Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании

Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании

Исследована субклеточная локализация и активность фосфо­рилазы (КФ 2.4.1.1) в мини-клубнях S. tuberosum L. (сорт Адрета). Мини-клубни формировали в условиях стационарного контроля и при воздействии клиностатирования, имитирую­ щего микрогравитацию. В экспериментах использовали метод стерильной культ...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Date:2004
Main Authors: Недуха, Е.М., Шнюкова, Е.И.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2004
Series:Біополімери і клітина
Subjects:
Клітинна біологія
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157212
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании / Е.М. Недуха, Е.И. Шнюкова // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 6. — С. 498-504. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-157212
record_format dspace
spelling nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1572122025-02-09T09:38:05Z Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании Субклітинна локалізація і активність фосфорилази у паренхімних клітинах міні-бульб Solarium tuberosum L. при клиностатуванні Subcellular localization and activity of phosphorylase in parenchyma cells of Solanum tuberosum L. minitubers at clinorotation Недуха, Е.М. Шнюкова, Е.И. Клітинна біологія Исследована субклеточная локализация и активность фосфо­рилазы (КФ 2.4.1.1) в мини-клубнях S. tuberosum L. (сорт Адрета). Мини-клубни формировали в условиях стационарного контроля и при воздействии клиностатирования, имитирую­ щего микрогравитацию. В экспериментах использовали метод стерильной культуры мини-растений, электронно-цитохими­ ческий метод выявления локалилизации фосфорилазы, а также биохимические методы для определения содержания углеводов, активности фосфорилазы и ее изоферментного состава. Установлено, что клиностатирование не влияет на субклеточ­ную локализацию фосфорилазы и электрофоретическую по­ движность ее изоформ, однако вызывает повышение активно­сти фосфорилазы и содержания крахмала в запасающих орга­нах картофеля. Досліджували субклітинну локалізацію і активність фосфорилази (КФ 2.4.1.1) у міні-бульбах S. tuberosum L. (сорт Адрета). Міні-бульби формували за умов стаціонарного контролю та при дії клиностатування, яке імітувало мікрогравітацію. В експериментах використано метод стерильної культури міні-рослин, електронно-цитохімічний метод виявлення локалізації фосфо­рилази, а також біохімічні методи для визначення вмісту вуглеводів, активності фосфорилази та її ізоферментного складу. Встановлено, що клиностатування не впливає на субклітинну ло­калізацію фосфорилази і електрофоретичну рухливість її ізоформ, але спричинює підвищення активності фосфорилази та вмісту крохмалю в запасних органах картоплі. The subcellular localization and the phosphorylase (EC 2.4.1.1) activity in parenchyma cells of Solanum tuberosum L. (sv Adreta) minitubers have been investigated. The minitubers were formed in the stationary control and under influence of horizontal clinorotation, which imitated microgravity. The next methods used in the experiments: i) the method of sterial culture of miniplants, ii) electronic cytochemical method, and iii) biochemical methods for the determination of carbohydrates content, phosphorylase activity, and isoenzyme composition of phosphorylase. It is established that clinorotation does not influence the subcellular localization of phosphorylase and the electrophoretic mobility of phosphorylase isoforms; however, the clinorotation increases the phosphorylase activity and starch content in potato storage organs. 2004 Article Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании / Е.М. Недуха, Е.И. Шнюкова // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 6. — С. 498-504. — Бібліогр.: 24 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0006CF https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157212 577.152.9; 581.151; 582.926.2 ru Біополімери і клітина application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Клітинна біологія
Клітинна біологія
spellingShingle Клітинна біологія
Клітинна біологія
Недуха, Е.М.
Шнюкова, Е.И.
Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании
Біополімери і клітина
description Исследована субклеточная локализация и активность фосфо­рилазы (КФ 2.4.1.1) в мини-клубнях S. tuberosum L. (сорт Адрета). Мини-клубни формировали в условиях стационарного контроля и при воздействии клиностатирования, имитирую­ щего микрогравитацию. В экспериментах использовали метод стерильной культуры мини-растений, электронно-цитохими­ ческий метод выявления локалилизации фосфорилазы, а также биохимические методы для определения содержания углеводов, активности фосфорилазы и ее изоферментного состава. Установлено, что клиностатирование не влияет на субклеточ­ную локализацию фосфорилазы и электрофоретическую по­ движность ее изоформ, однако вызывает повышение активно­сти фосфорилазы и содержания крахмала в запасающих орга­нах картофеля.
format Article
author Недуха, Е.М.
