Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії

Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії

Не каталітичний С-модуль тирозил-тРНК синтетази ссавців має подвійну функцію: бере участь у зв' язуванні тРНК як цис-фактор та після протеолітичного відщеплення від каталітичного кора синтетази проявляє иитокінову активність подібно до цитокіну ЕМАР II. С-модуль TyrRS містить залишок триптофану...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Published in:Біополімери і клітина
Date:2006
Main Authors: Кордиш, М.О., Корнелюк, О.І.
Format: Article
Language:Ukrainian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2006
Subjects:
Структура та функції біополімерів
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156780
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії / М.О. Кордиш, О.І. Корнелюк // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 4. — С. 283-289. — Бібліогр.: 23 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156780
record_format dspace
spelling Кордиш, М.О.
Корнелюк, О.І.
2019-06-18T20:24:11Z
2019-06-18T20:24:11Z
2006
Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії / М.О. Кордиш, О.І. Корнелюк // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 4. — С. 283-289. — Бібліогр.: 23 назв. — укр.
0233-7657
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156780
577.322
DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00073A
Не каталітичний С-модуль тирозил-тРНК синтетази ссавців має подвійну функцію: бере участь у зв' язуванні тРНК як цис-фактор та після протеолітичного відщеплення від каталітичного кора синтетази проявляє иитокінову активність подібно до цитокіну ЕМАР II. С-модуль TyrRS містить залишок триптофану Trp144, який є флуоресцентним зондом у структурі білка, однак локалізований поза сайтом зв'язування РНК. Для дослідження взаємодії ізольованого С-модуля з тРНК консервативний ароматичний залишок (Phe) 127 у РНК-зв' язу вальному центрі методами сайт-спрямованого мутагенезу було замінено на флуорофор Trp127. Це дозволило суттєво підвищити квантовий вихід флуоресценції білка та визначити параметри зв'язування С-модуля з тРНК. На основі даних спектрофлуориметричного титрування визначено величину константи дисоціації комплексу С-модуля з тPHK (Phe), яка складає 2,9-10⁻⁸ М, та стехіометрію комплексу (n = 1,2).
The non-catalytic COOH-terminal module of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase manifests a dual function: involvement in tRNA binding as a cis-factor and cytokine activity after proteolytic cleavage from synthetase catalytic core similar to EMAP II cytokine. The C-module of TyrRS contains a single Trp144 which is an intrinsic fluorescent probe in protein structure, but it is localized outside of RNA binding site. To explore the interaction between C-module and tRNA in solution the conservative aromatic (Phe) 127 residue was substituted for Trp127 fluorophore by site-directed mutagenesis. This replacement allowed enhancing the protein quantum yield and determining the binding parameters of tRNA and C-module. The dissociation constant of the complex between C-module and tRNA (Phe) was calculated on the basis of spectrofluorometric titrations data. It was about 2,9-10⁻⁸ M, and stoichiometry of the complex n=1.2.
Некаталитический С-модуль тирозил-тРНК синтетазы мле­копитающих выполняет двойную функцию: участвует в свя­зывании тРНК как цис-фактор и при протеолитическом расщеплении от каталитического кора синтетазы проявляет цитокиновую активность подобно цитокину ЕМАР II. С-мо­дуль TyrRS содержит остаток триптофана Trp144, который является флуоресцентним зондом в структуре белка, однако локализован вне сайта связывания РНК. Для исследования взаимодействия изолированного С-модуля с тРНК консерва­тивный ароматический остаток (Phe) 127 в РНК-связывающем центре был заменен на флуорофор Trp127 методами сайт-на­правленного мутагенеза. Это позволило существенно повы­сить квантовый выход флуоресценции белка и определить параметры связывания С-модуля с тРНК. На основе данных спектрофлуориметрического титрования определены величи­на константы диссоциации комплекса С-модуля с тPHK (Phe), которая составляет 2,9-10⁻⁸ М, и стехиометрия комплекса (n = 1,2).
Роботу виконано за фінансової підтримки гранту № 5.07/200 Державного фонду фундаментальних досліджень Міністерства освіти та науки України.
uk
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Біополімери і клітина
Структура та функції біополімерів
Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії
Исследование взаимодействия изолированного С-модуля тирозил-тРНК синтетазы с тРНК методом флуоресцентной спектроскопии
Investigation of the interaction between isolated C-module of tyrosyl-tRNA synthetase and tRNA by fluorescence spectroscopy
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії
spellingShingle Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії
Кордиш, М.О.
Корнелюк, О.І.
Структура та функції біополімерів
title_short Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії
title_full Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії
title_fullStr Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії
title_full_unstemmed Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії
title_sort дослідження взаємодії ізольованого с-модуля тирозил-трнк синтетази з трнк методом флуоресцентної спектроскопії
author Кордиш, М.О.
