Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки

С использованием метода сайт-специфического мутагенеза сделана попытка построить нок-аут мутацию одного из трех гомологичных генов для синтеза шаперонинов в R. leguminosarum. Показано, что ген cpn60-1 не может быть выведен из строя в связи с его важностью для жизнедеятельности клетки....

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	1999
Main Authors:	Ерко, В.Н., Ланд, П.А.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1999
Series:	Биополимеры и клетка
Subjects:	Геном и его регуляция
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156814
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки / В.Н. Ерко, П.А. Ланд // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 516-521. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156814
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1568142025-02-23T18:01:38Z Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки Ген cpn60-1, який кодує один з гомологічних шаперонінів у Rhizobium leguminosarum bv. viceae, є важливим для життєдіяльності клітини Gene cpn60-1 coding one of homologous chaperonins in Rhizobiuin leguminosarum is essential for cell life Ерко, В.Н. Ланд, П.А. Геном и его регуляция С использованием метода сайт-специфического мутагенеза сделана попытка построить нок-аут мутацию одного из трех гомологичных генов для синтеза шаперонинов в R. leguminosarum. Показано, что ген cpn60-1 не может быть выведен из строя в связи с его важностью для жизнедеятельности клетки. З використанням методу сийт-специфічного мутагенезу зроблено спробу побудувати нок-аут мутацію одного з трьох гомологічних генів для синтезу шаперонінів у R. leguminosarum bv. viceae . Показано, що ген cpn60-1 не може бути «виведений з ладу» у зв'язку з його важливістю для життєдіяльності клітини. Using the method of site specific mutagenesis we have tried to knock-out one of three homologous genes for chaperonins synthesis in Rhizobium leguminosarum bv. viceae. It has been shown that cpn60-1 gene cannot be destroyed due to its essentiality for cell life. 1999 Article Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки / В.Н. Ерко, П.А. Ланд // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 516-521. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000548 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156814 575.24:576.851.155 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Геном и его регуляция Геном и его регуляция
spellingShingle	Геном и его регуляция Геном и его регуляция Ерко, В.Н. Ланд, П.А. Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки Биополимеры и клетка
description	С использованием метода сайт-специфического мутагенеза сделана попытка построить нок-аут мутацию одного из трех гомологичных генов для синтеза шаперонинов в R. leguminosarum. Показано, что ген cpn60-1 не может быть выведен из строя в связи с его важностью для жизнедеятельности клетки.
format	Article
author	Ерко, В.Н. Ланд, П.А.
author_facet	Ерко, В.Н. Ланд, П.А.
author_sort	Ерко, В.Н.
title	Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки
title_short	Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки
title_full	Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки
title_fullStr	Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки
title_full_unstemmed	Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки
title_sort	ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1999
topic_facet	Геном и его регуляция
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156814