Шнюкова, Е.И.
author_facet Недуха, Е.М.
Шнюкова, Е.И.
author_sort Недуха, Е.М.
title Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании
title_short Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании
title_full Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании
title_fullStr Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании
title_full_unstemmed Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании
title_sort субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней solanum tuberosum l. при клиностатировании
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2004
topic_facet Клітинна біологія
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157212
citation_txt Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании / Е.М. Недуха, Е.И. Шнюкова // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 6. — С. 498-504. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.
series Біополімери і клітина
work_keys_str_mv AT neduhaem subkletočnaâlokalizaciâiaktivnostʹfosforilazyvparenhimnyhkletkahminiklubnejsolanumtuberosumlpriklinostatirovanii
AT šnûkovaei subkletočnaâlokalizaciâiaktivnostʹfosforilazyvparenhimnyhkletkahminiklubnejsolanumtuberosumlpriklinostatirovanii
AT neduhaem subklítinnalokalízacíâíaktivnístʹfosforilaziuparenhímnihklítinahmíníbulʹbsolariumtuberosumlpriklinostatuvanní
AT šnûkovaei subklítinnalokalízacíâíaktivnístʹfosforilaziuparenhímnihklítinahmíníbulʹbsolariumtuberosumlpriklinostatuvanní
AT neduhaem subcellularlocalizationandactivityofphosphorylaseinparenchymacellsofsolanumtuberosumlminitubersatclinorotation
AT šnûkovaei subcellularlocalizationandactivityofphosphorylaseinparenchymacellsofsolanumtuberosumlminitubersatclinorotation
first_indexed 2025-11-25T10:29:40Z
last_indexed 2025-11-25T10:29:40Z
_version_ 1849757881243533312
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2004. Т. 20. № 6 К Л І Т И Н Н А БІОЛОГІЯ Субклітинна локалізація і активність фосфорилази у паренхімних клітинах міні-бульб Solarium tuberosum L. при клиностатуванні О. М. Недуха, Є. I . Шнюкова Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України Вул. Терещенківська, 2, Київ, 01601, Україна Досліджували субклітинну локалізацію і активність фосфорилази (КФ 2.4.1.1) у міні-бульбах S. tuberosum L. (сорт Адрета). Міні-бульби формували за умов стаціонарного контролю та при дії клиностатування, яке імітувало мікрогравітацію. В експериментах використано метод стерильної культури міні-рослин, електронно-цитохімічний метод виявлення локалізації фосфо­ рилази, а також біохімічні методи для визначення вмісту вуглеводів, активності фосфорилази та її ізоферментного складу. Встановлено, що клиностатування не впливає на субклітинну ло­ калізацію фосфорилази і електрофоретичну рухливість її ізоформ, але спричинює підвищення активності фосфорилази та вмісту крохмалю в запасних органах картоплі. Вступ. Відомо, що в умовах реального космічного польоту та при повільному горизонтальному кли­ ностатуванні, яке моделює біологічні ефекти мікро­ гравітації, відбуваються зміни в структурно-функ­ ціональній організації гравітаційночутливих тка­ нин і клітин, а також у метаболізмі рослин, насам­ перед вуглеводному [1 , 2 ] . Під впливом мікро­ гравітації виявлено такі зміни вуглеводного мета­ болізму: модифікація структури крохмалю сім'ядо­ лей проростків Glycine Willd. [З ], зниження вмісту кристалічної целюлози, пектинів і крохмалю у клітинах Funaria hygrometrica [2, 4 ] , збільшення кількості крохмальних зерен у хлоропластах лист­ ків Brassica гара [5] і зміна активності а-амілази, ендо- та екзоцелюлаз, які беруть участь у гідролізі полісахаридів [4, 6 ] . Встановлено кореляцію між інтенсивністю змін у рівні вуглеводного метабо­ лізму та тривалістю впливу мікрогравітації [1 ]. Питання про зміни вмісту вуглеводів у запасних