Корнелюк, О.І.
author_facet Кордиш, М.О.
Корнелюк, О.І.
topic Структура та функції біополімерів
topic_facet Структура та функції біополімерів
publishDate 2006
language Ukrainian
container_title Біополімери і клітина
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Исследование взаимодействия изолированного С-модуля тирозил-тРНК синтетазы с тРНК методом флуоресцентной спектроскопии
Investigation of the interaction between isolated C-module of tyrosyl-tRNA synthetase and tRNA by fluorescence spectroscopy
description Не каталітичний С-модуль тирозил-тРНК синтетази ссавців має подвійну функцію: бере участь у зв' язуванні тРНК як цис-фактор та після протеолітичного відщеплення від каталітичного кора синтетази проявляє иитокінову активність подібно до цитокіну ЕМАР II. С-модуль TyrRS містить залишок триптофану Trp144, який є флуоресцентним зондом у структурі білка, однак локалізований поза сайтом зв'язування РНК. Для дослідження взаємодії ізольованого С-модуля з тРНК консервативний ароматичний залишок (Phe) 127 у РНК-зв' язу вальному центрі методами сайт-спрямованого мутагенезу було замінено на флуорофор Trp127. Це дозволило суттєво підвищити квантовий вихід флуоресценції білка та визначити параметри зв'язування С-модуля з тРНК. На основі даних спектрофлуориметричного титрування визначено величину константи дисоціації комплексу С-модуля з тPHK (Phe), яка складає 2,9-10⁻⁸ М, та стехіометрію комплексу (n = 1,2). The non-catalytic COOH-terminal module of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase manifests a dual function: involvement in tRNA binding as a cis-factor and cytokine activity after proteolytic cleavage from synthetase catalytic core similar to EMAP II cytokine. The C-module of TyrRS contains a single Trp144 which is an intrinsic fluorescent probe in protein structure, but it is localized outside of RNA binding site. To explore the interaction between C-module and tRNA in solution the conservative aromatic (Phe) 127 residue was substituted for Trp127 fluorophore by site-directed mutagenesis. This replacement allowed enhancing the protein quantum yield and determining the binding parameters of tRNA and C-module. The dissociation constant of the complex between C-module and tRNA (Phe) was calculated on the basis of spectrofluorometric titrations data. It was about 2,9-10⁻⁸ M, and stoichiometry of the complex n=1.2. Некаталитический С-модуль тирозил-тРНК синтетазы мле­копитающих выполняет двойную функцию: участвует в свя­зывании тРНК как цис-фактор и при протеолитическом расщеплении от каталитического кора синтетазы проявляет цитокиновую активность подобно цитокину ЕМАР II. С-мо­дуль TyrRS содержит остаток триптофана Trp144, который является флуоресцентним зондом в структуре белка, однако локализован вне сайта связывания РНК. Для исследования взаимодействия изолированного С-модуля с тРНК консерва­тивный ароматический остаток (Phe) 127 в РНК-связывающем центре был заменен на флуорофор Trp127 методами сайт-на­правленного мутагенеза. Это позволило существенно повы­сить квантовый выход флуоресценции белка и определить параметры связывания С-модуля с тРНК. На основе данных спектрофлуориметрического титрования определены величи­на константы диссоциации комплекса С-модуля с тPHK (Phe), которая составляет 2,9-10⁻⁸ М, и стехиометрия комплекса (n = 1,2).
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156780
citation_txt Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії / М.О. Кордиш, О.І. Корнелюк // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 4. — С. 283-289. — Бібліогр.: 23 назв. — укр.
