Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi

Микрофлюориметрическим методом определяли топологическое состояние ДНК в изолированных политенных хромосомах хирономуса С. thummi, находящихся на стадии активной транскрипции. Показано, что 15 % всей ДНК хромосом, доступной интеркаляции бромистого этидия, находится в торсионно напряженном состоянии...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Published in:	Биополимеры и клетка
Date:	1999
Main Authors:	Кузин, Ф.Э., Шилова, И.Э., Бугреев, Д.Б., Невинский, Г.А., Груздев, А.Д.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1999
Subjects:	Геном и его регуляция
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156813
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi / Ф.Э. Кузин, И.Э. Шилова, Д.В. Бугреев, Г.А. Невинский, А.Д. Груздев // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 510-515. — Бібліогр.: 29 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1860251606226829312
author	Кузин, Ф.Э. Шилова, И.Э. Бугреев, Д.Б. Невинский, Г.А. Груздев, А.Д.
author_facet	Кузин, Ф.Э. Шилова, И.Э. Бугреев, Д.Б. Невинский, Г.А. Груздев, А.Д.
citation_txt	Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi / Ф.Э. Кузин, И.Э. Шилова, Д.В. Бугреев, Г.А. Невинский, А.Д. Груздев // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 510-515. — Бібліогр.: 29 назв. — рос.
collection	DSpace DC
container_title	Биополимеры и клетка
description	Микрофлюориметрическим методом определяли топологическое состояние ДНК в изолированных политенных хромосомах хирономуса С. thummi, находящихся на стадии активной транскрипции. Показано, что 15 % всей ДНК хромосом, доступной интеркаляции бромистого этидия, находится в торсионно напряженном состоянии. Численное значение обнаруженного напряжения, выраженное в относительной разности скручивания напряженной молекулы ДНК по отношению к ее релаксированной форме, равно –0,1. Показано также, что домены торсионно напряженной ДНК содержат транскрибируемые последовательности. Торсионно напряженная ДНК недоступна релаксирующему действию эндогенных топоизомераз, но теряет напряжение при добавлении экзогенной топоизомеразы I. Мікрофлюориметричним методом визначено топологічний стан ДНК в ізольованих політенних хромосомах хірономусу С. thummi, які знаходяться на стадії активної транскрипції. Показано, що 15 % усієї ДНК хромосом, яка доступна інтеркаляції бромистого етидію, знаходиться у торсійна напруженому стані. Числове значення виявленої напруги, виражене у відносній різниці скручення напруженої молекули ДПК по відношенню до її релаксованої форми, дорівнює –0,1. Показано також, що домени торсійно напруженої ДИК містять послідовності, що транскрибуються. Торсійно напружена ДНК є недоступною релаксуючій дії ендогенних топоізомераз, але напруга зникає при додаванні екзогенної топоізомерази І. Topological state of DNA in isolated polytene chromosomes of Chironomus thummi at the stage of the highest transcription activity has been determined by microfluorometrical method. About 15 % of chromosomal DNA stained with EtBr have been found to be under torsional stress. The value of the stress expressed as the relative twist difference is –0.1. It has been shown that domains of the stressed DNA contain transcriptionally active genes. Torsionully stressed DNA relaxes after addition of endogeneoits topoisomerase I.
first_indexed	2025-12-07T18:44:05Z
format	Article
fulltext	I S S N 0 2 3 3 - 7 6 5 7 . Б и о п о л и м е р ы и к л е т к а . 1 9 9 9 . Т . 1 5 . № 6 ГЕНОМ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi Ф. Э. Кузин, И. Э. Шилова, Д. В. Бугреев 1, Г. А. Невинский 1 , А. Д. Груздев И н с т и т у т ц и т о л о г и и и г е н е т и к и С и б и р с к о г о о т д е л е н и я Р А Н П р . А к а д е м и к а Л а в р е н т ь е в а , 1 0 , 6 3 0 0 9 0 , Н о в о с и б и р с к , Р о с с и я * Н о в о с и б и р с к и й и н с т и т у т б и о о р г а н и ч е с к о й х и м и и С и б и р с к о г о О т д е л е н и я Р А Н Н о в о с и б и р с к , 6 3 0 0 9 0 , Р о с с и я Микрофлюориметрическим методом определяли топологическое состояние ДНК в изолированных политенных хромосомах хирономуса С. thummi, находящихся на стадии активной транскрипции. Показано, что 15 % всей ДНК хромосом, доступной интеркаляции бромистого этидия, находит ся в торсионно напряженном состоянии. Численное значение обнаруженного напряжения, выражен ное в относительной разности скручивания напряженной молекулы ДНК по отношению к ее релаксированной форме, равно -0,1. Показано также, что домены торсионно напряженной ДНК содержат транскрибируемые последовательности. Торсионно напряженная ДНК недоступна ре- лаксирующему действию эндогенных топоизомераз, но теряет напряжение при добавлении