Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів

В огляді на прикладах багатьох досліджень розглянуто проблеми регуляції експресії генів за допомогою антисенсових РНК у прокаріотах та в еукаріотичних клітинах. Знані у увагу приділене проблемі створення внутрішньоклітинної резистентності проти вірусів з використанням антисенсових РНК Аналізуються...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:	Биополимеры и клетка
Datum:	1998
Hauptverfasser:	Кухаренко, О.П., Швед, А.Д.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainisch
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1998
Schlagworte:	Обзоры
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157482
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів / О.П. Кухаренко, А.Д. Швед // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 6. — С. 477-487. — Бібліогр.: 56 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1860134370424127488
author	Кухаренко, О.П. Швед, А.Д.
author_facet	Кухаренко, О.П. Швед, А.Д.
citation_txt	Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів / О.П. Кухаренко, А.Д. Швед // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 6. — С. 477-487. — Бібліогр.: 56 назв. — укр.
collection	DSpace DC
container_title	Биополимеры и клетка
description	В огляді на прикладах багатьох досліджень розглянуто проблеми регуляції експресії генів за допомогою антисенсових РНК у прокаріотах та в еукаріотичних клітинах. Знані у увагу приділене проблемі створення внутрішньоклітинної резистентності проти вірусів з використанням антисенсових РНК Аналізуються загальна концепція та стратегія побудови штучних систем антисенсової регуляції експресії генів у клітинах еукаріот. В обзоре рассмотрены результаты многих публикаций по проблеме регуляции экспрессии генов с помощью антисенсовых РНК в прокариотических и эукариотических клетках. Уделено внимание созданию моделей внутриклеточной устойчивости против вирусов с использованием антисенсовых РНК. Анализируются общая концепция и стратегия создания систем, антисенсовой регуляции экспрессии генов в клетках эукариот. The review summarises results of a large number of publications on the problem of gene expression regulation by antisense RNA in procaryotic and eucaryotic cells. A special attention devoted to the intracellular immunization and antiviral, resistance based on anti-sense RNA. Common principles of modelling of antisense regulation in eucaryotic. cells are discussed.
first_indexed	2025-12-07T17:46:19Z
format	Article
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1998. Т. 14. № 6 О Б З О Р Ы Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів О. П. Кухаренко, А. Д. Швед Інститут молекулярної біології та генетики HAH України 2.52143, Київ, вул. Академіка Заболотного, 150 В огляді на пршсладах багатьох досліджень розглянуто проблеми регуляції експресії генів зо допомогою антисенсових РНК у прокаріотах та в еукаріотичних клітинах. Знані у увагу приділене проблемі створення внутрішньоклітинної резистентності проти вірусів з використанням анти сенсових РНК Аналізуються загальна концепція та стратегія побудови штучних систем антисенсової регуляції експресії генів у клітинах еукаріот. Вступ. Сучасні наукові погляди на проблему регу ляції окремих генів у клітині грунтуються на до свіді досліджень природних механізмів експресії генетичної інформації-та точному визначенні пер винної структури Д Н К обраних генів. Ц е й напря мок започатковано у шестидесяті роки, коли до слідження базувалися на феноменологічному під ході. За браком інформації про первинну послі довність генів досліди тих часів нагадували пошуки гіпотетичної «нуклеїнової субстанції», коли до ку льтур клітин додавали иефракціоновану суміш природних нуклеїнових кислот, одержаних з різних джерел, як вірусного походження, так і гомо логічних клітинних Р Н К та Д Н К , намагаючись у такий спосіб підвищити опір клітин проти вірусної інфекції. Згодом, з опануванням хіміками методів штучного синтезу нуклеїнових кислот з певною послідовністю та секвенування Д Н К ці досліди набули характеру досконалої наукової методології і стали теоретичним підґрунтям галузі сучасної біо- технології — створення штучних олігодеоксинукле- отидів та їхніх похідних з визначеною біологічною та біохімічною активністю. Такі підходи до регу ляції генів базуються на здатності комплементар них послідовностей нуклеїнових кислот утворювати дзоспіральні гібридні лг/нцюги Уотсона-Крика. чЗа цим принципом комплементарні олігонуклеотиди було названо гібридонами, або антисенсовими нук леїновими кислотами, оскільки вони за структурою первинної послідовності збігаються з ланцюгами Д Н К , протилежними кодуючому (сенсовому) лан цюгу. ( С ) О. П. КУХАРЕНКО, А. Д. ШВЕД, 1998 Публікації [1 , 2 ] вважаються основоположни ми в цій галузі та часто цитуються у наукових оглядах і експериментальних роботах стосовно вип робувань антисенсових синтетичних олігодеокси- нуклеотидів та антисенсових Р Н К з метою регу ляції експресії клітинних і вірусних генів [3—51 На певному етапі цих досліджень, а саме тоді коли розробки генної інженерії створили можли вості для конструювання штучних генів, або ре- комбінантних Д Н К , виникла ідея побудови моле кулярних конструкцій, які після введення їх де живої клітини здійснювали б синтез подовжених (сотні або тисячі нуклеотидів завдовжки) антисен сових Р Н К (асРНК) , спрямованих проти визначе ного гена-мішені [6, 7 ] . Відкриття на початку 80-х років природного механізму антисенсової регуляції експресії бактеріальних генів [ 8 — Л \| стало базою для ідеї створення систем ендогенного синтезу асРНК з метою штучної регуляції генів. Розпоча лося активне дослідження можливостей та ме ханізмів антисенсової регуляції експресії генія ^ допомогою штучно створених рекомбінантких кон струкцій на різних клітинних моделях та еука ріотичних клітинно-вірусних системах 112— 14 \| Згодом, наприкінці 80-х років, ідея антисенсової регуляції набула наукового визнання у молеку лярній біології. Цьому сприяло відкриття природ них ендогенних а с Р Н К в еукаріотичних клітинах та у вірусів еукаріот [15—17] . Зараз асРНК засто совуються в багатьох лабораторіях світу як альтер натива генним мутаціям у дослідженнях функції) генів. Регуляторний механізм а с Р Н К полягає в тому що, крім транскрипції гена з сенсового л а н ц ю / 477 КУХАРЕНКО О. П., ШВЕД А. Д. Д Н К , здійснюється транскрипція з другого, анти- сенсового, у зворотному напрямку. В результаті подвійної антипаралельної транскрипції з ' являють ся мРНК і комплементарні їм асРНК. З а існу ючими у я в а м и , м Р Н К , утворюючи дуплекс з асРНК, втрачає здатність зв 'язуватися з рибосомою і не транслюється. Перспектива створення штучної системи регуляції генів спонукала дослідників до експериментів, які показали, що трансляцію дійсно можна блокувати введенням до клітини асРНК, комплементарних м Р Н К конкретного білка. Нако пичені на сьогодні дані переконливо свідчать про здатність асРНК специфічно регулювати експресію визначеного гена на тслятранскрииц ійних стадіях. Приклади природної антисенсової регуляції генів у прокаріотах . У роботі [10] вперше було отримано експериментальне підтвердження при родного механізму, в якому інвертована послі довність (ISlO-елемент) транспозона Т п Ю може негативно регулювати експресію свого власного білка транспозази на рівні трансляції . На 5 '-кінці IS10 Р Н К було знайдено ділянку довжиною 36 пар основ (п, о.