Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази
Через однонаправлений рух крові від портальної вени та печінкової артерії до центральної вени та у зв’язку з використанням кисню клітинами синусоїду у печінці формується градієнт концентрації кисню. Його різні концентрації визначають нерівномірну експресію генів у клітинах, розташованих в перипортал...
Saved in:
| Published in: | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Date: | 2007 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2007
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157513 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази / А.А. Самойленко, Н.М. Теплюк, М.Ю. Оболенська, Т. Кітцманн // Біополімери і клітина. — 2007. — Т. 23, № 5. — С. 391-397. — Бібліогр.: 17 назв. — укр., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859806039077027840 |
|---|---|
| author | Самойленко, А.А. Теплюк, Н.М. Оболенська, М.Ю. Кітцманн, Т. |
| author_facet | Самойленко, А.А. Теплюк, Н.М. Оболенська, М.Ю. Кітцманн, Т. |
| citation_txt | Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази / А.А. Самойленко, Н.М. Теплюк, М.Ю. Оболенська, Т. Кітцманн // Біополімери і клітина. — 2007. — Т. 23, № 5. — С. 391-397. — Бібліогр.: 17 назв. — укр., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Біополімери і клітина |
| description | Через однонаправлений рух крові від портальної вени та печінкової артерії до центральної вени та у зв’язку з використанням кисню клітинами синусоїду у печінці формується градієнт концентрації кисню. Його різні концентрації визначають нерівномірну експресію генів у клітинах, розташованих в перипортальній та перивенозній зонах печінкового синусоїду. Ген, який кодує сериндегідратазу (СДГ), є типовим представником генів, що переважно експресуються в гепатоцитах перипортальної зони синусоїду. Нозерн-блот гібридизація і трансфекція первинних гепатоцитів щура конструкцією, що містить репортерний ген люциферази під контролем промотору гена СДГ (–2303…+55 п. н.), виявили, що експресія гена СДГ вища при нормоксії (16 % O2), ніж при гіпоксії (8 % O2). Чотири потенційних елементи відповіді на нормоксію (ЕВН) знайдено в промоторі гена СДГ (ЕВН-1, ЕВН-2, ЕВН-3 і ЕВН-4). Щоб встановити, який з цих елементів є функціонально важливим у гепатоцитах, клітини трансфікували конструкціями з репортерним геном люциферази, що перебуває під контролем у різній мірі вкороченої ділянки промотору гена СДГ. Трансфекція клітин HeLa і HepG2 конструкціями з шістьма послідовно розташованими копіями кожного з потенційних ЕВН перед промотором SV40 і репортерним геном люциферази засвідчила, що ЕВН-2 в клітинах HeLa і HepG2, а ЕВН-1 у клітинах HeLa беруть участь у регуляції транскрипції гена СДГ за умов нормоксії.
В связи с однонаправленным движением крови от портальной вены и печеночной артерии к центральной вене и из-за использования кислорода клетками синусоида в печени формируется градиент концентрации кислорода. Его различные концентрации определяют неравномерную экспрессию генов в клетках, расположенных в перипортальной и перивенозной зонах печеночного синусоида. Ген, кодирующий сериндегидратазу (СДГ), является типичным представителем генов, преимущественно экспрессирующихся в гепатоцитах перипортальной зоны синусоида. Нозерн-блот гибридизация и трансфекция первичных гепатоцитов крысы конструкцией, содержащей репортерный ген люциферазы под контролем промотора гена СДГ (–2303 …+55 п. н.), выявили, что экспрессия СДГ выше при нормоксии (16 % O2), чем при гипоксии (8 % O2). Четыре потенциальных элемента ответа на нормоксию (ЭОН) обнаружены в промоторе гена СДГ (ЭОН-1, ЭОН-2, ЭОН-3 и ЭОН-4). Чтобы установить, какой из этих элементов функционирует в гепатоцитах, клетки трансфицировали конструкциями с репортерным геном люциферазы, находящимся под контролем в разной мере укороченных участков промотора гена СДГ. Трансфекция клеток HeLa и HepG2 конструкциями, содержащими шесть последовательно расположенных копий каждого из потенциальных ЭОН перед промотором SV40 и репортерным геном люциферазы, показала, что ЭОН-2 в клетках HeLa и HepG2, а ЭОН-1 в клетках HeLa участвуют в регуляции транскрипции гена СДГ при нормоксии.
An oxygen gradient is formed in the liver due to the unidirectional blood flow from the portal vein and hepatic artery to the central vein and due to the oxygen-consuming metabolic processes of the cells along the sinusoid. This gradient appears to be one of the major factors responsible for differential expression of a number of genes between periportal and perivenous zones of liver sinusoid. The serine dehydratase (SerDH) gene is predominantly expressed in the hepatocytes of periportal zone. Northern blot analysis and transfections with the SerDH promoter luciferase constructs containing SerDH promoter (–2303 … +55 bp) upstream of the Firefly luciferase gene demonstrated that the SerDH expression was higher under normoxia (16 % O2) as compared to hypoxia (8 % O2). Four putative normoxia responsive elements (NRE) were found in the SerDH promoter (NRE-1, NRE-2, NRE-3, NRE-4). To identify which of these elements is functional in hepatocytes, several plasmids containing 6 copies of putative SerDH NRE’s upstream of the SV40 promoter and the Firefly luciferase gene were constructed. It was found that NRE-2 in both HeLa and HepG2 cells as well as NRE-1 in HeLa cells were responsible for the O2-dependent SerDH gene expression.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:16:19Z |
| format | Article |
| fulltext |
Ox y gen as a Reg u la tor of Serine Dehydratase (SerDH)
Gene Ex pres sion.
