К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) в настоящее время изучается в основном с позиций функционирования множественных экспортеров и переполнения клетки белками. Однако часто подобным образом проблема не находит своего решения. Здесь мы кратко суммируем последние достижения в изучении МЛУ и...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2004
Автори:	Черепенко, Е.И., Говорун, Д.Н.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2004
Назва видання:	Біополімери і клітина
Теми:	Огляди
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157568
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков / Е.И. Черепенко, Д.Н. Говорун // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 3. — С. 193-206. — Бібліогр.: 85 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-157568
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1575682025-02-23T17:47:00Z К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков On the problem of multidrug resistance: hypermutability as a mechanism to defense metabolic targets from toxic xenobiotics До проблеми множинної лікарської стійкости: гіпермутабільність як механізм захисту метаболічних мішеней бактеріальної клітини від цитотоксичних ксенобіотиків Черепенко, Е.И. Говорун, Д.Н. Огляди Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) в настоящее время изучается в основном с позиций функционирования множественных экспортеров и переполнения клетки белками. Однако часто подобным образом проблема не находит своего решения. Здесь мы кратко суммируем последние достижения в изучении МЛУ и приводим наши результаты по обнаружению МЛУ, возникающей за счет мутирования тесно сцепленных генов, составляющих кассеты. Они могут специально располагаться в клетке (энвиронсомы) так, что в отличие от других генов (доместосомы) контактируют с внутриклеточным пространством и главным внутриклеточным потоком веществ. Геном содержит –100 энвиронсом, и фенотип хемоустойчивости возникает за счет мутирования хотя бы одной из них. Когда во внутриклеточный поток попадает мутаген, кассета первая становится областью эффективного локального мутагенеза. Если кассета кодирует белки с природной неструктурированностью и мутация может вызвать в них переход по линии беспорядок–порядок, то это приведет к изменению геометрии внутри клеточного пространства так, что доступ лигандов к мишеням станет невозможным, что обусловит множественную лекарственную устойчивость. Multidrug resistance (mdr), a scourge of modern pharmacology, is studied mainly as related to the function of multidrug exporters and cell overcrowding with proteins. However, often it brings no solution to the problem. Here we briefly summarize achievements in the mdr study and analyze our results showing that mdr may emerge due to simultaneous mutations arisen in different tightly linked genes united into a cassette. The latter may be specially localized inside the cell (we dubbed this as an environsome) so that it faces, unlike other genes, the intracellular space and the main intracellular flux. There are ~100 environsomes per cell, the chemoresistant phenotype may be due to a mutation in one of them. In case of a mutagen involved into the flux the cassette is the first to become an area of effective local mutagenesis and develops many mutations simultaneously. If the cassette codes for natively unfolded proteins and the transition disorder/order due to mutations becomes possible it may change the geometry of intracellular space and cause ligand and target sequestration, leading to the cell multiple chemoresistance). Множинну стійкість до ліків (МСЛ) вивчають переважно з позицій функціонування множинних експортерів та перевантаження клітини білками. Проте в багатьох випадках ця проблема не знаходить свого вирішення. У представленому огляді на тлі основних досягнень вивчення МЛС стисло подаються власні результати виявлення МЛС за рахунок тісно зчеплених генів, що утворюють касети, в яких мутації виникають одночасно. Касети (на відміну від інших генів-доместосом) мають, на нашу думку, спеціальне розташування (енвіронсоми), шр забезпечує їхній контакт із внутрішньоклітинним простором та головним внутрішньоклітинним потоком речовин. Геном містить ~100 енвіронсом і стійкість виникає, якщо хоч би в одній з них з'явилася мутація. Коли мутаген опиняється у внутрішньоклітинному потоці, касета енвіронсоми першою сприймає мутагенний удар. Якщо вона кодує білки з притаманною їм природною неструктурованістю, а мутація може спричинити перехід у молекулі білка від гнучкості до жорсткості, то це може викликати зміни геометрії внутрішньоклітинного простору. Внаслідок цих змін ліганди не зможуть потрапляти до мішеней, що призведе до фенотипу множинної стійкості до ліків. 2004 Article К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков / Е.И. Черепенко, Д.Н. Говорун // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 3. — С. 193-206. — Бібліогр.: 85 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0006A6 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157568 575.224 + 577.352.4 + 579.252 + 615.015. ru Біополімери і клітина application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Огляди Огляди
spellingShingle	Огляди Огляди Черепенко, Е.И. Говорун, Д.Н. К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков Біополімери і клітина
description	Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) в настоящее время изучается в основном с позиций функционирования множественных экспортеров и переполнения клетки белками. Однако часто подобным образом проблема не находит своего решения. Здесь мы кратко суммируем последние достижения в изучении МЛУ и приводим наши результаты по обнаружению МЛУ, возникающей за счет мутирования тесно сцепленных генов, составляющих кассеты. Они могут специально располагаться в клетке (энвиронсомы) так, что в отличие от других генов (доместосомы) контактируют с внутриклеточным пространством и главным внутриклеточным потоком веществ. Геном содержит –100 энвиронсом, и фенотип хемоустойчивости возникает за счет мутирования хотя бы одной из них. Когда во внутриклеточный поток попадает мутаген, кассета первая становится областью эффективного локального мутагенеза. Если кассета кодирует белки с природной неструктурированностью и мутация может вызвать в них переход по линии беспорядок–порядок, то это приведет к изменению геометрии внутри клеточного пространства так, что доступ лигандов к мишеням станет невозможным, что обусловит множественную лекарственную устойчивость.