}, комплементарну м Р Н К транспозази. Ц я антисенсова послідовність перекриває стартовий A U G - к о д о н і посл ідовність Ш а й н а - Д а л ь г а р н о транспозазного гена. Гібридизація цих двох транс- криптів перешкоджає зв ' я зуванню м Р Н К з рибосо мою та її трансляції . Але найперший доказ регуля торної ролі природних а с Р Н К було отримано при вивченні механ і зму к о н т р о л ю в а н н я копійності плазмід у бактеріальних клітинах. Механізм регу ляції реплікації плазмідних Д Н К з репліконами родин ColElMD та incFII відбувається через вза ємодію двох РНК-транскриптів [18] . Ініціація син тезу одного з цих транскриптів (РНК II) почи нається на відстані 555 п. о. від точки початку реплікації art В цьому районі Р Н К II залишається згібридизованою зі своєю Д Н К - м а т р и ц е ю і розщеп люється Р Н К а з о ю Н в точці початку реплікації. Фрагмент розщепленої Р Н К служить затравкою для ДНК-полімерази І, яка синтезує новий ланцюг Д Н К . Друга Р Н К довжиною 108 основ ( Р Н Г І) транскрибується з протилежної нитки Д Н К в об ласті, що кодує 5 ' -к інець Р Н К II. Комплементарне зв 'язування Р Н К І та Р Н К II порушує гібри дизацію останньої з Д Н К - м а т р и ц е ю та її функцію як РНК-затравки для ДНК-пол імерази . Ефективність блокування залежить від швид кості гібридизації Р Н К І з Р Н К II , яка повинна відбуватися раніше, ніж згібридизуються Р Н К II та Д Н К . Швидкість зв ' я зування двох Р Н К регулю ється вторинною структурою взаємодіючих моле кул та білком Rom, що їх стабілізує. Аналіз вто ринної структури послідовностей Р Н К І і Р Н К II виявив у них обох три паліндроми, які утворюють три шпильки [18] . Згідно з запропонованою модел лю, взаємодія між молекулами Р Н К J і РНК і і відбувається спочатку в районі відкритих петель відповідних паліндромів (RNA kissing), що забезпе чує наступне просторове зближення 5 -кінця РНК І з Р Н К II і утворення гибриду довжиною 108 л, о. за принципом «застібки-блискавки». Білок Rom, який сприяє утворенню гибриду в клітинах, ко дується ділянкою плазміди, що знаходиться між 402 та 708 п. о. у 3 ' -напрямку від точки ініціації реплікації. Отже, синтез м Р Н К білкг активується реплікацією Д Н К , білок Rom прискорює гібри дизацію Р Н К І та Р Н К II, що призводить до блокування реплікації плазміди і обмеження її копіювання у клітині. Регуляція ініціації реплікації плазмід за уча стю низькомолекулярних Р Н К у прокаріот є роз повсюдженим механізмом. Такий спосіб регуляції є загально визнаним також для плазмід родин RI, F та NRI бактерій Escherichia соїіу р'Т18 бактерій Staphylococcus aureus. Причому наслідки асРНК регуляції реплікації та копійності плазмід RI та F є фатальними для клітин Е. соїі. Тут асРНК (ген sok) довжиною 180 п. о. блокує м Р Н К гена mok. А білок Мок позитивно регулює трансляцію мРНК гена hok, білковий продукт якого є летальним токсином для Е, colL У разі недостатньої копійності плазміди синтезується багато білка Нок, від якого бактерія загине. Якщо копійність плазміди з геном sok вище необхідного порога, sok блокують транс ляцію mok і трансляція м Р Н К hok не активується, оскільки гибрид перших двох (асРНК : мРНК) руй нується у клітині Р Н К а з о ю III. У Е, соїі також за участю асРНК, комплемен тарної м Р Н К гена білка OmpF, регулюється жит тєво важлива для бактерій функція . Білки О т р С та OmpF виконують функцію пор клітинної мембрани бактерії, через які відбувається дифузія гідрофі льних молекул і завдяки яким бактерії пристосо вані до змін осмотичного тиску поживного середо вища. Експресія О т р С регулюється осмосом через сигнали у промоторі гена, але підвищення осмотич ного тиску поряд із збільшенням продукції О т р С призводить до зниження продукції OmpF, Секве нування цих генів [19] дозволило виявити унікаль ний механізм регуляції генної експресії, опосеред кований новим різновидом Р Н К , яку було назване micRNA (mRNA-interfering complementary RNA';. Виявлена Р Н К довжиною 174 п. о. кодується неза- л е ж н о ю транскрипційною одиницею, названою /шсі^-геном, який розташований у 5 ' -напрямку від гена отрС, але транскрибується в зворотному на прямку. Цей РНК-транскрипт містить ділянку до 478 вжиною 80 п. о., комплементарну 5 ' -к інцю м Р Н К білка OmpF в районі, що охоплює послідовність Шайна-Дальгарно і AUG-кодон [19] . Автори при пустили, що ця micRNA, гібридизуючись з м Р Н К OmpF, блокує трансляцію останньої. Продукція цієї Р Н К здійснюється пропорційно продукці ї м Р Н К білка О т р С , тому паралельно з підсиленням його синтезу відбувається зростання транскрипції асРНК, здатної блокувати експресію білка OmpF. У цьому полягає механізм підтримання постійно су марної кількості білків OmpF и OmpC. Цей природний механізм було відтворено в модельному експерименті і доведено можливість пригнічення експресії білка OmpF за допомогою штучного гена а с Р Н К [20 ]. Для цього ділянку гена отрС довжиною біля 300 п. о. (антисенсова до ompF область) було вирізано вище промотора, зі лито з геном /J-галактозідази і вбудовано в плаз - міду. У клітинах, трансформованих такою пл^з - мідою з химерною послідовністю разом з а с Р Н К до вищерозташованої послідовності-мішені, в разі ін дукції галактозидазного гена спостерігали майже повне пригнічення синтезу білка OmpF. Приклади природної асРНК-регуляц і ї експ ресії генів у еукаріот . Про існування природного механізму антисенсової регуляції генів у клітинах вищих еукаріот вперше засвідчено у роботі [15] при вивченні транскрипції гена дегідрофолатредук- тази (ДГФР) у клітинах миші. Рівень цього ф е р менту регулюється протягом клітинного циклу, хоча транскрипцією гена керує конститутивний промотор. На певній стадії розвитку клітин від бувається різке зростання синтезу білка. Встанови ти підвищення чи зниження рівня транскрипції гена Д Г Ф Р не вдалося, але в ядрах клітин виявле но групу неполіаденільованих транскриптів довжи ною 180—240 п. о., які синтезувалися на проти лежному ланцюгу Д Н К гена Д Г Ф Р . Експеримен тально доведено, що згадані транскрипти, які комплементарні ділянці сигналу термінації транс крипції м Р Н К Д Г Ф Р , за рахунок спарювання з останньою можуть впливати на експресію всь то гена. Слід відмітити, іцо малі неполіаденільовані транскрипти детектувалися лише в ядрі, тобто їхня регуляторна роль, можливо, асоційована з транс крипцією або транспортом м Р Н К у цитоплазму. Згодом свідчення про існування і регуляторні функції природних асРНК з 'явилися у ході дослід жень експресії с-тус иротоонкогена у л імфоцитах людини та в клітинах л імфоми Беркіта [16] (рані- ліе було досліджено вплив штучних конструкцій з ас.РНК проти транскриптів генів тус). З а антисен- совим механізмом регулюється також синтез ф а к - АНТИСЕНСОВІ РНК ЯК. ЗАСІК РЕГУЛЯЦІЇ ККСПРЕСІЇ ГЕНІ И тора трансляції eIF-2a в Т-лімфоцитах людини [17] та процесинг м Р Н К гена р53 у клітинах еритролейкемії мишей під час їхньої індукованої диференціації [21 ]. В останніх двох випадках син тез транскриптів з а с Р Н К регулювався трансдук- торними шляхами , а самі а с Р Н К мали лише 80 % гомології з мішенню. Цікавим проявом антисенсової регуляції є бло кування експресії мієлінового білка у нейронах дефіцитних за мієліном мишей-мутантів [22 \|. Тут відбулася еволюційна дуплікація цілого гена міє ліну та прилеглих послідовностей одночасно з ре версією в його межах ланки з кількома централь ними екзонами та інтронами. Незалежна транс к р и п ц і я н о р м а л ь н о г о т а м у т а н т н о г о ген ів розташованих тандемно у хромосомі, ефективно блокує процесинг м Р Н К обох генів та призводить до спадкової патології тварин. Віднайдено також, що на ранніх стадіях інфек ційного циклу ВІЛ-1 з його З ' -LTR експресуються довгі антисенсові транскрипти, які пригнічують його 5 ' -LTR промотор [23, 24 ]. Число прикладів природною механізму анти сенсової регуляції генів у клітинах еукаріот постій но збільшується і зараз сягає десятків. Проте now-А що не знайдено природних асРНК у рослинах Подальші дослідження природних клітинки к ме ханізмів антисенсової регуляції можуть допомогти узагальненню розрізнених уявленнь про регуляцію генів за допомогою а с Р Н К та вдосконаленню під ходів до моделювання штучних генетичних конст рукцій на цій основі. Використання а с Р Н К д л я штучної регуляції генів в еукаріотах . Свідчення про можливість ви користання а с Р Н К в еукаріотичній системі вперше були представлені [6 ] на прикладі експресії тимі- динкіназного (ТК) гена. В цій роботі транскрипти з антипаралельного ланцюга гена вперлге було названо «антисенсовими Р Н К » . Автори видалили фрагмент структурної частини гена ТК вірусу гер песу довжиною 1364 п. о. починаючи з 51-го нуклеотиду н и ж ч е AUG-кодону, і вбудували у плазміду під промотор у зворотній орієнтації. При спільній мікроін 'єкції в ядра ТК" ї,-клітин мишей двох плазмід — з ТК-геном і з а сРНК у спів відношенні копій 1:100 — частота появи ТК^-клі- тин знижувалася у 4—5 разів порівняно з клі тинами, до яких вводили таку ж надлишкову кількість плазміди без анти-ТК-послідовностей ра- зом з ТК-геном. Ефект був специфічним, оскільки а с Р Н К проти герпетичного ТК-гена не впливали на експресію ТК-гена курчати . 