A. Samoylenko1, N. Tepliuk2, M. Obolenskaya2, T. Kietzmann3
1Palladin In sti tute of Bio chem is try of the NASU
9 Leontovych Str., Kyiv, 01601, Ukraine
2In sti tute of Mo lec u lar Bi ol ogy and Ge net ics of the NASU
150 Ac a de mi cian Zabolotny Str., Kyiv, 03143, Ukraine
3Tech ni cal Uni ver sity of Kaiserslautern
54 Erwin-Schrodinger-Stra?e, Kaiserslautern, 67663, Ger many
samoylenko@biochem.kiev.ua
An ox y gen gra di ent is formed in the liver due to the uni di rec tional bloodflow from the por tal vein and
hepatic ar tery to the cen tral vein and due to the ox y gen-con sum ing met a bolic pro cesses of the cells along
the si nu soid. This gra di ent ap pears to be one of the ma jor fac tors re spon si ble for dif fer en tial ex pres sion of a
num ber of genes be tween periportal and perivenous zones of liver si nu soid. The serine dehydratase
(SerDH) gene is pre dom i nantly ex pressed in the hepatocytes of periportal zone. North ern blot anal y sis and
transfections with SerDH pro moter lu ci fer ase con structs con tain ing SerDH pro moter (-2303… +55 bp) up -
stream of the Fire fly lu ci fer ase gene dem on strated that the SerDH ex pres sion was higher un der normoxia
(16% O2) as com pared to hypoxia (8% O2). Four pu ta tive normoxia re spon sive el e ments (NRE) were found
in the SerDH pro moter (NRE-1, NRE-2, NRE-3, NRE-4). To iden tify which of these el e ments is func tional in
hepatocytes, sev eral plasmids con tain ing 6 cop ies of pu ta tive SerDH NRE’s up stream of the SV40 pro moter
and the Fire fly lu ci fer ase gene were con structed. It was found that NRE-2 in both HeLa and HepG2 cells as
well as NRE-1 in HeLa cells were re spon si ble for the O2-de pend ent SerDH gene ex pres sion.
Keywords: serine dehydratase gene, tran scrip tion reg u la tion, re porter gene, lu ci fer ase, hepatocytes,
normoxia
In tro duc tion. An ox y gen gra di ent is formed in the
liver due to the uni di rec tional bloodflow. Ox y gen par -
tial ten sion (free con cen tra tion) equals about 60-65 mm
Hg in the periportal blood and falls to about 30-35 mm
Hg in the perivenous blood. This gra di ent in O2 ten sion
ap pears to play a key role in the dif fer en tial ex pres sion
of a num ber of genes be tween the more aer o bic
periportal zone and less aer o bic perivenous zone of
liver si nu soid [1].
It has been shown that pro mot ers of most genes in -
duced by hypoxia con tain a spe cific O2 re spon sive se -
quence, named the hypoxia re sponse el e ment (HRE)
[2]. This se quence can be bound by sev eral re lated tran -
scrip tion fac tors known as hypoxia-in duc ible fac tors
(HIF), among which HIF-1 is stud ied the most. HIF-1 is
a dimer of HIF-1a and HIF-1b, both be long ing to the
ba sic he lix-loop-he lix (bHLH) PAS (Per-ARNT-Sim)
391
ISSN 0233-7657. Biopolymers and cell. 2007. vol. 23. N 5. Translated from Ukrainian.
Ó A. SAMOYLENKO, N. TEPLIUK, M. OBOLENSKAYA, T. KIETZMANN, 2007
tran scrip tion fac tor fam ily. While HIF-1b was found to
be a con sti tu tional pro tein, HIF-1a pro tein lev els were
ox y gen-de pend ent. Al though hypoxia may have in sig -
nif i cant ef fect on the HIF-1a mRNA ex pres sion, the
ma jor reg u la tion ap pears to oc cur posttranslationally
on the level of pro tein sta bi li za tion. Un der normoxia
two proline res i dues (P402 and P564) within the O2-de -
pend ent deg ra da tion do main of HIF-1a are sub ject to
hydroxylation by a new fam ily of prolyl hydroxylases.
The hydroxylation en ables the bind ing of the von
Hippel-Lindau (VHL) tu mor sup pres sor pro tein, a
com po nent of an E3 ubiquitin ligase com plex that tar -
gets the HIFa-sub units for deg ra da tion by the
ubiquitin-proteasome path way.
While the mo lec u lar mech a nisms of the
hypoxia-de pend ent gene reg u la tion are well char ac ter -
ized, the mech a nisms, reg u la tory tran scrip tion fac tors,
and the DNA re spon sive el e ments re quired for
normoxia-de pend ent gene in duc tion are poorly known
[3-5]. It was the aim of the pres ent study to char ac ter ize
the ox y gen-de pend ent ex pres sion of serine dehydratase
(SerDH) gene, one of the genes upregulated in the more
aer o bic periportal zone as com pared to the perivenous
zone of liver si nu soid, and to iden tify pro moter el e -
ments re spon si ble for this reg u la tion.
L-serine dehydratase (L-serine am mo nia-lyase, EC
4.2.1.13) is an en zyme, cat a lyz ing the pyridoxal phos -
phate-de pend ent deamination of serine to pro duce
pyruvate. This en zyme cat a lyzes the con ver sion of
L-threonine to a-ketobutyrate by the same mech a nism
and is iden ti cal to L-threonine dehydratase (EC
4.2.1.16). It is a homodimeric pro tein hav ing a 327
amino acid sub unit with mo lec u lar weight of 34 kDa
[6]. SerDH is ex pressed in liver pre dom i nantly and to a
lesser ex tent – in kid ney. Its ex pres sion is ac ti vated by
glucagon and glucocorticoids and re pressed by in su lin
[7], while ox y gen-de pend ent reg u la tion of SerDH has
not been in ves ti gated yet.