органах рослин при дії мікрогравітації лишається відкритим. Ми припустили, що зміни у метаболізмі запасних вуглеводів рослин в умовах реального космічного польоту є наслідком змін активності ферментів, пов 'язаних із синтезом первинного і © О. М. НЕДУХА, Є. І. ШНЮКОВА, 2004 вторинного крохмалю. Одним із таких ферментів є фосфорилаза (КФ 2.4.1.1), яка бере участь в обміні крохмалю, синтезуючи амілозу шляхом глюкозиль- ного переносу з глюкозо-1-фосфату [7] . Тради­ ційно фосфорилаза рослин розглядається як фер­ мент, який гідролізує крохмаль [8, 91. За останні роки показано, що а-поліглюкан може функціо­ нувати не лише як донор глюкозних залишків, але і як акцептор, і тоді фосфорилаза діє як глюкан- синтезувальний фермент, збільшуючи співвідно­ шення ортофосфату до глюкозо-1-фосфату [10]. Метою нашої роботи було вивчення ефектів клиностатування (2 об/хв) на ріст крохмаль-запас- них органів міні-бульб картоплі, субклітинну ло­ калізацію та активність фосфорилази (КФ 2.4.1.1), а також на вміст крохмалю, моно- і дисахаридів у міні-бульбах картоплі. Біла картопля (.S. tubero­ sum) — один із восьми видів культурних рослин, що запропоновано програмою Б С Ж З (Біологічна система життєзабезпечення) для підтримки життя астронавтів у космосі при тривалих польотах [11]. Матеріали і методи. Об'єктом дослідження були 10- і 30-добові міні-бульби картоплі (5. tube­ rosum L., сорт Адрета). Материнські міні-рослини картоплі вирощували в стерильних умовах у куль- 498 турі на агаризованому середовищі Мурасіге і Скуга (МС) [12] протягом 6 тижнів при температурі 24 °С та добовому освітленні лампами денного світла 80 м М м 2 с ч (5000 л к ) . Для утворення міні-бульб материнську рослину розрізали на сег­ менти (висотою до 4 см з одним листком), які пересаджували на модифіковане агаризоване сере­ довище МС з наступними добавками (мг /л ) : віта­ мін В, — 0 , 1 ; вітамін В 6 — 0,5; вітамін В 5 — 0,5; аскорбінова кислота — 3,0; індолілоцтова кислота (ЮК) — 1,0—3,0; кінетин — 2,5; абсцизова кисло­ та (АБК) — 0 , 5 — 1 , 5 ; аденін — 0,25; мезоінозит — 10,0; гліцин — 2,0. Для формування міні-бульб на столонах використовували такі умови: 8 год освіт­ лення лампами холодного денного білого світла 80 м М м 2 с _ І (5000 л к ) , 16 год — темрява; темпе­ ратура: 18 °С — уночі і 24 °С — удень. Повторність дослідів чотириразова. У кожному досліді в стаціонарному контролі та при клиноста- туванні використано по 105 рослин. Половину про­ бірок із столонами ставили на горизонтальний кли- ностат (2 об /хв ) , другу половину (стаціонарний контроль) — поряд з клиностатом. Для дослідів використовували 10- і 30-добові бульби, які збира­ ли через 4 год після початку освітлення, їх зважу­ вали, фотографували і фіксували для електронно- цитохімічного виявлення локалізації фосфорилази [13]. Зрізи серединної частини міні-бульб товщи­ ною біля 1 мм фіксували у 2,5 %-му розчині глутарового альдегіду у 0,5 М фосфатному буфері, рН 7,4, протягом 1 год при 4 °С. Далі матеріал промивали 0,22 М розчином сахарози в ідентич­ ному буфері і проводили інкубацію при 37 °С протягом 30—40 хв у розчині такого складу (мМ): глюкозо-1-фосфат — 5, аденозин-5-фосфат — 0,3 , сахароза — 0,44, N a F — 20, P b ( N 0 3 ) 2 — 3,6, аце­ татний буфер — 80, рН 5,8. Після інкубації ма­ теріал промивали, дофіксовували 2 % - м розчином O s 0 4 , обезводжували етиловим спиртом і ацетоном та заливали у суміш епоксидних смол (епон/арал- дит) за методикою [10] . Для контролю цито­ хімічної реакції до інкубаційного середовища дода­ вали 5 мМ флоризин або ж 1 мМ C u ( N 0 3 ) 2 . Ультратонкі зрізи одержували на ультрамікротомі LKB. Неконтрастовані зрізи вивчали за допомогою електронного мікроскопа JEM-1200EX. Активність фосфорилази у міні-бульбах визна­ чали за методом [14] ; кількість фосфору — за ме­ тодом