1, навпаки,, анти-ТК- послідовність до ТК-гена курчати пригнічувало експресію Т К курчати , але не вірусного гена. 479 К У Х А Р Е Н К О О. П., Ш В Е Д А- Д . У своїх подальших дослідженнях [7] автори використали різні а с Р Н К до м Р Н К Т К герпесу. Було сконструйовано плазміду , що експресу є асРНК, комплементарні до 5 - к і н ц я м Р Н К ТК-гена вірусу герпесу, які перекривають 80 п. о. вище AUG-кодона і 343 основи його структурної області. Мікроін'єкція такої плазміди разом з Т К - п л а з - мідою у співвідношенні 2 0 0 : 1 у ядра L-клітин забезпечувала суттєвіше зниження частоти появи ТК + -к.літин, ніж попередньо створена плазміда, що утримувала ас-иослідовності тільки до структурної частини ТК-гена . Для визначення мінімальної довжини Р Н К Г достатньої для блокування гена комплементарними транскриптами, було створено конструкцію, у якій промотор і 52 п. о. лідерної 5'-області ТК-гена вірусу герпесу були вбудовані перед рамкою транс ляції ТК-гена курчати [7 ] . Ц я химерна конст рукція при мікроін'екції у ядра L-клітин забезпе чувала нормальну експресію Т К курчати. Однак у разі спільної ін 'єкці ї цієї плазміди з надлишком алтисенсової (до 5 ' -к інця ТК-гена вірусу герпесу) .плазміди спостерігали м а й ж е повне пригнічення експресії ТК-гена курчати. Але при співвідношенні цих плазм ід 1:1 в ідтворюваною блокування не спостерігалося. Варто відмітити, що у цих перших роботах з асРНК-регуляці ї автори відтворили дві можливі моделі штучного блокування гена. У першій вплив спрямовано на ендогенні клітинні транскрипти — спочатку переводили клітини у тип Т К + , а потім трансдукували в них антисенсову конструкцію і отримували ефект пригнічення. У другій моделі асРНК спрямовували проти екзогенних послідов ностей, що відповідає системі внутрішньоклітин ного опору проти певного екзогена. Автори створи ли таку систему на прикладі бактеріального гена х л о р а м ф е м і к о л а ц е т и л т р а н с ф е р а з и (ХАТ) . Вони спочатку трансфікували клітини вектором з геном асРНК та отримали високий рівень його експресії, а вже потім ввели до клітин плазміду з геном ХАТ і спостерігали повне пригнічення синтезу білка [7 ]. У ході досліджень ще однієї штучної системи антисенсової регуляції, яка відповідала першій зга даній моделі, автори також отримали докази при гнічення за допомогою а с Р Н К природних клітин них генів \|7 ]. Автори створили вектор, що експре- сує а с Р Н К проти /3-актину. При введенні до клітини вектора, продукуючого а с Р Н К до гена структурного білка цитоскелету /3-актину, відбу валося пригнічення синтезу цього білка, уповіль нювався ріст клітин і знижувалася кількість мікро- фібрилярних актинових структур. Руйнування ак- тинових волокон у клітинах було відмічено і при введенні 5 '-кепованої а сРНК довжиною 500 п. о., синтезованої in vitro на фрагменті ДНК-матриці актинового гена. Зміни в мікроін'вкованих клі тинах свідчили про те, що регуляторні механізми, які мають забезпечувати необхідний рівень актину, були не спроможні компенсувати вплив асРНК. Згодом було створено та досліджено ще кі, ка конструкцій з асРНК проти різних ділянок ТК-гена вірусу герпесу [12] . Плазміда рМОКТІ містила фрагмент довжиною 1100 п. о., що включав 53 п о. 5'-неструктурно!' частини ТК м Р Н К і всі кодуючі послідовності, за винятком останніх 23 м, о. Плаз міда pMDKT2 включала 5 ' -фрагмент довжиною 301 п. о. (сегмент А) і 225 п. о. З -кінця ТК-гена (сегмент С ) . Плазміда рМВКТЗ — тільки сегмент С. При трансфекції в ТК^ L-клітин и плазміди pMDKT2 (сегменти А і С) або рМВКТЗ (тількт, сегмент С) у клонах відбувалося пригнічення на 80—90 % ТК-активності . При цьому синтез у клітинах асРНК в кількості 5-10° молекул нд клітину в 300 разів перевищував ТК м Р Н К . Однак у клітинах, трансформованих плазмідою pMDKTL що утримувала майже всю ас-послідовпість ТК- гена, високого рівня синтезу асРНК і пригніченні! ТК-активності не спостерігали. Питання про те. чому конструкції з коротшими ас РНК ефективніше блокували Т К м Р Н К , залишилося без відповіді Крім того, не було виявлено різниці між впливом асРНК, комплементарних 5 ' - і 3 -ділянкам мРНК ТК-гена . Отже, з отриманих результатів виплива ло, що блокування 5 ' -ділянки м Р Н К не с обов'яз ковою умовою активності а сРНК, оскільки асРНК, комплементарна 225 п. о. З ' -ділянки мРНК, шо кодує С-кінець білка, також пригнічувала її експ ресію. Причому 95 % двониткових Р Н К , що мали ТК-послідовності, містилися в ядрі, а довжина дуплексних ділянок, захищених від нуклеазного розщеплення, складала 225 п. о., тобто дорівню вала С-сегменту а с Р Н К . Оскільки у вихідних ТК L-клітинах вся Т К м Р Н К виявлялася в цитоплазмі, а в клітинах, що продукують ас-транскрилти, ТК м Р Н К Е містилися переважно в ядрі, автори припу стили, що знюкення ТК-активності асРНК до С фрагмента гена обумовлене порушенням транспор ту ТК м Р Н К у цитоплазму, де вона залучається де трансляції у полісомах. З а сучасними поглядами, результати тут пояс нюються кращими кінетичними характеристиками коротких асРНК. При цьому автори не мали відо мостей стосовно того, що сигнали транспорту та поліаденілювання Т К м Р Н К також могли бути мішенями асРНК у клітинах. Детально досліджено механізм блокування ге на креатинкінази у лімфоїдних клітинах людини 480 штучними асРНК [25] . Тут різними а с Р Н К блоку вали 3''-область гена. Виявилося, що а с Р Н К , яка перекривала два останніх екзони з інтроном, стоп- к о д о н та с а й т З ' -процесингу-поліаденілювання м Р Н К , ефективно пригнічувала синтез креатин- кінази у трансформованих клітинах. Однак а с Р Н К не виливала ні на сплайсинг, ні на поліадені- лювання, ні на транспорт м Р Н К у цитоплазму . Не відмічено навіть погіршення зв ' я зування м Р Н К з полісомами трансляції. Отже, автори д ійшли вис новку, що асРНК блокували синтез білка на стадії термінації трансляції. Визначним дослідженням штучної антисенсової регуляції в еукаріотах було вивчення .