format	Article
author	Черепенко, Е.И. Говорун, Д.Н.
author_facet	Черепенко, Е.И. Говорун, Д.Н.
author_sort	Черепенко, Е.И.
title	К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков
title_short	К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков
title_full	К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков
title_fullStr	К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков
title_full_unstemmed	К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков
title_sort	к проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2004
topic_facet	Огляди
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157568
citation_txt	К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков / Е.И. Черепенко, Д.Н. Говорун // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 3. — С. 193-206. — Бібліогр.: 85 назв. — рос.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT čerepenkoei kproblememnožestvennojlekarstvennojustojčivostigipermutabilʹnostʹkakmehanizmzaŝitymetaboličeskihmišenejbakterialʹnojkletkiotcitotoksičeskihksenobiotikov AT govorundn kproblememnožestvennojlekarstvennojustojčivostigipermutabilʹnostʹkakmehanizmzaŝitymetaboličeskihmišenejbakterialʹnojkletkiotcitotoksičeskihksenobiotikov AT čerepenkoei ontheproblemofmultidrugresistancehypermutabilityasamechanismtodefensemetabolictargetsfromtoxicxenobiotics AT govorundn ontheproblemofmultidrugresistancehypermutabilityasamechanismtodefensemetabolictargetsfromtoxicxenobiotics AT čerepenkoei doproblemimnožinnoílíkarsʹkoístíjkostigípermutabílʹnístʹâkmehanízmzahistumetabolíčnihmíšenejbakteríalʹnoíklítinivídcitotoksičnihksenobíotikív AT govorundn doproblemimnožinnoílíkarsʹkoístíjkostigípermutabílʹnístʹâkmehanízmzahistumetabolíčnihmíšenejbakteríalʹnoíklítinivídcitotoksičnihksenobíotikív
first_indexed	2025-11-24T04:44:31Z
last_indexed	2025-11-24T04:44:31Z
_version_	1849645567076990976
fulltext	I S S N 0233-7657. Біополімери і клітина. 2004 . Т. 20. № З К проблеме множественной лекарственной устойчивости: гипермутабильность как механизм защиты метаболических мишеней бактериальной клетки от цитотоксических ксенобиотиков Е. И. Черепенко, Д. Н. Говорун Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143 E-mail: dhovorun@imbg.org.ua Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) в настоящее время изучается в основном с позиций функционирования множественных экспортеров и переполнения клетки белками. Однако часто подобным образом проблема не находит своего решения. Здесь мы кратко суммируем последние достижения в изучении МЛУ и приводим наши результаты по обнаружению МЛУ, возникающей за счет мутирования тесно сцепленных генов, составляющих кассеты. Они могут специально располагаться в клетке (энвиронсомы) так, что в отличие от других генов (доместосомы) контактируют с внутриклеточным пространством и главным внутриклеточ ным потоком веществ. Геном содержит -100 энвиронсом, и фенотип хемоустойчивости возникает за счет мутирования хотя бы одной из них. Когда во внутриклеточный поток попадает мутаген, кассета первая становится областью эффективного локального мутагенеза. Если кассета кодирует белки с природной неструктурированностью и мутация может вызвать в них переход по линии беспорядок—порядок, то это приведет к изменению геометрии внутри клеточного пространства так, что доступ лигандов к мишеням станет невозможным, что обусловит множественную лекарственную устойчивость. Значительное количество выпускаемых фармаколо гической промышленностью лекарственных препа ратов, а также различных пестицидов предназначе но для осуществления единственной цели — убить соответствующую клетку . Это необходимо для предотвращения разных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных инфекций, а также злокачественного роста собственных клеток данно го организма. Создание лекарственных препаратов, способных уничтожать биологически опасные клет ки, имеет длительную историю, последние главы которой составляют лекарства мишенного типа [1—5] и так называемые макромолекулярные ле карства [6 ]. Таким образом, современные лекарственные © Е. И ЧЕРЕПЕНКО, Д. Н ГОВОРУН, 2004 