Родіонова та ін. [15] ; характеристику ізо- ферментного складу фосфорилази — за методом Гербранді та Верлеура [16] ; вміст вуглеводів — СУБКЛІТИННА ЛОКАЛІЗАЦІЯ І АКТИВНІСТЬ ФОСФОРИЛАЗИ антроновим методом [17] , білок — за Лоурі [18] . Для цитологічних та біохімічних експериментів використовували хімічні реактиви фірми «Sigma» (США). Одержані дані обробляли статистично. Результати і обговорення. Стаціонарний кон­ троль. Фенологічне спостереження показало, що міні-бульби картоплі утворювалися з пазушних бруньок та зрідка — на столоні. Формування бульб починалося на 9—10-ту добу після пересадки на модифіковане поживне середовище. Відсоток сфор­ мованих бульб був високим (табл. 1), на частині столонів (20 %) бульби не утворювалися. 10-денні міні-бульби були кулястими і мали зелений колір. Світлова мікроскопія поперечних зрізів сере­ динної частини бульби показала наявність ззовні перидерми (4—5 шарів, включаючи епідерміс), за якою розміщувалася крохмаль-запасна паренхіма (44,6±2,1 шарів) з амілопластами. Електронно-ци- тохімічне дослідження локалізації фосфорилази у крохмаль-запасних кл ітинах першого—третього шарів паренхіми виявило наявність преципітату реакції у пластидах та цитоплазмі, а саме: у стромі, на поверхні крохмальних зерен (рис. 1, а, б) або на всьому зерні крохмалю амілопластів, а також в ендоплазматичному ретикулумі (рис. 1, в). Продукт цитохімічної реакції представлений неве­ ликими гранулами фосфату свинцю розміром від 2 до 15 нм; розподіл преципітату за розмірами по субструктурах ам ілопласт ів був гетерогенним (табл. 2) . Іноді спостерігали «пилевидний» продукт реакції, пов 'язаний з периферією крохмалю або із стромою. У паренхімних клітинах виявлено гетеро­ генність цитохімічної реакції: в одній частині амі­ лопластів відмічено наявність преципітату, у дру­ гій — продукт цитохімічної реакції був відсутнім (табл. 3) . Така гетерогенність амілопластів, оче­ видно, свідчить про те , що синтез вторинного крохмалю в амілопластах відбувається у різних пластидах неодночасно, навіть в одній клітині. Причини подібного феномену поки лишаються не- з 'ясованими. У контролях цитохімічної реакції на активність фосфорилази, інкубованих з додаванням флоризину чи C u ( N 0 3 ) 2 , преципітат цитохімічної реакції був відсутнім. Встановлено, що вміст крохмалю у міні-буль­ бах був досить високим (табл. 1), тоді як вміст моно- і дисахаридів був у 8 разів меншим, ніж крохмалю (табл. 1). Активність фосфорилази у бульбах 10-добового віку була високою (табл. 1). У 10-денних міні-бульбах виявлено два ізоферменти фосфорилази (рис. 2, б). У гель-системі, яка місти- 499 НЕДУХА О. М., ШНКЖОВА С I. Таблиця J Ростові та біохімічні показники JO- і 30-добових міні-бульб картоплі Показник Стаціонарний контроль Клиностатування, 2 об/хв Показник 10 діб ЗО діб 10 діб ЗО діб Відсоток сформованих міні-бульб 80,00±2,40 80,00±2,40 97,70±2,90 97,70±2,90 Розмір міні-бульб, мм: довга вісь 2,68±0,36 5,88±0,49* 3,00±0,33 6,72±0,61* коротка вісь 2,06±0,24 3,27±0,28* 2,75±0,25 3,20±0,16 Сира маса, кг 18,87±2,94 40,38±6,24** 23,75±2,71 33,67±2,78*** Кількість клітинних шарів на серединний зріз бульби 44,60±2,10 56,33±3,71** 55,30±3,85 67,70±2,28*** Вміст вуглеводів у бульбах, мг/г сухої маси: крохмаль 460,02±7,20 572,70± 10,90* 659,60±9,50 709,00± 14,90** моно-і дисахариди 58,30±1,20 50,10±2,40** 76,10±0,90 32,00±1,60* Вміст вуглеводів у бульбах, мг/г сирої маси: крохмаль 127,10±5,90 176,90±3,40* 151,00±7,90 199,50±5,40* моно-і дисахариди 16,70±0,40 15,40±0,70 18,30±0,Ю 8,90±0,50* Активність фосфорилази: мкМ Р • г сирої маси"1 • хв"1 0,830±0,036 1,498±0,078* 1,121 ±0,048 2,644±0,073* мкМ Р • г сухої маси - 1 • хв - 1 4,129±0,171 6,651 ±0,359* 5,290±0,227 9,372±0,260* мкМ Р • г білка"1 • хв~1 0,158 ±0,008 0,065±0,003* 0,168±0,008 