впливу асРНК на гени теплового шоку Drosophila melano- gaster [261. Ц я робота цікава тим, що автори в и к о р и с т а л и систему і н д у ц и б е л ь н о г о син тезу асРНК і, таким чином, продемонстрували м о ж ливість визначення на рівні трансгенного організ'му функції гена, який є летальним. Раніше отримати такі мутації класичними підходами на рівні цілого організму було неможливо. Аналіз впливу р ізних асРНК показав, що блокування відбувається п р и зв 'язуванні останніх із трансляційними сигналами м Р Н К , оскільки а с Р Н К , які блокували л и ш е коду ючу ділянку м Р Н К , не змінювали рівня експресії її б ілка. Це був п е р ш и й приклад в и к о р и с т а н н я асРНК у дослідженні»; з біології розвитку. V подальших дослідженнях з використанням асРНК, які здійснювалися на різних моделял (клі тини миші та ооцити Xenopus, цілі трансгеині по асРНК організми комах D. tnelanogaster та грибів Dictyosteluim), отримували споріднені результати . З а цими результатами, пригнічення було суттєвим у разі наділення асРНК на сигнали трансляції (сайт кепування, зв ' язування з рибосомою) або інші важливі сигнали процесингу транскриптів . У кількох випадках ефективними були асРНК до З -кінця кодуючої послідовності генів та термі - натора трансляції. Відмічалася також значущість надлишкової експресії а сРНК проти мРНК-мігаені для її ефективного блокування. Інколи ефективною була експресія асРНК на однаковому з м ішенню рівні. Також сповіщалося про те, що а с Р Н К здатні блокували разом з геном-мішенню транскрипти вмсокогомологічного гена, що теж доводило спе цифічність дії а сРНК 116]. Застосування антисенсових Р Н К д л я при гнічення репродукції вірусів. Одну з перших сис тем в нутрішньокл і тинного ї му нітету на основі асРНК було створено в клітинах Е> соїі на прикладі однониткового н-РНК фага родини SP [27] . Геном в ф у с у має найпростішу будову і містить гени лише чотирьох білків. Два з них було обрано за м іше- АНТИСЕНСОВ) РНК ЯК ЗАСІБ РЕГУЛЯЦІЇ KKCOPVCIl ГЕНІ К ні — ген білків оболонки і ген реплікази. Фрагмен ти к Д Н К цих двох генів відповідно довжиною 247 та 159 п. о. (А і В) охоплювали ділянку з послідов ностями Шайна-Дальгарно та ініціаторного колону. Третій, О ф р а г м е н т , являв собою 3'-кінцеву ділян ку геному, кодуючу С-кінець реплікази. Ці фраг менти було вбудовано в антисенсовій орієнтаїг» та різній комбінації у плазміду під контроль промото ра лактозного оперона. В трансформованих плазмінами клітинах, об роблених перед інфікуванням Ш Т Г (індуктор лак тозного оперона) , відбувалося пригнічення репро дукції фага SP до 95 % . Результати свідчили, що найвпливовішими були а с Р Н К , комплементарні послідовностям Шайна-Дальгарно та AUG-кодону м Р Н К . Оскільки а с Р Н К з С-фрагментом З'-кінця геному також блокувала продукцію фага, що ке могло бути пов ' язане з процесами ініціації транс ляції , автори припустили, шо асРНК може пере шкоджати Р Н К - з а л е ж н і й РНК-репл іказ і в процесі транскрипції плюс-нитки геномної Р Н К у мінус- нитку . Ц е відкривало перспективу для асРНК Я К інгібіторів транскрипції РНК-вірусів. Згодом автори випробували асРНК проти іншої мішені в геномі фага SP — гена білка дозрівання [28] . На відміну від конструкцій попередньої робо ти [27] , де м ішенями а с Р Н К були капсидні б і л е та репліказа фага , копійність яких у клітині П літично-продуктивній стадії інфекції висока, у но вих конструкціях автори спрямували асРНК на мішень, копійність якої підтримувалася вірусом у кількості однієї молекули на фагову частку, що робило її вразлив ішою. Було створено п 'ять плаз мід з генами а с Р Н К різної довжини, комплемен тарних різним д і л я н к а м мРНК-мішені . Виявилося, що для с у т т є в о ю пригнічення експресії гена до статньо а с Р Н К д о в ж и н о ю 19 нуклеотидів, яка пе рекривала послідОіВність Шайна-Дальгарно . Довші молекули а с Р Н К до сайту ініціації трансляції були дещо ефективнішими. М а й ж е повного пригнічення репродукції фага SP вдалося досягти за допомогою асРНК, що відповїдалг. повнорозмірнїй мРНК з сайтами ініціації т р а н с л я ц і ї . Однак, якщо Ц І Й асРНК бракувало л и ш е 19 нуклеотидів, компле ментарних послідовності Шайіна-Дальгарно виш.е AUG-кодону, вона п р и г н і ч у в а л а репродукцію фага л и ш е на 2] %, На сьогодні створено чИлМало ефективних кон струкцій з асРНК проти фагі.3г проти вірусів рос лин [29—ЗО], щ е більше в ідоме ' антисенсових сис тем регуляції проти вірусів л ю д и н и . Але перші конструкції з а с Р Н К для пригнічеь 'ня вірусів сука ріот були створені на моделі пта шин их ретро- вірусів, У роботі [31] в н у т р і ш н ь о к л і т и н н и й сит:? 48! К У Х А Р Е Н К О О. П., Ш В Ь Д А. Д . двох різних ас РНК до гена env вірусу саркоми Рауса специфічно пригнічував експресію м Р Н К - мішені. При цьому дія а с Р Н К , комплементарної некодуючому З ' -к інцю м Р Н К , не відрізнялася від такої асРНК, комплементарної 5 - к і н ц ю м Р Н К , і завдяки кожній з них рівень Env знижувався до 20 %. Пригнічення репродукції вірусу асРНК, спрямованими проти 3 ' -к інця м Р Н К , на думку авторів, було результатом блокування сигналу па кування вірусної Р Н К у віріони або її транспорту з ядра в цитоплазму. Можливо також, що кінцевою причиною пригнічення репродукції вірусу був де фіцит капсидних білків Env. оскільки блокування З -кінця м Р Н К може призводити до блокування пзліаденілювання та прискорення деградації транс- к рип ту. Також було створено векторну конструкцію на базі ретро вірусу, яка н;/водила в клітинах синтез асРНК проти іншого пташиного ретровірусу [32, 33 ]. У цьому випадку вдалося досягти значного пригнічення репродукції вірусу за рахунок блоку вання сайта зв ' я зування ираймера зворотної транс крипції PBS (який є комплементарним З ' -кінцю клітинної т Р Н К ) . Механізм пригнічення вірусу бу ло встановлено набагато пізніше [34] . Згодом було створено вектори на базі ре тровірусу мишей MMLV, які ексиресували дві різні асРНК проти ретровірусу HTLV-1 в гемопоетичних клітинах кісткового мозку людини [35] . Ц е була перша модель генотерапії лентівірусної інфекції людини за допомогою а с Р Н К . Одна з цих асРНК блокувала понад 1000 п. о., починаючи з 5 , -к інця вфусних Р И К . Друга перекривала перший кодую чий екзон гена трансактиватора. Tax . Обидві асРНК, синтез яких спрямовував ранній промотор цитомегаловірусу, суттєво знижували продукцію в русу і його трансформуючий вплив на клітини, хоча синтез віріонної РНК та білків оболонки вірусу не змінювався. Імовірно, що перша асРНК блокувала упакування Р Н К у віріони, оскільки вона перекривала a s - сигнал інкапсидаціі, а друга пригнічувала синтез життєво важливого для про дуктивної інфекції HTLV вірусного трансактивато- ра Tax. Другий вектор з асРНК на базі MMLV було створено іншими авторами для пригнічення самого ж MMLV у л імфоцитах мишей [36] . Тут для забезпечення синтезу а с Р Н К було використано промотор гена т Р Н К (високоефективний промотор, з якого транскрибує клітинна РНК-полімераза III) . Вектор утримував відразу дві копії гена асРНК — по одній в кожному LTR, Довжина асРНК, спрямо ваних на гени gag та рої, становила всього 25 п. о. Рівні пригнічення продукції вірусу були відповідно 97 та 40 % для конструкцій з різними асРКК. Дослідження механізму пригнічення показало, им блокування відбувається на стадії трансляції вірус них м Р Н К . Б у л о створено в е к т о р и , що ексиресували асРНК проти вірусу бичачого лейкозу ВІЛ\ який с генеалогічно близький до ретровірусів імунол фі- цитів людини. Тут дві різні асРНК б \ л компле ментарними до 300 п. о. послідовності LTR або 1000 п. о. гена X трансактиватора вірусу [371. Промотором, що контролював експресію асРНК, авторами було обрано повнорозмірьий власний LTR BLV [38] , оскільки транскрипцію з останнього здатний трансактивувати Х-білок ВІД , Рівень при гнічення продукції вірусу у культурі клітин, транс- фікованих конструкцією, сягав 70 %.. Було реалізовано спробу пригнічення за допо могою асРНК репродукції вірусу SV40, Цей ДНК вірус має нескладну будову, його молекулярна біологія добре вивчена, і визначн ій мішень серед ключових генів було нескладно. За мішень а с РНК було обрано послідовність 5 ' -к інця мРНК Т-анти- гена довжиною 160 п. о., отже, пригнічення було спрямовано на послідовність or і вірусу Модель внутрішньоклітинного противірусного і му ї-нтету. основана на пригніченні в ірусною роплікона. вчя вилася цілком вдалою. Транскрипцію направляв промотор РНК-полімерази III (промотор V А і РНК аденовірусу людини) . За отриманими результата ми, оп-залежна реплікація у трансформованих ан тисенсовою конструкцією клітинах COS, то кон ститутивно синтезують Т-антиген, була пригнічена більш як на 50 %. Про блокування за допомогою асРНК репро дукції вірусів *з великими розмірами геному у людини сповіщалося рідко, оскільки будова та ре гуляція їхніх генів складна та недостатньо до сліджена. Але робота [39] є прикладом того, коли експресія всього величезного геному може бути значно пригнічена через блокування його ключо вих генів. Тут асРНК блокували мРНК структур но-регуляторного білка рр65 (UL83) цитомегало вірусу (CM.V). Цей білок — структурний віріон асоційований продукт, копійність якого с високою в інфікованій клітині і у вірі она х Він тако> трансформує клітини за якимось невідомим регул л торним механ ізмом. Експресія із складу пла- змідного вектора, створеного на основі ретровірусу к Д Н К р65 гена довжиною 4000 п, о. у антисенсозія орієнтації значно знижувала в інфікованих к л тинах рівні мРНК-мішені та білка вірусу. Синтс вірусної Д Н К та продукція CMV були майже по г ністю пригнічені. Але в інфікованих клітинах і\ - кож відмічено пригнічення експресії другого ген , 482 CMV pp71 (UL82), послідовність якого розташова на у тій самій м Р Н К , але нижче рр65. Обидва гени є гомологічними і виникли внаслідок дуплікації. З а попередніми даними, рр71 є трансактиватором без посередньо раннього промотора CMV. Отже, ство рена кострукція, можливо, блокувала відразу дві мішені в межах однієї біцистронної матриці . З т д о м у ході досліджень з молекулярної біо логії вірусів та спроб впливу на їхню репродукцію за допомогою асРНК почали з 'являтися підтвер дження гіпотези про існування природних регуля торних асРНК в еукаріотах на прикладі вірусних геномів. У роботі [40] експериментально показано можливість антисенсового блокування Р Н К вірусу поліоми та підтверджено існування природного ме ханізму антисенсової регуляції його генів. У циклі репродукції цього вірусу на ранніх стадіях. інфекції з являються транскрипти трьох генів, що кодують пухлинні білки. В цей період транскрипти пізніх генів присутні у клітині в дуже малій кількості. З початком реплікації вірусної Д Н К кількість пізніх транскриптів різко зростає разом з копійністю Д Н К , а вміст пухлинних білків у клітині в цей період зменшується, незважаючи на те, що синтез ранніх транскриптів майже не змінюється. Як вия вилося, репресія синтезу пухлинних білків спричи няється антисенсовим блокуванням ранніх м Р Н К пізніми транскриптами, в інтронах яких містяться комплементарні раннім послідовності. Далі автори експериментально довели, що при штучному змен шенні в ядрі пізніх транскриптів відбувається різке збільшення ранніх білків, а в разі штучного 'синте зу надлишку пізніх — зменшується кількість ран ніх РНК. Тобто регуляція експресії генів вірусу поліоми здійснюється шляхом зворотного зв 'язку з залученням асРНК. На завершення огляду досліджень асРНК мож на навести приклади проектів практичного застосу вання внутрішньоклітинної імунізації проти віру сів. Цікавою тут є модель противірусної резистент ності за рахунок асРНК на прикладі збудника тропічної лихоманки вірусу Денге та його спе цифічного носія — москіта [41 ]. Москіти є ланкою трансмісивного шляху інфікування людини цим вірусом. Організм та слинні залози паразита є місцем персистентної інфекції та ампліфікації збу дника у природі. Отже, через надання резистент ності проти вірусу клітинам комах можна блокува ти вірус у його природному резервуарі і в такий спосіб перервати трансмісивний шлях зараження ним людей. Автори розробки скористалися для переносу гена асРНК в організм комах вектором на базі іншого вірусу — Синдбіс. Введення в ендоцель комах рекомбінантного векторного вірусу Синдбіс з А Н Т И С Е Н С О В І P H K ЯК. З А С І Б РЕГУЛЯЦІЇ ЕКСПРЕСІЇ ГЕН.'.Н геном асРНК повністю блокувало репродукцію ві русу Денге у слинних залозах. З а мішень асРНК у геномі вірусу Денге було обрано ділянку 5 -кінця його транскрипту довжиною 560 п. о. Ця ділянка м Р Н К кодує рамку примембранного білка, потріб ного для пакування Р Н К у віріони, та містить інші генетичні сигнали, важливі для репродукції вірусу. Протягом 90-х років було створено та пе ревірено функціональну активність близько 20 різ них векторних конструкцій, експресуючих асРНК проти збудника СНІДу ВІЛ-1 . Першою публіка цією стосовно створення внутрішньоклітинної стій кості до ВІЛ були роботи [42, 431. Автори Д О С Я Г Л Е , 70—80 %-го пригнічення продукції ВІЛ за рахунок експресії а сРНК довжиною 407 п. о., яка блокувала 112 п. о. перед та 295 п. о. після стартового колону гена білка Gag, включаючи головний донорський сайт сплайсингу першого екзона всіх вірусних м Р Н К та частину сайта пакування Р Н К у віріон. Сенсовий транскрипт цієї ж послідовності теж при гнічував репродукцію ВІЛ у випадку гострої інфек ції клітин, але не діяв у хронічно інфікованих. Експресія асРНК відбувалася з плазмідного векто ра під контролем раннього промотора/енхансера цитомегалов ірусу у вигляді поліаденільованих транскриптів довжиною біля 600 п. о. У роботі [44] сконструювали вектор на оснозі MMLV-ретровірусу, який експресував асРНК проти ВІЛ до його сайта зв ' я зування праймера зворотної транскрипції PBS та до м Р Н К вірусного трансакти ватора Tat . АсРНК проти PBS мали довжину 18— 20 нуклеотидів та перекривали або безпосередньо сам PBS, або послідовність, розташовану з 5 '-кінця PBS у напрямку елонгації праймера. У створених конструкціях вторинна структура ділянки з асРНК була штучно детермінована таким чином, щоб остання знаходилася на верхівці петлі шпильки. Антисенсовою послідовністю проти Та ! була кДНК T a t - м Р Н К . Вона включала перший, спільний для всіх вірусних м Р Н К некодуючий єкзон довжиною 280 п. о., та перші 60 п. о. першого кодуючого екзона Ta t , які перекривали стартовий кодов трансактиватора. Всі ці послідовності експресу вали у складі м Р Н К селективного гена неоміцинфос фотрансферази (пео г) під контролем промотора ге на тимідинкінази вірусу герпесу. АсРНК проти PBS частково пригнічували ВІЛ в обох випадках, при чому асРНК проти PBS була ефективнішою, ніж асРНК проти 5 - P B S . АсРНК проти Таї не вплива ла на репродукцію ВІЛ внаслідок невдало обраних системи експресії та антисенсової послідовності. У роботі [45] автори створили та перевірили противірусну активність серії конструкцій, які екс- пресували 10 різних а с Р Н К практично проти всіх 483 КУХАРЕНКО О. П., ШВЕД А. Д. ділянок геному ВІЛ, виключаючи область R - U 5 LTR. Вектор та промотор для ендогенної експресії були ті ж самі, що й у роботі [42] . Тобто у цих роботах використано єдину векторно-клітинну мо дель, і результати дослідження 11 конструкцій підлягали порівнянню. З дослідів випливало, що найефективнішими є асРНК, які блокують ділянку першого кодуючого T a t / R e v екзона разом з ф л ан гами (78 % пригнічення) . Також значне при гнічення репродукції ВІЛ забезпечували а с Р Н К до послідовності рамки Gag довжиною 1000 п. о. Ніяких ds-сигналів ця асРНК не блокувала і гібри дизувалася лише з центральною ділянкою рамки Gag. Інші асРНК спричиняли незначний рівень пригнічення або не впливали на вірус. Щ е одну к о н с т р у к ц і ю , я к а експресу вала асРНК проти Tat екзона, було досліджено у роботі [46]. Автори створили рибозим типу «головки мо лотка», який розрізав вказаний екзон, та вбудува ли його у З ' -некодуючу ланку м Р Н К гена пео г . Д л я порівняння вони створили аналогічну конструкцію, яка відрізнялася від рибозим-експресуючого век тора відсутністю каталітичного домену рибозиму і утримувала лише антисенсові послідовності рибо зиму довжиною 48 п. о., комплементарні Ta t екзо на. Експресія цього рибозиму та асРНК у складі ретровірусного вектора на основі MMLV пригні чувала продукцікз вірусу, причому асРНК вплива ла суттєвіше. Було випробувано противірусну активність асРНК проти 5 ' -к інця м Р Н К ВІЛ, який відповідає за зв 'язування з рибосомами та утримує cw-сигна- ли кепування м Р Н К і TAR-елемент [47] . Довжина послідовності а с Р Н К складала лише 63 п. о. Експ ресія а сРНК відбувалася під контролем ретрові русного промотора LTR RSV. Транскрипти у кліти нах були кеповані та поліаденільовані. Рівень при гнічення репродукції