экзогенной топоизомеразы I. Введение. На одном из уровней упаковки ДНК в хроматине происходит ее разделение на петлевые домены. Домены механически независимы друг от друга, и ДНК в них являются топологически замк нутыми [1 ]. Локальное перекручивание или недок ручивание двойной спирали замкнутой ДНК созда ет в ней сверхспиральность, распространяющуюся в виде торсионного напряжения по всему домену. Многие процессы, в которые вовлечена ДНК, при водят к локальным изменениям ее вторичной структуры. Верно и обратное — изменения вторич ной структуры ДНК могут влиять на ДНК-зависи мые процессы. Например, увеличение отрицатель ных торсионных напряжений ДНК при инициации транскрипции у прокариот заметно облегчает обра зование открытого комплекса ДНК с РНК-полиме- разой [2]. Подобная зависимость ожидается и при связывании с ДНК эукариотических РНК-полиме- раз [3 ], что подтверждается исследованием эукари отических генов в модельных системах [4]. Методы, используемые для изучения топологи ческого состояния ядерной ДНК, обычно основаны на повышенной способности некоторых красителей © Ф . Э. К У З И Н , И. '.). Ш И Л О В А , Д . В. Б У Г Р Е Е В , Г. А. Н Б В И Н С К . И Й . А. Д . Г Р У З Д Е В , 1999 интеркалировать в недокрученную спираль ДНК. Отрицательные торсионные напряжения проявля ются в уменьшении плотности посадки интеркаля- тора после релаксации ДНК. Часто в качестве интеркалятора используют триметилпсорален, ко торый способен проникать в живые клетки. Для релаксации ДНК используются различные никую- щие агенты. Последующий анализ количества свя занного псоралена с нативной и никованной ДНК дает возможность судить о существующих торсион ных напряжениях. В работах [5—7 ], где исследова ли отдельные транскрипционно активные гены in vivo, показали наличие в их ДНК значительных торсионных напряжений. Заметим, что авторы этих работ стремились получить «мгновенный» снимок топологического состояния исследуемой ДНК. При этом было невозможно отличить дина мичное состояние, при котором происходят непре рывная генерация напряжения, например РНК- полимеразой [8 ], и одновременно релаксация ДНК топоизомеразами, от стабильно напряженного со стояния ДНК. Существует мнение [9], что в ДНК эукариотических ядер нет длительно существую щих несдерживаемых торсионных напряжений. За метим также, что торсионно напряженная ДНК не была обнаружена при исследовании интерфазных 510 ядер [10]. Этот результат можно объяснить как особенностями применяемых методов, так и малым количеством напряженной ДНК в ядрах. Для доказательства существования стабильно торсионно напряженной ДНК в интерфазных ядрах в настоящей работе использовали изолированные политенные- хромосомы хирономуса. Из соотноше ния числа активных пуфов (336) и неактивных дисков (1500) в политенных хромосомах [11] не трудно оценить, что напряженная ДНК в них составляет заметную часть (около 20 %) всей ядерной ДНК. Это позволяет надеяться на ее обна ружение используемым нами микрофлюориметри ческим методом [12]. Кроме того, в изолированных политенных хромосомах не сохраняется исходного стационарного состояния генерации и релаксации напряжения. Иными словами, «мотор» (или «мото ры»), продуцирующий торсионное напряжение (РНК-полимераза, геликазы или предполагаемые гиразы), останавливается из-за уменьшения пула нуклеозидтрифосфатов. Наконец, использование двух релаксирующих ДНК ферментов — ДНКазы I и топоизомеразы I — позволяет сделать некоторые выводы о механизме поддержания напряжения в активно транскрибируемой ДНК. Материалы и методы. В работе использовали личинки 5-й фазы четвертого личиночного возра ста хирономуса С. thummil, характеризующиеся максимальным уровнем транскрипции ДНК в слюнных железах 113). Маркерами при отборе животных служили гениталии 9-го брюшного сег мента личинки [14]. Измерения производили на выделенных вручную политенных хромосомах с микрургически удаленным ядрышком. Часть изме рений была выполнена на политенных ядрах. Для выделения ядер слюнные железы личинок выдер живали в течение 40 мин на холоду в 1 %-м растворе сапонина («Мегск», ФРГ) и пипетировали пипеткой с диаметром кончика около 100 мкм. При выделении ядер использовали раствор Роберта [151, содержащий 87 мМ NaCl, 3,2 мМ КС1, 1 мМ MgCl2 и 10 мМ трис-малеат, рН 6,3, при выделении хромосом — аналогичный раствор, но забуферен- ный 10 мМ трис-малеатом до рН 7,3. Дальнейшее окрашивание хромосом и ядер бромистым этидием (БЭ, «Serva», ФРГ) и их обработку ДНК-релакси- рующими ферментами проводили в последнем рас творе. Используемый нами метод [12] основан на свойстве БЭ вводить положительные сверхвитки ДНК при его интеркаляции в топологически замк нутую молекулу. Константа связывания БЭ с не- докрученной ДНК больше, чем с