0,113±0,004* *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,005. Рис. 1. Локалізація фосфорилази у фрагментах паренхімних клітин міні-бульб картоплі, утворених у стаціонарному контролі: а—в — 10-добові бульби; г, д—30-добові бульби. Преципітат цитохімічної реакції показано стрілками; А — амілопласт; Е. р. — ендоплазматичний ретикулум; К. з. — крохмальне зерно; Об — оболонка клітини; С — строма ла крохмаль або глікоген як затравку, одна анодна смуга з Rf = 0,36 характеризувалася вищою фосфо- рилазною активністю, ніж друга, менш просунута до аноду, із /? f = 0,14. За період із 10-ї по 30-ту добу колір бульб перетворився на зелено-жовтий або жовтуватий. Форма бульб не змінилася, вона була кулястою та видовженою. Розмір міні-бульб збільшився у 1,5 разу, а сира маса — вдвічі (табл. 1), число шарів запасної паренхіми — в 1,3 разу. Локалізація продукту цитохімічої реакції на фосфорилазу лишилася незмінною: продукт реакції виявлявся у стромі та на крохмальних зернах (рис. 1, г, д). Щільність продукту реакції в амілопластах збільшилася (табл. 3) . Біохімічним методом також встановлено підвищення активності фосфорилази (табл. 1) та виявлено два ізоферменти, які за Rf не відрізнялися від ізоферментів у 10-добових бульбах (рис 2, г) . Клиностатування (2 об/хв.) Утворення міні- бульб в умовах горизонтального клиностатування починалося на 2—3 доби раніше, ніж у контролі. Відсоток утворених міні-бульб був більшим і стано­ вив 97. Міні-бульби утворювалися як із пазушної бруньки, так і на столоні, за аналогією до контро­ лю. 10-денні міні-бульби, як і в контролі, були кулястими, іноді витягнутими, проте забарвлені 500 СУБКЛІТИННА ЛОКАЛІЗАЦІЯ І АКТИВНІСТЬ ФОСФОРИЛАЗИ Таблиця 2 Вміст цитохімічного преципітату, який маркував фосфорилазу у різних субструктурах пластид міні-бульб картоплі, сформованих у контролі Амілопласти, у субпродуктах яких виявлено преципітат цитохімічної реакції, % Вік міні-бульб, дні У стромі На периферії зерна крохмалю На всій поверхні зерна крохмалю Пластиди, у яких преципітат відсутній, % 10 36 40 3 21 зо 32 36 6 26 Таблиця З Щільність цитохімічного преципітату, який маркував фосфорилазу в амілопластах паренхіми міні-бульб картоплі, сформованих у контролі Вік міні-бульб, дні Щільність преципітату, який маркував активність фосфорилази у різних субструктурах поверхні 2 пластиди, од/0,5 мкм У стромі На периферії зерна крохмалю На всій поверхні зерна крохмалю 10 7,368±0,989 2,850±0,534 12,158±0,672 зо 9,182±1,126 7,450±0,769 15,111 ±0,768 лише в зелено-жовтий колір. Ростові показники цих бульб відрізнялися від таких у контролі біль­ шими розмірами і більшою кількістю клітинних шарів (табл. 1). Структура перидерми та запасної паренхіми нагадувала таку у контролі. Субклі­ тинна локалізація фосфорилази у клітинах кро- хмаль-запасної паренхіми була ідентичною її ло­ калізації у клітинах стаціонарного контролю. Пре­ ципітат виявлявся у стромі та на крохмалі пластид, зрідка — в цитоплазмі (рис. З, я, б). Підрахунок гранулярного преципітату показав, що його щіль­ ність перевищувала такий у клітинах контролю (табл. 4, 5) . Необхідно також відмітити, що пози­ тивна цитохімічна реакція відбувалася не в усіх амілопластах. Біохімічне визначення вмісту крох­ малю у бульбах показало його зростання порівняно з контрольними зразками (табл. 1). Тоді як вміст моно- і дисахаридів був низьким. Активність фос­ форилази була вищою, ніж у відповідному конт­ рольному матеріалі. Нами відмічено збільшення інтенсивності забарвлення двох ізоферментів фос­ форилази (рис. 2, а) у порівнянні з такою в контрольних зразках, що свідчило про інтенсив- ніший синтез лінійного глюкану — амілози з глю­ козо- 10-фосфату. У клиностатованих 30-добових міні-бульбах (табл. 1) відмічено такі зміни. Розмір та сира маса міні-бульб, як і кількість шарів клітин, у них збільшилися, майже всі бульби