Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β
Нещодавно клоновано нову форму кінази рибосомного білка S6, названу p70Sb кіназа β, амінокислотна послідовність якої має високий ступінь гомології з відомою p70S6 кіназою α. В роботі представлено результати порівняльного аналізу кінетики активації сироваткою α2- і β2-форм S6 кінази, експресованих у...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1999 |
| Hauptverfasser: | , , , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1999
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156802 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β / Т.Й. Вальовка, В.В. Філоненко, С.С. Пальчевський, М.М. Великий, Л.Б. Дробот, М. Вотерфілд, Г.X. Мацука, I. Т. Гут // Биополимеры и клетк а. — 1999. — Т. 15, № 5. — С. 415-421. — Бібліогр.: 39 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859639369200041984 |
|---|---|
| author | Вальовка, Т.Й. Філоненко, В.В. Пальчевський, С.С. Великий, М.М. Дробот, Л.Б. Вотерфілд, М. Мацука, Г.Х. Гут, І.Т. |
| author_facet | Вальовка, Т.Й. Філоненко, В.В. Пальчевський, С.С. Великий, М.М. Дробот, Л.Б. Вотерфілд, М. Мацука, Г.Х. Гут, І.Т. |
| citation_txt | Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β / Т.Й. Вальовка, В.В. Філоненко, С.С. Пальчевський, М.М. Великий, Л.Б. Дробот, М. Вотерфілд, Г.X. Мацука, I. Т. Гут // Биополимеры и клетк а. — 1999. — Т. 15, № 5. — С. 415-421. — Бібліогр.: 39 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Нещодавно клоновано нову форму кінази рибосомного білка S6, названу p70Sb кіназа β, амінокислотна послідовність якої має високий ступінь гомології з відомою p70S6 кіназою α. В роботі представлено результати порівняльного аналізу кінетики активації сироваткою α2- і β2-форм S6 кінази, експресованих у клітинах НЕК293. Виявлені відмінності вказують на різний в часовому відношенні прояв їхньої функціональної активності in vivo. Інкубація трансфікованих клітин з імуносупресором рапаміцшюм пригнічує індуковану сироваткою активацію як р70α2, так і p70β2 кіназ. Пригнічення р70β2 відбувається за низьких концентрацій рапаміцину. Одночасно β2-форма кінази є менш чутливою до високих концентрацій інгібітора у порівнянні з р70α2. Отримані дані дозволяють припустити існування диференційних механізмів модуляції сигнальних шляхів, що опосередковують активацію α- і β-форм S6 кінази.
Недавно клонирована новая форма киназы рибосомного белка S6, названная p70S6 киназа β, аминокислотная последовательность которой имеет высокую степень гомологии с известной p70S6 киназой а. В работе представлены результаты сравнительного анализа кинетики активации сывороткой α2- и β2-форм S6 киназы, экспрессированных в клетках НЕК293. Установленные отличия указывают на разное в часовом отношении проявление их функциональной активности in vivo. Инкубация трансфицированных клеток с иммуносупрессором рапамицином угнетает индуцированную сывороткой активацию как р70α2, так и р70β2 киназ. Угнетение p70β2 происходит при низких концентрациях рапамицина. Одновременно β2-форма киназы менее чувствительна к высоким концентрациям ингибитора по сравнению с р70α2. Полученные данные дают основание предположить существование дифференциальных механизмов модуляции сигнальных путей, которые опосредуют активацию α- и β-форм S6 киназы.
A novel ribosomal S6 kinase, termed p70S6 kinase β, has been recently identified. It is highly homologous to known p70/p85 S6 kinase (p70S6 kinase α) in catalytic, kinase extension and auto-inhibitory domains, but differs significantly in the regulatory N- and C-terminal regions. Here we report the kinetics of serum-induced activation of cytoplasmic isoforms of p70S6 kinase α and β (p70α2 and p70β2) in transiently transfected HEK293. Both kinases exhibit biphasic activation upon serum stimulation, but differ in the appearance of peaks of their S6 specific activity. We also found that p70α2 and p70β2, when overexpressed in HEK293 cells, are sensitive to the immunosuppressant rapamycin. However, p70β2 kinase is more sensitive to low concentrations of rapamycin, when compared with p70α2. At the same time, high concentrations of rapamycin are inhibitory to a higher extent towards p70α2, than p70β2 kinase. Taken together, our results indicate that p70α2 kinase is activated earlier in response to serum and is less sensitive to high concentration of rapamycin, in comparison to p70α2. These differences indicate the existence of alternative signalling mechanisms, involved in the regulation of p70β2 kinase.
|
| first_indexed | 2025-12-07T13:19:41Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 5
Функціональні та регуляторні особливості кінази
рибосомного білка S6 типу /?
Т. Й. Вальовка, В. В. Філоненко 1 , С. С. Пальчевський 1, М. М. Великий,
Л. Б. Дробот 2 , М. Вотерфілд 3, Г. X. Мацука 1, I. Т. Гут 1 , 3
Львівський державний університет ім. І. Франка
Вул. Грушевського, 4, Львів, 79005, Україна
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143, Україна
2
Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
Вул. Драгоманова, 14/16, Львів, 79005, Україна
З
Інститут Людвіга по вивченню рака
WIP8BT, Лондон, 91, Райдінг Хауз Стріт, Англія
Нещодавно клоновано нову форму кінази рибосомного білка S6, названу p70Sb кіназа /3, амі
нокислотна послідовність якої мас високий ступінь гомології з відомою p70S6 кіназою а. В роботі
представлено результати порівняльного аналізу кінетики активації сироваткою а2- і /32-форм S6
кінази, експресованих у клітинах НЕК293. Виявлені відмінності вказують на різний в часовому
відношенні прояв їхньої функціональної активності in vivo. Інкубація трансфікованих клітин з
імуносупресором рапаміцшюм пригнічує індуковану сироваткою активацію як р70а2, так і p70fi2
кіназ. Пригнічення р70/$2 відбувається за низьких концентрацій рапаміцину. Одночасно ^2-форма
кінази є менш чутливою до високих концентрацій інгібітора у порівнянні з р70а2. Отримані дані
дозволяють припустити існування диференційних механізмів модуляції сигнальних шляхів, що
опосередковують активацію а- і /3-форм S6 кінази.