релаксированной или перекрученной. Поэтому релаксация ДНК ка- ТОРС И О Н Н О Е Н А П Р Я Ж Е Н И Е В ДНК П О Л И Т Е Н Н Ы Х Х Р О М О С О М С Г HUM Ml как ким-либо агентом (мы использовали два фермен- ллым та — эукариотическую топоизомеразу I и ДНКазу I) приводит к изменению интенсивности флюорес- [льно ценции хромосом при всех концентрациях БЭ, щрах кроме той, при которой имевшаяся в ДНК отрица- нные тельная сверхспирализация компенсирована интер- оше- каляцией красителя. В работе измеряли величину вных относительной разности интенсивности AI/I флюо- ] не- ресценции хромосом до и после действия фермен- них тов при нескольких концентрациях красителя и всей находили ту концентрацию С„, при которой АУ// = эбна- = 0. Затем вычисляли соответствующую плотность гтри- посадки г0 красителя на ДНК, что давало возмож- нных ность определить искомую величину плотности щого сверхвитков. ации Отметим, что термин «плотность сверхвитков» лото- был введен для описания топологически замкнутой ;ение ДНК в растворе [16], когда торсионное напряже- емые ние приводит к изменению как скрученности ДНК пула (7V), так и положения ее оси в пространстве {Wr). іание Однако динамичное образование «сверхвитков» азы I ДНК в хроматине и хромосомах не всегда возмож- орые но. Если же учесть, что связывание интеркалятора [ия в определяется вторичной структурой ДНК, т. е. периодом ее двойной спирали, то более корректно шали использовать термин «относительная разность озра- скрученности» (ОРС = ATw/Tw) напряженной мо- д̂ иеся лекулы ДНК по отношению к ее релаксированной [К в форме. гборе В типичном опыте выделенные ядра или хро- 1 сег- мосомы помещали на дно камеры с раствором БЭ. и на Измерения проводили на группах по 4—5 ядер или а х с соответствующем количестве хромосом. Конструк- 4зме- ция камеры позволяла производить смену раство- Для ров, что обеспечивало неизменность концентрации ядер- красителя в течение опыта. В работе использовали %-м микрофлюориметры собственной конструкции [12 \| >вали и микрофлюориметр МСФ-2 (Пушино, Россия). При Флюоресценцию препарата возбуждали светом га- зерта логенной лампы (9 В, 100 Вт), пропущенным через 1 мМ интерференционный фильтр (480 нм). Интенсив- іении ность флюоресценции измеряли при 620 нм и ерен- непрерывно записывали самописцем. После дости- йшее жения плато интенсивности флюоресценции при [дием окрашивании хромосом в камеру добавляли фер- акси- менты. Затем находили изменение флюоресцен- [ рас- ции, обусловленное их действием, и вычисляли величину AI/L Конечная активность ДНК топо- н н а изомеразы I, выделенной из плаценты человека, штки согласно [17], составляла 200 ед/мл, а концентра ?амк- ц И Я ДНКазы I («Sigma», США) —0,1—0,5 мкг/мл с н е ~ в зависимости от того, на каком объекте (политен- інной н ы е хромосомы или ядра) проводили измерения. <С ка- Типичная кривая изменений интенсивности флюо- 51 і КУЗИН Ф. '.) И Д Р ресценции препарата в течение опыта приведена на рис 1. Плотность посадки красителя на ДНК О0) вычисляли по уравнению изотермы для никованной ДНК [18] г/С = К т к (1 — Зг) 3 / (1 — 2г) \ (1) Показатель степени в числителе правой части выражения (I) — размер сайта связывания (я) кра сителя на ДНК, выраженный в числе пар основа ний. Значения п для ДНК in vitro обычно лежат в пределах 2—2,5. Для «свободной» ДНК хроматина значение /1 = 3 было вычислено из взвешенных значений /7 = 5—6 для хроматина [19] и п = 6—7 для коровых частиц нуклеосом [20]. Константу связывания БЭ с хромосомной ДНК определяли по измерениям интенсивностей флюо ресценции изолированных, мягко пред обработан ных ДНКазой 1 хромосом в диапазоне концентра ций от 5 10~8 до 2-Ю"7 М БЭ, построенных в координатах Клотца (1/С, 1/1). Полученное значе ние К д н к = (4,5±0,6) • 10' М - 1 . Принимая угол скру чивания ДНК при интеркалировании одной моле кулы БЭ равным 26°, находили величину относи тельной разности скручивания из ATw/Tw^ = -Ц0-267360°)/- 0 = -0,72 г0. Для оценки доли ДНК, релаксирующей под действием ферментов в хромосомах, эксперимен тальную кривую сравнивали с расчетной, вычис ленной в виде относительной разности плотностей посадки красителя на никованной (уравнение (1)) и торсионно напряженной ДНК (уравнение (2)): г/С = ^ д н к-ехр[10(/- 0-г) ]( l-3r)V( l-2r) 2 . (2). Долю никованной ДНК рассчитывали из соот ношения масштабов кривых по вертикальной оси. Результаты и обсуждение. Величины Д/ / / , измеренные для изолированных политенных хро мосом в диапазоне концентраций от 10 7 до 5 * х Ю~ъ М БЭ, представлены на рис. 2, а . Здесь в качестве ДНК-релаксирующего агента использова ли топоизомеразу I. Как видно, при С< 10" М БЭ все измеренные величины отрицательны, что соот ветствует уменьшению флюоресценции после до бавления фермента, а