work_keys_str_mv AT kordišmo doslídžennâvzaêmodííízolʹovanogosmodulâtiroziltrnksintetaziztrnkmetodomfluorescentnoíspektroskopíí
AT kornelûkoí doslídžennâvzaêmodííízolʹovanogosmodulâtiroziltrnksintetaziztrnkmetodomfluorescentnoíspektroskopíí
AT kordišmo issledovanievzaimodeistviâizolirovannogosmodulâtiroziltrnksintetazystrnkmetodomfluorescentnoispektroskopii
AT kornelûkoí issledovanievzaimodeistviâizolirovannogosmodulâtiroziltrnksintetazystrnkmetodomfluorescentnoispektroskopii
AT kordišmo investigationoftheinteractionbetweenisolatedcmoduleoftyrosyltrnasynthetaseandtrnabyfluorescencespectroscopy
AT kornelûkoí investigationoftheinteractionbetweenisolatedcmoduleoftyrosyltrnasynthetaseandtrnabyfluorescencespectroscopy
first_indexed 2025-11-24T16:49:08Z
last_indexed 2025-11-24T16:49:08Z
_version_ 1850486974156111872
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2006. Т. 22. № 4 Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії М. О. Кордиш, О. І . Корнелюк Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143 , Україна kordysh_m@yahoo.com Не каталітичний С-модуль тирозил-тРНК синтетази ссавців має подвійну функцію: бере участь у зв1 язу ванні тРНК як цис-фактор та після протеолітичного відщеплення від каталітичного кора синтетази проявляє иитокінову активність подібно до цитокіну ЕМАР II. С-модуль TyrRS містить залишок триптофану Тгр144, який є флуоресцентним зондом у структурі білка, однак локалізований поза сайтом зв'язування РНК. Для дослідження взаємодії ізольованого С-модуля з тРНК консервативний ароматичний залишок PheI27 у РНК-зв' язу вальному центрі методами сайт-спрямованого мутагенезу було замінено на флуорофор ТгрІ27. Це дозволило суттєво підвищити квантовий вихід флуоресценції білка та визначити параметри зв'язування С-модуля з тРНК. На основі даних спектрофлуориметричного титрування визначено величину константи дисоціації комплексу С-модуля з mPHKphe, яка складає 2,9-10~8 М, та стехіометрію комплексу (п-1,2). Ключові слова: тирозил-тРНК синтетаза, мутагенез, флуоресценція. Вступ. Аміноацил-тРНК синтетази каталізують ви- сокоспецифічне аміноацилювання гомологічних тРНК у процесі біосинтезу білка. Однією з найвив- ченіших АРСаз ссавців є цитоплазматична тиро- зил-тРНК синтетаза (TyrRS) [1—3]. Цей фермент складається з двох структурних модулів: N H 2 - кінцевого каталітичного модуля та цитокінподіб- ного СООН-кінцевого модуля — гомолога цитокіну ЕМАР II (ендотеліального та моноцитактивуючого поліпептиду II). Некаталітичний С-модуль цито­ плазматичної TyrRS ссавців виконує подвійну функцію: бере участь у зв 'язуванні т Р Н К як цис- фактор та після протеолітичного відщеплення від каталітичного кора синтетази виявляє цитокінову активність, подібну до ЕМАР II [4, 5 ] . Еукаріотні © М. О. К О Р Д И Ш , О. І. К О Р Н Е Л Ю К , 2 0 0 о АРСази, як правило, використовують т Р Н К - з в ' я - зувальні фактори (tIF) в цис- чи транс-иоложтт відносно каталітичного ядра синтетази, причому ці фактори можуть неспецифічно взаємодіяти з різ­ ними тРНК [6, 7 ] . С-модуль та ЕМАР II належать до групи тРНК-зв 'язувальних факторів, до складу яких вхо­ дить ОВ-фолд. їхніми представниками також є окремий білок T r b p l l l у бактерій [8] та Агсір- білок у дріжджів [7 ]. У ссавців мультисинтетазний комплекс включає окремий білок р43, який є попередником цитокіну ЕМАР II [9] . Усі ці білки у своїй структурі містять ОВ-фолд як домен, харак­ терною властивістю якого є зв 'язування з нук­ леїновими кислотами. Архітектура багатьох білків базується на закритих /^-барелях, одним з яких є 5-стрендовий ОВ-фолд, вперше описаний Мурзі ним 283 mailto:kordysh_m@yahoo.com К.