Вступ. Активація трансляції є необхідною мета
болічною подією відповіді клітини на вплив росто
вих факторів, гормонів, цитокінів, а також форбо-
лових ефірів та онкогенів. Процес ініціації транс
ляції як одна з основних регуляторних ланок білко
вого синтезу регулюється фосфорилюванням—де-
фосфорилюванням ключових компонентів апарату
трансляції [1 ]. Одним з цих компонентів є S6 білок
40S субчастинки рибосом, фосфорилювання якого
зростає у відповідь на мітогенні стимули [21. На
сьогоднішній день отримано переконливі докази на
користь того, що Ser/Thr-специфічне фосфорилю
вання S6 білка in vivo опосередковується p70S6
кіназою [3—7 ]. У свою чергу, посилення фосфори
лювання S6 білка забезпечує ефективну дифе-
© Т Й ВАЛЬОВКА, В В. Ф І Л О Н Е Н К О , С С- П А Л Ь Ч Е В С Ь К И Й ,
И. М В Е Л И К И Й , Л. Б. Д Р О Б О Т , М Д . В О Т Б Р Ф 1 Л Д ,
Г X. МАЦУКА, 1. Т. ГУТ, 1 9 9 9
ренційну трансляцію мРНК, які містять поліпіри-
мідинову послідовність на 5'-кінці в області, яка не
транслюється [7, 8 ]. Цей клас мРНК кодує значну
кількість компонентів білок-синтезуючого апарату
клітини, включаючи мРНК рибосомних білків та
факторів елонгації (eEF-J та eEF-2), і може скла
дати до 20 % від загального вмісту мРНК у клітині
[9J. Крім цього, показано, що активація згаданої
кінази є необхідною не лише для індукції білкового
синтезу, але й для регуляції клітинного циклу.
Інактивація p70S6 кінази шляхом мікроін'єкції
нейтралізуючих антитіл [10, 161 чи інкубації з
імуносупресором рапаміцином [11—13 J супровод
жується зупинкою багатьох типів клітин у G1 фазі
клітинного циклу [ 14 J.
Донедавна було відомо тільки одну форму
p70S6 кінази, яка експресується в клітинах у виг
ляді двох ізоформ — p70al і р70ес2. Ці дві ізоформи
ферменту кодуються одним геном і є результатом
415
ВАЛЬОВКА Т. Й. ТА ІН.
альтернативного сплайсингу мРНК та використан
ня альтернативних центрів початку трансляції
[15]. p70al (525 амінокислотних залишків) від
різняється від р70а2 (502 амінокислотних залиш
ки) лише наявністю N-кінцевого фрагмента, який
містить шість послідовних залишків Arg безпосе
редньо після початкового Met і визначає ядерну
локалізацію даної ізоформи [16, 17].
В останні роки здійснюються інтенсивні пошу
ки сигнальних молекул, потенційних регуляторів
p70S6 кінази, а також вивчення сигнальних шля
хів, які ведуть до активації цього ферменту. Вста
новлено, що активація p70S6 кінази in vivo зумов
лена фосфорилюванням залишків Ser і Thr, які
згруповані в три кластери. Перший кластер охоп
лює Ser434, Ser441, Thr444, Ser447 і Ser452, які
локалізовані в псевдосубстратному аутоінгібіторно-
му домені [4, 20—22]. Показано, що фосфорилю-
вання залишків Ser і Thr у цьому кластері є
першим етапом у процесі активації p70S6 кінази.
Експерименти in vitro свідчать про те, що кінази,
які активуються мітогенами (Erkl та Erk2), Cdc2,
та кінази, що активуються за участю стресових
факторів, р38, здатні фосфорилювати S6 кіназу в
цьому кластері. Другий кластер містить Ser394 і
Thr412, які знаходяться в районі, що з'єднує між
собою каталітичний домен і С-кінцеву область [18,
19]. Фосфорилювання цих амінокислотних залиш
ків призводить до конформаційних змін у структурі
кінази, які відкривають третій регуляторний кла
стер і спричиняють часткову активацію кінази.
Третій кластер включає Thr252, який локалізу
ється в активуючій петлі кіназного домену, і його
фосфорилювання обумовлює повну активацію кіна
зи. Цікаво, що делеція С-кінцевої області не впли
ває суттєвим чином на здатність вкороченого му
танту р70АСТ104, стабільно експресованого в клі
тинах NIH ЗТЗ, активуватися у відповідь на
сироватку, в той час як заміна залишків Thr252,
Ser394 і Thr412 на Ala зумовлює повну інакти
вацію ферменту [19, 23, 24].
Використання імуносупресора рапаміцину,
який безпосередньо пригнічує TOR кіназу (відому
ще як RAFT чи FRAP), та специфічних інгібіторів
РІЗ'-кінази (вортманіну і LY294002) дозволило
ідентифікувати сигнальні шляхи, причетні до акти
вації p70S6 кінази, і показати, що вони не зале
жать від індукції мітогенного сигналу через МАРК
сигнальний шлях [25—28]. Дослідження останніх
років вказують на те, що РІЗ'-кіназний шлях
активації p70S6 кінази використовує PDK1 як ни
жче розташований сигнальний ефектор. Відомо, що
PDK1 фосфорилює Thr252 in vivo та in vitro. Це
призводить до часткової активації p70S6 кінази
[29]. За даними Барнет і співавт. [ЗО], другий
критичний залишок Thr412 є специфічним суб
стратом для рапаміцин-чутливої TOR кінази. Про
демонстровано також, що ТРА-індукована акти
вація p70S6 кінази, яка здійснюється за участю
РКС, може блокуватися рапаміцином. Все це вка
зує на участь TOR /FRAP-залежного шляху в
трансдукції сигналу [33 ].
Слід також відзначити, що фосфорилювання
залишків Thr252 і Thr412 є чутливим до дії імуно
супресора рапаміцину, який безпосередньо інакти-
вує mTOR кіназу, та специфічних інгібіторів РІ
З'-кінази [25—28].
Таким чином, згідно з наявними експеримен
тальними даними, повна активація p70S6 кінази є
результатом послідовного фосфорилювання фер
менту за участю множинних, відносно незалежних
Ser/Thr-специфічних протеїнкіназ.