Ma te ri als and Meth ods. The iso la tion of pri mary
rat hepatocytes from liver was per formed at ster ile con -
di tions by the method of col la gen ase per fu sion as de -
scribed in [8]. Hepatocytes were cul tured in me dium Ì
199 (Gibco, Eggenstein, Ger many) in the pres ence of
dexa meth a sone (10 mM), in su lin (1 nÌ) and (in the
course of the first 4 h af ter plat ing) 4% fe tal calf se rum
(FCS). HeLa and hepatoma HepG2 cells were cul tured
in the MÅÌ me dium (ÐÀÀ Lab o ra to ries, Àustria) con -
tain ing 10% FCS. The cells were cul tured in ÑÎ2 in cu -
ba tor Cytoperm 8080 (Heraeus, Hanau, Ger many) at
37°C in hu mid i fied at mo sphere con tain ing 8% O
2 (mild
hypoxia) or 16% O
2
(normoxia), 5% CO
2
and 87% or
79% N
2
, re spec tively. Tak ing into ac count ox y gen dif -
fu sion through cul ture me dium, ox y gen con cen tra tions
in ÑÎ2 in cu ba tor cor re spond to the phys i o log i cal ox y -
gen con cen tra tions on the sur face of perivenous and
periportal hepatocytes [1].
To con struct the plasmids pGL3SerDH-2303,
pGL3SerDH-2128, pGl3SerDH-937, pGl3SerDH-471,
and pGl3PCK-493, the vec tor pGL3 ba sic (4818 b.p.)
(Promega, Mannheim, Ger many), con tain ing the Fire -
fly lu ci fer ase (Luc) gene as a re porter to es ti mate the
pro moter ac tiv ity, was used. The cor re spond ing re gions
of SerDH pro moter were cloned in the polylinker of
pGl3 ba sic. The plasmids pGl3-SerDH-NRE1,
pGl3-SerDH-NRE2, pGl3-SerDH-NRE3, and
pGl3-SerDH-NRE4 were con structed us ing the vec tor
pGL3 pro moter (Promega), in the polylinker of which
the cor re spond ing oligonucleotides were cloned in
front of SV40 pro moter. The oligonucleotides con tain -
ing six cop ies of the cor re spond ing NRE el e ments were
ob tained from the NAPS com pany (Gottingen, Ger -
many) and HPLC pu ri fied. Each re peat ing unit con -
tained 9 b.p. of the cor re spond ing NRE flanked by 3
b.p. at the 5?- and by 2 b.p. at the 3?-ends. The
oligonucleotides also con tained ad di tional se quences
which were nec es sary for tech ni cal rea sons, namely, ei -
ther the SpeI or SmaI re stric tion sites in the mid dle of
the se quence for the iden ti fi ca tion of pos i tive clones
and both SacI and NheI sites at the ends. The con struct
pGl3-Epo-HRE con tained three cop ies of the HRE
from the eryth ro poi e tin gene in front of pGl3 pro moter
and was al ready de scribed [9]. E. coli K 12 DH5a and
XL1-blue strains (Stratagene, Hei del berg, Ger many)
were trans formed by electroporation. Plasmid DNA
was iso lated us ing JETstar Plasmid Pu ri fi ca tion Sys tem
(Genomed, Bad Oeynhausen, Ger many).
Pri mary rat hepatocytes (1×106 cells per Æ 60 mm
dish), HeLa and HepG2 cells (con flu ent cul tures on Æ
60 mm dishes) were transfected us ing cal cium phos -
phate pre cip i ta tion method with 2.5 mg plasmid DNA,
con sist ing of 500 ng pRL-V40 (Promega) and 2 mg
Fire fly lu ci fer ase re porter gene con struct, as de scribed
SAMOYLENKO A. ET AL.
392
be fore [10]. Con struct pRL-SV40, ex press ing Renilla
lu ci fer ase gene un der con trol of SV40 pro moter, was
used to con trol transfection ef fi ciency. In ev ery cul ture
ex per i ment, two dishes were transfected per mea sured
point. Af ter re moval of the me dia (4 h af ter
transfection), cells were cul tured at stan dard con di tions
with out se rum. Af ter 24 h, the me dium was changed
and cells were cul tured for an other 24 h ei ther un der
hypoxia or normoxia. Cells were then washed twice
with 0.9% NaCl and in cu bated for 15 min on a rock ing
plat form with 300 ml of pas sive lysis buffer sup plied
with the Dual Lu ci fer ase Re porter As say Kit
(Promega). The lysate was then scraped from the
plates, vor tex-mixed, and cen tri fuged for 2 min. From
the supernatant, 20 ml was as sayed for Fire fly lu ci fer ase
ac tiv ity in a luminometer Auto Lumat Plus LB 953
(Berthold, Pforzheim, Ger many). Af ter ad di tion of 100
ml of Stop and Glo™ Re agent (Promega), which
quenches the ac tiv ity of Fire fly lu ci fer ase, the Renilla
lu ci fer ase ac tiv ity was re corded again in a
luminometer. Lu ci fer ase ac tiv ity pre sented in fig ures
was cal cu lated as a ra tio be tween in ten si ties of Fire fly
and Renilla lu ci fer ase lu mi nes cence (nor mal ized lu mi -
nes cence). Sta tis ti cal anal y sis was per formed as de -
scribed in Leg ends to Fig ures.
To tal RNA from hepatocytes was iso lated us ing
isothiocyanate method as de scribed [11]. The de tec tion
of mRNA on North ern blots was per formed af ter hy -
brid iza tion of 15 mg to tal RNA with digoxigenin la -
beled SerDH or b-actin spe cific probes (DIG RNA La -
bel ing Kit, Roche, Mannheim, Ger many). Hy brid iza -
tion sig nals were vi su al ized by chemiluminescence,
and the videodensitometer (Biotec-Fischer,
Reiskirchen, Ger many) was used for quan ti fi ca tion of
these sig nals.