ОРДИШ м. О., КОРНЕЛЮК. О. I. у 1993 році як олігонуклеотид(олігосахарид)-зв'я­ зувальний структурний мотив [10]. На цей час у базі даних просторових структур PDB налічується 85 різноманітних ОВ-фолд-вміс- них білків. Найбільшою групою серед них є білки, що зв 'язують нуклеїнові кислоти, серед них родина антикодон-зв' язу вальних доменів, до якої належать AspRS, AsnRS і LysRS (N-кінцеві домени яких є типовими ОВ-фолдами та беруть участь у впізна­ ванні антикодонів гомологічних т Р Н К [11]), та родина Myf-доменів, до складу якої входять ЕМАР II, С-модуль TyrRS ссавців, Arclp-білок дріжджів, білок T r b p l l l і В2-домєн PheRS бактерій. Варто зазначити, що структурні аспекти взає­ модії ізольованого С-модуля TyrRS з тРНК, а також роль окремих амінокислотних залишків поки що залишаються невивченими. Раніше нами прове­ дено дослідження власної триптофанової флуорес­ ценції та конформаційної рухливості ізольованого С-модуля TyrRS [12, 13] і цитокіну ЕМАР II [14, 15] з використанням Тгр144 у С-модулі та Тгр125 у ЕМАР II як флуоресцентних зондів у структурі цих білків. Мета цієї роботи полягала у вивченні взаємодії С-модуля TyrRS і цитокіну ЕМАР II з тРНК методами флуоресцентної спектроскопії. У попе­ редніх експериментах нами показано, що взаємодія С-модуля з т Р Н К супроводжується сильною агре­ гацією білка в розчині і це суттєво впливає на визначення параметрів зв 'язування. У зв 'язку з цим в представленій роботі для підвищення кван­ тового виходу флуоресценції С-модуля TyrRS і зниження робочих концентрацій білка методами сайт-спрямованого мутагенезу консервативний аро­ матичний залишок Phe l27 у РНК-зв 'язувальному центрі було замінено на флуорофор Тгр127. Це дало можливість провести коректні дослідження взаємодії С-модуля з т Р Н К методом флуоресцент­ ної спектроскопії та визначити параметри зв 'язу­ вання, а також перевірити гіпотези щодо механізму взаємодії індольного кільця Тгр127 з РНК при утворенні комплексу. Матеріали і методи. Рекомбінантні білки С- модуль TyrRS та ЕМАР II були експресовані у клітинах Escherichia coli та очищені до гомогенного стану (95 %) за допомогою металхелатуючою хро­ матографії згідно з [16]. Після виділення рекомбі- нантних білків послідовність His-Tag відщеплю­ вали за допомогою ентерокінази (enterokinase, light chain) («BioLabs», США). Для дослідження комплексів білків з нуклеї­ новою кислотою розчини білків і TPHK P h e («Sigma», США) готували в буфері, який вміщував 20 мМ трис-НСІ, рН 7,7, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2 . Концентрації білків і т Р Н К Р Ь е визначали спек­ трофотометрично, застосовуючи такі коефіцієнти екстинкції: для С-модуля є 2 8 0 = 9650 М^см" 1 ; для мутантного С-модуля (Phel27Trp) £ 2 8 0 = = 15470 M ' W 1 ; для ЕМАР II є 2 8 0 = 8480 М" 1 см _ І ; для T P H K p h e є 2 6 0 = 500000 M ' W 1 . УФ-поглинання вимірювали з використанням спектрофотометра Specord UV VIS («Сагі Zeiss Jena», Німеччина). Заміну залишку Phe l27 на Тгр127 в С-модулі TyrRS здійснювали сайт-спря- мованим мутагенезом за допомогою методу Quik- Change, розробленого фірмою «Stratagene» (США), з використанням праймерів F488WS і F488WAs: F488WS 5'-caagaagaaagtctgggagaaattgcaggc-3'; F488WAs 5'-gcctgcaatttctcccagactttcttcttg-3\ Реакційна суміш для проведення ПЛР містила 1 х Pfu-буфер («Fermentas», Литва) , 0,2 ммоль dNTPs («АмплиСенс», Росія), праймери F488WS і F488WAs (по 20 пмоль), 50—100 нг плазміди pKCTD, 2,5 од. акт. Pfu ДНК-полімерази. Об'єм реакційної суміші доводили деіонізованою водою до 50 мкл. Початкову денатурацію матриці проводили протягом 1 хв за температури 94 °С. Далі здійсню­ вали 35 циклів за такою програмою: денатурація матриці упродовж 1 хв за температури 94 °С, відпал праймерів — 1 хв, 60 °С; добудова прай­ мерів — 6 хв, 72 °С. Після закінчення реакції зразок інкубували додатково (6 хв, 72 °С). Продукт ПЛР розщеплювали за допомогою рестриктази Dpnl («Fermentas») за температури 37 °С протягом ночі. При цьому реакційна суміш містила реакційний буфер рестриктази Dpnl та 20 од. акт. ферменту. Для трансформації 200 мкл компетентних клі­ тин Е. coli DH5a використовували 5—10 мкл продуктів рестрикції. Ефективність сайт-спрямованого мутагенезу із заміною Phe l27 на Тгр127 перевіряли за допомо­ гою секвенування плазмідної ДНК. Структури С-модуля та мутанта із заміною Phe l27 на Тгр127 візуалізували, використовуючи програму SwissPDB-Viewer 3.7 (Ь2) на основі мо­ делі просторової структури С-модуля с т 5 [17]. 