Недавно було клоновано нову форму p70S6
кінази (p70S6K/?), амінокислотна послідовність якої
впродовж каталітичного і аутоінгібіторного доменів
має високий ступінь гомології з уже відомою p70S6
кіназою а [31 ]. Ця форма кінази також представ
лена двома ізоформами: ядерною p70S6K/?l (495
амінокислотних залишків) і цитоплазматичною
p70S6K/?2 (482 амінокислотних залишки). В струк
турі p70^S, як і в р70а, розрізняють N- та С-кінцеві
некаталітичні райони, каталітичний домен, подо
вження каталітичного домену та аутоінгібіторний
домен (рис. 1). Поряд з високою консервативністю
амінокислотних послідовностей р70а і р70/? впро
довж каталітичного (83 % ) , регуляторного (80 %)
і аутоінгібіторного (73 %) доменів, їхні N- та
С-кінцеві послідовності характеризуються відносно
низьким рівнем гомології — 28 і 25 % відповідно
[31 ].
Як вказувалося вище, р70а зазнає множинного
фосфорилювання по трьох кластерах регуляторних
центрів у відповідь на стимуляцію клітин ростови
ми факторами [33]. Ці центри фосфорилювання є
також висококонсервативними в рІОр і представ
лені кластером Ser/Thr-Pro мотивів в аутоінгібі-
торному псевдосубстратному домені (Ser423,
Ser430, Ser436, Ser441 у р70/И, які відповідають
Ser434, Ser441, Ser447 і Ser452 у p70al) [20, 22].
Наступний кластер локалізований в подовженні
каталітичного домену і включає Ser383 і Thr401,
що відповідають Ser394 і Thr412 у p70al [18, 34].
Третій представлений Thr241, що відповідає
Thr252, який розташований в активуючій петлі
p70al [18, 19].
Поряд з гомологією регуляторних центрів фос
форилювання слід відмітити відсутність у р70/3
одного з центрів фосфорилювання, якому в струк-
416
Ф У Н К Ц І О Н А Л Ь Н І ТА Р Е Г У Л Я Т О Р Н І О С О Б Л И В О С Т І КІНАЗИ БІЛКА S6
Пролін-багатий домен
Рис. 1. Порівняльна характеристика а та р ізоформ p70S6 кінази
турі р70а відповідає Thr444. Крім цього, унікаль
ною структурною детермінантою С-кінцевої області
р70/? є наявність Pro-багатого району, який може
бути залучений до взаємодії з сигнальними білка
ми, що містять 8НЗ-домени (Src-гомологічні доме
ни типу 3) [31 ]. Все це дає підстави припустити
існування регуляторних відмінностей в активації
цих двох форм S6 кінази.
Встановлено, що p70S6K/? здатна фосфорилю-
вати S6 білок in vitro. З огляду на ці відомості в
даній роботі було проведено порівняльний аналіз
функціональних і регуляторних особливостей двох
форм p70S6 кінази у відповідь на стимуляцію
клітин сироваткою.
Матеріали і методи. Конструювання плазмід.
Для того щоб клонувати р70а2 і р70/?2 в pcDNA3.1
експресуючий вектор, кДНК послідовності обох
форм модифікували за допомогою полімеразної
ланцюгової реакції, використовуючи наступні
праймери: з 5'-кінця р70а2 (містить центр упі
знавання рестриктазою ВатНІ і безпосередньо за
ініціюючим Met послідовність, що кодує EE-tag
епітоп (MEFMPME)) — GAA ТТС GGA ТСС GCC
АСС ATG GAG ТТС ATG CCG ATG GAG AGG
С AG GAG TGT TTG АСА TAG AC; з З-кінця
p70«2 {EcoRD — CGG GAA ТТС TCA TAG ATT
CAT ACG CAG GTTG; з 5'-кінця p70£2 {ВатНІ,
EE-tag) — AATTCG GATCC GCC ACC ATG GAG
TTC ATG CCG ATG GAG GCG GCC GTG TTT
GAT TTG GAT; з З'-кінця p70£2 {EcoRD — CGG
GAA ТТС СТА GCG CCC TGG ACG CCC ACG.
Наявність EE-tag епітопа в послідовності p70a і /?
дозволяє проводити біохімічний аналіз експресова-
них кіназ, використовуючи специфічні монокло-
нальні антитіла проти даного епітопа.
Ампліфіковані к ДНК клону вал и у вектор
pcDNA3.I по центрах упізнавання ендонуклеазами
рестрикції ВатНІ і EcoRI. Нуклеотидну послідов
ність клонованих фрагментів перевіряли за допомо
гою автоматичного сиквенатора АВІ 377 (Applied
Biosystem).
Культивування і тимчасова трансфекція клі
тин. Клітини лінії НЕК293 (клітини ембріональної
нирки людини) культивували в середовищі DMEM,
що містило 10 % телячої ембріональної сироватки
(«Life Technologies, Іпс», США), 2 мМ L-глутамін
та антибіотики пеніцилін і стрептоміцин. Перед
трансфекцією клітини НЕК293 культивували на
чашках Петрі діаметром 10 см до досягнення 70 %
конфлюенту. Клітини трансфікували плазмідною
ДНК (5 мкг ДНК на чашку) з використанням
ліпофектаміну («Life Technologies, Іпс») згідно з
протоколом компанії. Через 20 год після транс-
фекції клітини переводили на безсироваткове сере
довище і після 24-год голодування стимулювали,
інкубуючи їх у середовищі DMEM з 10 % сироват
ки протягом зазначеного періоду часу. В експери
ментах з використанням рапаміцину клітини інку-
бували в присутності зростаючих концентрацій
цього інгібітора протягом 15 хв перед стимуляцією.
Контрольні клітини інкубували в присутності
0,1 % диметилсульфоксиду, оскільки в ньому був
розчинений рапаміцин.
Отримання клітинних лізатів та імунопре-
417
ВАЛЬОВКА Т. Й. Т А Ш.
ципітація p70S6 кінази. Стимуляцію клітин зупи
няли двохразовим відмиванням ЗФР (забуференим
фізіологічним розчином), охолодженим до 4 °С.