citation_txt	Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки / В.Н. Ерко, П.А. Ланд // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 516-521. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT erkovn gencpn601kodiruûŝijodinizgomologičnyhšaperoninovurhizobiumleguminosarumâvlâetsâvažnymdlâžiznedeâtelʹnostikletki AT landpa gencpn601kodiruûŝijodinizgomologičnyhšaperoninovurhizobiumleguminosarumâvlâetsâvažnymdlâžiznedeâtelʹnostikletki AT erkovn gencpn601âkijkoduêodinzgomologíčnihšaperonínívurhizobiumleguminosarumbvviceaeêvažlivimdlâžittêdíâlʹnostíklítini AT landpa gencpn601âkijkoduêodinzgomologíčnihšaperonínívurhizobiumleguminosarumbvviceaeêvažlivimdlâžittêdíâlʹnostíklítini AT erkovn genecpn601codingoneofhomologouschaperoninsinrhizobiuinleguminosarumisessentialforcelllife AT landpa genecpn601codingoneofhomologouschaperoninsinrhizobiuinleguminosarumisessentialforcelllife
first_indexed	2025-11-24T06:35:48Z
last_indexed	2025-11-24T06:35:48Z
_version_	1849652567728979968
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 6 Ген срп60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки В. Н. Ерко, П. А. Л а н д 1 Институт физиологии растений и генетики НАН Украины Ул. Васильковская, 3 1 / 1 7 , Киев, 03022 , Украина * Школа биологических наук, Бирмингемский университет Бирмингем, В15 2ТТ, Англия С использованием метода сайт-специфического мутагенеза сделана попытка построить кок-аут мутацию одного из трех гомологичных генов для синтеза шаперонинов в R. leguminosarum. Показано, что ген српЬО-l не может быть выведен из строя в связи с его важностью для жизнедеятельности клетки. Введение. Для того чтобы белки могли реализовать свои свойства, какими бы они ни были — катали тическими, регуляторными, структурными и т. д., каждый индивидуальный белок должен приобрести специфическую для него конформацию в простран стве. На протяжении длительного периода полага ли, что процесс сборки белков — это спонтанный процесс, не требующий дополнительных факторов или энергетических затрат [1 ]. Как позже обнару жилось, спонтанная сборка белков характерна для несложных, чаще однодоменных полипептидов, со стоящих из небольшого количества аминокислот. Белки, имеющие сложную третичную и четвертич ную структуру, собираются с помощью шаперо- нов — семейства белков, обнаруженных у всех ви дов прокариот, эукариот и археа [2 ]. У бактерий существует несколько шаперонов различного рода. Наиболее изученными из них являются шапероны DnaK — белки с молекулярной массой 70 кДа и шапероны СрпбО (или GroEL) , получившие название шаперонины, с молекуляр ной массой 60 кДа. Обе группы обладают АТРазной активностью (используют энергию АТР для своей работы) и чрезвычайно консервативны по аминокислотной последовательности. Из сравнения аминокислотных © В . Н . Е Р К О , П . А . Л А Н Д , 1 9 9 9 последовательностей этих шаперонов, выделенных из Escherichia coli и организма человека, следует, что гомология между ними составляет более 50 %. Это свидетельствует о высокой консервативности функций, выполняемых шаггеронами, и древности их происхождения [3, 4 ]. Мутации, полностью выводящие из строя ша- перонин GroEL у бактерии Е. coli, летальны, так как этот шаперонин является абсолютно необходи мым для нормального роста при любых температу рах [5 ] . Делеция гена шаперона DnaK приводит к чрезвычайной холодо- и теплочувствительности бактерий, которые при этом не способны расти при температурах, значительно отличающихся от 30 °С [6] . Обычно бактерии содержат одну копию генов для синтеза шаперонинов. В отличие от Е. coli и большинства других бактерий, клубеньковые бак терии Rhizobium и Bradyrhizobium в составе своего генома имеют множественные семейства генов, ко дирующих гомологичные шаперонины. Так , R. те- liloti и В. japonicum имеют пять гомологичных генов groEL [7, 8 ], a R. leguminosarum — три гена, названных српбО-1, срп60-2 и срп60-3 [9 ] , экспрес- сирующихся либо конститутивно, с усиленным синтезом при воздействии на бактерии повышенной температуры, либо в зависимости от условий роста и при симбиозе с растениями [8 ]. 