284 Флуоресцентні вимірювання здійснювали на спектрофлуориметрі Сагу Eclipse (Varian Inc., Mul- grave, Австралія). Ширина щілини монохроматора збуджуючого світла становила 5 нм. Довжина хвилі збудження — 296 нм. Величини інтенсивностей флуоресценції білка під час титрування т Р Н К Р Ь е коригували на розведення (Кр)> флуоресценцію буфера та поглинання нуклеїнових кислот — при довжині хвилі 296 нм (AQ 29b). Коефіцієнт корекції на розведення визначали як Kp-V/V0> де V0 — початковий об'єм білка; V — об'єм розчину білка після додавання т Р Н К Р Ь 2 % Коефіцієнт корекції на поглинання т Р Н К — IQ^Q У г , де L — довжина оп­ тичного шляху кювети. Параметри зв 'язування білків з т Р Н К визнача­ ли за допомогою рівняння (1) [18]: а(Р0> L, ^ п , Ф ) = 1 - Ф х (п • Kd + п • Р 0 + L) 1 2пР0 V(/t • Kd + п • PQ + L)1 - ( 4 я ~ Р 0 - L) л (1) 2пР0 J ' де а « / 3 4 7 / 0 3 4 0 ; Ф - 1 - / н а с и ч Є н н я 3 4 0 / / 0 3 4 0 ; / 3 4 о - інтен- сивність флуоресценції білка за присутності тРНК в концентрації L; / 0 3 4 0 — початкова інтенсивність ф л у о р е с ц е н ц і ї б ілка ; / н а с и ч Є н н Я 3 4 0 ~ інтенсивність флуоресценції білка за присутності тРНК при на­ сиченні; Р0 — загальна концентрація білка в роз­ чині; Kd — константа дисоціації комплексу; п — стехіометрія зв 'язування. Для отримання числових значень Kd та п використовували імовірнісний метод мінімуму х2- Функція х2 узгоджує експериментальні дані а = = / 3 4 0 / / 0 3 4 0 з модельними а (Р0, L, Kd, n, Ф) (рівняння 1), де Ф проявляє тенденцію до росту в разі погіршення узгодження. Рівняння для функції X2: 1 РІчт\1 XsqR{Kdt п, Ф) = • ] £ х г і = І „ (а(Рое0 Let, Kg, п, Ф) - аехр,) 2 (2) а 2 де pts — кількість експериментальних точок а; а2 —- стандартне відхилення величини а. Програму Mathcad 2003 Professional і команду Minimize вико­ ристано для знаходження мінімуму функції xsqR П Р И певних значеннях Kd та я , які було необхідно визначити. Результати і обговорення. Ізольований С-мо­ дуль TyrRS містить один залишок триптофану Тгр144, який локалізований в А-субдомені модуля. Спектр триптофанової флуоресценції нативного С- модуля має максимум емісії при 327 нм (рис. 1, спектр / ) , що відповідає внутрішньоглобулярній 285 К О Р Д И Ш М. О. , К О Р Н Е Л Ю К О. I. Тгр 127 Тгр144 Рис. 2. Просторова структура С-модуля тирозил-тРНК синтетази із заміною кон­ сервативного ароматичного залишку P h e l 2 7 на Тгр локалізації флуорофору та його екранованому ста­ ну в структурі білка [12] . Проведені нами раніше [12, 13] дослідження власної триптофанової флуо­ ресценції та конформаційної рухливості С-модуля з використанням Тгр144 як флуоресцентного зонда показали високу чутливість до локальних конфор- маційних змін у його мікрооточенні. Проте Тгр144 локалізований поза межами РНК-зв'язувального сайта С-модуля, який забезпечує структурно-спе­ цифічне зв'язування різних тРНК. Вірогідний РНК-зв'язувальний сайт нами було ідентифіковано раніше на основі даних футпринтингу нуклеазами ChS, Rn, VI і PhyM та іонами РЬ 2 + , а також комп'ютерного макромолекулярного докингу С-мо­ дуля і тРНК Р Ь е [19] . Потенційна РНК-зв'язувальна поверхня вклю­ чає залишки конекторної петлі між двома стренда- ми ОВ-фолду (L426-G433, K435-Q437), міждомен- ний інтерфейс (E480-L481), лізин-багатий кластер К 4 8 2 Р К К К 4 8 6 та амінокислотні залишки Е489-К490 а-спіралі А-субдомену [19] . В попередніх експери­ ментах з вивчення взаємодії С-модуля з тРНК нами показано, що ця взаємодія супроводжується сильною агрегацією білка в розчині, причому агре­ гація індукується саме присутністю поліаніонної структури РНК (М. Кордиш, неопубліковані ре­ зультати). Очевидно, що наявність процесу агре­ гації суттєво впливає на коректність визначення параметрів зв'язування в експериментах з флуори- метричного титрування білка лігандами. Тому для підвищення квантового виходу флуоресценції С- модуля TyrRS і проведення коректних досліджень взаємодії білка з тРНК