Клітини лізували в буфері лізису, що містив 50 мМ
Hepes, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 % Nonidet Р-40,
2 мМ EDTA, 50 мМ NaF, 10 мМ пірофосфат
натрію, 1 мМ Na 3 V0 4 , 1 мМ PMSF (фенілметил-
сульфонілфторид, «Sigma», США), 3 мМ бензамі-
дин («Sigma»), 50 мкг/мл лейпептину («Boehringer
Mannheim», ФРГ) і 50 мкг/мл апротиніну («Sig-
ma»). Отримані лізати витримували протягом 20 хв
на льодовій бані і центрифугували (25 хв,
12000 об/хв) для осадження детергентнерозчинної
фракції. Супернатант лізатів клітин врівноважу
вали за кількістю загального білка і інкубували з
анти-EE моноклональними антитілами і білок-G-
сефарозою («Рпагтасіа», Швеція) при температурі
4 °С протягом 3 год. Осаджені імунні комплекси
відмивали три рази буфером лізису, що містив
0,5 М NaCl, та двічі — кіназним буфером (40 мМ
Hepes, рН 7,4, 20 мМ MgCl2, 20 мМ ^-гліце
рофосфат, 1 мМ ДТТ). Отримані імунопреципітати
використовували в S6 кіназній реакції.
Визначення p70S6 кіназної активности S6
кіназну активність визначали в імунопреципітатах,
використовуючи як субстрат 80S рибосоми, очи
щені з гомогенату печінки щура [32 J. S6 кіназну
реакцію ініціювали додаванням кіназного буфера,
що містив 20 мкМ [у- 3 2Р] АТР (5 мкКі на пробу)
(«Amersham Pharmacia Biotech», Англія), 20 мкг
білка 80S субчастинок рибосом, 1 мкМ інгібітор
сАМР-залежної протеїнкінази (РКІ, «СаІЬіоспет»,
США). Реакційну суміш інкубували протягом
ЗО хв при 30 °С. Реакцію зупиняли додаванням
5-кратного буфера Леммлі для проб і прогрівали
при 95 °С протягом 5 хв. Продукти реакції розді
ляли електрофорезом у 12,5 %-му поліакриламід-
ному гелі і визначали рівень фосфорилювання S6
білка за допомогою Phosphorlmager (Molecular Dy
namics). S6 кіназну активність виражали в імпхв" 1
3 2 Р , включеного в S6 білок.
Результати та обговорення. Відомо, що а-фор-
ма p70S6 кінази активується при відповіді клітини
на дію мітогенних факторів, зокрема інсуліну,
епідермального фактора росту (EGF) і сироватки
[13]. Показано, що активація р70а, стимульована
агоністами, носить двохфазний характер [35—37 ].
Першій фазі відповідає пік швидкої активації, тоді
як пізня активація є повільною і поступово перехо
дить у плато. Поряд з цим виявлено, що в різних
клітинних лініях час появи швидкого піка акти
вації може варіювати від 10 до 60 хв. Наприклад,
ранній пік активації p70S6 кінази в клітинах гепа-
томи (Hep G2) та ембріональної нирки людини
(НЕК293) припадає на 20—30 хв [30, 38], тоді як
у фібробластах хом'яка (CCL 39) швидка активація
досягає максимуму на 10-ту хв [37 ].
У даній роботі здійснено порівняльний аналіз
динаміки активації р70сг2 і р70^2 форм S6 кінази в
клітинах НЕК293 у відповідь на стимуляцію сиро
ваткою. Для цього клітини НЕК293 трансфікували
рекомбінантним вектором pcDNA3.J, що містив
послідовності р70а2 і р70£2. Після 24-год голоду
вання клітини стимулювали сироваткою протягом
вказаного періоду часу. Експресовані форми S6
кінази імунопреципітували анти-EE-tag монокло
нальними антитілами, а отримані імунні комплекси
використовували в S6 кіназній реакції in vitro.
Отримані нами результати вказують на двохфаз
ний характер активації обох форм S6 кінази (рис.
2). Профіль кривої активації р70а2 добре узгод
жується з опублікованими раніше даними по акти
вації ендогенної p70aS6 кінази. Ранній пік акти
вації р70а2 припадає на 20-ту хв і переходить у
повільну інактивацію. Тривала фаза пізньої акти
вації починається після 60 хв і спостерігається
впродовж наступних 2 год інкубації клітин у сере
довищі з 10 % сироватки.
За даними Венг і співавт. [39], перша фаза
активації-інактивації р70а кінази при стимуляції
CHO-IR клітин інсуліном корелює з фосфорилю-
ванням—дефосфорилюванням залишків Thr412 і
Thr252. На відміну від р70а2 ранній пік активації
р70/?2 спостерігається вже на 10-ту хв і характери
зується стрімким зростанням і наступним спадом.
Нами був виявлений також другий незначний пік
активації р70/? кінази на 60-й хв, який спосте
рігався в трьох незалежних експериментах.
Нами виявлено також, що профіль кривих, які
описують кінетику активації EE-tag р70а і р70£,
експресованих у клітинах НЕК293 у відповідь на
стимуляцію клітин сироваткою, суттєво відрізня
ється (рис. 2). На відміну від р70а, максимум
активності якої припадає на 20-ту хв стимуляції,
активація p7Qft носить більш ранній характер і
максимум кіназної активності спостерігається вже
на 10-ту хв. У випадку р70/? інактивація кінази
відбувається у дві стадії: швидка інактивація на
20-й хв та повільна інактивація після годинної
інкубації в присутності сироватки.
Важливо наголосити, що максимум активності
р70а збігається в часі з першою стадією інактивації
р70/?, що вказує на різний в часовому відношенні
прояв їхньої функціональної активності in vivo.