516 Г Е Н C P N b O - 1 , К О Д И Р У Ю Щ И Й Ш А П Е Р О Н И Н У R . L E G U M I N O S A R U M Значение множественности генов для синтеза гомологичных шаперонинов, синтезирующихся в разных условиях, так же, как и существование в одной клетке шаперонинов, отличающихся по ами нокислотной последовательности, и возможная роль этих шаперонинов в азотфиксирующем сим биозе клубеньковых бактерий с растениями оста ются невыясненными. Хотя показано, что Т п 5 мутация одного из генов groEL у R. meliloti приво дит к инактивации N o d D l , NodD3 и SyrM регуля торов экспрессии генов и в результате к отсутствию азотфиксации [10] . Такой же фенотип в симбиозе с бобовыми характерен для мутантов В. japonicum, несущих нок-аут мутации по двум из пяти генов groEL этого микроорганизма, кодирующих шаперо нины. Предметом данной работы является конструи рование мутаций по одному из трех гомологичных генов српбО'.Я. leguminosarum и проблема построе ния мутаций в этих генах. Материалы и методы. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе, приведены в табл. 1. Среды и условия роста. Штаммы Е, coli выра щивали на твердой или жидкой среде LB [13] при температуре 37 °С, a R. leguminosarum — на TY [14] или С79 \| 1 5 ] при 28 °С. Для получения мутантов скрещивали R. leguminosarum с Е. coli при температуре 28 °С на среде TY в течение ночи при с о о т н о ш е н и и клеток 5:1 соответственно . Мутанты R. leguminosarum, у которых произошел один акт рекомбинации с плазмидой pNW6J или pND61 (интеграция плазмиды в геном), отбирали на среде С79 с добавлением 500 м к г / м л стрептоми цина и 200 м к г / м л канамицина . После этого про веряли отсутствие роста клонов R. leguminosarum, появившихся на этой среде, на среде TY с 5 %-й сахарозой и 500 м к г / м л стрептомицина и осущест вляли блот-гибридизацию геномной Д Н К этих кло нов с соответствующим геном српбО для определе ния правильности встраивания плазмиды в нужный оперон. Мутанты, у которых произошло замещение гена срп60-1 на мутантный аналог cpn60::nptll или на фрагмент с геном nptll за геном срп60-1, отби рали на среде TY с 5 % - й сахарозой и 200 м к г / м л канамицина. Колонии, выросшие на этой среде, проверяли на отсутствие устойчивости к гентами- цину в концентрации 10 м к г / м л на среде TY. Работа с ДНК. Ферменты для работы с Д Н К приобретены у «BRL», «Promega» (США) и «New England Biolabs» (Англия) и использованы в соот ветствии с инструкциями [13] . Препараты геном ной Д Н К готовили с использованием протеина з ы К и ацетилтриметиламмонийного брома [16] ; препа раты плазмидной Д Н К — по методу Бирнбойма и Доли [17] . Полимер аз нал цепная реакция (ПЦР). Реак ции амплификации Д Н К с помощью П Ц Р . Т ш / - полимеразы проводили в термоциклере Techne DB3. Амплификацию части гена српЬ0-1 для блот- гибридизации осуществляли с помощью праймеров 517 Е Р К О В I t , Л А Н Д П . А . D13222 и D2753 при следующих условиях: денату рация (93 °С, 1 мин 45 с) ; отжиг (54 °С, 1 мин 45 с); синтез (72 °С, 1 мин 45 с) . Олигонуклеотиды синтезированы компанией «Alta Bioscience» (Анг лия) . Блот-гибридизация по Саузерну. Рестрициро- ванную Д Н К после электрофореза в 0,7 % - й ага- розе переносили на нейлоновые мембраны, как описано [13] . Мембраны отмывали в условиях высокой ионной силы. Пробы для гибридизации метили с использованием набора «Renaissance» для флюоресцентного мечения при помощи случайных праймеров с флюоресцеин-dUTP. Результаты и обсуждение . Д л я проведения мутагенеза гена срп60-1, кодирующего один из гомологичных шаперонинов у R. leguminosarum, был использован оперон cpnJO-J, срп60-1 этой бактерии (в дальнейшем оперон срп-1), клониро ванный ранее [9] . Физическая карта этого оперона представлена на рис. 1, а. В этом опероне ген cpnlO-l кодирует ко-шаперонин СрпЮ, работаю щий совместно с шаперониновым комплексом, ко торый в свою очередь состоит из 14 гомологичных субъединиц; кодируемых геном српбО. Для инакти вации работы шаперонина СрпбО-1 необходимо было либо делетировать, либо инактивировать ген српбО-J. Поэтому при получении мутантов R. legu minosarum с отсутствием синтеза шаперонина СрпбО-1 была использована система для направ ленного мутагенеза на основе плазмиды-«самоуби- йцы» pJQ200KS 112], поскольку длина клониро ванного фрагмента оперона срп-1 позволяла ис пользовать метод сайт-специфического мутагенеза, т. е. рекомбинацию между гомологичными фраг ментами (длина клонированного фрагмента оперо на срп-1 составляет 3,3 тыс. п. н.) . Плазмида pJQ200KS несет маркер устойчиво сти к гентамицину и ген sacB, экспрессия которого в бактериях, растущих на средах с содержанием сахарозы около 5 % , приводит к гибели этих бактерий. Эта плазмида обладает узким кругом хозяев благодаря ее Р15А ориджину репликации и не способна реплицироваться в R. leguminosarum в отличие от Е. coli. Кроме этого, она несет mob- фрагмент плазмиды RP4, позволяющий ее конъю- гационный перенос в R. leguminosarum из Е. coli S I 7 . 1 . Поэтому при скрещивании R. leguminosarum bv. viceae 84011pRLl с E. coli S I 7 . 1 , несущей плазмиду pJQ20()KS, эта плазмида мобилизуется в клубеньковые бактерии и либо элиминирует из клеток ризобий в связи с невозможностью ее ре пликации в этих бактериях, либо встраивается в геном бактерий, но только в том случае, если несет в своем составе фрагменты Д Н К , имеющие гомоло гию с геномной Д Н К ризобий. Так , если в клетку в составе плазмиды вводится фрагмент Д Н К , несу щий мутированный ген срп60-1, в который встроен ген nptll, кодирующий неомицинфосфотрансфера- зу, придающую клеткам устойчивость к антибиоти ку канамицину (рис. 1, б и 2, а ) , то в результате рекомбинации произойдет встраивание всей плаз миды в хромосомную копию этого гена таким образом, что в геноме бактерии окажется как мутированный, так и исходный ген, разделенные плазмидной Д Н К (рис. 2, б). В результате второго акта рекомбинации мо жет произойти вырезание пламиды pJQ200KS из генома (рис. 2, б и в). При этом, если имеется хорошая система для отбора клеток, несущих му- тантный ген, то в клетке остается только этот мутантный ген, а ген дикого типа элиминирует вместе с плазмидой. В нашем случае для направ ленного мутагенеза был использован оперон срп-1 с встроенным в качестве маркера nptll-геном ус тойчивости к канамицину для отбора мутантов клубеньковых бактерий, в которые произошло встраивание плазмиды с мутантным геном српЬ0-1, и мутантов, у которых в результате второй реком- Рис. I. Физическая карга опе рона срп-1 (а) и схема созда ния мутантного гена српЬ0-1 с инсерцией nptll в нем (б) и контрольного — с инсерцией nptll за г е н о м (б); /У— Hindlll, Р — Pstl. Объяснения см. в тексте Г Е Н C P N 6 0 - 1 , К О Д И Р У Ю Щ И Й Ш А П Е Р О Н И Н У к. I - E G H M I N O S A K M :М Рис. 2. Схема, сайт-направленного мутагенеза гена срп60-1 с использованием плазмиды pNW61 (предшественник pJQ200KS). Масштабность не соблюдена. Показано первое рекомбинацион- ное событие (а), инсерция плазмиды в хромосому с последую щим (вторым) актом рекомбинации (б) и получившейся хромо сомной конструкцией (в) бинации ген дикого типа замещен на мутирован ный ген. Однако поиск бактерий, у которых про изошли второй акт рекомбинации и замещение гена дикого типа на мутированный, был бы значи тельно затруднен среди большого числа бактерий, где не произошло вырезания плазмиды, если бы не наличие в этой плазмиде гена sacBy блокирующего рост