цитотоксические средства делят на две группы. Одна из них представлена малыми молекулами — химическими соединениями, обладающими свойст вами лигандов по отношению к соответствующим макромолекулам клетки (мишеням) . Высокоспеци фическое связывание лигандов с мишенными мак ромолекулами инактивирует последние. Это нару шает естественный порядок протекания метаболи ческих реакций клетки и обрекает ее с высокой вероятностью на смерть. Следовательно, упомяну тая группа лекарств представлена метаболически ми ингибиторами. Другую группу самых современных цитостати- ков составляют молекулы белков и пептидов, обла дающих известной функциональной активностью, которую они не утрачивают при проникновении в клетку с помощью эндоцитоза. Более того, оказа лось, что молекулы таких цитостатиков обладают 193 mailto:dhovorun@imbg.org.ua ЧЕРЕПЕНКО Е И., ГОВОРУН Д. Н. специальными доменами P T D (protein transduction domains), наделяющими их способностью прохож дения через клеточную мембрану. Эти молекулы могут быть узнаны в клетке соответствующими цитоскелетными моторами [7 ], адресно доставляю щими их в нативном состоянии в определенные места клетки, то есть к мишеням действия этих медикаментозных средств. Завершение проекта «Геном человека» [8— 10] , открывшего широкие возможности в иденти фикации различных мишеней действия соответст вующего лекарства, и развитие так называемых highthrougput технологий (позволяющих изучать одновременно большое количество параметров на большом количестве образцов) [11] послужили толчком к небывалой интенсификации исследова ний по созданию новых лекарств. В специальной литературе появились данные, оценивающие ско рость появления в течение нескольких лет новых лекарств, выражающуюся в таких цифрах , как 10000 [1 ] и 3000 [12] новых наименований вместо тех 500 лекарств мишенного типа действия, кото рые циркулируют на фармацевтическом рынке в настоящее время [1 ]. Однако расшифровку генети ческого кода организма можно сравнить лишь с открытием континентов, их же освоение и заселе ние потребует значительно больших времени и усилий [13] . Наряду с необходимостью решения проблем по идентификации мишеней и дизайна соответствую щего лиганда к ним нужно выяснить вопросы, связанные с фармакогеномикой, — эффективным действием лекарства независимо от генетического паспорта индивида [1 , 5, 8 4 ] . Эффективность тера певтического использования разработанного меди камента неразрывно связана с таким общебиологи ческим явлением, как возникновение цитотоксиче- ской у с т о й ч и в о с т и при д е й с т в и и на к л е т к у факторов внешней среды, а также эндогенных фак торов. Поскольку данная работа ограничивается рамками обсуждения клеточного поведения по от ношению только к цитотоксическим ксенобиоти кам, составляющим класс малых химических моле кул, проблема устойчивости к макромолекулярным лекарствам здесь рассматриваться не будет. Ука жем лишь, что в настоящее время эта проблема решается на уровнях эффективности прохождения макромолекулы через клеточную мембрану и по давления иммуногенности такой молекулы в орга низме и в клетке [6] . Каковы же механизмы возникновения хеморе- зистетности, в частности, такого явления, как мно жественная лекарственная устойчивость (МЛУ)? Ниже мы кратко проанализируем известные дан ные по этому вопросу, раскроем суть развиваемой нами концепции о причастности явления гиперму- табильности к возникновению в клетке МЛУ и охарактеризуем основы такой хеморезистентности. Генетические и биохимические механизмы возникновения хеморезистентности в бактериаль ной клетке . Эра антибиотиков, начавшаяся с 40-х годов прошлого века, сыграла в биологии двоякую роль: открыла принципиально новый класс тера певтически активных соединений и проложила путь для изучения механизмов устойчивости клет ки к антибиотикам, а отсюда — и к другим видам цитотоксической устойчивости. Панораму резуль татов по мере их поступления при изучении про блемы цитотоксической устойчивости отражают написанные с разницей в 12 лет такие обобщающие работы — обзор 1990 г. [14] и монография 2002 г. [15] . Однако проблема МЛУ остается далекой от своего решения. Нужны новые методы в исследова нии биологии клетки. Прежде чем характеризовать предлагаемый нами подход к изучению МЛУ, крат ко рассмотрим имеющуюся информацию по этой проблеме. Отметим, что описанные механизмы хеморези стентности являются по своей природе генетиче скими. Действительно, ранее установлено, что об работка мутагеном клеток является фактором воз никновения устойчивости последних к мишенным метаболическим ингибиторам [16] . Однако в по следнее время появляются работы, демонстрирую щие возможность эпигенетического механизма воз никновения МЛУ [17] . Генетические механизмы хемоустойчивости делятся на две группы. К одной из них относят механизмы, связанные с изменениями соответству ющих кодирующих и регуляторных последователь ностей клеточного генома. В основе этих измене ний могут лежать такие генетические события [14, 15]: 1) амплификация или делеция соответствую щего гена; 2) точечные мутации того или иного гена; 3) мутации, обусловливающие дисфункцию цис- и /пранс-регуляторных областей соответствую щего гена. Другая группа генетических механизмов, обус ловливающих хеморезистентность, связана с при обретением клеткой в результате горизонтального переноса с помощью плазмид, транспозонов и ин- тегронов специальных генов, способных, как пра вило, нейтрализовать цитотоксические ксенобиоти ки за счет их деградации или химической модифи к а ц и и , д е л а ю щ е й ксенобиотики н е а к т и в н ы м и [18—20]. Описанные возможные генетические измене ния лежат , как установлено, в основе изменений 194 ряда биохимических процессов, приводящих к ци тотоксической устойчивости клетки [14]: 1) изме нения в участках мишени, делающие невозможным связывание ингибитора с мишенью, а также изме нение концентрации в клетке сайта связывания данного ингибитора; 2) изменение в работе транс портных белков, ответственных либо за проведение веществ внутрь клеток, либо за их выброс из клетки наружу; 3) включение обходных путей метаболического блока, в том числе вероятность структурной мимикрии молекул в клетке; 4) воз можность секвестраций в клетке ингибитора и мишени. Кратко охарактеризуем результаты изу чения этих механизмов. О мутировании и амплификации сайта связы вания ингибитора с мишенью. Этот механизм лежит в основе лишь одинарной хеморезистентно сти, возникающей при мишенном ингибировании, и здесь мы не будем его подробно рассматривать, поскольку акцент в данной работе ставится на МЛУ. Укажем лишь, что нарушающие связывание токсического лиганда с мишенью точечные, деле- ционные мутации по этому сайту, а также его амплификация обусловливают фенотип устойчиво сти к данному ингибитору. В подробностях рас смотрению этого механизма посвящены обзоры [21—23]. Важность ссылки на этот механизм в данной работе заключается в том, что мутация, изменяющая сайт связывания токсического лиганда с мишенью, относится к классу редких генетиче ских событий (вероятность такой мутации состав ляет величину 10""), в то время как мутанты, устойчивые к мишенным метаболическим ингиби торам и обусловленные действием мутагена, возни кают с высокой вероятностью (10~4 ) [16]. С какими же генами связан наблюдаемый эффект гипермутирования? Транспортные белки бактерий и обнаружение кодирующих их генов. Бактериальным транспорт ным белкам, которые удивительно похожи на соот ветствующие переносчики веществ клеток высших организмов, посвящены обзоры [24, 25]. Они де лятся на белки, переносящие вещества из внешней среды через клеточную мембрану внутрь клеток, и белки, выбрасывающие соответствующие вещества из клетки наружу. Характеризуя первую группу белков, укажем, что в связи с микродерматологическими особенно стями клеток граммотрицательных бактерий, обла дающих тремя барьерами для проницаемости ве ществ (внешней липополисахаридной мембраной, сетчатым, определяющим остов клетки пептидо- гликановым слоем, и цитоплазматической мембра ной), белки этой группы бывают двух типов: отве- К ПРОБЛЕМЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ чающие за транспорт веществ через 1) внешнюю и 2) плазматическую