Очевидно, що виявлені відмінності в кінетиці акти
вації а- і /ї-форм p70S6 кіназ можуть свідчити про
здатність р70/? забезпечувати ранню відповідь клі
тини на мітогенний стимул, у той час як р70а
418
Ф У Н К Ц І О Н А Л Ь Н І Т А Р Е Г У Л Я Т О Р Н І О С О Б Л И В О С Т І КІНАЗИ БІЛКА S 6
Рис. 2. Кінетика активації а- і /?-форм кінази рибосомного білка
S6 в умовах стимуляції клітин сироваткою: я, б — динаміка
зміни рівня фосфорилювання S6 білка, представлена графічно та
радіоавтографами відповідно (а: 1 — p70S6Ka; 2 — p70S6K/5);
в — рівень експресії обох форм кінази, визначений за допомо
гою імуноблотингу з антитілами до EE-tag епітопа. Трансфекцію
клітин лінії НЕК293 здійснювали векторами pcDNA3.1 EE-tag
р70а2 і pcDNA3.1 EE-tag р70р2. S6 кіназну активність ана
лізували, як це описано в розділі «Матеріали і методи»
чутливість обох форм ферменту до інгібітора про
являє протилежну тенденцію. При концентрації
рапаміцину 20 нМ інгібування активності р70а
складає близько 80 %, а р70 — лише 64 %. Ця
різниця стає ще вираженішою при збільшенні кон
центрації рапаміцину до 200 нМ (інгібування р70а
становить 96,4 %, а р70£ — 72 % ) .
Таким чином, нами встановлено, що пригні
чення активності а2- і /?2-форм p70S6 кінази зале
жить від концентрації рапаміцину в культураль-
ному середовищі і ця залежність є різною для
досліджених форм ферменту. Активність р70/?2
ефективніше пригнічується низькими концентра
ціями рапаміцину, що не властиво для р70а2,
однак при вищих концентраціях /?-форма є менш
чутливою до його впливу в порівнянні з а-формою.
Виявлені відмінності щодо чутливості обох
форм p70S6 кінази до інгібуючого впливу рапа
міцину можуть бути пов'язані зі специфікою їхньої
активації через TOR /FRAP-залежний сигнальний
шлях. Відсутність одного з рапаміцинчутливих ре-
здійснює більш пізню регуляцію стану фосфорилю
вання S6 білка і, не виключено, процесу біосинтезу
білка в цілому.
Відомо, що p70S6 кіназа є чутливою до дії
імуносупресора рапаміцину [11—13]. Нами було
досліджено вплив різних концентрацій рапаміцину
на ступінь пригнічення кіназної активності цито
плазматичних сг2- і /?2-форм p70S6 кінази. Як
видно з рис 3 і 4, рапаміцин у концентрації 2 нМ
пригнічує активність р70/?2 на 55 % у порівнянні з
контролем, тоді як зазначена концентрація інгі
бітора суттєво не впливає на активність р70а2.
Однак при збільшенні концентрації рапаміцину
Рис 3. Вплив різних концентрацій рапаміцину на активність
«-форми кінази рибосомного S6 білка: а — без стимуляції сиро
ваткою (/); з додаванням 10 % сироватки (2); інкубація
протягом 15 хв з рапаміцином в концентрації 2 (3), 20 (4) І
200 нМ (5); б — радіоавтографічно представлене фосфорилю
вання S6 білка; в — визначення рівня експресії «-форми S6
кінази за допомогою імуноблотингу з антитілами до EE-tag
епітопа. S6 кіназну активність аналізували, як це описано в
розділі «Матеріали і методи. Трансфекцію клітин лінії HEK293
здійснювали вектором pcDNA3.1 EE-tag p70S6a2
419
ВАЛЬОВКА Т. Й. ТА ІН.
Ю5
Рис. 4. Вплив різних концентрацій рапаміцину на активність
/3-форми кінази рибосомного S6 білка: а — без стимуляції сиро
ваткою (7); з додаванням 10 % сироватки (2); інкубація
протягом 15 хв з рапаміцином в концентрації 2 (І), 20 (4) і
200 нМ (5); б — радіоавтографічно представлене фосфорилю-
вання S6 білка; в — визначення рівня експресії а-форми S6
кінази за допомогою імуноблотингу з антитілами до EE-tag
епітопа. S6 кіназну активність аналізували, як це описано в
розділі «Матеріали і методи». Трансфекцію клітин лінії НЕК293
здійснювали вектором pcDNA3.J EE-tag p70S6£2
гуляторних центрів у структурі рІОр (аналог
Thr444 у р70а) може бути вірогідним поясненням
цих відмінностей.
У майбутньому було б важливо дослідити
вплив заміни Val433 -» Thr на чутливість мутанту
р70^ до рапаміцину та вортманіну.
Т. И. Вальовка, В. В. Филоненко, С. С. Лальчевский, М. М.
Великий, Л. Б. Дробот, М. Вотерфилд, Г. X. Маиука, И. Т. Гущ
Функциональные и регуляторные особенности киназы
рибосомного белка S6 типа f$
Резюме
Недавно клонирована новая форма киназы рибосомного белка
S6, названная p70S6 киназа ft, аминокислотная последова
тельность которой имеет высокую степень гомологии с
известной p70S6 киназой а. В работе представлены результа
ты сравнительного анализа кинетики активации сывороткой
а2- и 02-форм S6 киназы, экспрессированных в клетках
НЕК293. Установленные отличия указывают на разное в
часовом отношении проявление их функциональной активно
сти in vivo. Инкубация трансфицированных клеток с иммуно-
супрессором рапамицином угнетает индуцированную сыворот
кой активацию как р70а2, так и р70р2 киназ. Угнетение p70f$2
происходит при низких концентрациях рапамицина. Одновре
менно /32-форма киназы менее чувствительна к высоким
концентрациям ингибитора по сравнению с р70а2. Полученные
данные дают основание предположить существование диффе
ренциальных механизмов модуляции сигнальных путей, кото
рые опосредуют активацию а- и fi-форм S6 киназы.