віріонів складав від 60 до 90 %. Ми також здійснили спробу пригнічення ВІЛ-! за допомогою асРНК та сконструювали вектор, який експресує а с Р Н К проти першого кодуючого T a t / R e v екзона ВІЛ-1 довжиною 386 п. о. під контролем власного безенхансерного промотора ВІЛ-1 [48] . Антисенсова послідовність синтезува лася у клітинах як складова частина 5 '-некодуючої ділянки мРНК селективного гена пео г . У разі трансфекції цієї конструкції у ембріональні гемопо- етичні клітини людини вона знижувала продукцію вірусу у 100 разів та на 70 % блокувала синтез його антигенів Gag. Варто відзначити, що на прикладі Р Н К ВІЛ-1 було детально досліджено залежність блокуючого впливу асРНК від вторинної структури м Р Н К - мішені [49-51 ]. Спочатку автори підрахували за допомогою комп'ютерного аналізу вільну енергію утворення вторинних структур асРНК або від повідними м Р Н К в межах всього геному ВІЛ. Виявилося, що рівень вільної енергії утворення вторинної структури певною ланкою мРНК (або асРНК) корелює з її блокуючою активністю in vivo. Мішені-мРНК з слабкою вторинною структурою ефективніше пригнічувалися асРНК. Така ж за лежність відмічалася у випадках природної асРИК- регуляцїї генів у прокаріот. Гіпотези стосовно механізмів антисенсової ре гуляції експресії генів т а стратегія добору мішені для а с Р Н К . Найпоширенішим принципом асРПК- регуляції вважається блокування трансляції мРНК, тому сигнали ініціації цього процесу у стратегії добору мішені асРНК є пріоритетними. Але грун т у ю ч и с ь на сучасних п у б л і к а ц і я х з проблем асРНК-регуляці ї , при доборі ділянки та стратегії блоку трансляції м Р Н К автори інколи нехтують вибором 5 ' -к інця певної м Р Н К як мішені. У разі прокаріотичних систем та вірусів еукаріот вони аргументують це тим, що у випадку поліцис- тронних матриць ефект пригнічення не буде роз повсюджуватися на рамки трансляції , які розташо вані нижче і виходять за межі ділянки-мішені. Ця обставина, на думку авторів, диктує необхідність конструювання систем, продукуючих більш подо вжені ас-транскрипти, комплементарні тільки ко дуючим послідовностям м Р Н К з незначною вто ринною структурованістю. Щ е одним аргументом авторів на користь довших а с Р Н К , відповідно ієну ючому уявленню про механізм їх дії, с де града ці 5і їхніх дуплексів з м Р Н К у клітині. Тому довші двониткові РНК-г ібриди повинні являти собою уразливіші мішені для деградуючих ферментів, що підсилюватиме ефект пригнічення їхньої транс ляції . Деякі автори, застосовуючи асРНК у фунда ментальних дослідженнях, не вдаються до ана літичного пошуку ділянки для блокування в межах мРНК-мішені і використовують повнорозмірну по слідовність означеного гена або його кДНК у анти- сенсовій орієнтації. Проте за рахунок довжини асРНК рідко досягається максимальний ефект бло кування мРНК-мішені . З накопиченням позитивного та негативного досвіду з використання асРНК фахівці , аналізуючи «невдалі конструкції», дійшли висновку, що для блокування м Р Н К важливо враховувати ступінь вторинної структурованості мішені та націленої на неї а сРНК. Ступінь вторинної структурованості транскриптів, а також білки клітини, які взає модіють з м Р Н К , суттєво впливають на ефек тивність утворення гібриду м Р Н К : асРНК у про- 484 А Н Т И С Е Н С О В І РНК. ЯК. З А С І Б Р Е Г У Л Я Ц І Ї ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ каріотах та клітинах еукаріот. Частіше ефектив нішими G асРНК, спрямовані проти ділянок м Р Н К з вторинною структурою типу шпильки з великими неспарованими петлями. Цій петлі у межах мішені в ідповідатиме в ідкрита для спарювання петля асРНК і ініціювання утворення гібриду буде енер гетично вигідним. З метою досягнення мінімальної структурова ності ас РНК та збільшення її «мобільності» не варто використовувати транскрипти довше 150— 350 нуклеотидів, оскільки з досвіду відомо, що асРНК довжиною 75—125 п. о. проти вдало вибра ної мішені є не менш ефективними і більш спе цифічними, ніж транскрипти довше 1000 п. о. Варто відзначити, що механізм дії а сРНК у прокаріотах досліджено краще, ніж в еукаріотах. Відмінним тут є те , що в бактеріальних клітинах показано руйнування довгих двоспіральних Р Н К РНКазою III [52] . В еукаріотах механізм блоку вання внаслідок деградації гібридів нуклеазами є найпростішою серед інших гіпотез, жодну з яких поки що не доведено. Серед останніх це інтер ференція з транспортними білками та блок транс порту м Р Н К через ядерні пори, блокування сиг налів процесингу (сплайсингу, поліаденілювання, кепування та ін.) . Чимало спекулятивного ма теріалу представлено стосовно клітинних білків еукаріот, які можуть модулювати утворення гіб ридних двоспіральних РНК [3] . Також вже є відомості про кілька ферментів еукаріотичних клі тин, які направлено модифікують иуклеотиди дво спіральних Р Н К та роблять неможливою їхню трансляцію (наприклад. Double Strand RNA Un- windase) . Але вказані білки відкриті у клітинах віддалених організмів, їхні основні функції не схо жі, а їхня експресія регулюється за механізмами, де двоспіральні РНК не відіграють ролі актива торів. Тому робити узагальнення щодо всіх таких випадків, як механізм асРНК-блокування , немож ливо. Однак двоспіральні Р Н К здатні активувати 2 - 5 ' - о л і г о а д с и і л а т с и н т е т а з у , я к а п р о д у к у є ррр(2'р5'А}„ поліаденілати. Ці незвичайні молеку ли активують ендорибонуклеазу L, яка деградує вірусні та клітинні Р И К [53] . Двоспіральні Р Н К також здатні активувати у клітинах хребетних кіназу DDPK (Double-s t rand-RNA Dependent P r o tein Kinase серин-треонінової специфічності) , суб стратом якої служить трансляційний eIF4a, актив ний у нефосфорильованій формі. Звичайно, ця кіназа може якось впливати через інші субстрати у клітині на активність Р Н К а з , але це ще досконало не досліджено. Двоспіральні Р Н К також можуть піддаватися у клітині ковалентній модифікації та інактивації білком, який активується інтерферо ном — Interferon-Inducible Double-Stranded RNA- specific Adenosine Deaminasa (dsRAD) [54 ]. При конструюванні штучних систем регуляції генів за допомогою асРНК намагаються досягти максимального рівня останніх у клітині завдяки сильному конститутивному промотору, що вигля дає цілком виправданим. Однак відомо, що для кожного окремого випадку існує иороговий рівень відношення копійності а с Р Н К / м Р Н К , вище якого ефект блокування не сягає [51 ]. У багатьох випад ках тисячократний надлишок асРНК проти мішені не давав повного пригнічення її експресії. Інколи ефективною була експресія а с Р Н К на однаковому з мішенню рівні. У деяких випадках асРНК-регу- ляції в еукаріотах як у природних клітинних сис темах, так і в експериментально створених від бувається суттєве блокування гена незначним рів нем асРНК, навіть стехіометрично меншим від рівня мішені, що пояснити механістично не просто. Вірогідніше всього, тут має місце специфічна взає модія асРНК з певними сайтами м Р Н К , що викли кає дестабілізацію і втрату функціональних вла стивостей мішені без ефекту «вититровування» асРНК. Таким чином, за браком повної картини моле кулярних механізмів асРНК-блокування в еука ріотичних клітинах у пошуках мішені для асРНК поки що значну роль відіграє емпіричний підхід. Проте застосування антисенсового методу регуляції генів поширюється, і у сучасних наукових до слідженнях асРНК, як і антисенсові олігоиуклео тиди, використовують в експериментальній онко логії [55—56] , біотехнології, оскільки асРНК є зручним аналогом генних мутацій. Також асРНК займають одне з перших місць серед засобів внут рішньоклітинної імунізації клітин проти вірусів у генотерапп. А. П. Кухаренко, А. Д. Швед Антисенсовые РНК как средство регуляции экспресии генов Резюме В обзоре рассмотрены результаты многих публикаций по проблеме регуляции экспрессии генов с помощью антисенсовых РНК в прокариотических и эукариотических клетках. Уделено внимание созданию моделей внутриклеточной устойчивости против вирусов с использованием антисенсовых РНК. Анали зируются общая концепция и стратегия создания систех,, антисенсовой регуляции экспрессии генов в клетках эукариот. А. P. Kukharenko, A. D. Shved Antisense RNA as a tool for regulation of gene expression Summary The review summarises results of a large number of publications on the problem of gene expression regulation by antisense RNA hi 485 КУХАРЕНКО О П., ШВЕД А. Д. procaryotic and eucaryotic cells. A special attention devoted to the intracellular immunization and antiviral resistance based on anti- sense RNA. Common principles of modelling of antisense regulation in eucaryotic cells are discussed, СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Zamecnik P. S., Stephenson M. L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligo- deoxy -nucleotide / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1978 .