Re sults and Dis cus sion. In duc tion of SerDH
mRNA ex pres sion by glucagon and its mod u la tion by
ox y gen.Pri mary rat hepatocytes were cul tured for 24 h
at stan dard con di tions and then treated for 24 h un der
hypoxia (8% O2) or normoxia (16% O2) ei ther with or
OX Y GEN AS A REG U LA TOR OF SERINE DEHYDRATASE
393
Fig. 1. Mod u la tion of glucagon-de pend ent SerDH
mRNA ex pres sion by ox y gen in rat pri mary
hepatocytes. Hepatocytes were first cul tured for 24 h
un der normoxia (16% O2). Af ter 24 h the me dium
was changed and cells were fur ther cul tured for 24 h
un der normoxic or hypoxic (8% O2) con di tions. Af ter
21 h cells were treated with the in di cated con cen tra -
tions of glucagon (ggn.). (A) The SerDH mRNA lev -
els were mea sured by North ern blot ting. The mRNA
level un der normoxia was set equal to 1. Val ues are
means ± SEM of three in de pend ent cul ture ex per i -
ments. Sta tis tics, Stu dent’s t-test for paired val ues: *
sig nif i cant dif fer ence 8% O2 vs. 16% O2, p £ 0.05.
(B) Rep re sen ta tive North ern Blot. For North ern anal -
y sis 15 mg to tal RNA were hy brid ized to
digoxigenin-la belled SerDH and b-actin antisense
RNA probes. Autoradiographic sig nals were ob -
tained by chemiluminescence and scanned by
videodensitometry.
with out ad di tion of glucagon. In the ab sence of its in -
ducer – glucagon, SerDH mRNA ex pres sion in pri mary
rat hepatocytes was not de tect able (Fig.1). It proves that
normoxia alone is not a suf fi cient stim u lus to in duce
SerDH ex pres sion. In deed, the ex pres sion of
gluconeogenic SerDH en zyme in vivo at stan dard con -
di tions is un de tect able. How ever, fast ing, lead ing to se -
cre tion of glucagon, stim u lates SerDH ex pres sion [7].
When the cells were treated for 3 h with 1 nM
glucagon, SerDH mRNA ex pres sion was in duced app.
5-fold un der normoxia and app. 2-fold un der hypoxia.
At a glucagon con cen tra tion of 10 nM SerDH mRNA
lev els were fur ther en hanced app. 12-fold un der
normoxia and app. 5-fold un der hypoxia, thus, SerDH
mRNA lev els un der normoxia were again app. 2.5-fold
higher than SerDH mRNA lev els un der hypoxia. These
re sults in di cate that re gard less of the pres ence of dif fer -
ent glucagon con cen tra tions, SerDH mRNA ex pres sion
un der hypoxia is much lower than un der normoxia
(Fig.1).
Lo cal iza tion of the normoxia re spon sive el e ments
in the pro moter of SerDH gene. To find out what se -
quences could be in volved in the reg u la tion of SerDH
gene ex pres sion by ox y gen, the SerDH pro moter se -
quence was an a lyzed for sim i lar i ties with the NRE of
the phosphoenolpyruvate carboxykinase-1 (PCK-1)
gene 5'-TTAGGTCAG-3' [4].
Se quence anal y sis of the rat SerDH pro moter re -
vealed that four pu ta tive NREs were pres ent within the
first 2303 b.p. of the pro moter. All four po ten tial
normoxia re sponse el e ments, namely, NRE-1,
-2169/-2161, 5'-TGAGGACAG-3', NRE-2,
-1904/-1896, 5'-TTATGTGAG-3', NRE-3, -578/-570,
5'-TTAGTCCAG-3', and NRE-4, +38/+46,
5'-CTAGATCAG-3', match the NRE of the PCK-1
gene in 7 out of 9 b.p.
SAMOYLENKO A. ET AL.
394
Fig. 2. Reg u la tion of SerDH pro moter Luc gene ex pres sion by ox y gen. The hepatocytes were tran siently transfected with the Luc gene con -
structs driven by a wild type –2303 b.p., –2128 b.p., –937 b.p. or –471 b.p. rat SerDH pro moter (pGl3SerDH-2303, pGl3SerDH-2128,
pGl3SerDH-937, and pGl3TAT-471). Hepatocytes were first cul tured for 24 h un der normoxia (16% O2). Af ter 24 h the me dium was
changed and cells were fur ther cul tured for 24 h un der normoxic or hypoxic (8% O2) con di tions. In each ex per i ment the per cent age of Luc
ac tiv ity was de ter mined rel a tive to the cor re spond ing 16% O2 con trols which were set equal to 100%. The val ues rep re sent means ± SEM of
six in de pend ent ex per i ments. Sta tis tics, Stu dent’s t-test for paired val ues: * sig nif i cant dif fer ence 8% O2 vs. 16% O2, p£ 0.05.
A 2303 b.p. frag ment of the 5'-flank ing re gion of rat
SerDH gene was cloned in front of the lu ci fer ase gene
in pGl3-ba sic to gen er ate pGl3SerDH-2303. In pri mary
rat hepatocytes transfected with pGI3SerDH-2303 Luc
ac tiv ity was in duced max i mally un der normoxia and to
only app. 60% un der hypoxia (Fig.2).
The Luc ac tiv ity in cells transfected with
pGI3SerDH-2303 and treated with glucagon was not
in duced com pared to the un treated con trol (un pub -
lished data). These re sults are in line with other stud ies
since both cAMP-reg u la tory el e ments (CRE-1 and
CRE-2) of SerDH gene, po ten tially in volved in the
glucagon-de pend ent gene in duc tion, are lo cated app.
3500 b.p. up stream from the tran scrip tion ini ti a tion site,
i.e. they are not pres ent in the con struct
pGl3SerDH-2303 or the shorter con structs used in our
ex per i ments [12]. A CRE-1 lo cated at -3528/-3521 of
the SerDH gene is not in volved di rectly in the gene ac ti -
va tion by hor mones whereas CRE-2 (-3538/-3531), ad -
ja cent to CRE-1 and bound by CREB (CRE bind ing
pro tein), ap pears to be crit i cal for cAMP and
glucagon-de pend ent in duc tion of SerDH ex pres sion
[12].