були жовтого ко­ льору. Присутність фосфорилази виявлено у стромі пластид, по периферії крохмальних зерен або ж на всій поверхні крохмалю (рис. 1, в, г ) , у цитоплазмі продукт реакції виявлявся дуже рідко. Преципітат був відсутній у частині амілопластів (табл. 4) . Щільність цитохімічного преципітату у стромі амі­ лопластів була вищою в шість разів у порівнянні з відповідним контролем, по периферії крохмалю — у 10 разів і по всій поверхні крохмальних зерен — у шість разів (табл. 5 ) . Визначення вмісту крохмалю показало також його підвищення, тоді як пул моно- і дисахаридів зменшився удвічі порівняно з бульбами, утворени­ ми в умовах стаціонарного контролю (табл. 1). Біохімічний аналіз виявив суттєве (удвічі) зростан­ ня активності фосфорилази у порівнянні з такою у 10-денних клиностатованих міні-бульбах. Встанов­ лено підвищення інтенсивності забарвлення двох ізоферментних зон фосфорилази з # f 0,14 і 0,36 у міні-бульбах 30-добового віку порівняно з 10-ден- ними (рис. 2) . Таким чином, порівняльний аналіз ростових показників міні-бульб, сформованих в умовах кон­ тролю та при 30-добовому горизонтальному клино- статуванні, свідчить про те , що в умовах скаляри- зації вектора гравітації відбувається прискорений ріст запасних органів картоплі за рахунок збіль­ шення кількості клітинних шарів. Можливо, це могло бути наслідком прискореного поділу клітин та /або прискореного росту клітин розтягненням. Подібні дані описані Дж. Пербалем із співавт., які 501 НЕДУХА О. М., ШНЮКОВА Є. I. -R/0J4 Rf0,36 Рис. 2. Ізозимні спектри фосфорилази, виявлені електрофоре­ тичним методом у міні-бульбах картоплі, які сформувалися при клиностатуванні (а, в) та в стаціонарному контролі (б, г); а, б — 10-добові бульби; в, г — 30-добові бульби Рис. 3. Локалізація фосфорилази у фрагментах паренхімних клітин міні-бульб картоплі, утворених при клиностатуванні: я, б — 10-добові бульби; в, г — 30-добові бульби. Преципітат ци­ тохімічної реакції указано стрілками; А — амілопласт; Е. р. — ендоплазматичний ретикулум; К. з. — крохмальне зерно; М — мітохондрія; Об — оболонка клітини; С — строма виявили підвищення мітотичного індексу коренів чечевиці, що зростала в умовах реального косміч­ ного польоту [19] . Одержані нами дані стосовно збільшення вміс­ ту крохмалю, підвищення активності фосфорилази та зниження вмісту моно- і дисахаридів у клино- статованих міні-бульбах свідчать про суттєві зміни вуглеводного метаболізму у запасних органах кар­ топлі при тривалій дії зміненої гравітації. Зв 'язок метаболізму сахарози із синтезом крохмалю у бульбах картоплі в умовах in vivo відомий. Коре­ ляцію прискореної мобілізації сахарози із збіль­ шенням синтезу крохмалю раніше виявлено в [20] при порівнянні синтезу крохмалю у бульбах дикого виду картоплі та картоплі, в яку трансформували пірофосфатазний ген з Escherichia coli. Відомо, що ріст бульб картоплі відбувається з одночасним відкладанням вторинного крохмалю у крохмаль-запасній паренхімі. Крім цього, є свід­ чення того, що бульби картоплі формуються і ростуть з участю фітогормонів (гіберелінової кисло­ ти, Ю К та АБК) , які індукують прискорений ріст запасних органів і синтез вторинного крохмалю [21, 22 ] . Можна припустити, що тривале клиноста­ тування викликає суттєві зміни фітогормонального балансу при формуванні запасних органів картоплі. Електронно-цитохімічне дослідження субклі­ тинної локалізації фосфорилази у міні-бульбах картоплі показало наявність фосфорилази не лише у пластидах, а й у цитоплазмі. Аналогічну ло­ калізацію фосфорилази описано і у фотосинтезу- вальних клітинах рослин [13, 23 ] . Відомо, що вищі рослини містять два типи фосфорилази: перша — пластидна, друга — цитозольна. Альбрех із співавт. методом імунної мікроскопії листків і бульб кар­ топлі показали, що під час нагромадження крохма­ лю у