мембраны. Оказалось, что бел ки первого типа образуют во внешней мембране специальные каналы и составляют три класса: по- рины, формирующие заполненные водой поры; по- риноподобные белки, обладающие, однако, сайтами связывания определенных веществ; мембранно-ре- цепторные белки, сопряженные с таким якорным белком, как ТопВ, продлевающим соответствую щий транспортный канал непосредственно через плазматическую мембрану [25]. Что касается переносчиков веществ через плазматическую мембрану, то они достаточно мно гочисленны и делятся на две группы относительно источника энергии, используемой для их работы. Этими источниками являются либо А Т Р (первич ная система транслокаций) , либо мембранный по тенциал клетки — pmf (proton motive force) (вто ричные переносчики). Среди плазматических переносчиков выделяют четыре группы белков: 1) составляющие системы облегченной диффузии (uniport) ; 2) являющиеся вторичными переносчиками, соединяющими транс порт данного растворенного вещества с одновре менным транспортом ионов Н + или N a + в одном направлении (symport) или в разных (antiport) (т. е. переносчик активируется лишь при связывании второго лиганда) ; 3) составляющие системы транс локации групп на примере так называемой системы P T S (phosphotransferase sys tem) , использующей фосфоэнолпирувил (PEP) для фосфорилирования переносимых через клеточную мембрану молекул Сахаров в результате активации специального ком плекса: фермент I—белок Нрг—фермент II; по следний за счет различных комбинаций своих субъ единиц обусловливает специфичность в узнавании молекул соответствующих Сахаров; 4) составляю щие систему активного транспорта, зависящего от существования определенного связывающего белка, узнающего субстрат в периплазме и доставляющего его к специальной плазматической транспортной АТРазе (traffic ATPase) [26], которая у бактерий представлена субъединицами, кодируемыми раз личными генами, а у высших организмов — одной полипептидной цепью (АВС-переносчик). Многочисленные работы по получению и изу чению мутантов, возникших вследствие транспорта различных соединений (системы проведения внутрь клеток гистидина, мальтозы, фосфатов, различных аминокислот — см. обзор [28 ]) первичными и вто ричными переносчиками, показали, что мутации генов, кодирующих транспортные белки, являются достаточно редким событием (его вероятность не превышает 10~6). 195 ЧВРЕПЕНКО Е И , ГОВОРУН Д. Н. Что касается выброса веществ из клетки, то впервые этот процесс был описан датским биохи миком Дано [29 ] и десятилетие спустя в мембране МЛУ раковых клеток был найден белок Pgp 170, названный MDR1, ответственный за процесс вы броса различных неродственных соединений из клетки [29 ]. Т а к и е соединения получили название аллокритов [30] . Новейшие исследования, посвя щенные этому белку, представлены в обзорах [30, 31 ]. Отличительной чертой его строения оказалась парность, во-первых, расположенных в цитоплазме нуклеотидсвязывающих доменов. Из - за этого такой тип переносчика веществ получил название АВС- переносчик от ATP-binding cassette [27 ]. Во-вто рых, количество сегментов молекулы, пересекаю щих мембрану, также парно и выражается форму- лой 6 + 6. Создается впечатление, что MDR1 — это продукт дупликации определенного предшествен ника. Обращает на себя внимание тот факт , что MDR1 представлен как бы слитой структурой из тех субъединиц, из которых состоят транспортные АТРазы бактерий [27 ]. Т а к и м образом, дизайн самых различных транспортных белков, очевидно, связан с эксплуа тацией некой общей темы, допускающей, однако, определенные вариации, позволяющие молекулам этого класса функционировать и как импортеры, и как экспортеры веществ. Модель работы экспортера MDR1 представлена в работе [30] (рис. 1) Соглас но этой модели, димер трансмембранной части белка (TMD — t ransmembrane domain) располага ется в мембране так, что со стороны поверхностно го слоя мембраны образует воронку, заполненную водой. Находящиеся в цитоплазме АВС-домены, имеют L-форму, димеризуясь за счет структуры, отраженной длинной стороной этой буквы. Струк тура, схематически представленная