To de ter mine what re gion of the SerDH pro moter
could be re spon si ble for the ox y gen-de pend ent reg u la -
tion of SerDH gene ex pres sion, pri mary rat hepatocytes
were transfected with three se ri ally de leted SerDH pro -
moter lu ci fer ase gene con structs pGl3SerDH-2128,
pGl3SerDH-937, and pGl3SerDH-471 con tain ing the
first 2128 b.p., 937 b.p., and 471 b.p. of the SerDH pro -
moter, re spec tively (Fig.2). Normoxia did not in duce
Luc ac tiv ity in the cells transfected with ei ther
pGl3SerDH-2128, pGl3SerDH-937 or
pGl3SerDH-471 in di cat ing that NRE-2, NRE-3, and
NRE-4 did not seem to be in volved in the reg u la tion of
SerDH gene ex pres sion by normoxia.
These re sults dem on strated that the ex pres sion of
the –2303 SerDH pro moter Luc gene con struct was in -
duced by normoxia and the normoxia re spon sive re gion
of SerDH was lo cal ized be tween –2128 and -2303 b.p.
of the SerDH pro moter.
Bi o log i cal ac tiv ity of the po ten tial SerDH-spe cific
NREs un der heterological con di tions. Since hypoxia
re spon sive el e ments from eryth ro poi e tin and other
hypoxia-reg u lated genes could act as transcriptional
enhancers when cloned in front of an in de pend ent pro -
moter and a re porter gene, the role of po ten tial NREs
from SerDH pro moter in the normoxia-de pend ent gene
reg u la tion was in ves ti gated us ing these el e ments as
enhancers, reg u lat ing ex pres sion of the re porter lu ci fer -
ase gene. The 90 b.p. oligonucleotides con tain ing 6
cop ies ei ther of NRE-1, NRE-2, NRE-3 or NRE-4 from
the SerDH pro moter were cloned in front of the SV40
pro moter and the lu ci fer ase gene in pGl3-prom to gen -
er ate pGl3-SerDH-NRE1, pGl3-SerDH-NRE2,
pGl3-SerDH-NRE3, and pGl3-SerDH-NRE4. When
pri mary rat hepatocytes were transfected with these
con structs, nei ther of them was ex pressed dif fer en tially
un der normoxia or hypoxia. How ever, in HepG2 cells
the con struct pGl3-SerDH-NRE2 was ac ti vated by
normoxia in about 40%, while the oth ers dis played the
same lev els of Luc ac tiv ity un der normoxia and
hypoxia. In HeLa cells the ex pres sion of two out of four
con structs, pGl3-SerDH-NRE1 and
pGl3-SerDH-NRE2, was ac ti vated by normoxia in
about 30% (Fig.3). Luc ac tiv ity in the cells transfected
with the hypoxia-in duc ible pGl3-Epo-HRE con struct
[9] as a con trol was sig nif i cantly higher in the cells cul -
tured un der hypoxia for all three cell types in ves ti gated
(Fig.3).
These re sults in di cate that some po ten tial SerDH
NREs are more ac tive in im mor tal ized cells. It is well
known that intratumoral hypoxia is one of the driv ing
forces in can cer pro gres sion and a lot of genes in volved
in sur vival, angiogenesis, and metastases for ma tion are
in duced by hypoxia [13-14]. On the other hand, some
pro-oncogenic pro teins (e.g. plasminogen ac ti va tors)
are in duced by normoxia [15-16]. There fore, hy po thet i -
cal ac ti va tion of fac tors stim u lated by normoxia be -
cause of ge netic changes in the pro cess of
carcinogenesis might ac ti vate these genes even un der
normoxia.
The ma jor ity of genes mod u lated by O2 have been
shown to be in duced by hypoxia. Though sev eral genes
have been found to be pos i tively mod u lated by
normoxia [1], lit tle is known about pos si ble normoxia
reg u la tory el e ments as well as cor re spond ing tran scrip -
tion fac tors me di at ing this mod u la tion and a gen eral
idea has not been pre sented. In the cur rent study it was
shown that SerDH pro moter se quences ho mol o gous to
the pre vi ously iden ti fied NRE of the PCK-1 gene [4]
were in volved in the normoxia-de pend ent gene reg u la -
OX Y GEN AS A REG U LA TOR OF SERINE DEHYDRATASE
395
tion. On the other hand, in the hu man glutathione
peroxidase (GPX) gene two sim i lar 13 b.p. ox y gen re -
spon sive el e ments were found to bind dis pa rate pro -
teins and to con fer normoxia-de pend ent in duc tion of
GPX gene ex pres sion in hu man cardiomyocytes [3, 5].
The se quences of the ox y gen re spon sive el e ments from
the GPX gene are not sim i lar to the NRE se quences
iden ti fied in our ex per i ments. It might be also spec u -
lated that higher gene ex pres sion un der normoxia as
shown in our study could be due to an in hib i tory ef fect
of HIF-1 un der hypoxia. How ever, HIF-1 usu ally acts
as an ac ti va tor and the role of HIF-1 as transcriptional
in hib i tor was dem on strated only for few genes so far
[17]. This mech a nism does not ap pear to ac count for
SerDH mod u la tion by ox y gen since its pro moter con -
tains no com plete 8 b.p. HRE in the 5?-flank ing re gion.
The abil ity of NREs, de scribed in our study, to func tion
in var i ous cell types and in dif fer ent pro mot ers in di -
cates that these pro moter el e ments are not spe cific for
SerDH gene only.
In the pres ent study the O2-de pend ent ex pres sion of
SerDH mRNA and the O2-de pend ent reg u la tion of
SerDH pro moter ac tiv ity were dem on strated. Both
SerDH mRNA and SerDH pro moter-driven lu ci fer ase
re porter gene stim u la tion by normoxia (16% O
2
) as
com pared to mild hypoxia (8% O
2
) was not mod u lated
by glucagon. Fur ther more, the re spec tive normoxia re -
spon sive el e ments in the SerDH pro moter were iden ti -
fied and char ac ter ized.
SAMOYLENKO A. ET AL.