Т. Valovka, V. Fiionenko, S. Palchevsky, M. Velikiy, L. Drobot,
M. Waterfield, G. Matsuka, I. Gout
Functional and regulatory properties of p70S6 kinase p
Summary
A novel ribosomal S6 kinase, termed p70S6 kinase p, has been
recently identified. It is highly homologous to known p70/p85 S6
kinase (p70S6 kinase a) in catalytic, kinase extension and auto-
inhibitory domains, but differs significantly in the regulatory N- and
С-terminal regions. Here we report the kinetics of serum-induced
activation of cytoplasmic isoforms of p70S6 kinase a and p (p70a2
and p70p2) in transiently transfected HEK293. Both kinases exhibit
biphasic activation upon serum stimulation, but differ in the
appearance of peaks of their S6 specific activity. We also found that
p70a2 and p70fi2f when overexpressed in HEK293 cells, are
sensitive to the immunosuppressant rapamycin. However, p70fl2
kinase is more sensitive to low concentrations of rapamycin, when
compared with p70a2. At the same time, high concentrations of
rapamycin are inhibitory to a higher extent towards p70a2, than
p70$2 kinase. Taken together, our results indicate that p70@2 kinase
is activated earlier in response to serum and is less sensitive to high
concentration of rapamycin, in comparison to p70a2. These diffe
rences indicate the existence of alternative signalling mechanisms,
involved in the regulation of p70fi2 kinase.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
l.Morley S. J., Thomas G. Intracellular messengers and the
control of protein synthesis / / Pharmacol. Ther.—1991.—50,
N 6.—P. 291—319.
2. Martin-Perez J., Thomas G. Ordered phosphorylation of 40S
ribosomal protein S6 after serum stimulation of quiescent 3T3
cells / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1983.—80, N 4.—
P. 926—930.
3. Chung J., Kuo C. J., Crabtree G. R., Blenis J. Rapamycin-
FKBP specifically blocks growth-dependent activation of and
signaling by the 70 kDa S6 protein kinases / / Cell.—1992.—
69, N 7.—P. 1227—1236.
4. Banerjee P., Ahmad Af. F., Grove J. R., Kozlosky C, Price D.
J., Avruch J. Molecular structure of a major insulin/mitogen-
activated 70 kDa S6 protein kinase / / Proc. Nat. Acad. Sci.
USA.—1990.—87, N 21.—P. 8550—8554.
5. Kozma S. C , Ferrari S., Bassand P., Siegmann Nf., Totty N.,
Thomas G. Cloning of the mitogen-activated S6 kinase from rat
liver reveals an enzyme of the second messenger subfamily / /
Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1990.—87, N 9.—P. 7365—
7369.
6. Palen E.t Trough J. A. Phosphorylation of ribosomal protein
S6 bycAMP-dependent protein kinase and mitogen-stimulated
S6 kinasedifferentially alters translation of globin mRNA / / J .
Biol. Chem.—1987.—262, N 8.—P. 3518—3523.
7. Jefferies H. B. J., Fumagalli S., Dennis P. В., Reinhard C,
Pearson R. В., Thomas G. Rapamycin suppresses 5' TOP
mRNA translation through inhibition of p70S6K / / EMBO
J.—1997.—16, N 12.—P. 3693—3704.
8. Terada N., Patel H. R., Takase K., Kohno 1С, Nairn A. C,
420
Gelfond E. W. Rapamycin selectively inhibits translation of
mRNA encoding elongation factors and ribosomal proteins / /
Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1994.—91, N 24.—P. 11477—
11481.
9. Nasmyth К Retinoblastoma protein. Another role rolls in / /
Nature.—1996.—382, N 6586.—P. 28—29.
10. Lane H. A., Fernandez A., Lamb N. / . C , Thomas G. p 7 0 S 6 K
function is essential for Gl progression / / Nature.—1993.—
363, N 6425.—P. 170—172.
11. Price D. J.t Grove J. R., Calvo V., Avruch J., Bierer В. E.
Rapamycin-induced inhibition of the 70-kilodalton S6 protein
kinase / / Science.—1992.—257, N 5072.—P. 973—977.
12. Ferrari S., Pearson R. В., Silgmann M.t Kozma S. C ,
Thomas G. The immunosuppressant rapamycin induced inac-
tivation of p70 S 6 K through dephosphorylation of a novel set of
sites / / J. Biol. Chem.—1993.—268, N 22.—P. 16091 —
16094.
13. Спои M. M.y Blenis J. The 70 kDa S6 kinase: regulation of a
kinase with multiple roles in mitogenic signaling / / Curr. Opin.
Cell. Biol.—1995.-7, N 6.—P. 806—914.
14. Kanda S.f Hodgkin M. N., Woodfield R. J., Wakelam J. O.,
Thomas G, Cleasson-Welsh L Phosphatidylinositol 3'-kinase-
indcpendent p70 S6 kinase activation by fibroblast growth
factor receptor-1 is important for proliferation but not differen
tiation of endothelial cells / / J. Biol. Chem.—1997.—272, N
37.—P. 23347—23353.
15. Grove J. R., Banerjee P., Balasubramanyam A., Coffer P. J.,
Price D. J., Avruch J., Woodgett J. R. Cloning and expression
of two human p70 S6 kinase polypeptides differing only at their
amino termini / / Мої. Cell. Biol—1991—11, N 11.—
P. 5541—5550.
16. Reinhard C., Fernandez A., Lamb N. J., Thomas G. Nuclear
localization of p85 S 6 K : functional requirement for entry into S6
phase / / EMBO J.—1994.—13, N 7.—P. 1557—1565.
17. Coffer P. J., Woodgett J. R. Differential subcellular localization
of two isoforms of p70 S6 protein kinase / / Biochem. and
Biophys. Res. Communs.—1994.—198, N 2.—P. 780—786.
18. Han J.-W., Pearson R. В., Dennis P. В., Thomas G.
Rapamycin, wortmannin, and the methylxanthine SQ20006
inactivate by inducing dephosphorylation of the same
subset of sites / / J. Biol. Chem.—1995.—270, N 36.—P.
21396—21403.
19. Pearson R. В., Dennis P. В., Han J.-W., Williamson N. A ,
Kozma S. C , Wettenhall R. E. H.t Thomas G. The principal
target of rapamycin-induced p70S6K inactivation is a novel
phosphorylation site within a conserved hydrophobic domain / /
EMBO J.—1995 —21, N 21.—P. 5279—5287.
20. Price D. J., Mukhopadhyay N. K, Avruch J. Insulin-activated
protein kinases phosphorylate a peptide inhibitor of the p70 S6
kinase / / J. Biol. Chem.—1991.—266, N 25.—P. 16281 —
16284.