бактерий на сахарозе. Поэтому поиски бакте рий, у которых произошел второй кроссинговер между мутированным и нормальным генами, про водили на среде TY с добавлением сахарозы, и клоны, появляющиеся на этой среде, проверяли на отсутствие маркера устойчивости к гентамицину, присущему данной плазмиде. Известно, что если ген, кодирущий синтез шаперонина в клетке, находится в единичной ко пии, то мутации, полностью выводящие из строя этот ген, летальны. У R. leguminosarum bv. viceae имеются три гомологичных гена, кодирующих ша- перонины СрпбО. Поэтому делеция отдельного гена српбО является возможной, хотя может быть и летальной. В случае невозможности получения му тантов R. leguminosarum по гену српбО-J можно сделать вывод о том, что эти мутации летальны для клетки. Однако для того чтобы с уверенностью утверждать о том, что мутанты по гену српбО-1 летальны, необходим контроль, который бы ясно показал, что метод, примененный для получения мутантов, действительно работает в данном конк ретном случае, а отсутствие мутантов связано с их летальностью, а не с тем, например, что фрагмент Д Н К , использованный для гомологичной рекомби нации, слишком короток и рекомбинация происхо дит с очень низкой частотой, что и приводит к видимости отсутствия мутантов. Поэтому для получения мутантов по гену српбО-1 мы сконструировали производные плазми ды pJQ200KS, несущие оперон срп-1 и ген прШ в разных положениях (рис. 1). При получении му тантов R. leguminosarum по српбО-J-гену плазмида pNW61 несла ген nptll в гене српб()-1 (рис. 1, б и 2, а), а плазмида pND61 — на 20 нуклеотидов ниже кодона терминации трансляции этого гена (рис. 1 , 6 ) . Таким образом, получение клубенько вых бактерий, несущих ген nptll за геном српб()-1, является контролем опыта и свидетельствует о его эффективности. Ген nptll встраивали в ген српбО-1 по его двум сайтам Bglll (BgUI \546—BglII 2048) с делецисй фрагмента гена српбО-1 длиной 499 п. н. и клони рованием фрагмента в плазмиду plJ 1S9L В даль нейшем фрагмент cpnJO-1, српбО-1 ::nptlI длиной 4,6 тыс. п. н. был реклонирован в плазмиду pJQ200KS по ее Smal-атту (тупые концы) и ЕсоКУ-сайтам фрагмента с заполнением его 5 - л и п ких концов с помощью большого фрагмента Д Н К - полимеразы I. Конструирование контрольной плаз миды с геном nptll, находящимся за геном српб()-1, производили подобным образом, за исключением того, что nptll-ген встраивали в МмяУ-сайт, нахо дящийся на 20 п. н. ниже терминирующего кодона гена српбО-1. В результате скрещивания штамма Е. coli S 1 7 . 1 , несущего в своем составе pNW61 или pND6I, с R. leguminosarum были получены клоны R. leguminosarum NW61M и R. leguminosarum ND61M, несущие в своем геноме соответствующие плазмиды в составе хромосомы как результат пер вого акта кроссинговера (см. рис. 2, б). Правиль ность встраивания плазмид по гомологии с оперо- ном срп-1 была подтверждена с помощью блот-гиб- р и д и з а ц и и по С а у з е р н у с использованием в качестве метки nptll гена плазмиды pANU2 (дан ные не приведены), а также гена српбО-1, ампли- фицированного с плазмиды рСІЗКІ с использова нием праймеров D13222 и D2753 («Alta Biosciences (см. «Материалы и методы») (рис. 3, дорожки 3 и 4). Частоты возникновения клонов клубеньковых бактерий, у которых произошло встраивание в геном плазмид pNW61 и pND61, представлены в табл 2. Следующим шагом в получении мутантов является отбор среди клонов /?. leguminosarum 519 F . P K . 