396
Fig. 3. Ox y gen-de pend ent ex pres sion of pGl3-SerDH-NRE Luc con structs in HepG2 and HeLa cells. HepG2 and HeLa cells were tran -
siently transfected with the Luc gene con structs pGl3-SerDH-NRE1, pGl3-SerDH-NRE2, pGl3-SerDH-NRE3, pGl3-SerDH-NRE4, and
pGl3-Epo-HRE. Af ter 24 h me dium was changed and the cells were cul tured for 24 h un der normoxic (16% O2) or hypoxic (8% O2) con di -
tions. In each ex per i ment the per cent age of Luc ac tiv ity was de ter mined rel a tive to the cor re spond ing 16% O2 con trols (for pGl3-Epo-HRE cor -
re spond ing to the 8% con trol) which were set equal to 100%. The val ues rep re sent means ±SEM of three in de pend ent ex per i ments. Sta tis tics,
Stu dent’s t-test for paired val ues: * sig nif i cant dif fer ence 8% O2 vs. 16% O2, p£ 0.05. Se quences shown in the up per strand cor re spond to
the se quences of the SerDH gene. The NRE se quences are un der lined. Se quences shown in the lower strand cor re spond to the PCK-1 NRE.
The nu cleo tides dif fer ent for SerDH NRE and PCK-1 NRE are shown in lower case let ters.
À. À. Ñàìîéëåíêî, Í. Í. Òåïëþê, Ì. Þ. Îáîëåíñêàÿ,
Ò. Êèòöìàíí
Êèñ ëî ðîä â ìåæêëå òî÷ íîì ïðî ñòðà íñòâå ãå ïà òî öè òîâ êàê
ðå ãó ëÿ òîð òðàíñ êðèï öèè ãåíà ñå ðèí äå ãèä ðà òà çû.
Ðå çþ ìå
 ñâÿ çè ñ îä íîíàï ðàâ ëåí íûì äâè æå íè åì êðî âè îò ïî ðòàëü íîé
âåíû è ïå ÷å íî÷ íîé àð òå ðèè ê öåí òðàëü íîé âåíå è èç-çà èñ ïîëü -
çî âà íèÿ êèñ ëî ðî äà êëåò êà ìè ñè íó ñî è äà â ïå÷ åíè ôîð ìè ðó åò ñÿ
ãðà äè åíò êîí öåí òðà öèè êèñ ëî ðî äà. Åãî ðàç ëè÷ íûå êîí öåí òðà -
öèè îïðå äå ëÿ þò íå ðàâ íî ìåð íóþ ýêñ ïðåñ ñèþ ãå íîâ â êëåò êàõ,
ðàñ ïî ëî æåí íûõ â ïå ðè ïîð òàëü íîé è ïå ðè âå íîç íîé çî íàõ ïå ÷å -
íî÷ íî ãî ñè íó ñî è äà. Ãåí, êî äè ðó þ ùèé ñå ðèí äå ãèä ðà òà çó (ÑÄÃ),
ÿâ ëÿ åò ñÿ òè ïè÷ íûì ïðåä ñòà âè òå ëåì ãå íîâ, ïðå è ìó ùåñ òâåí íî
ýêñ ïðåñ ñè ðóþùèõñÿ â ãå ïà òî öè òàõ ïå ðè ïîð òàëü íîé çîíû ñè íó -
ñî è äà. Íî çåðí-áëîò ãèá ðè äè çà öèÿ è òðàíñ ôåê öèÿ ïåð âè÷ íûõ
ãå ïà òî öè òîâ êðû ñû êî íñòðóê öè åé, ñî äåð æà ùåé ðå ïîð òåð íûé
ãåí ëþ öè ôå ðà çû ïîä êîí òðî ëåì ïðî ìî òî ðà ãåíà ÑÄÃ (–2303
…+55 ï. í.), âû ÿ âè ëè, ÷òî ýêñ ïðåñ ñèÿ ÑÄÃ âûøå ïðè íîð ìîê ñèè
(16 % O2), ÷åì ïðè ãè ïîê ñèè (8 % O2). ×å òû ðå ïî òåí öè àëü íûõ
ýëå ìåí òà îò âå òà íà íîð ìîê ñèþ (ÝÎÍ) îá íà ðó æå íû â ïðî ìî -
òî ðå ãåíà ÑÄÃ (ÝÎÍ-1, ÝÎÍ-2, ÝÎÍ-3 è ÝÎÍ-4). ×òî áû óñòà -
íî âèòü, êà êîé èç ýòèõ ýëå ìåí òîâ ôóíê öè î íè ðó åò â
ãå ïà òî öè òàõ, êëåò êè òðàíñ ôè öè ðî âà ëè êî íñòðóê öè ÿ ìè ñ ðå -
ïîð òåð íûì ãå íîì ëþ öè ôå ðà çû, íà õî äÿ ùèì ñÿ ïîä êîí òðî ëåì â
ðàç íîé ìåðå óêî ðî ÷åí íûõ ó÷àñ òêîâ ïðî ìî òî ðà ãåíà ÑÄÃ.
Òðàíñôåê öèÿ êëå òîê HeLa è HepG2 êî íñòðóê öè ÿ ìè, ñî äåð æà -
ùè ìè øåñòü ïî ñëå äî âà òåëü íî ðàñ ïî ëî æåí íûõ êî ïèé êàæ äî ãî
èç ïî òåí öè àëü íûõ ÝÎÍ ïå ðåä ïðî ìî òî ðîì SV40 è ðå ïîð òåð -
íûì ãå íîì ëþ öè ôå ðà çû, ïî êà çà ëà, ÷òî ÝÎÍ-2 â êëåò êàõ HeLa è
HepG2, à ÝÎÍ-1 â êëåò êàõ HeLa ó÷àñ òâó þò â ðå ãó ëÿ öèè òðàíñ -
êðèï öèè ãåíà ÑÄÃ ïðè íîð ìîê ñèè.
