные подтверждают тот факт, что инкубация DITNC клеток с пиритиамином и окситиамином активирует процес­ сы апоптоза В тех же условиях ампролиум не влиял значи­ тельно на клетки DITNC. Ключевые слова: антагонисты тиамина, окситиамин, пири­ тиамин, ампролиум, апоптоз. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Frederikse P. H., Farnsworth P., Zigler J. S., Jr. Thiamine deficiency in vivo produces fiber cell degeneration mouse lenses / / Biochem. and Biophys. Res. Communs.—1999.— 258.—P. 703—707. 2. Stagg A. R., Fleming J. C, Baker M. A., Sakamoto M., Cohen N., Neufeld E. J. Defective high-affinity thiamine transporter leads to cell death in thiamine-respqnsive mega- 297 Ч О Р Н И Й С. А. , П А Р Х О М Е Н К О Ю. М. loblastic anemia syndrome fibroblasts / / J. Clin. Invest— 1999.—103.—P. 723—729. 3. Paek L. C, Colingasan N. Y., Uchida K., Zhang H., Gibson G. E. Metabolic impairment elicits brain cell type selective changes in oxidative stress and cell death in culture / / J. Neurochem.—2000.—74.—P. 114—124. 4. Pannunzio P., Haze 11 A. S., Pannunzio M., Rao К. V., Butterworth R. F. Thiamine deficiency results in metabolic acidosis and energy failure in cerebellar granule cells: an in vitro model for the study of cell death mechanisms in Wer­ nicke's encephalopathy / / J. Neurosci. Res .—2000.—15.— P. 286—292. 5. Calingasan N. Y.t Gibson G. E. Dietary restriction attenuates the neuronal loss, induction of heme oxygenase-1 and blood- brain barrier breakdown induced by impaired oxidative meta­ bolism / / Brain Res .—2000.—885.—P. 62—69. 6. Kruse M.f Navarro D., Desjardins P., Butterworth R. F. Increased brain endothelial nitric oxide synthase expression in thiamine deficiency: relationship to selective vulnerability / / Neurochem. Int .—2004.—45.—P. 49—56. 7. Park L C , Calingasan N. Y, Uchida K, Zhang #., Gibson G. E. Metabolic impairment elicits brain cell type-selective changes in oxidative stress and cell death in culture / / J. Neurochem.—2000.—74.—P. 114—124. 8. Rais В., Comin В., Puigjaner Brandes J. L., Creppy E., Saboureau D., Ennamany R., Lee W. N., Boros L. G., Cascante M. Oxythiamine and dehydroepiandrosterone induce a Gl phase cycle arrest in Ehrlich's tumor cells through inhibition of the pentose cycle / / FEBS Let t—1999 .—456.— P. 113—118. 9. Wang J. J.t Hua Z., Fentress H. M., Singleton С. K. JNK1 is inactivated during thiamine deficiency-induced apoptosis in human neuroblastoma cells / / J. Nutr. Biochem.—2000.— 11.—P. 208—215. 10. Ostrovskiy Yu. M. On the mechanism of coenzymic and noncoenzymic action of thiamine / / J . Vitaminol.—1968.—14 (suppl.).—P. 98—102. 11. Пархоменко Ю. M., Донченко Г. В., Протасова 3. С. Нейроактивность тиамина: факты и гипотезы / / Укр. биохим. журн.—1996 .—62, № 2 .—С. 3—15. 12. Пархоменко Ю. М., Черныш И. Ю., Чурилова Т. Я., Халмурадов А. Г. Влияние тиаминфосфатов на активность регуляторных ферментов пируватдегидрогеназного комп­ лекса / / Укр. биохим. журн.—1987 .—59, № 6.—С. 4 9 — 54. 13. Nghiem Y. О., Bettendorff L, Changeux J. P. Specific phosphorylation of Torpedo 43K rapsyn by endogenous kina­ se (s) with thiamine triphosphate as the phosphate donor / / FASEB J . - 2 0 0 0 . - 1 4 . - P . 5 4 3 - 5 4 4 . 14. Meador K.t Ixtring D., Nichols A/., Zamrini E.t Rivner M., Posas H., Thompson E., Moore E. Preliminary findings of high-dose thiamine in dementia of Alzheimer's type / / J. Geriatr. Psychiatry Neurol .—1993.—6.—P. 222—229. 15. Heroux M., Raghavendra Rao V. L., lavoie J., Richardson J. S., Butterworth R. F. Alterations of thiamine phosphorylation and of thiamine-dependent enzymes in Alzheimer's disease / / Metab. Brain Diseases .—1996.—11.—P. 81—88. 16. Butterworth R. F. Effects of thiamine deficiency on brain metabolism: implications for the pathogenesis of the Wernicke- Korsakoff syndrome / / Alcohol. Alcohol .—1989.—24.— P. 271—279. 17. Hazell A. S., Todd K. G., Butterworth R. F. Mechanisms of neuronal cell death in Wernicke's encephalopathy / / Metab. Brain Diseases .—1998.—13.—P. 97—122. 18. Tong W., Sun G. Y. Phosphorylation of lipids in rat primary glial cells and immortalized astrocytes (DITNC) / / Lipids.— 1994.—29.—P. 385—390. 19. Rucker-Martin C , Henaff M., Hatem S. N., Delpy E., Mercadier J. J. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine during apoptosis of adult rat ventricular myocytes in vitro II Basic Res. Cardiol.—1999.—94.— P. 171 — 179. 20. Godard T, Deslandes E., Lebailly P., Vigreux C, Sichel F., Poul J. M., Gauduchon P. Early detection of staurosporine-in- duced apoptosis by comet and annexin V assays / / Histochem. Cell Biol .—1999.—112.—P. 155—161. 21. Nagathihalli S. N., Nadarajah V., Wolfgang Z. Hypoxia- mediated apoptosis in oral carcinoma cells occurs via two independent pathways / / Мої. Cancer.—2004.—3.—P. 1—14. 22. Zhang G.t Zhou G., Dai Ch. Upregulation and activation of caspase-3 or caspase-8 and elevation of intracellular free calcium mediated apoptosis of indomethacin-induced K562 cells / / China's Med. J .—2004.—117.—P. 978—984. 23. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / / Anal. Biochem.—1976.— 72.—P. 248—254. 24. Островский Ю. M. Тиамин.—Минск, 1971.—144 с. УДК 576.6 577 16 Надійшла до редакції 05.04.05 ")0«

Схожі ресурси