методами сайт-спрямовано- го мутагенезу нами було замінено консервативний ароматичний залишок P h e l 2 7 на флуорофор Тгр127. Останній локалізований в межах РНК- зв'язувального центра поряд з лізин-багатим кла­ стером КРККК. Слід відзначити, що в цьому ж положенні поліпептидного ланцюга гомологічного білка — цитокіну ЕМАР II міститься залишок Тгр [20]. На рис. 1 (спектр 2) наведено спектр трипто­ фанової флуоресценції мутантного С-модуля із за­ міною Phel27 на Тгр127 при довжині хвилі збуд­ ження флуоресценції 296 нм, що є умовою збуд­ ження лише трипофанової флуоресценції в білках [18, 2 1 ] . Максимум спектра флуоресценції мутан­ тного С-модуля знаходиться на 332 нм і є суттєво зсунутим у довгохвильову спектральну область по­ рівняно з нативним С-модулем, оскільки обумовле­ ний як залишком Тгр127, так і залишком Тгр144. Введення флуорофору Тгр 127 спричинює також різке зростання квантового виходу флуоресценції, обумовлене додатковим внеском залишку Тгр 127 у загальну емісію білка (рис. І, спектр 2) . Положення максимуму спектра флуоресценції свідчить про частково експонований характер за­ лишку Тгр127 стосовно молекул розчинника, згід­ но з моделлю структурно-фізичних класів залишків Тгр у білках [22] . Аналіз просторової структури 286 мутантного С-модуля із заміною Phel27 на Тгр (рис. 2) також підтверджує частково експонований характер флуорофору Тгр127. Взаємодія білків з РНК передбачає конфор- маційні зміни білків і тРНК у процесі формування специфічних комплексів. Раніше нами вивчено конформаційну рухливість ізольованого цитокіну ЕМАР II з використанням власної флуоресценції Тгр 125 як зонда в структурі цього білка [14, 15] , локалізація якого відповідає введеному в мутант­ ний С-модуль Тгр127. Моніторинг конформаційних змін у локально­ му оточенні флуорофору Тгр 125 в ЕМАР II дозво­ лив зафіксувати конформаційний перехід за фі­ зіологічної температури (37 °С), який супровод­ жується частковою експонованістю Тгр 125 щодо молекул розчинника [15] . Оскільки ароматичний залишок Тгр125 ЕМАР II належить до тРНК- Рис. 3. Флуориметричне титрування роз­ чину С-модуля (а) та ЕМАР II (б) т Р Н К Р Н е при 20 °С. Концентрація С-моду­ ля в розчині становила 1 мкМ, концент­ рація ЕМАР II — 3 мкМ зв'язувального центра і знаходиться в області висо­ кої конформаційної рухливості, було висловлено припущення, що цей конформаційний перехід Тгр 125 є функціонально необхідним для подальшої взаємодії з РНК [15] . Така взаємодія може здій­ снюватися за різними можливими механізмами, наприклад, внаслідок інтеркаляції ароматичного залишку триптофану між азотистими основами в структурі тРНК чи формуванням стекінгових ком­ плексів без інтеркаляції. Слід відзначити, що всі білки, які містять ОВ-фолд та зв'язують нуклеїнові кислоти, як правило, мають в структурі РНК- зв'язувальних центрів консервативні ароматичні залишки, що є функціонально необхідними при формуванні комплексів білків з РНК [23]. Віро­ гідно, що С-модуль та ЕМАР II також взаємодіють з тРНК за подібним механізмом, а консервативний ароматичний залишок Phel27 С-модуля, еквіва- 287 К О Р Д И Ш М. О. , К О Р Н Е Л Ю К О. I. лентний Тгр125 в ЕМАР И, може брати участь у комплексоутворенні з тРНК. Для визначення параметрів зв'язування С-мо­ дуля TyrRS з тРНК Р Ь е нами проведено флуоримет- ричне титрування розчину білка тРНК Р Ь е . При збільшенні концентрації т Р Н К Р Ь е в розчині макси­ мум спектра флуоресценції С-модуля практично не змінювався, натомість спостерігалося суттєве змен­ шення інтенсивності флуоресценції. Очевидно, це можна пояснити зв'язуванням С-модуля TyrRS з тРНК Р Ь е . Аналогічний ефект гасіння триптофанової флуоресценції при додаванні тРНК без суттєвих змін максимуму спектра емісії нами відмічено і для білка ЕМАР II (рис. З, б). На основі отриманих експериментальних даних змін власної триптофа­ нової флуоресценції С-модуля TyrRS та ЕМАР II при титруванні т Р Н К Р Ь е розраховано параметри зв'язування тРНК у цих комплексах (за темпера­ тури 20 °С), які наведено