Êëþ ÷å âûå ñëî âà: ãåí ñå ðèí äå ãèä ðà òà çû, ðå ãó ëÿ öèÿ òðàíñ -
êðèï öèè, ðå ïîð òåð íûé ãåí, ëþ öè ôå ðà çà, ãå ïà òî öè òû, íîð -
ìîê ñèÿ.
REFERENCES
1. Jungermann K., Kietzmann T. Oxygen: modulator of
metabolic zonation and disease of the liver //
Hepatology.–2000.–31.–P. 255–260.
2. Semenza G. L. Regulation of physiological responses to
continuous and intermittent hypoxia by hypoxia-inducible
factor 1 // Exp. Physiol.–2006.–91.–P. 803–806.
3. Cowan D. B., Weisel R. D., Williams W. G., Mickle D. A. G.
Identification of oxygen responsive elements in the
5'-flanking region of the human glutathione-peroxidase gene
// J. Biol. Chem.–1993.–268.–P. 26904–26910.
4. Bratke J., Kietzmann T., Jungermann K. Identification of an
oxygen responsive element in the 5'-flanking sequence of the
rat cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase-1 gene,
modulating its glucagon-dependent activation // Biochem.
J.–1999.–339.–P. 563–569.
5. Merante F., Altamentova S. M., Mickle D. A. G., Weisel R. D.,
Thatcher B. J., Martin B. M., Marshall J. G., Tumati L. C.,
Cowan D. B., Li R. K. The characterization and purification of
a human transcription factor modulating the glutathione
peroxidase gene in response to oxygen tension // Mol. and
Cell. Biochem.–2002.–229.–P. 73–83.
6. Ogawa H., Fujioka M., Matsuda Y., Su Y., Dunn T., Miller D.
A., Pitot H. C. Sequence of the rat serine dehydratase gene //
Nucl. Acids Res.–1988.–16.–P. 10921–10923.
7. Su Y., Kanamoto R., Miller D. A., Ogawa H., Pitot H. C.
Regulation of the expression of the serine dehydratase gene in
the kidney and liver of the rat // Biochem. and Biophys. Res.
Communs.–1990.–170.–P. 892–899.
8. Berry M. N., Friend D. S. High-yield preparation of isolated
rat liver parenchymal cells – A biochemical and fine
structural study // J. Cell Biol.–1969.–43.–P. 506–520.
9. Kietzmann T., Cornesse Y., Brechtel K., Modaressi S.,
Jungermann K. Perivenous expression of the mRNA of the
three hypoxia-inducible factor alpha-subunits, HIF1alpha,
HIF2alpha and HIF3alpha, in rat liver // Biochem.
J.–2001.–354.–P. 531–537.
10. Immenschuh S., Hinke V., Ohlmann A., Gifhorn-Katz S., Katz
N., Jungermann K., Kietzmann T. Transcriptional activation
of the haem oxygenase-1 gene by cGMP via a cAMP response
element/activator protein-1 element in primary cultures of rat
hepatocytes // Biochem. J.–1998.–334.–P. 141–146.
11. Samoylenko A., Roth U., Jungermann K., Kietzmann T. The
upstream stimulatory factor-2a inhibits plasminogen
activator inhibitor-1 gene expression by binding to a
promoter element adjacent to the hypoxia-inducible factor-1
binding site // Blood.–2001.–97.–P. 2657–2666.
12. Haas M. J., Pitot H. C. Glucocorticoids stimulate CREB
binding to a cyclic-AMP response element in the rat serine
dehydratase gene // Arch. Biochem. and Biophys.–
1999.–362.–P. 317–324.
13. Harris A. L. Hypoxia – a key regulatory factor in tumor
growth // Nat. Revs Cancer.–2001.–2.–P. 38–46.
14. Semenza G. L. Targeting HIF-1 for cancer therapy // Nat.
Revs Cancer.–2003.–3.–P. 721–732.
15. Pinsky D. J., Liao H., Lawson C. A., Yan S. F., Chen J.,
Carmeliet P., Loskutoff D. J., Stern D. M. Coordinated
induction of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) and
inhibition of plasminogen activator gene expression by
hypoxia promotes pulmonary vascular fibrin deposition // J.
Clin. Invest.–1998.–102.–P. 919–928.
16. Pillay V., Dass C. R., Choong P. F. The urokinase
plasminogen activator receptor as a gene therapy target for
cancer // Trends Biotechnol.–2007.–25.–P. 33–39.
17. Narravula S., Colgan S. P. Hypoxia-inducible factor
1-mediated inhibition of peroxisome proliferator-activated
receptor alpha expression during hypoxia // J.
Immunol.–2001.–166.–P. 7543–7548.