запасних органах відбувається експресія від­ повідних генів Phi а та Ph2b [23] . Зважаючи на ці дані, а також на результати, одержані нами по збільшенню активності фосфорилази у паренхімі, яка запасає крохмаль, ми припустили, що при тривалій імітації невагомості експресія генів Phi а та Ph2b може прискорюватися. Крім цього, врахо­ вуючи дані літератури про те, що синтез вторинно­ го крохмалю залежить від швидкості синтезу моно- та дисахаридів у фотосинтезувальних органах та експорту сахарози у запасні органи [24 ] і одержані нами результати стосовно зниження вмісту моно- і дисахаридів у клиностатованому матеріалі, можна припустити, що при тривалому клиностатуванні відбуваються суттєві зміни у швидкості не лише 502 СУБКЛІТИННА ЛОКАЛІЗАЦІЯ І АКТИВНІСТЬ ФОСФОРИЛАЗИ Таблиця 4 Вміст цитохімічного преципітату, який маркував фосфорилазу у різних субструктурах пластид міні-бульб картоплі, сформованих при клиностатуванні Таблиця 5 Щільність цитохімічного преципітату, який маркував фосфорилазу в амілопластах паренхіми міні-бульб картоплі, сформованих при клиностатуванні синтезу моно- і дисахаридів, але й транспортуван­ ня сахарози у міні-бульби картоплі. О. М. Nedukha, Е. 1. Schnyukova Subcellular localization and activity of phosphorylase in parenchyma cells of Solanum tuberosum L. minitubers at clinorotation Summary The subcellular localization and the phosphorylase (EC 2.4.1.1) activity in parenchyma cells of Solanum tuberosum L. (sv Adreta) minitubers have been investigated. The minitubers were formed in the stationary control and under influence of horizontal clino­ rotation, which imitated microgravity. The next methods used in the experiments: i) the method of sterial culture of miniplants, ii) electronic cytochemical method, and Hi) biochemical methods for the determination of carbohydrates content, phosphorylase activity, and isoenzyme composition of phosphorylase. It is established that clinorotation does not influence the subcellular localization of phosphorylase and the electrophoretic mobility of phosphorylase isoforms; however, the clinorotation increases the phosphorylase activity and starch content in potato storage organs. E. M. Недуха, E. И. Шнюкова Субклеточная локализация и активность фосфорилазы в паренхимных клетках мини-клубней Solanum tuberosum L. при клиностатировании Резюме Исследована субклеточная локализация и активность фосфо­ рилазы (КФ 2.4.1.1) в мини-клубнях S. tuberosum L. (сорт Адрета). Мини-клубни формировали в условиях стационарного контроля и при воздействии клиностатирования, имитирую­ щего микрогравитацию. В экспериментах использовали метод стерильной культуры мини-растений, электронно-цитохими­ ческий метод выявления локалилизации фосфорилазы, а также биохимические методы для определения содержания углеводов, активности фосфорилазы и ее изоферментного состава. Ус­ тановлено, что клиностатирование не влияет на субклеточ­ ную локализацию фосфорилазы и электрофоретическую по­ движность ее изоформ, однако вызывает повышение активно­ сти фосфорилазы и содержания крахмала в запасающих орга­ нах картофеля. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Kordyum Е. L. Biology of plant cells in microgravity and under clinostating / / Int. Rev. Cytol.-1997.~171.—P. 1—78. 2. Сытник К. M., Кордюм Е. Л., Недуха О. М., Фомичева В. М. Растительная клетка при изменении геофизических факторов.—Киев: Наук, думка, 1984.—134 с. 3. Kuznetsov О., Brown Сh., Levine Н., Sanwo М., Hasensteinn К. Space-grown plants show modified starch structure: Abstr. of 33rd COSPAR 2000 (Warsaw, 16—28 July).—Warsaw, 2000.—P. 631. 4. Nedukha О. M. Effect of microgravity on the structure and function of plant cell wall / / Int. Rev. Cytol.—1996.—170.— P. 39—77. 