при С > 10~6 М БЭ — поло жительны. Полученная зависимость не является следствием проявления изменений в структуре хро матина ни при окраске хромосом БЭ, ни при релаксации напряжения в ДНК. Известно, что нарушения нуклеосомной организации хроматина наблюдаются лишь при очень высокой концентра ции (10~5 М) красителя [22, 23], а релаксация ДНК не изменяет ее связи с белками так, чтобы уменьшилась доступность ДНК красителю [6, 10 \|. Для точного определения концентрации С„ БЭ, при которой происходит компенсация сверхвитков ДНК во время окрашивания, на рис. 2, а, построе на кривая, рассчитанная по изотермам связывания красителя с топологически открытой и топологиче ски замкнутой ДНК. Наилучшая корреляция расчетной кривой с результатами измерений на политенных хромосо мах наблюдалась при С 0=10~° М БЭ. Отсюда величина ATw/Tw - - 0 , 1 . Второй варьируемый па раметр кривой, показывающий, какая доля хромо сомной ДНК напряжена и доступна релаксирующе- му действию топоизомеразы I, оказался близким к 15 %, Остальные 85 % ДНК либо малодоступны ферменту (вероятнее всего, это ДНК дисков полит енных хромосом), либо разомкнуты. Использование ДНКазы I приводило к более сложным последствиям. А именно, после быстрых изменений интенсивности следовало медленное (в течение нескольких часов) ее падение. Оно, по-ви димому, связано с распадом никованной ДНК до олигонуклеотидов вследствие накопления одно нит чатых разрывов. В то же время величины А / / / для «быстрых» изменений интенсивности флюоресцен ции после добавления ДНКазы 1 (данные не пред ставлены) практически совпадали с таковыми, пол ученными при использованием топоизомеразы I. В этой связи напомним, что высокая чувствитель ность к нуклеазам характерна для активных райо нов интерфазного ядра [24 ]. Кроме того, проведен ная нами оценка доли торсионно напряженной ДНК в 15 % близка к оценке (22 %) доли ДНК доменов, содержащих транскрибируемые последо вательности, полученной из соотношения числа пуфов и общего числа дисков в политенных хромо сомах хирономуса [11]. Все это позволяет считать Т О Р С И О Н Н О Е Н А П Р Я Ж Е Н И Е В Д Н К П О Л И Т Е Н Н Ы Х Х Р О М О С О М С. THUMMI Р и с . 2 . Л — з а в и с и м о с т ь о т н о с и т е л ь н о г о и з м е н е н и я ф л ю о р е с ц е н ц и и п о л и т е н н ы х х р о м о с о м от к о н ц е н т р а ц и и к р а с и т е л я ( / — п р и д е й с т в и и Д Н К а з ы I, д о б а в л е н н о й п о с л е т о п о и з о м е р а з ы I; 2 — п р и д е й с т в и и т о п о и з о м е р а з ы I; 3 — п р и д е й с т в и и Д Н К а з ы I на х р о м о с о м ы IV б е з я д р ы ш е к ) ; В — о т н о с и т е л ь н о е и з м е н е н и е ф л ю о р е с ц е н ц и и п о л и т е н н ы х я д е р п р и д е й с т в и и Д Н К а з ы I п о с л е о б р а б о т к и п а н к р е а т и ч е с к о й Р Н К а з о й торсионно напряженную ДНК транскрибируемой ДНК. Предложенная интерпретация результатов бы ла подтверждена аналогичными измерениями на политенных хромосомах IV с микрургически удаленным ядрышком. В самой малой хромосоме IV хирономуса С. thummi имеются три больших транскрипционно активных кольца Бальбиани, на личие которых приводит к увеличению в ней (по сравнению со всем хромосомным набором) доли транскрипционно активной ДНК. Поэтому обнару жив, что экспериментальные точки (рис. 2, я), принадлежащие торсионно напряженной ДНК, ло жились на кривую, рассчитанную при условии, что она составляет не 15, а около 28 % всей окраши ваемой ДНК, мы получили еще одно свидетельство тому, что торсионно напряженная ДНК политен ных хромосом содержит транскрибируемые после довательности ДНК. При использовании БЭ мы учитывали, что он интеркалирует не только между парами оснований в ДНК, но и в двуцепочечные участки молекул РНК. Хотя наличие РНК в препарате не влияет на положение точки компенсации С„, оно приводит, однако, к искажению формы экспериментальных кривых и уменьшает долю торсионно напряженной ДНК. Для устранения этого эффекта при измере ниях на политенных хромосомах было достаточно удалить ядрышко, тогда как в случае политенных ядер была необходима предварительная обработка РНКазой. Результаты измерений относительных изменений интенсивности флюоресценции окра шенных БЭ ядер, предобработанных панкреатиче ской РНКазой, представлены на рис 2. б. В каче стве ДНК-релаксирующего агента в данном случае использована ДНКаза I. Из сравнения рис. 2, а и б, легко заметить, что в пределах точности измере ний доля торсионно напряженной ДНК и величина напряжения в ней одинаковы для политенных ядер и изолированных политенных хромосом. Обнаруженные торсионные напряжения в ДНК очень велики. Поэтому нельзя исключить, что даже малые концентрации БЭ изменяют структуру хроматина так, что в ДНК возникают