21. Mukhopadhyay N. /С, Price D. J., Kyriakis J. M., Pelech S.,
Sanghera J., Avruch J. An array of insulin-activated, proline-
directed serine/threonine protein kinases phosphorylate the
p70 S6 kinase / / J. Biol. Chem.—1992.—267, N 5.—
P. 3325—3335.
22. Ferrari S., Bannwarth W., Morley S. J., Totty N. F.f Thomas
G. Activation of p 7 0 S 6 K is associated with phosphorylation of
four clustered sites displaying Ser/Thr-Pro motifs / / Proc. Nat.
Acad. Sci. USA.—1992.—89, N 15.—P. 7282—7286.
23. Weng Q.P., Andrabi K, Klippel A., Kozlowski M. Т.,
Williams L Т., Avruch J. Phosphatidylinositol 3'-kinase
signals activation of p70 S6 kinase in situ through site-specific
p70 phosphorylation / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1995 —
92, N 1 2 . - P . 5744-5748.
Ф У Н К Ц І О Н А Л Ь Н І ТА Р Е Г У Л Я Т О Р Н І О С О Б Л И В О С Т І КІНАЗИ БІЛКА S6
24. Sugiyama Я., Papst P., Gelfand Е. W., Terada N. p70 S6
kinase sensitivity to rapamycin is eliminated by amino acid
substitution of Thr 229 / / J. Immunol—1996.—157, N 2,—
P. 656—660.
25. Blenis J. Signal trunsduction via the MAP kinases: proceed at
your own RSK / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1993.—90, N
13.—P. 5889—5892.
26. Grews С. M., Erikson R. L Extracellular signals and reversible
protein phosphorylation: what to MEK of it all / / Cell.—
1993.—74, N 2.—P. 215—217.
27. Davis R. J. The mitogen-activated protein kinase signal trans
duction pathway / / J. Biol. Chem.—1993.—268, N 20.—
P. 14553—14556.
28. Marshall C. J. MAP kinase kinase kinase, MAP kinase kinase
and MAP kinase / / Curr. Opin. Gen. Dev.—1994—4,
N 1.—P. 82—89.
29. Alessi D. R., Kozlowski M. Т., Weng Q.-P, Morrice N.,
Avruch J. 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase 1
(PDK1) phosphorylates and activates the p70 S6 kinase in vivo
and in vitro II Curr. Biol—1997 —8, N 2.—P. 69—81.
30. Burnett P. E., Barrow R. K, Cohen N. A., Snyder S. #.,
Sabatini D. M. RAFT phosphorylation of the translational
regulators p70 S6 kinase and 4E-BP1 / / Proc. Nat. Acad. Sci.
USA.—1998.—95, N 4.—P. 1432—1437.
31. Gout /., Minami Т., Нага К, Tsujishita Y, Filonenko V.,
Waterfield M. D., Yonezawa K. Molecular cloning and charac
terization of a novel p70 S6 kinase, p70 S6 kinase ft containing
a proline-rich region / / J. Biol. Chem.—1998.—273.—
P. 30061—30064.
32. Thomas G., Gordon RoggH. N'-Acetylcytidine a previously
unidentified labile component of the small subunit of eukaryotic
ribosomes / / J. Biol. Chem.—1978.—253.—P. 1101 — 1105.
33. Pullen N., Thomas G. The modular phosphorylation and
activation of p70S6K / / FEBS Lett.—1997 —410, N 1 —
P. 78—82.
34. Moser B. A., Dennis P. В., Pullen N., Pearson R. В.,
Williamson N. A., Wettenhall R. E., Kozma S. C. Thomas G
Dual requirement for a newly identified phosphorylation site in
p 7 0 S 6 K f / M o l С е И Ш о 1 _ 1 9 9 7 _ i 7 N 9 _ p 5648—5655.
35. Susa M., Olivier A. R., Fabbro D., Thomas G. EGF induces
biphasic S6 kinase activation: late phase is protein kinase
C-dependent and contributes to mitogenicity / / Cell—1989.—
57, N 5.—P. 817—824.
36. Susa M., Vulevic D., Lane H. A., Thomas G. Inhibition or
down-regulation of protein kinase С attenuates late phase
p70S6K activation induced by epidermal growth factor but not
by platelet-derived growth factor or insulin / / J . Biol. Chem.—
1992.—267, N 10—P. 6905—6909.
37. Kahan C , Seuwen K, Meloshe S., Pouyssegur J. Coordinate
biphasic activation of p44 mitogen-activated protein kinase and
S6 kinase by growth factors in hamster fibroblast. Evidence for
thrombin-induced signals different from phosphoinositide turn
over and adenylylcyclase inhibition / / J. Biol. Chem.—
1992.—267, N 19.—P. 13369—13375.
38. Chung J., Grammer Т. C, Lemon К P.y Kazlanskas A.,
Blenis J. PDGF- and insulin-dependent pp70S6 activation
mediated by phosphatidylinositol-3-OH kinase / / Nature.—
1994.—370, N 6484.—P 71—75.