—75 , N 1.—P. 2 8 0 - 2 8 4 . 2. Stephenson M. L., Zamecnik P. S. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxynucleotide / / Ibid.—P. 285—288 . 3. Stein C. A., Cheng Y. C. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents — is the bullet really magical? / / Science.— 1993 .—261 , N 5 і 2 4 . — P . ( 0 0 4 — 1 0 1 2 . 4. Matsukura M., Shinozuka K.f Zon G. et al Phosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides: inhibitors of replication and cytopalhic effects of human immunodeficiency virus / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— і 9 8 7 . — 8 4 , N 2 1 . — P . 7706—7710 . 5. Zamecnik P. S.f Goodchild J., Taguchi Y.t Sarin P. Inhibition of replication and expression of human T-cell lymphotropic virus type III in cultured cells by exogenous synthetic oligo nucleotides complementary to viral RNA / / Ib id .—1986.—83, N 12.—P. 4143—4147 . 6. Izant J. G.y Weintraub H. Inhibition of thymidine kinase gene expression by anti-sense RNA: a molecular approach to genetic analysis / / Ce l l .—1984 .—36, N 4 .—P. 1007—1015. 7. Izant J. G.y Weintraub И. Constitutive and conditional suppres sion of exogenous genes by anti-sense RNA / / Science.— 1985.—229, N 4 7 1 1 . — P . 3 4 5 — 3 5 2 . 8. Tomizawa J.-I > J toll Т., Sdzer G., Sorn T. Inhibition of ColEJ RNA primer formation by a plasmid-specified small RNA / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1981 .—78, N 3 .—P. 1421 — 1425. 9. Light J., Molin S. The sites of action of the two copy number control functions of plasmid Rl / / Мої. and Gen. Genet.— 1982.—187, N 3 .—P. 4 8 6 — 4 9 3 . 10. Simons R. W., Kleckner N. Transla.ti.onal control of IS 10 transposition / / Ce l l .—1983 .—34, N 3 .—P. 6 8 3 — 6 9 1 . 11. Tomizawa J.-I., Som T. Control of ColEI plasmid replication: enhancement of binding of RNAI to the primer transcript by the Rom protein / / Ib id .—1984.—38, N 3 .—P. 871—878 . 12. Kim S. K . } Wold B. J. Stable reduction of thymidine kinase activity in cells expressing high levels of anti-sense RNA / / Ib id .—1985.—42, N 1.—P. 129—138. 13. Preiss A., Rosenberg V. В., Kienlin A. et al. Molecular genetics of Kruppel, a gene required for segmentation of the Drosophila embryo / / Nature. — 1 9 8 5 . — 3 1 3 , N 5 9 9 7 . — P . 2 7 — 3 2 . 14. Crowley Т. E., Nellen W., Gamer R. N . , Firtel R. A. Phcnocopy of discoidin I-minus mutants by anti-sense tra. sfor- mation in dictyosxlium / / Ce l l .—1986 .—43, N 3 . - - P . 6 3 3 — 641. 15. Farnham P. /., Abrams J. M., Schimke R. T. Opposite-strand RNAs from the- 5'-flanking region of the mouse dihydrofolate reductase gene / / Proc. Mat Acad. Sci. U S A . — 1 9 8 5 . — 8 2 , N 12.—P. 3 9 7 8 — 3 9 8 2 . !6. Cela.no P., Craig M. Characterization of a naturally occuring antisense RNA transcript with homology to the second intron of the human c-myc gene / / J . Cell. Biochem., Suppl. 15D.— 1991.—P. 13. 17. Boa! Т., Cohen R., Noguchi M. Identification of potential antisense regulation of eIF-2a gene expression / / Ibid.—P. 15. 1.8. Tomizawa J.-I. Control of ColEI plasmid replication: initial interaction of RNAI and the primer transcript is reversible / / Cell. —1985 .—40 . N 3 .—P. 5 2 7 — 5 3 5 . 19. Mizuno Т., ChouM.-J., Inouye M. A comparative study on the genes for three proteins of the Escherichia coli outer mem brane. DNA sequence of the osmoregulated ompC gene / / J. Biol. Chem.—1983 .—258 , N 11 .—P. 6932 6940. 20. Mizuno Т., Chou M.-J., Inouye M. A unique mechanism regulating gene expression: translational inhibition by a com plementary RNA transcript (micRNA) / / Proc. Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 8 4 . — 8 1 , N 7 .—P. 1966—1970. 21. Khochbin S., Lawrence J.-J. An antisense RNA involved in p53 mRNA maturation in murine erythroleukemia cells induced to differentiation / / EMBO J. — 1 9 8 9 . — 8 , N 1 3 — P 4107— 4117. 22. Tosic M., Roach A., de Rivaz J.-C. et al. Post-transcriptional events are responsible for low expression of myelin basic protein in myelin deficient mice: role of natural antisense RNA / / Ibid .—1990.—9, N 2 .—P. 401—406 . 23. Michael N., Vahey M. Т., d'Arcy L. et al. Negative-strand RNA transcripts are produced in HIV-1 infected cells and patients by a novel promoter downregulaied by Tat / / J. Virol .—1994.—68, N 2 .—P. 979—987 . 24. Lai P. K.t Barsov E. V., Nonoyama M. Detection of leftward transcripts of HIV-1 in infected cells / / IXth Int. Conf. on AIDS: Abstrs.—Berlin, 1993 .—PO-A05 -0078 . 25. CHng J. L. C, Mulligan R. C, Schimmel P., Holms E . W. Anti-sense RNA complementary to 3 ' coding and noncodiiig sequences of creatine kinase is a potent inhibitor of translation in. vivo II Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1 989 .—86 , N 24. P. 10006—10010. 26. McGarry T. /., Lindauist S. Inhibition of heat shock protein synthesis by heat-inducible anti-sense RNA / / Ibid. —1986 .— 83, N 2 .—P. 3 9 9 — 4 0 3 . 27. Coleman J., Hiroshima A.} Inokuchi Y. et al. A novel immune system against bacteriophage infection using complementary RNA (micRNA) / / Nature .—1985.—315, \ 6 0 2 0 . — P . 601 — 603. 28. Hiroshima A., Sawaki S.f Inokuchi Y., Inouye M. Engineering of the mRNA-interfering complementary RNA immune system against viral infection / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. —1986 .— 83 .—P. 7726—7730 . 29. Hemenway C , Fang R. X , Kaniewski W. K. et al. Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNA II EMBO J .—1998 .—7, N 5 .—P. 1273—1280. 30. Powell P. A., Stark D. M., Sanders P. R., Ik-achy R. N. Protection against tobacco mosaic virus antisense RNA / / Proc. Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 8 9 . — 8 6 . — P . 6 9 4 9 - 6 9 5 2 . 31 . Chang L.-J.y Stoltzfus С. M. Gene expression from both intronless and intron-containing Rous sarcoma vh us clones is specifically inhibited by anti-sense RNA / / Мої. Cell. Biol.— 1985 .—5.—P. 2341—2348 . 32. To R. Y.-L., Booth S. C, Neiman P. E. inhibition of retroviral replication by anti-sense RNA / / I b id .—1986 .—6, N 12.— P. 4758—4762 . 33. Neiman P. E., Booth S. C , To R. Y.-L. Antisense inhibitioi. of viral replication and host-cell gene expression in avian retroviral systems / / Current Communications in Molecu! ~ Biology: Antisense RNA and DNA / Ed . D. A. Melton.—New York.: Cold Spring Harbor Lab., 1988 .—P . 1 2 5 - 1 2 8 . 34. To R. Y.-L., Neiman P. E. Inhibition of replication of avian retroviruses by antisense RNA / / J . Cell. Biochem., Suppl. 15D.—1991 .—P. 11. 35. Von Ruden Т., Gilboa E. Inhibition of human T-cell leukemic' virus type 1 replication in primary human T cells that express antisense RNA / / J. Virol .—1989.—63, N 2.—-P. 677—682 36. Sullenger B. A , Lee Т. C, Smith C. A. el al. Expression of chimeric tRNA driven antisense transcripts renders NTH 3 і j 486 http://Transla.ti.onal http://Cela.no АНТИСБНСОБІ РНК. ЯК. ЗАСІБ РЕГУЛЯЦІЇ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ cells highly resistant to moloney murine leukemia virus replica tion / / Мої. Cell. B io l .