явления, связанные с разрушением структур, в которых аккумулированы сверхвитки ДНК. Такой особен ностью обладают участки неканонических форм ДНК, стабилизированные взаимодействием с бел ками или нуклеиновыми кислотами [23 ]. Для про верки этой возможности использовали следующий тест. Изолированные политенные хромосомы снача ла обрабатывали раствором топоизомеразы I, кото рая, сохраняя топологическую замкнутость ДНК. сбрасывала имеющиеся в ней напряжения. Затем препараты отмывали от фермента и проводили стандартные измерения флюоресценции в раство рах БЭ с добавлением ДНКазы I. В этих опытах отрицательно торсионно напряженная ДНК не бы ла обнаружена. Более того, судя по кинетике действия ДНКазы I, исчезнувшая фракция ДНК заменялась на фракцию торсионно ненапряженной, 513 К У З И Н Ф 3. и Д Р . но топологически замкнутой ДНК, которая обнару живалась по наличию значений Л / / / , целиком расположенных выше горизонтальной оси (рис. 2, а). Отсюда следует, во-первых, что фракция ДНК, релаксируемая топоизомеразой I, идентична фрак ции, наиболее доступной никующему действию ДНКазы I, и, во-вторых, что обнаруженное торси онное напряжение в ДНК не связано с воздействи ем БЭ на хроматин. В настоящее время не известны эукариотиче- ские ферменты, которые подобно гиразам прокари от могут вводить отрицательное торсионное напря жение в ДНК. Поэтому считают, что напряжение в транскрибируемой ДНК порождается РНК-поли- меразами, генерирующими при своем движении вдоль цепи ДНК положительное торсионное напря жение перед собой и отрицательное — за собой [8 ]. Возникновение напряжения объясняют энергетиче скими причинами: вращение транскрипционного комплекса энергетически менее выгодно, чем рас кручивание двойной спирали ДНК. В такой модели небольшая разница в скоростях образования и релаксации торсионных напряжений может приво дить к появлению стационарного положительного или отрицательного торсионного напряжения. В то же время известно, что топоизомераза I, сосредото ченная в транскрипционно активном хроматине [211, способна в равной мере релаксировать и отрицательные, и положительные торсионные на пряжения в ДНК. Поэтому существует мнение [9 ], что в ДНК эукариотических ядер нет длительно существующих несдерживаемых торсионных на пряжений. Однако в наших опытах транскрипция была остановлена, а торсионное напряжение не исчезло. Его сохранение едва ли связано с вымыванием молекул топоизомераз из препаратов. Об этом свидетельствует значительно более медленная ки нетика релаксации топоизомеразой I молекул ДНК в составе ядер, чем в изолированных хромосомах, зависящая от скорости диффузии молекул фермен та в препарате. Следовательно, можно ожидать, что увеличенная скорость диффузии эндогенных топоизомераз из изолированных политенных хро мосом по сравнению с политенными ядрами должна приводить к разным значениям торсионного напря жения в них. Этого, однако, не происходит. Поэтому мы предположили, что стабильный уровень торсионного напряжения в ДНК интерфаз ных ядер поддерживается иным механизмом. Не исключено, что активность топоизомераз в ядре определяется их окружением. Известно [28 ], что при транскрипции рибосомных генов топоизомера за I ассоциирована с РНК полимеразой I, хотя авторы указали, что у них нет подобных свиде тельств для РНК полимеразы II. Однако существу ют факты количественной и временной связи ак тивностей РНК полимеразы И и топоизомеразы I [26]. Изменение конформации топоизомеразы I в комплексе с РНК полимеразой (или регуляторны- ми белками) может приводить к тому, что торсион но напряженная ДНК будет восприниматься фер ментом как релаксированная. В таком случае при транскрипции будут сбрасываться ферментом толь ко надпороговые торсионные напряжения в ДНК. Альтернативный механизм возможен на основе модулирования доступности топоизомеразе моле кул ДНК за счет изменения конформации хрома тина в составе транскрипционного комплекса. По сле остановки транскрипции, в частности, при выделении хромосом хроматин остается в таком состоянии, что его ДНК недоступна эндогенным топоизомеразам. Однако и в этом случае нужно предполагать, что топоизомеразы в ядре входят в состав неких комплексов, изменяющих их взаимо действие с ДНК, так как только экзогенные топо изомеразы, как показано нами, приводят к релак сации хромосомной ДНК. Ф. Е. Кузін, I. Е. Шилова, Д. В. Бугресв, Т. А. Невінський, О. Д. Груздев С т а б і л ь н а т о р с і й н а н а п р у г а в Д Н К п о л і т е н н и х х р о м о с о м Chironomus thummi Р е з ю м е Мікрофлюориметричним методом визначено топологічний стан ДНК в ізольованих політенних хромосомах хірономусу С. thummi, які знаходяться на стадії активно)' транскрипції. Показано, що 15 % усієї ДНК хромосом, яка доступна ін теркаляиії бромистого