0 В H , Л А Н Д П . А . Тыс. П. Н. 1 2 3 4 5 6 Рис. 3. Результаты блот-гибридизации по Саузерну геномной Д Н К производных штамма R. leguminosarum bv. viceae 8401/pRLI, рестрицированной Pstl; 2 — то же HindllJ; З — R. leguminosarum NM61M, рестрицированная PstP, 4 — то же Hindi77; 5 — R. leguminosarum ND61H, рестрицированная PstT, 6 — то же Hindlll. Полоса гибридизации 2,3 тыс. п. н. в контрольной линии 2 соответствует полному оперону срп-1 (см. рис. 1, а)у а полосы гибридизации 9 и 1 1 тыс. п. н. — оперонам срп-2 и срП'З NW61M и R. leguminosarum ND61M таких, у кото рых произошел второй кроссинговер с замещением гена дикого типа на мутантный или контрольный с одновременным вырезанием плазмиды (рис. 2, б и б). Частоты возникновения таких клонов представ лены в табл. 3, а результаты их блот-гибридизации по Саузерну — на рис. 3 , дорожки 5 и 6. Как видно из табл. 3, частота возникновения контрольных клонов R. leguminosarum ND61H, не сущих ген nptll за неповрежденным геном срп6()-1 (см. рис. 1,<?), соответствует средней частоте воз никновения рекомбинаций, известной для R. legu minosarum. В то же время ни одного случая воз никновения мутантов R. leguminosarum, у которых произошло замещение гена српбО-7 на мутантный ген српбО-1::nptl7, обнаружено не было. Все клоны R. leguminosarum NW61M, появившиеся на среде с сахарозой и добавлением неомицина и стрептоми цина, продолжали нести в составе генома плазмиду pNW61 (с геном sac В, в котором, очевидно, про изошла мутация, что и привело к устойчивости этих клонов к сахарозе) или часть этой плазмиды. Таким образом, в результате проведенной ра боты показано, что один из генов српбО, кодирую щих гомологичные шаперонины у клубеньковых б а к т е р и й гороха R. leguminosarum bv. viceae 8 4 0 1 / p R L l , а именно: ген српбО-1, невозможно «вывести из строя», так как это приводит к гибели бактерий. Существует несколько объяснений полученным результатам. Во-первых, гомологичные гены српбО- 2 и српбО-3 не экспрессируются или их экспрессии недостаточно для поддержания процесса сборки белков на уровне, обеспечивающем нормальную жизнедеятельность клетки. Действительно, данные Таблица 2 Частоты возникновения клонов R. leguminosarum с плазмидой pNW6l или pNDOl в геноме, полученные в результате переноса этих плазмид из штамма Е. coli SI7.1 в R. leguminosarum bv. viceae 8401/pRLl Ш т а м м и е г о х а р а к т е р и с т и к а Ч а с т о т а и н т е г р а ц и и п л а з м и д ы pNWbl и л и pNDbl в х р о м о с о м у К о л и ч е с т в о п р о в е р е н н ы х к л о н о R. leguminosarumNW6\M (плазмида pNW61 с геном nptll, встроен ным в срп60-1, находится в составе бактериальной хромосомы) R. leguminosarum ND61M (плазмида pND61 с геном nptll, встроен ным в српЬО-1, находится в составе бактериальной хромосомы) 1-Ю 2 1 0 200 200 П р и м е ч а н и е . Частоты возникновения N m R , G m R , сахарозочувствительных клонов показаны как среднее четырех независимых скрещиваний. 520 Г Е Н C P N W 1 - I , ' К О Д И Р У Ю Щ И Й Ш А П Е Р О Н И Н У к І ,F.<il I M I N O S A k l 'М Табліща 3 Получение штамма R. leguminosarum с замещением гена српбО-l на мутантный српбО-1:: nptll и контрольного штамма с геном nptll, встроенным за српЬО-1 Подсчитана как частота возникновения Nm , сахарозоустойчивых клонов; * 100 % — мутации в гене sacB (проверены 800 клонов); ***91 % — замещение гена српЬ0-1 на конструкцию српЬО-1 с nptll за этим геном; 9 % — мутации в гене sacB (проверены 100 клонов). об экспрессии оперонов срп-1 и срп-3 R. legu minosarum, полученные в результате исследований с помощью Р Т - П Ц Р ( П Ц Р тотальной матричной РНК с использованием ревертазы), показывают, что экспрессия оперона српбО-1 конститутивна, а оперон срп-3 экспрессируется только в микроаэроб ных условиях (П. А. Ланд, личное сообщение). Во-вторых, в случае, если оперон срп-2 экспресси руется на достаточно высоком уровне, а мутацию по гену срп60-1 получить не удается, это будет означать, что существует специфичность действия шаперонинов в зависимости от их аминокислотной последовательности. В. М. Єрко, П. А. Ланд Ген српЬО-1, який кодує