UDC 577.218
Re ceived 22.05.07
OX Y GEN AS A REG U LA TOR OF SERINE DEHYDRATASE
397
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-157513 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T15:16:19Z |
| publishDate | 2007 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Самойленко, А.А. Теплюк, Н.М. Оболенська, М.Ю. Кітцманн, Т. 2019-06-20T04:18:00Z 2019-06-20T04:18:00Z 2007 Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази / А.А. Самойленко, Н.М. Теплюк, М.Ю. Оболенська, Т. Кітцманн // Біополімери і клітина. — 2007. — Т. 23, № 5. — С. 391-397. — Бібліогр.: 17 назв. — укр., англ. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000778 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157513 577.218 Через однонаправлений рух крові від портальної вени та печінкової артерії до центральної вени та у зв’язку з використанням кисню клітинами синусоїду у печінці формується градієнт концентрації кисню. Його різні концентрації визначають нерівномірну експресію генів у клітинах, розташованих в перипортальній та перивенозній зонах печінкового синусоїду. Ген, який кодує сериндегідратазу (СДГ), є типовим представником генів, що переважно експресуються в гепатоцитах перипортальної зони синусоїду. Нозерн-блот гібридизація і трансфекція первинних гепатоцитів щура конструкцією, що містить репортерний ген люциферази під контролем промотору гена СДГ (–2303…+55 п. н.), виявили, що експресія гена СДГ вища при нормоксії (16 % O2), ніж при гіпоксії (8 % O2). Чотири потенційних елементи відповіді на нормоксію (ЕВН) знайдено в промоторі гена СДГ (ЕВН-1, ЕВН-2, ЕВН-3 і ЕВН-4). Щоб встановити, який з цих елементів є функціонально важливим у гепатоцитах, клітини трансфікували конструкціями з репортерним геном люциферази, що перебуває під контролем у різній мірі вкороченої ділянки промотору гена СДГ. Трансфекція клітин HeLa і HepG2 конструкціями з шістьма послідовно розташованими копіями кожного з потенційних ЕВН перед промотором SV40 і репортерним геном люциферази засвідчила, що ЕВН-2 в клітинах HeLa і HepG2, а ЕВН-1 у клітинах HeLa беруть участь у регуляції транскрипції гена СДГ за умов нормоксії. В связи с однонаправленным движением крови от портальной вены и печеночной артерии к центральной вене и из-за использования кислорода клетками синусоида в печени формируется градиент концентрации кислорода. Его различные концентрации определяют неравномерную экспрессию генов в клетках, расположенных в перипортальной и перивенозной зонах печеночного синусоида. Ген, кодирующий сериндегидратазу (СДГ), является типичным представителем генов, преимущественно экспрессирующихся в гепатоцитах перипортальной зоны синусоида. Нозерн-блот гибридизация и трансфекция первичных гепатоцитов крысы конструкцией, содержащей репортерный ген люциферазы под контролем промотора гена СДГ (–2303 …+55 п. н.), выявили, что экспрессия СДГ выше при нормоксии (16 % O2), чем при гипоксии (8 % O2). Четыре потенциальных элемента ответа на нормоксию (ЭОН) обнаружены в промоторе гена СДГ (ЭОН-1, ЭОН-2, ЭОН-3 и ЭОН-4). Чтобы установить, какой из этих элементов функционирует в гепатоцитах, клетки трансфицировали конструкциями с репортерным геном люциферазы, находящимся под контролем в разной мере укороченных участков промотора гена СДГ. Трансфекция клеток HeLa и HepG2 конструкциями, содержащими шесть последовательно расположенных копий каждого из потенциальных ЭОН перед промотором SV40 и репортерным геном люциферазы, показала, что ЭОН-2 в клетках HeLa и HepG2, а ЭОН-1 в клетках HeLa участвуют в регуляции транскрипции гена СДГ при нормоксии. An oxygen gradient is formed in the liver due to the unidirectional blood flow from the portal vein and hepatic artery to the central vein and due to the oxygen-consuming metabolic processes of the cells along the sinusoid. This gradient appears to be one of the major factors responsible for differential expression of a number of genes between periportal and perivenous zones of liver sinusoid. The serine dehydratase (SerDH) gene is predominantly expressed in the hepatocytes of periportal zone. Northern blot analysis and transfections with the SerDH promoter luciferase constructs containing SerDH promoter (–2303 … +55 bp) upstream of the Firefly luciferase gene demonstrated that the SerDH expression was higher under normoxia (16 % O2) as compared to hypoxia (8 % O2). Four putative normoxia responsive elements (NRE) were found in the SerDH promoter (NRE-1, NRE-2, NRE-3, NRE-4). To identify which of these elements is functional in hepatocytes, several plasmids containing 6 copies of putative SerDH NRE’s upstream of the SV40 promoter and the Firefly luciferase gene were constructed. It was found that NRE-2 in both HeLa and HepG2 cells as well as NRE-1 in HeLa cells were responsible for the O2-dependent SerDH gene expression. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Структура та функції біополімерів Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази Кислород в межклеточном пространстве гепатоцитов какрегулятор транскрипции гена сериндегидратазы Oxygen as a regulator of serine dehydratase (SerDH) gene expression Article published earlier |
| spellingShingle | Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази Самойленко, А.А. Теплюк, Н.М. Оболенська, М.Ю. Кітцманн, Т. Структура та функції біополімерів |
| title | Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази |
| title_alt | Кислород в межклеточном пространстве гепатоцитов какрегулятор транскрипции гена сериндегидратазы Oxygen as a regulator of serine dehydratase (SerDH) gene expression |
| title_full | Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази |
| title_fullStr | Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази |
| title_full_unstemmed | Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази |
| title_short | Кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази |
| title_sort | кисень у міжклітинному просторі гепатоцитів як регулятор транскрипції гена сериндегідратази |
| topic | Структура та функції біополімерів |
| topic_facet | Структура та функції біополімерів |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157513 |
| work_keys_str_mv | AT samoilenkoaa kisenʹumížklítinnomuprostorígepatocitívâkregulâtortranskripcíígenaserindegídratazi AT teplûknm kisenʹumížklítinnomuprostorígepatocitívâkregulâtortranskripcíígenaserindegídratazi AT obolensʹkamû kisenʹumížklítinnomuprostorígepatocitívâkregulâtortranskripcíígenaserindegídratazi AT kítcmannt kisenʹumížklítinnomuprostorígepatocitívâkregulâtortranskripcíígenaserindegídratazi AT samoilenkoaa kislorodvmežkletočnomprostranstvegepatocitovkakregulâtortranskripciigenaserindegidratazy AT teplûknm kislorodvmežkletočnomprostranstvegepatocitovkakregulâtortranskripciigenaserindegidratazy AT obolensʹkamû kislorodvmežkletočnomprostranstvegepatocitovkakregulâtortranskripciigenaserindegidratazy AT kítcmannt kislorodvmežkletočnomprostranstvegepatocitovkakregulâtortranskripciigenaserindegidratazy AT samoilenkoaa oxygenasaregulatorofserinedehydrataseserdhgeneexpression AT teplûknm oxygenasaregulatorofserinedehydrataseserdhgeneexpression AT obolensʹkamû oxygenasaregulatorofserinedehydrataseserdhgeneexpression AT kítcmannt oxygenasaregulatorofserinedehydrataseserdhgeneexpression |