нижче: Комплекс С-модуля TyrRS з тРНК Р Ь е : п = 1,2 / ^ ~ 2 , 9 1 0 ~ 8 М Комплекс ЕМАР II з т Р Н К Р Ь е л - 1,3 Kd~ 3,4-10" 7 М Незмінне положення максимуму спектра флуо­ ресценції як С-модуля TyrRS, так і ЕМАР II при титруванні т Р Н К Р Ь е з високою вірогідністю може свідчити про відсутність інтеркаляції ароматичних залишків триптофану в структуру нуклеїнової кис­ лоти при формуванні комплексів. Отже, функціо­ нальна роль ароматичних амінокислотних залиш­ ків може реалізуватися за можливим механізмом формування стекінгових взаємодій між індольним кільцем триптофану та азотистими основами РНК. Роботу виконано за фінансової підтримки гран­ ту № 5.07/200 Державного фонду фундаменталь­ них досліджень Міністерства освіти та науки Ук­ раїни. М. A. Kordysh, A. I. Kornelyuk Investigation of the interaction between isolated C-module of tyrosyl- tRNA synthetase and tRNA by fluorescence spectroscopy Summary The non-catalytic COOH-terminal module of mammalian tyrosyl- tRNA synthetase manifests a dual function: involvement in tRNA binding as a cis-factor and cytokine activity after proteolytic cleavage from synthetase catalytic core similar to ЕМАР II cytokine. The C-module of TyrRS contains a single Trpl44 which is an intrinsic fluorescent probe in protein structure, but it is localized outside of RNA binding site. To explore the interaction between C-module and tRNA in solution the conservative aromatic Phe 127 residue was substituted for Trpl27 fluorophore by site- directed mutagenesis. This replacement allowed enhancing the protein quantum yield and determining the binding parameters of tRNA and C-module. The dissociation constant of the complex between C-module and tRNA e was calculated on the basis of spectrofluorometric titrations data. It was about 2.9 10 , and stoichiometry of the complex n^ 1.2. Keywords: tyrosyl-tRNA synthetase, mutagenesis, fluorescence. M. А. Кордьіиі, А. И. Корнелюк Исследование взаимодействия изолированного С-модуля тирозил-тРНК синтетазы с тРНК методом флуоресцентной спектроскопии Резюме Некаталитический С-модуль тирозил-тРНК синтетазы мле­ копитающих выполняет двойную функцию: участвует в свя­ зывании тРНК как цис-фактор и при протеолитическом расщеплении от каталитического кора синтетазы проявляет цитокиновую активность подобно цитокину ЕМАР II. С-мо­ дуль TyrRS содержит остаток триптофана Тгр 144, который является флуоресцентним зондом в структуре белка, однако локализован вне сайта связывания РНК. Для исследования взаимодействия изолированного С-модуля с тРНК консерва­ тивный ароматический остаток Phel27 в РНК-связывающем центре был заменен на флуорофор Тгр 127 методами сайт-на­ правленного мутагенеза. Это позволило существенно повы­ сить квантовый выход флуоресценции белка и определить параметры связывания С-модуля с тРНК. На основе данных спектрофлуориметрического титрования определены величи­ на константы диссоциации комплекса С-модуля с mPHKPhe, которая составляет 2,9-10 М, и стехиометрия комплекса (п-1,2). Ключевые слова: тирозил-тРНК синтетаза, мутагенез, флуоресценция. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Mirande М. Aminocyl-tRNA synthetase family from pro- karyotes and eukaryotes. Structural domains and their implica­ tions / / Progr. Nucl. Acid Res. Мої. Biol .—1991.—40.— P. 95—142. 2. Bonnefond L., Giege R, Rudinger-Thirion J. Evolution of the t R N A T y r / T y r R S aminoacylation systems / / Biochimie.— 2005 .—87.—P. 873—883. 3. Корнелюк А. И. Структурно-функциональное исследова­ ние тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих / / Биопо­ лимеры и клетка.—1998.—14, № 4.—С. 349—359. 4. Kornelyuk A. I., Tas М. P. R, Dubrovsky A. JL, Murray J. С. Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase / / Biopolimery і kletka.— 1999.—15, № 2.—P. 168—172. 5. Wakasugi K, Schimmel P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA synthetase / / Science.— 1 9 9 9 . — 2 8 4 — P. 147—151. 