39. Weng Q.-P., Kozlowski M., Belham C, Zhang A., Comb M.
J., Avruch J. Regulation of the p70 S6 kinase by phosphoryla
tion in vivo II J. Biol. Chem.—1998.—273, N 26.—
P. 16621 — 16629.
УДК 577.218
Надійшла до редакції 10.05.99
421
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156802 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T13:19:41Z |
| publishDate | 1999 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Вальовка, Т.Й. Філоненко, В.В. Пальчевський, С.С. Великий, М.М. Дробот, Л.Б. Вотерфілд, М. Мацука, Г.Х. Гут, І.Т. 2019-06-19T06:07:46Z 2019-06-19T06:07:46Z 1999 Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β / Т.Й. Вальовка, В.В. Філоненко, С.С. Пальчевський, М.М. Великий, Л.Б. Дробот, М. Вотерфілд, Г.X. Мацука, I. Т. Гут // Биополимеры и клетк а. — 1999. — Т. 15, № 5. — С. 415-421. — Бібліогр.: 39 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000539 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156802 577.218 Нещодавно клоновано нову форму кінази рибосомного білка S6, названу p70Sb кіназа β, амінокислотна послідовність якої має високий ступінь гомології з відомою p70S6 кіназою α. В роботі представлено результати порівняльного аналізу кінетики активації сироваткою α2- і β2-форм S6 кінази, експресованих у клітинах НЕК293. Виявлені відмінності вказують на різний в часовому відношенні прояв їхньої функціональної активності in vivo. Інкубація трансфікованих клітин з імуносупресором рапаміцшюм пригнічує індуковану сироваткою активацію як р70α2, так і p70β2 кіназ. Пригнічення р70β2 відбувається за низьких концентрацій рапаміцину. Одночасно β2-форма кінази є менш чутливою до високих концентрацій інгібітора у порівнянні з р70α2. Отримані дані дозволяють припустити існування диференційних механізмів модуляції сигнальних шляхів, що опосередковують активацію α- і β-форм S6 кінази. Недавно клонирована новая форма киназы рибосомного белка S6, названная p70S6 киназа β, аминокислотная последовательность которой имеет высокую степень гомологии с известной p70S6 киназой а. В работе представлены результаты сравнительного анализа кинетики активации сывороткой α2- и β2-форм S6 киназы, экспрессированных в клетках НЕК293. Установленные отличия указывают на разное в часовом отношении проявление их функциональной активности in vivo. Инкубация трансфицированных клеток с иммуносупрессором рапамицином угнетает индуцированную сывороткой активацию как р70α2, так и р70β2 киназ. Угнетение p70β2 происходит при низких концентрациях рапамицина. Одновременно β2-форма киназы менее чувствительна к высоким концентрациям ингибитора по сравнению с р70α2. Полученные данные дают основание предположить существование дифференциальных механизмов модуляции сигнальных путей, которые опосредуют активацию α- и β-форм S6 киназы. A novel ribosomal S6 kinase, termed p70S6 kinase β, has been recently identified. It is highly homologous to known p70/p85 S6 kinase (p70S6 kinase α) in catalytic, kinase extension and auto-inhibitory domains, but differs significantly in the regulatory N- and C-terminal regions. Here we report the kinetics of serum-induced activation of cytoplasmic isoforms of p70S6 kinase α and β (p70α2 and p70β2) in transiently transfected HEK293. Both kinases exhibit biphasic activation upon serum stimulation, but differ in the appearance of peaks of their S6 specific activity. We also found that p70α2 and p70β2, when overexpressed in HEK293 cells, are sensitive to the immunosuppressant rapamycin. However, p70β2 kinase is more sensitive to low concentrations of rapamycin, when compared with p70α2. At the same time, high concentrations of rapamycin are inhibitory to a higher extent towards p70α2, than p70β2 kinase. Taken together, our results indicate that p70α2 kinase is activated earlier in response to serum and is less sensitive to high concentration of rapamycin, in comparison to p70α2. These differences indicate the existence of alternative signalling mechanisms, involved in the regulation of p70β2 kinase. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β Функциональные и регуляторные особенности киназы рибосомного белка S6 типа β Functional and regulatory properties of p70S6 kinase β Article published earlier |
| spellingShingle | Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β Вальовка, Т.Й. Філоненко, В.В. Пальчевський, С.С. Великий, М.М. Дробот, Л.Б. Вотерфілд, М. Мацука, Г.Х. Гут, І.Т. Структура и функции биополимеров |
| title | Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β |
| title_alt | Функциональные и регуляторные особенности киназы рибосомного белка S6 типа β Functional and regulatory properties of p70S6 kinase β |
| title_full | Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β |
| title_fullStr | Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β |
| title_full_unstemmed | Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β |
| title_short | Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу β |
| title_sort | функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка s6 типу β |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156802 |
| work_keys_str_mv | AT valʹovkati funkcíonalʹnítaregulâtorníosoblivostíkínaziribosomnogobílkas6tipuβ AT fílonenkovv funkcíonalʹnítaregulâtorníosoblivostíkínaziribosomnogobílkas6tipuβ AT palʹčevsʹkiiss funkcíonalʹnítaregulâtorníosoblivostíkínaziribosomnogobílkas6tipuβ AT velikiimm funkcíonalʹnítaregulâtorníosoblivostíkínaziribosomnogobílkas6tipuβ AT drobotlb funkcíonalʹnítaregulâtorníosoblivostíkínaziribosomnogobílkas6tipuβ AT voterfíldm funkcíonalʹnítaregulâtorníosoblivostíkínaziribosomnogobílkas6tipuβ AT macukagh funkcíonalʹnítaregulâtorníosoblivostíkínaziribosomnogobílkas6tipuβ AT gutít funkcíonalʹnítaregulâtorníosoblivostíkínaziribosomnogobílkas6tipuβ AT valʹovkati funkcionalʹnyeiregulâtornyeosobennostikinazyribosomnogobelkas6tipaβ AT fílonenkovv funkcionalʹnyeiregulâtornyeosobennostikinazyribosomnogobelkas6tipaβ AT palʹčevsʹkiiss funkcionalʹnyeiregulâtornyeosobennostikinazyribosomnogobelkas6tipaβ AT velikiimm funkcionalʹnyeiregulâtornyeosobennostikinazyribosomnogobelkas6tipaβ AT drobotlb funkcionalʹnyeiregulâtornyeosobennostikinazyribosomnogobelkas6tipaβ AT voterfíldm funkcionalʹnyeiregulâtornyeosobennostikinazyribosomnogobelkas6tipaβ AT macukagh funkcionalʹnyeiregulâtornyeosobennostikinazyribosomnogobelkas6tipaβ AT gutít funkcionalʹnyeiregulâtornyeosobennostikinazyribosomnogobelkas6tipaβ AT valʹovkati functionalandregulatorypropertiesofp70s6kinaseβ AT fílonenkovv functionalandregulatorypropertiesofp70s6kinaseβ AT palʹčevsʹkiiss functionalandregulatorypropertiesofp70s6kinaseβ AT velikiimm functionalandregulatorypropertiesofp70s6kinaseβ AT drobotlb functionalandregulatorypropertiesofp70s6kinaseβ AT voterfíldm functionalandregulatorypropertiesofp70s6kinaseβ AT macukagh functionalandregulatorypropertiesofp70s6kinaseβ AT gutít functionalandregulatorypropertiesofp70s6kinaseβ |