один з гомологічних шаперонінів у Rhizobium leguminosarum, є важливим для життєдіяльності клітини Резюме З використанням методу сийт-специфічного мутагенезу зроб лено спробу побудувати нок-аут мутацію одного з трьох гомологічних генів для синтезу шаперонінів у R. leguminosarum bv. viceae. Показано, іцо ген срп60-1 не може бути «виведений з ладу» у зв'язку з його важливістю для життєдіяльності клітини. V. N. Ycrko, P. A. Lund Gene српЬ0-1 coding one of homologous chaperonins in Rhizobium leguminosarum is essential for cell life Summary Using the method of site specific mutagenesis we have tried to knock-out one of three homologous genes for chaperonins synthesis in Rhizobium. leguminosarum bv. viceae. It has been shown that cpnbO'l gene cannot be destroyed due to its essentiality for cell life. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Anfinsen С. В. Principles that govern the folding of protein chains / / Science. — 1 9 7 3 . — 1 8 1 . — P . 223—230 . 2. Ellis R. J. Proteins as molecular chaperones / / Nature.— 1987.—328.—P. 378—379 . 3. Zeilstra-Ryalls J., Payet ()., Georgopoulos C. The universally conserved GroE (Hsp60) chaperonins / / Anriu. Rev. Micro biol.—1991 . — 4 5 . — P . 3 0 1 — 3 2 5 . 4. Boorstain W. R., Zeigelhoffer Т., Craig E. A. Molecular evolution of the HSP70 multigene family / / J. Мої. Evol. 1994 .—38.—P. 1 — 17. 5. Payet O., Zeigelhoffer Т., Georgopoulos С The groES and GroEL heat shock gene products of Escherichia coli are essential for bacterial growth at all temperatures / / J. Bac ter id .—171 , N 3 — P. 1379—1385. 6. Pack K.-H., Walker G. C. Escherichia coli dnaK null mutants are inviable at high temperature / / J. Bacteriol.—1987. —169, N 1.—P. 283—290 . 7. Rusanganva E., Gupta R. S. Cloning and charecteri/.alion of multiple groEL chaperonin-encoding genes in Rhizobium meli- loti II Gene.— 1 993. — 1 2 6 . — P . 6 7 — 7 5 . 8. Babst M., llennecke Fischer H.-M. Two different mecha nisms are involved in the heat-shock regulation of chaperonni gene expression in Bradyrhizobiumjaponicum 11 Мої. Micro b i d . — 1 9 9 6 . — 1 9 , N 4 .—P. 8 2 7 — 8 3 9 . 9. Wallington E. J., Lund P. A. Rhizobium leguminosarum contains multiple chaperonin (српбО) genes / / Microbiology. - 1994.—140. — P. 113—122. 10. Ogawa J., Long S. R. The Rhizobium meliloti groELc locus is required for regulation of early nod genes by the transcription activator N'odD / / Genes and Development.—1995.—9.— P. 714—729 . 11. Simon R., Priefer U.t Puhler A. A broad host range mobiliza tion system for 'in vivo genetic engineering: transposoii muta genesis in gram negative bacteria / / Bio/Technology. — 1983. — 1 . — P . 7 8 4 — 7 9 1 . 12. Quandt J., Hynes M. P. Versatile suicide vectors which allow direct selection for gene replacement in gram-negative bacteria / / Gene .—1993 — 1 2 7 . — P . 15—21"'. 13. Maniatis Т., Pritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: Л laboratory manual. — New York: Cold Spring Harbor Lab. press, 1989.—545 p. 14. Beringer J. E., Beynon J. L., Buchanan-Wollaston Л. V., Johnston A. W. B. Transfer of the drug-resistance transposoii Tn5 to Rhizobium II Nature .—1978 .—276.—P. 633—634 15. Генетические методы селекции клубеньковых бактерий (методические рекомендации).—Л.: ВНИИСХМ, 1984. 16. Ausubef F. М. Current Protocols in Molecular Biology. —New York: Willey Intersci., 1987 .—320 p. 17. Birnboim H. C, Doly J. A rapid alcaline extraction procedure for screening recombinabt plasmid DNA / / Nucl. Acids Res.— 1979 .—7.—P. 1513—1523. УДК 575.24:576.851.155 Поступила в редакцию 17.06.98 521

Ген cpn60-1, кодирующий один из гомологичных шаперонинов у Rhizobium leguminosarum, является важным для жизнедеятельности клетки

Institution

Similar Items