етидію, знахос)иться у торсійна на пруженому стані. Числове значення виявленої напруги, вираже не у відносній різниці скручення напруженої молекули ДПК по відношенню до її релаксованої форми, дорівнює -0,1. Показано також, що домени торсійно напруженої ДИК містять по слідовності, що транскрибуються. Торсійно напружена ДНК с недоступною релаксуючій дії ендогенних топоізомераз, але напруга зникає при додаванні екзогенної топоізомерази І. F. Е. Kuzin, І. Е. Shilova, D. V. Bugreev, G. A. Nevinski, A. D. Gruza'ev S t a b l e tors ional t ens ion in D N A of Chironomus thummi p o l y t e n e c h r o m o s o m e s S u m m a r y Topological state of DNA in isolated polytene chromosomes of Chironomus thummi at the stage of the highest transcription activity has been determined by microfluorometrical method. About 15 % of chromosomal DNA stained with EiBr heve been found to be under torsional stress. The value of the stress expressed as the relative twist difference is -O.J. It has been shown that domains of the stressed DNA contain transcriptionally active genes. Torsional!y stressed DNA relaxes after addition of endogeneous topoisomerasc I. 514 THUMMI С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы {.Kramer И. R., Sinden R. R. M e a s u r e m e n t of u n r e s t r a i n e d negat ive s u p e r e o i l i n g a n d topo log i ca l d o m a i n s i ze in l iving h u m a n ce l l s / / B i o c h e m i s t r y . — 1 9 9 7 . — 3 6 . — P . 3 1 5 1 — 3 1 5 8 . 2 . McClure W. R. M e c h a n i s m a n d contro l of transcr ipt ion in i t ia tion in p r o k a r y o t e s / / A n n . R e v . B i o c h e m . — 1 9 8 5 . — 5 4 . — P. 1 7 1 — 2 0 4 . 3 . Durst S. A., Edwards А. M., Kubalek E. W., Kornberg R. D. T h r e e d i m e n s i o n a l s t ruc ture of y e s t R N A p o l y m e r a s e II at 16 A reso lut ion / / C e l l . — 1 9 9 1 . — 6 6 . — P . 121 — 1 2 8 . 4 . Hirosc S.t Suzuki Y. In vitro t ranscr ipt ion of e u k a r y o t i c g e n e s is a f f e c t e d d i f ferent ly by the d e g r e e of D N A s u p e r e o i l i n g / / Proc . Nat . A c a d . Sc i . U S A . — 1 9 8 8 . — 8 5 . — P. 7 1 8 — 7 2 2 . 5 . Ljungman A/ . , Hanawall P. C. L o c a l i z e d tors ional t ens ion in the D N A of h u m a n c e l l s / / P r o c . N a t . A c a d . Sc i . U S A . — 1 9 9 2 . — 8 9 . — P . 6 0 5 5 — 6 0 5 9 . 6. Jupe E. R., Sinden R. R., Catrwright I. L. S t a b l y m a i n t a i n e d m i c r o d o m a i n of l o c a l i z e d u n r e s t r a i n e d s u p e r e o i l i n g at Droso- phila h e a t s h o c k g e n e l o c u s / / E M B O J. — 1 9 9 3 . — 1 2 . — P . 1 0 6 7 — 1 0 7 5 . 7. Jupe E. R., Sinden R. R., Catrwright I. L. S p e c i a l i z e d c h r o m a t i n s tructure d o m a i n boundary' e l e m e n t s f lanking a Drosophila h e a t s h o c k g e n e l o c u s ar e u n d e r tors ional strain in vivo II B i o c h e m i s t r y . — 1 9 9 5 . — 3 4 . — P . 2 6 2 8 — 2 6 3 3 . 8. Liu L. F.t Wang J. C. S u p e r e o i l i n g of the D N A t e m p l a t e d u r i n g transcript ion / / P r o c . Nat . A c a d . Sc i . U S A . — 1 9 8 7 . — 8 4 . — P. 1 3 5 3 — 1 3 5 8 . 9. Free/nan L. A., Garrard W. T. D N A s u p e r e o i l i n g in c h r o m a t i n s tructure a n d g e n e e x p r e s s i o n / / Crit . R e v . in E u k a r y o t i c G e n e E x p r e s s i o n . — 1 9 9 2 . — 2 . — P . 1 6 5 — 2 0 5 . 10 . Sinden R. R.t Carlson J. O., Pettijohn D. E. T o r s i o n a l t ens ion in the D N A d o u b l e h e l i x m e a s u r e d with t r i m e t h y l p s o r a l e n in l iving E. coli ce l l s : A n a l o g o u s m e a s u r e m e n t s in insec t a n d h u m a n c e l l s / / C e l l . — 1 9 8 0 . — 2 1 . — P . 7 7 3 — 7 8 3 . 11 . Кикнадзе И. И. С р а в н и т е л ь н а я х а р а к т е р и с т и к а п у ф ф и н г а в х р о м о с о м а х с л ю н н ы х ж е л е з Chironomus t hum ті в л и ч и н о ч н о м в о з р а с т е и п р и м е т а м о р ф о з е . II. П у ф ф и н г в х р о м о с о м а х I, II и III / / Ц и т о л о г и я . — 1 9 7 8 . — 2 8 . — С . 5 1 4 — 5 2 1 . 1 2 . Gruzdev A. D., Shurdov М. A. T o p o l o g i c a l s ta te of D N A in p o l y t e n e c h r o m o s o m e s / / B i o c h i m . e t b i o p h y s . ac ta . — 1 9 9 2 . — 1 1 3 1 . — P . - 3 5 — 4 0 . 13 . Кикнадзе Я . / / . , Панова Т. М. Захаренко Л. П. С р а в н и т е л ь н а я х а р а к т е р и с т и к а ггуфинга в х р о м о с о м а х с л ю н н ы х ж е л е з Chironomus thummi в л и ч и н о ч н о м р а з в и т и и и п р и м е т а м о р ф о з е . III. Т р а н с к р и п ц и о н н а я а к т и в н о с т ь я д р ы ш к а и к о л е ц Б а л ь б и а н и / / Ц и т о л о г и я . — 1 9 8 1 . — 2 3 , № 5 . — С. 5 3 1 — 5 3 8 . 