короткой час тью буквы, расположена симметрично линии диме- ризации ABC-доменов и осуществляет контакт этих доменов с TMD-участком молекулы со сторо ны цитоплазмы. Гидрофильное вещество может выбрасываться непосредственно в воронку. Гидро фобное же вещество, оказавшееся во внутреннем слое мембраны, подвергается латеральной трансло кации на основе T M D и выбрасывается наружу. Наличие таких молекул-насосов — неотъемле мая черта организации клетки от бактерий до человека [32] . На большую важность существова ния этого типа молекул указывает то, что у выпол няемой ими функции обнаружен значительный запас прочности. Это объясняется присутствием у эукариотов наряду с MDR-насосом второго экспор тера белка MRP1 (multidrug resistance protein) [31, 33—36] . Главное отличие MRP насоса от MDR Рис. 1. Схематическое изображение устройства АВС-переносчи- ка [30] (объяснение схемы представлено в тексте) заключается в том, что первый экспортирует ал- локриты в виде конъюгатов с глутатионом. У бактерий открыты работающие за счет мем бранного потенциала многочисленные экспортеры, многие из которых множественные [37, 38 ]. Уста новлено, что по своему строению они составляют три семейства белков: 1) MFS (major facilitator superfamily), T M D которых пересекает мембрану 12—14 раз; 2) Smr (small mult idrug resistance), T M D которых пересекает мембрану 4 раза; 3) R N D (res is tance/nodulat ion/divis ion) , T M D которых пе ресекает мембрану 12 раз , но имеются еще две большие экстраплазматические петли. Еще одной характеристикой этих белков явля ется то, как они работают, — сами по себе или нуждаются в дополнительных белках — таких, ко торые осуществляют физический контакт между плазматической мембраной и периплазмой (MFP- membrane fusion proteins) , а также с внешней мембраной (OMF — outer membrane factor). Схема известных экспортеров представлена на рис. 2 [39 ]. Показаны два типа насосов: LmrA — АТРаза , ос тальные используют энергию pmf. Насосы NorA и QacA — представлены только MFS белками и не требуют для своей функции дополнительных бел ков. Насос EmrB — это также MFS белок, но ему необходимы белки типа MFP (контакт между мем бранами) и типа OMF (контакт с окружающей средой). Эти функции выполняют соответственно белки EmrA и ТоІС (рис. 2) . Экспортер из семей ства R N D требует для своей работы также сопря жения с белками типа MFP и ОМР, функцию которых выполняют соответственно белки АсгА и ТоІС. В нижней части рисунка приведены названия субстратов, являющихся аллокритами установлен ных экспортеров. 196 К ПРОБЛЕМЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ Рис. 2. Бактериальные насосы, перекачивающие множественные субстраты [39] (объяснения см. в тексте) Клонирование в составе мультикопийных плаз - мид фрагментов геномной Д Н К , содержащей гены, кодирующие известные экспортеры, позволяет уви деть по передаче признака от устойчивой клетки к чувствительной функцию этих насосов и изучить особенности последних. Однако часты случаи выяв ления цитотоксической устойчивости, не связанные с какими-либо изменениями в работе транспортных белков. Так, при обработке клеток Escherichia coli мутагеном возможно образование с высокой часто той (10~4) \| 1 6 ] мутантов gly1', устойчивых к метабо лическому ингибитору глифосату, инактивирующе- му единственную мишень клетки — 5-энолпиру- вил-3-фосфатшикимат синтазу (EPSPS) — шестой фермент шикиматного пути синтеза [40] . (Сразу же отметим, что данные клетки a priori не облада ют активностью, разрушающей неприродную С-Р связь, присущую глифосату [41 ].) Однако клони рование фрагментов геномной Д Н К пяти мутантов gly не дало положительных результатов [42] , что можно было бы ожидать в случае активации экс портера с помощью мутации, которая должна быть доминантной. Одна из изучаемых мутаций оказа лась рецессивной и при этом не нарушала процесса поступления глифосата в клетку [43] . Может ли мутаген индуцировать с высокой вероятностью об ходные пути функции мишени, блокированной ме таболическим ингибитором? Об обходных путях метаболических блоков в клетке. Этот вопрос рассматривался в обзорах [14, 21 ]. Соответствующей теории еще не существует (появляются лишь первые попытки [44 ]) и это — область примеров. Мы задались целью, используя конкретный пример, получить ответ на вопрос — может ли мутаген и если да, то с какой эффектив ностью, стимулировать обходные пути возникшего в клетке метаболического блока? В качестве такого примера нами выбран кле точный синтез GMP. Пути синтеза пуринов досконально изучены: это путь de novo, дополнительный путь (salvage pathway) и шунт, соединяющий эти два пути [45— 47 ]. Если каждый путь и шунт выключить с помощью мутации (для этого удалось сконструиро вать специальный штамм S 0 609 [46 ]) и, исполь зуя библиотеку генов, клонировать фрагменты, комплементирующие такие мутации, то должны быть лишь три типа таких фрагментов. Однако клонирование выявило их семь [48 ]. Ясно, что че тыре «лишних» типа отражают возможности клет ки обходить блок. Укажем здесь, что подтвержде нием того, что изучение «артефактов» клонирова ния может быть, как указано в [48 ], методом изучения обходных путей, служит работа [49 ]. В этом исследовании дефектные по системам репара ции однонитчатых разрывов клетки , чрезвычайно чувствительные к УФ облучению, трансформирова ли банком генов в мультикопийных плазмидах и отбирали клоны, устойчивые к УФ свету. Анализ таких клонов показал, что данный дефект исправ лялся с помощью неожиданной активности РНКазы Т, необходимой для процессинга т Р Н К и 5S РНК. Это может быть только в том случае, если РНКаза 197 ЧЕРЕПЕНКО Е. И., ГОВОРУН Д. Н. Таблица 1 Сравнение величин реверсии под действием мутагена нитрозонитрогуанадина фенотипа Gua клеток S06O9 с фенотипом ауксотрофии Pro' -» Pro* и Arg -» Arg штаммов АЛ J J57 и В3898 Т наряду с РНКазной обладает и ДНКазной актив ностью 3 ' -5 ' полярности. Обнаружение большого количества фрагментов геномной Д Н К , комплементирующей Gua" фено тип, позволило сравнить величины реверсии под действием мутагена этого фенотипа с величиной реверсий по другим ауксотрофным маркерам. Ре зультаты этого сравнения показаны в табл. 1. Из приведенных данных следует, что индукции обход ных путей метаболического блока под действием мутагена с высокой вероятностью не происходит. Мы также установили, что если обходной путь может быть связан с явлением структурной мимик рии среди молекул клетки, то мутаген не повышает вероятности этого процесса в случае даже очень похожих молекул. Подобие в структуре молекул, выполняющих, однако, различные функции, могло бы указывать на особую генетическую пластич ность соответствующего генетического материала. Такими являются молекулы т Р Н К Р Ь е и Р Н К 1, участвующая в репликации Д Н К плазмид ColEl ряда [50] . Молекулы сложены в виде клеверного листа и имеются участки консенсусных последова тельностей, хотя Р Н К 1 аминоацилирующей спо собностью не обладает. Увеличение концентрации т Р Н К Р Ь е в клетке защищает дефектную термола бильную фенилаланил-тРНК синтетазу при непер- мессивной температуре. Оказалось, что подобным свойством обладает и Р Н К 1 [51]. Если структур ная мимикрия — это результат какой-то особой генетической пластичности, присущей такой струк туре, как у этой молекулы, и мутаген способен изменять ее с высокой вероятностью, то свойство Р Н К 1 защищать дефектную АРСазу от темпера туры после обработки клеток мутагеном должно очень часто утрачиваться. Однако этого не проис ходило, как выявлено в результате изучения 37 колоний трансформантов клеток NP37 с термола бильной фенилаланил-тРНК синтетазой, содержа щих либо плазмиду pBluescript, либо pBR322, ре плицирующихся на основе ori ColEl (табл. 2) . Приведенные данные показывают, что в клет ке, лишенной ферментативной активности, способ ной разрушить неприродную цитотоксическую фос- фоновую С-Р-связь глифосата, возникновение ус тойчивых мутантов с необыкновенно высокой частотой происходит за счет мутаций не в тех генах, которые отвечают за транспорт ингибитора [43 ] и обходные пути функции мишени, инактиви- рованной упомянутым ингибитором. Обусловлива ют ли эти мутации процесс секвестрации? О секвестрации ингибитора в клетке, пред