5. Jiao S., Hilaire E., Paulsen A., Guikema J. Ultrastructural observation of altered chloroplast morphology in space-grown Brassica rapa cotyledon / / J . Gravit. Physiol.—1999.—6, N 1.—P. 93—94. 6. Popova A. F., Kordyum E. L., Shnyukova E. I., Sytnik К. M. Plastid ultrastructure, fractional composition and activity of amylases in Chlorella cells in microgravity / / J. Gravit. Physiol.—1995.—N 2,—P. 159—160. 7. Smith A., Denyer К., Martin C. The synthesis of starch granule / / Annu. Rev. Plant Physiol, and Plant Мої. Biol.— 1997.—48.—P. 67—87. 8. Steup M., Peavey D. G., Gibbs M. The regulation of starch metabolism by inorganic phosphate / / Biochem. and Biophys. Res. Communs.—1976.—72.—P. 1554—1561. 9. Heldt H, Chu C, Maronde D.y Herold A., Stankovic Z. S. Role of orthophosphate and other factors in the regulation of starch formation in leaves and isolated chloroplasts / / Plant Physiol.—1977.—59.—P. 1146—1155. 503 http://Cytol.-1997.~171.� НЕДУХА О М., ШНЮКОВА € . I. 10. Watson К, McCleverty С , Geremia S., Cottoz S., Driguez Я., Johnson L. Phosphorylase recognition and phosphorolysis of its oligosaccharide: answers to long outstanding questions / / EMBO J.—1999.—18.—P. 4619—4632. 11. Croxdale J., Cook Г., Tidbits Т., Brown C. S., Wieeler R. M. Structure of potato tubers formed during space flight II J. Exp. Bot.—1997.—48.—P. 2037—2043. 12. Murashige T, Skoog F. A. A revised medium of rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture / / Physiol. Plantar.— 1962.—43, N 1.—P. 20—25. 13. Недуха E. M. Локализация активности фосфорилазы в клетках протонемы фунарии влагомерной / / Цитология.— 1977, № 9.—С. 1062—1064. 14. Ермаков А. И., Арасимович В. В., Яроиі Я. Я., Перу­ анский Ю. В., Луковников Г. А., Иконникова М. И. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А. И. Ермакова.—Ленинград: Агропромизд, 1987.—430 с. 15. Родионова В., Холопцева М. Определение фосфолипидов листьев двухмерной хроматографией в тонкослойном се- ликагеле / / Физиология растений.—1974.—6, № 2.— С. 201—204. 16. Gerbrandy S.t Verleur J. Phosphorylase isozymes localization and occurrence in different plant organs in relation to starch metabolism / / Phytochemistry.—1971.—10.—P. 261—266. 17. Болотова В. Ц., Саканен Е. И., Лесиовская Е. Е., Пасту- шенков Л. В. Спектрофотометрический метод определения содержания полисахаридов в листьях Tilia cordata II Растительные ресурсы.—2001.—37, № 3.—С. 109—112. 18. Lowry О. Я., Rosenbrough N. Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent III. Biol. Chem.—1951.—193, N l . - P . 265—275. 19. Perbal G., Driss-Ecole D., Rutin J.t Salle G. Graviperception of lentil seedlings roots grown in space (Spacelab Dl Mission) / / Physiol Plantar.—1987.—70.—P. 119—126. 20. Geinberger P., Hajirezaei M., Geiger M., Deiting U.t Son- newald U., Stitt M. Overexpression of pyrophosphatase leads to increased sucrose degradation and starch synthesis, in­ creased activities of enzymes for sucrose-starch interconver- sions, and increased levels of nucleotides in growing potato tubers / / Planta.—1998.—205.—P. 428—432. 21. Xu X.t van Lammeren A., Vermeer E.t Vreugdenhil D. The role of gibberellins, abscisic acid, and sucrose in the regulation of potato tuber formation in vitro II Plant Physiol.—1998.— 117.—P. 575—581. 22. Vreugdenhil D., Struik P. An integrated view of the hormonal regulation of tuber formation in piotato (Solanum tuberosum) II Physiol. Plantar.—1989.—75.—P. 525—531. 23. Albrechy Т., Koch A., Lode A., Greve В., Schneider-Mergener J., Steup H. Plastidic (pho-l-type) phosphorylase isoforms in potato {Solanum tuberosum L.) plants: expression analysis and immunochemical characterization / / Planta.—2001 .—213.—P. 602—613. 24. Курсанов А. Л. Транспорт ассимилятов в растении.—M.: Наука, 1976.—646 с. УДК 577.152.9; 581.151; 582.926.2 Надійшла до редакції 12.11.03 504

Similar Items