6. Quevillon S., Agou F., Robinson J. C, Mirande M. The p43 component of the mammalian multi-synthetase complex is likely to be the precursor of the endothelial monocyte-activating polypeptide II cytokine / / J. Biol. Chem. 1997.—272.— P. 32573—32579. 7. Simos G., Segref A., Fasiolo F., Hellmuth H., Shevchenko A., Mann M., Hurt E. C. The yeast protein Arclp binds to tRNA 288 В И В Ч Е Н Н Я ВЗАЄМОДІЇ С - М О Д У Л Я Т И Р О З И Л - т Р Н К СИНТЕТАЗИ 3 тРНК and functions as a cofactor for the methionyl- and glutamyl- tRNA synthetase / / The EMBO J .—1996.—15.— P. 5537— 5448. 8 Kusniro Т., Schimmel T. T r b p l l l selectively binds a non- covalently assembled tRNA-like structure / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—2002.—99.—P. 16631 — 16635. 9. Shalak V., Kaminska M., Mitnacht-Kraus R., Vandenabeele P., Clauss M., Mirande M. The EMAPII cytokine is released from the mammalian multisynthetase complex after cleavage of its p43/proEMAPII component / / J. Biol. Chem.—2001.— 276.—P. 23769—23776. 10. Murzin A. OB (oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous, sequences / / EMBO J .—1993 .—12.—P. 861—867. 11. Moras D. Structural aspects and evolutionary implications of the recognition between tRNAs and aminoacyl-tRNA syn­ thetases / / Biochimie.—1993.—75.—P. 651—657. 12. Kopdbiui M. А., Одынец К. А., Корнелюк А. И. Trpl44 как флуоресцентный зонд для изучения конформационной подвижности С-модуля эукариотической тирозил-тРНК синтетазы / / Биополимеры и клетка.—2003.—19, № 5.— С. 436—439. 13. Кордыш М. А., Корнелюк А. И. Мониторинг конфор- мационного изменения окружения флуорофора Тгр144 в С-модуле тирозил-тРНК синтетазы при тепловой денату­ рации / / Доп. НАН України.—2004.—№ 1.—С. 156—161. 14. Кордыш. М. А., Корнелюк А. И. Флуоресценция и ди­ намика структурного окружения флуорофора Тгр125 в цитокине ЕМАР II / / Вестн. Харьков, нац. ун-та им. В. Н. Каразина: Биофиз. вестн.—2003.—Вып. 2 (13) .—С. 86— 90. 15. Кордиш М. О., Дубровський О. Л., Корнелюк О. І. Ло­ кальний конформаційний перехід флуорофора Trpl25 в цитокіні ЕМАР II, індукований фізіологічною темпера­ турою / / Фізика живого.—2005.—13, № 1.—С. 79—83. 16. Дубровский А. Л., Браун Дж., Корнелюк А. И.у Мюррей К, Мацука Г. X. Бактериальная экспрессия полноразмерных и усеченных форм цитокина ЕМАР II и цитокинподобного домена тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих / / Био­ полимеры и клетка.—2000.—16, № 3.—С. 229—235. 17. Каниболоцкий Д. С , Одынец К А., С курский С. И., Корнелюк А. И. Изучение внутримолекулярной подвиж­ ности цитокин-подобного С-концевого модуля тирозил- тРНК синтетазы млекопитающих методом молекулярной динамики / / Фізика живого .—2003.—11, № 2.—С. 61 — 71. 18. Roy S. Fluorescence quenching methods to study protein- nucleic acid interaction / / Meth. Enzymol.—2004.—379.— P. 175—187. 19. Golub A., Petrushenko Z., Odynets K, Dubrovsky A., Rozhko O., Matsuka G.t Solecka K, Olszak K, Przykorska A., Kornelyuk A. Cytokine-like C-terminal module of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase reveals structure-specific tRNA bind­ ing: Computational docking modeling and footprint analysis / / Aminoacyl-tRNA synthetases in biology, medicine, and evolu­ tion.—Asilomar, 2002 .—P. 116. 20. Renault JL, Kerjan P., Pasqualato S., Menetrey J., Robinson J. C , Kawaguchi S., Vassylyev D. G., Yokoyama S., Mirande M., Cherfils J. Structure of the EMAPII domain of human aminoacyl-tRNA synthetase complex reveals evolutionary dimer mimicry / / EMBO J .—2001 .—20.—P. 570—578. 21. Lakowicz J. R. Principles of fluorescent spectroscopy / 2nd Edition.—New York: Plenum Press, 1999.—725 p. 22. Reshetnyak Y. Ky Koshevnik Y, Burshtein E. A. Decomposi­ tion of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. III. Correlation between fluorescence and micro- environment parameters of individual tryptophan residues / / Biophys. J .—2001 .—81.—P. 1735—1758. 23. Draper D. E. Themes in RNA-protein recognition III. Мої. Biol .—1999.—293.—P. 255—270 . УДК 577.322 Надійшла до редакції 12.05.06 289

Similar Items