14. Кикнадзе И. И., Колесников Н. И., Лопатин О. Е. Х и р о - н о м у с Chironomus thummi Kieff. ( л а б о р а т о р н а я к у л ь т у р а ) / / О б ъ е к т ы б и о л о г и и р а з в и т и я . — M.: Н а у к а , 1 9 7 5 . — С. 9 5 - 1 2 7 . 15. Robert М. E in f lus s von I o n e n s t a r k e und p H auf d ie d i f f e r e n - t iel le D e c o n d e n s a t i o n d e r N u c l e o p r o l e i d e i so l ierter S p e i c h e l - d r u s e u - Z e l l k e r n e u n d - C h r o m o s o m e n von Chironomus thummi II C h r o m o s o m a . — 1 9 7 1 . — 3 7 . — S . 1 — 3 3 . 16 . Bauer W. R. S t r u c t u r e a n d r e a c t i o n s of c l o s e d d u p l e x D N A / / A n n . R e v . B i o p h y s . B i o e n g . — 1 9 7 8 . — 7 . — P . 2 8 7 - 3 1 3 . 17. Бугреев Д. В., Васютина К. JJ., Максакова F. А., Бунева В. Н., Андо Т., Невинский У. А. У з н а в а н и е Д Н К - т о п о и з о м е р а з о й 1 ч е л о в е к а с у п е р с к р у ч е н н о й Д Н К : о ц е н к а о т н о с и т е л ь н о й . ) в к л а д а с п е ц и ф и ч е с к и х и н е с п е ц и ф и ч е с к и х в з а и м о д е й с т в и й / / М о л е к у л я р . б и о л о г и я . — 1 9 9 7 . — 3 1 3 1 . № 3 . — С . 4 1 8 — 4 3 0 . 18 . McGhee J. IX, von Hippel P. H. T h e o r e t i c a l a s p e c t s of D N A - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s : c o o p e r a t i v e a n d n o n c o o p e r a t i v e bin d i n g of l arge l i g a n d s to a o n e d i m e n s i o n a l h o m o g e n e o u s lattice / / J. Мої . B io l . — 1 9 7 4 . — 5 4 . — P . 1 7 1 — 2 0 4 . 19 . Vergani L, Gavazzo P., Mascetti G., Nicolini C. E t h i d i u m b r o m i d e i n t e r c a l a t i o n a n d c h r o m a t i n s tructure: a s p e c t r o - p o l a r i m e t r i c a n a l y s i s / / B i o c h e m i s t r y . — 1 9 9 4 . — 3 3 . — P . 6 5 7 8 — 6 5 8 5 . 2 0 . McMurray С. Т., van Holde К. E. B i n d i n g of e t h i d i u m to n u c l e o s o m e c o r e par t i c l e . 1. B i n d i n g a n d d i s s o c i a t i o n reac t ion / / B i o c h e m i s t r y . — 1 9 9 1 . — 3 0 . — P . 5 6 3 1 — 5 6 4 3 . 2 1 . Bauer W., Vinograd J. I n t e r a c t i o n of c l o s e d c i rcu lar D N A with in terca la t ive d y e s . II. T h e f ree e n e r g y of s u p e r h e l i x format ion in S V 4 0 D N A / / J. Мої . B io l . — 1 9 7 0 . — 4 7 . — P . 4 1 9 — 4 3 5 . 2 2 . Doenecke D. E t h i d i u m b r o m i d e b i n d i n g to n u c l e o s o m a l D N A / / E x p . Cel l R e s . — 1 9 7 7 . — 1 0 9 — P . 3 0 9 — 3 1 5 . 2 3 . Straetling W. H.} Seidel J. R e l a x a t i o n of c h r o m a t i n s tructure by e t h i d i u m b r o m i d e b i n d i n g : d e t e r m i n a t i o n by v i scos i ty a n d h i s t o n e d i s s o c i a t i o n s t u d i e s / / B i o c h e m i s t r y . — 1 9 7 6 . — 1 5 . — P . 4 8 0 3 — 4 8 0 9 . 2 4 . Hutchison A ; . , Weintraub H. Ix jca l i za t ion of D N A s e 1-sensi t ive s e q u e n c e s to s p e c i f i c r e g i o n s of i n t e r p h a s e nucle i / / Cel l — 1 9 8 5 . — 4 3 . — V. 4 7 1 — 4 8 2 . 2 5 . Reaban M. E.t Griffin J. A. I n d u c t i o n of R N A - s t a b i l i z e d D N A c o n f o r m e r s by transcr ipt ion of a n i m m u n o g l o b u l i n swi tch reg ion / / N a t u r e . — 1 9 9 0 . — 3 4 8 . — P . 3 4 2 — 3 4 4 . 2 6 . Van Holde K, Zlutanova J. U n u s u a l D N A s t r u c t u r e s , c h r o matin a n d transcr ipt ion / / B i o E s s a y . — 1 9 9 4 . — 1 6 . — P . 5 9 — 6 8 . 2 7 . Gilmour D. S., Pflugfelder C , Wang J. C , Lin J. T. T o p o i s o m e r a s e I i n t e r a c t s w i th t r a n s c r i b e d r e g i o n s in Dro- sophila c e l l s / / Ce l l . — 1 9 8 6 . — 4 4 . — P . 4 0 1 - 4 0 7 . 2 8 . Rose К. M., Szopa J., Han F.-S., Cheng Y. C, Richier A., Scheer U. A s s o c i a t i o n of D N A t o p o i s o m e r a s e I a n d R N A p o l y m e r a s e I: a p o s s i b l e ro le for t o p o i s o m e r a s e I in r ibosomal g e n e transcr ipt ion / / C h r o m o s o m a . — 1 9 8 8 . — 9 6 . — P . 4 1 1 — 4 1 6 . 2 9 . Stewart A. F., Herrera R. E., Nordheim A. R a p i d induc t ion of c-fos t ranscr ipt ion r e v e a l s q u a n t i t a t i v e l i n k a g e of R N A poly m e r a s e II a n d D N A t o p o i s o m e r a s e 1 e n z y m e act iv i t ies / / C e l l . — 1 9 9 0 — 6 0 — P . 141 — 1 4 9 . У Д К 5 7 7 . 2 1 3 П о с т у п и л а в р е д а к ц и ю 1 4 . 0 4 . 9 8 515
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156813
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0233-7657
language	Russian
last_indexed	2025-12-07T18:44:05Z
publishDate	1999
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
record_format	dspace