—1990 .—10.—P. 6512—6523 . 37. Томсопс В. П., Чернобаева Л. Г., Козырева С. В. и др. Експрессия специфических Р Н К в культурах клеток с интегрированным асРНК-геном и их корреляция с подав лением репродукции BLV / / Биополимеры и клетка.— 1993.—9, № 4 — С . 5 9 — 6 2 . 38. Борисенко А. С , Шаяхметов Д М., Герзилова А. Г., Тихоненко Т. И. Использование промотора U3 области LTR BLV для экспрессии генов противовирусных асРНК в клеточных культурах / / Мол. генетика, микробиология и вирусология. - -1994.—№ 3 .—С. 16—20. 39. Monte P. D., Bessia С, Ripalti A. el ai Stably expressed antisense RNA to Cytomegalovirus UL83 inhibits viral replica tion / / J Viroi. —1996 . - 70 , N 4 .— P. 2086—2094 . 40. Liu Z., Ball D. B.y Carmichael G. G. Targeted nuclear antisense RNA mimics natural antisense-induced degradation of polyoma virus early RNA / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1994 .—91, N 10.—P. 4 2 5 8 — 4 2 6 2 . 41. Olson К E.t Higgs S., Gaines J. et ai Genetically engineered resistance to Dengue-2 virus transmission in mosquitoes / / Science. — 1 9 9 6 . — 2 7 2 . — P . 884—886 . 42. Sczakiel G., Pawtita M. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in human T-cells stably expressing antisense RNA / / J. Viro l .—1991 .—65.—P. 468—472 . 43. Sczakiel G., Pawlita M., Klienheinz A. Specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA transcribed in sense and antisense orientation from the 5' - leader/£«£ region / / Biochem. and Biophys. Res. Communs.— 1990 .—169.—P. 6 4 3 — 6 5 1 . 44. Joshi S., van Brunschot A. Asad S. et ai. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 multiplication by antisense and sense RNA expression / / J. Virol.-—1991 .—65 , N 10.— P. 5524—5530 . 45. Rittner K, Sczakiel G. Identification and analysis of antisense RNA target regions of the human immunodeficiency virus type-1 /./ Nucl. Acids Res .—1991 .—19 , N 7 .—P. 1421 — 1426. 46. bi К. M. S., Biasolo M. A,t Dehni G. et ai Inhibition of replication of HIV-1 by retroviral vectors expressing tat-m- tisense and anti-faf ribozyme RNA / / Virology.—1992.— 190.—P. 176—183. 47. Chatterjee S., Johnson P. R.f Wong К К Dual- target inhibition of HIV-1 in vitro by means of an adeno-associated virus antisense vector / / Sc ience .—1992 .—258 .—P. 1485— 1488. 48. Кухаренко ,0. П., Швед А. Д., Рибалко С. Л. ma in. Створення модельної векторної конструкції, що експресуе антисенсові Р Н К проти ВІЛ-1, для внутрішньоклітинної імунізації гемопоетичних клітин / / Інфекц. хвороби.— 1996 .—2, № 3 . — С . 2 2 — 2 5 . 49. Sczakiel G., Homann М., Rittner К. Computer-a ided search for effective antisense RNA target sequences of the human immunodeficiency virus type 1 / / Antisense Res . Develop.—- 1 9 9 3 . — 3 . — P . 4 5 - 5 2 . 50. Rittner K, Burmester C, Sczakiel G. In vitro selection of fast-hybridizing and effective antisense RNAs directed against the human immunodeficiency virus type 1 / / Nucl. Acids R e s . — 1 9 9 3 . — 2 1 , N 6 . — P . 1381—1387 . 51 . Homann M., Rittner K, Sczakiel G. Complementary large loops determine rate of RNA duplex formation in vitro in the case of a effective antisense RNA directed against the HIV-1 / / J. Мої. B i o l . — 1 9 9 3 . — 2 3 3 . — P . 7—15. 52 . Hjalt T. A., Wagner E. G.. Bulged-oul nucleotides pro tec і asRNA from RNAse III cleavage and a re required for rapid target RNA binding in vitro and inhibition in vivo II Nucl Acids R e s . — 1 9 9 5 , — 2 4 , N 3 . — P . 5 7 1 — 5 8 7 . 53 . Maitra R. K, Li G., Xiao W. et ai Catalytic cleavage of an RNA target by 2-5A antisense and RNAse L / / J. Biol. Chem.—1995 .—270 , N 2 5 . — P . 15071 - 1 5 0 7 5 . 54. Liu У., Samuel S. E. Mechanism of interferon action: Function ally distinct RNA-binding and catalytic domains in the inter feron-inducible, double-stranded RNA-specific adenosine dea minase / / J. Viro l .—1996.—70, N 3 .—P. 1961 — 1968. 55. Cheng J. Q., Ruggeri В., Klein W. M. et ai Amplification of AKT2 in human pancreatic cancer cells and inhibition of АКТ expression by antisense RNA / / P roc . Nat. Acad. Sci. USA.— 1 9 9 6 . — 9 3 . — P . 3 6 3 6 — 3 6 4 1 . 56. Burfeind P., Chernicky C. L.} Rininsland F. et ai Antisense RNA to the type I insuline-like growth factor receptor suppres ses tumor growth and prevents invasion by rat prostate cancer cells in vivo II I b i d . — 1 9 9 6 . — 9 3 . — P . 7 2 6 3 — 7 2 6 8 . Надійшла до редакції 11.09.97 487
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-157482
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0233-7657
language	Ukrainian
last_indexed	2025-12-07T17:46:19Z
publishDate	1998
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
record_format	dspace
spelling	Кухаренко, О.П. Швед, А.Д. 2019-06-20T04:01:13Z 2019-06-20T04:01:13Z 1998 Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів / О.П. Кухаренко, А.Д. Швед // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 6. — С. 477-487. — Бібліогр.: 56 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0004EF https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157482 В огляді на прикладах багатьох досліджень розглянуто проблеми регуляції експресії генів за допомогою антисенсових РНК у прокаріотах та в еукаріотичних клітинах. Знані у увагу приділене проблемі створення внутрішньоклітинної резистентності проти вірусів з використанням антисенсових РНК Аналізуються загальна концепція та стратегія побудови штучних систем антисенсової регуляції експресії генів у клітинах еукаріот. В обзоре рассмотрены результаты многих публикаций по проблеме регуляции экспрессии генов с помощью антисенсовых РНК в прокариотических и эукариотических клетках. Уделено внимание созданию моделей внутриклеточной устойчивости против вирусов с использованием антисенсовых РНК. Анализируются общая концепция и стратегия создания систем, антисенсовой регуляции экспрессии генов в клетках эукариот. The review summarises results of a large number of publications on the problem of gene expression regulation by antisense RNA in procaryotic and eucaryotic cells. A special attention devoted to the intracellular immunization and antiviral, resistance based on anti-sense RNA. Common principles of modelling of antisense regulation in eucaryotic. cells are discussed. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Обзоры Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів Антисенсовые РНК как средство регуляции экспресии генов Antisense RNA as a tool for regulation of gene expression Article published earlier
spellingShingle	Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів Кухаренко, О.П. Швед, А.Д. Обзоры
title	Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів
title_alt	Антисенсовые РНК как средство регуляции экспресии генов Antisense RNA as a tool for regulation of gene expression
title_full	Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів
title_fullStr	Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів
title_full_unstemmed	Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів
title_short	Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів
title_sort	антисенсові рнк як засіб регуляції експресії генів
topic	Обзоры
topic_facet	Обзоры
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157482
work_keys_str_mv	AT kuharenkoop antisensovírnkâkzasíbregulâcííekspresíígenív AT švedad antisensovírnkâkzasíbregulâcííekspresíígenív AT kuharenkoop antisensovyernkkaksredstvoregulâciiékspresiigenov AT švedad antisensovyernkkaksredstvoregulâciiékspresiigenov AT kuharenkoop antisensernaasatoolforregulationofgeneexpression AT švedad antisensernaasatoolforregulationofgeneexpression

Антисенсові РНК як засіб регуляції експресії генів

Institution

Ähnliche Einträge