spelling	Кузин, Ф.Э. Шилова, И.Э. Бугреев, Д.Б. Невинский, Г.А. Груздев, А.Д. 2019-06-19T06:25:01Z 2019-06-19T06:25:01Z 1999 Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi / Ф.Э. Кузин, И.Э. Шилова, Д.В. Бугреев, Г.А. Невинский, А.Д. Груздев // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 510-515. — Бібліогр.: 29 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000547 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156813 577.213 Микрофлюориметрическим методом определяли топологическое состояние ДНК в изолированных политенных хромосомах хирономуса С. thummi, находящихся на стадии активной транскрипции. Показано, что 15 % всей ДНК хромосом, доступной интеркаляции бромистого этидия, находится в торсионно напряженном состоянии. Численное значение обнаруженного напряжения, выраженное в относительной разности скручивания напряженной молекулы ДНК по отношению к ее релаксированной форме, равно –0,1. Показано также, что домены торсионно напряженной ДНК содержат транскрибируемые последовательности. Торсионно напряженная ДНК недоступна релаксирующему действию эндогенных топоизомераз, но теряет напряжение при добавлении экзогенной топоизомеразы I. Мікрофлюориметричним методом визначено топологічний стан ДНК в ізольованих політенних хромосомах хірономусу С. thummi, які знаходяться на стадії активної транскрипції. Показано, що 15 % усієї ДНК хромосом, яка доступна інтеркаляції бромистого етидію, знаходиться у торсійна напруженому стані. Числове значення виявленої напруги, виражене у відносній різниці скручення напруженої молекули ДПК по відношенню до її релаксованої форми, дорівнює –0,1. Показано також, що домени торсійно напруженої ДИК містять послідовності, що транскрибуються. Торсійно напружена ДНК є недоступною релаксуючій дії ендогенних топоізомераз, але напруга зникає при додаванні екзогенної топоізомерази І. Topological state of DNA in isolated polytene chromosomes of Chironomus thummi at the stage of the highest transcription activity has been determined by microfluorometrical method. About 15 % of chromosomal DNA stained with EtBr have been found to be under torsional stress. The value of the stress expressed as the relative twist difference is –0.1. It has been shown that domains of the stressed DNA contain transcriptionally active genes. Torsionully stressed DNA relaxes after addition of endogeneoits topoisomerase I. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Геном и его регуляция Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi Стабільна торсійна напруга в ДНК політенних хромосом Chironomus thummi Stable torsional tension in DNA of Chironomus thummi polytene chromosomes Article published earlier
spellingShingle	Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi Кузин, Ф.Э. Шилова, И.Э. Бугреев, Д.Б. Невинский, Г.А. Груздев, А.Д. Геном и его регуляция
title	Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi
title_alt	Стабільна торсійна напруга в ДНК політенних хромосом Chironomus thummi Stable torsional tension in DNA of Chironomus thummi polytene chromosomes
title_full	Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi
title_fullStr	Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi
title_full_unstemmed	Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi
title_short	Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi
title_sort	стабильное торсионное напряжение в днк политенных хромосом chironomus thummi
topic	Геном и его регуляция
topic_facet	Геном и его регуляция
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156813
work_keys_str_mv	AT kuzinfé stabilʹnoetorsionnoenaprâženievdnkpolitennyhhromosomchironomusthummi AT šilovaié stabilʹnoetorsionnoenaprâženievdnkpolitennyhhromosomchironomusthummi AT bugreevdb stabilʹnoetorsionnoenaprâženievdnkpolitennyhhromosomchironomusthummi AT nevinskiiga stabilʹnoetorsionnoenaprâženievdnkpolitennyhhromosomchironomusthummi AT gruzdevad stabilʹnoetorsionnoenaprâženievdnkpolitennyhhromosomchironomusthummi AT kuzinfé stabílʹnatorsíinanaprugavdnkpolítennihhromosomchironomusthummi AT šilovaié stabílʹnatorsíinanaprugavdnkpolítennihhromosomchironomusthummi AT bugreevdb stabílʹnatorsíinanaprugavdnkpolítennihhromosomchironomusthummi AT nevinskiiga stabílʹnatorsíinanaprugavdnkpolítennihhromosomchironomusthummi AT gruzdevad stabílʹnatorsíinanaprugavdnkpolítennihhromosomchironomusthummi AT kuzinfé stabletorsionaltensionindnaofchironomusthummipolytenechromosomes AT šilovaié stabletorsionaltensionindnaofchironomusthummipolytenechromosomes AT bugreevdb stabletorsionaltensionindnaofchironomusthummipolytenechromosomes AT nevinskiiga stabletorsionaltensionindnaofchironomusthummipolytenechromosomes AT gruzdevad stabletorsionaltensionindnaofchironomusthummipolytenechromosomes

Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi

Institution

Similar Items