отвращающей его взаимодействие с мишенью. Секвестрация — это такая ситуация в клетке, ког да доступ ингибитора к мишени по физическим причинам становится невозможным. Изучение это го явления также основано на примерах. Одним из них является предотвращение отравления фермен тов солями тяжелых металлов, что происходит при сверхэкспрессии специального белка, предназна ченного для связывания этих вредных агентов клетки (см. обзор [14]) . Известно, что у эукариотов секвестрация мо жет быть связана с изменениями параметров эндо- цитозного процесса. Д л я прокариотов существуют такие варианты: 1) возможности возникновения случайного родства к токсическому лиганду у мо лекулы, отличной от мишени, а т акже концентра ционных эффектов сайта связывания лиганда; 2) вероятность изменения конфигурации внутрикле точного пространства и условий циркуляции ве ществ в нем. Многочисленные генетические исследования, выполненные на бактериях, показывают, что сек вестрация за счет первого варианта не может осуществляться с высокой частотой. Что касается второго, то исследования только начинаются [52, 53 ]. Н а ш е внимание привлекла возможность объяс- 198 К ПРОБЛЕМЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ нения наблюдаемой с высокой вероятностью секве страции ингибитора и мишени в результате пере крытия внутриклеточного свободного потока ве ществ за счет изменений в геометрии цитоплазмы. Такие изменения могут быть при переполнении клетки функциональными белками или в результа те обусловленного мутацией перехода от неупоря доченности к упорядоченности (d i sorder /o rder ) , характерной для белков с природной неструктури рованностью (natively unfolded proteins [73]) . О х е м о р е з и с т е н т н о с т и и с т р е с с о в о м о т в е т е к л е т к и , с в я з а н н о м с и н д у к ц и е й с и н т е з а 30—40 д о п о л н и т е л ь н ы х б е л к о в . Эта проблема рассмотрена в обзорах [14, 5 4 ] . Здесь кратко укажем, что в настоящее время у бактерий известны следующие системы стрессовой защиты: 1) SOS ответ, контролирующий интактность моле кул ДНК; 2) адаптивный ответ на действие алки- лирующих агентов на клетку; 3) oxyR система, отвечающая на окислительный стресс; 4) hsp сис тема защиты от термального воздействия — белки теплового шока [14] ; 5) mar система защиты клет ки от различных ксенобиотиков [54 ]. Оказалось, что клетки с индуцированными ре- гулонами стрессового ответа проявляют устойчи вость к вредным агентам, одновременно к несколь ким и разной природы. Авторы [14] отмечают, что: «Тпеге appears to be a fundamental association between adaptation to physiological stress and re sistance to drugs. T h e basis of it is not known. («Похоже, что имеется основополагающая связь между адаптацией к физиологическому стрессу и лекарственной устойчивостью. Основа этой связи неизвестна».) Спустя 12 лет авторы [54] также указывают, что «less is known about the ability of bacteria to alter their susceptibility to noxious agents by modulating their own intrinsic physiological sys tems to affect resistance. («Менее известно о спо собности бактерий к изменению их чувствительно сти к ядам за счет изменений собственных прису щих им физиологических систем, отражающихся на устойчивости».) Приведенные данные показывают, что появле ние в клетке большого количества новых белков является фактором возникновения хеморезистент ности. Более того, оказалось, что частота спонтан ных мутаций, обусловливающих цитотоксическую устойчивость, в случае обычных клеток и этих же клеток с сверхэкспрессией какого-то белка разли чается на порядок, увеличиваясь в последнем слу чае [14] . Как же изменяется геометрия цитоплаз мы в таких клетках и как она обусловливает наблюдаемые эффекты? С позиций концентраци онных эффектов белков в клетке находит объясне ние и описанный эпигенетический механизм МЛУ. О б э п и г е н е т и ч е с к о м м е х а н и з м е в о з н и к н о в е н и я М Л У . Такой механизм установлен в работе [17] . Обратив вни мание на то, что метастазы в 20 раз устойчивее к определенному ингибитору (и ингибиторам) по сравнению с первичной опухолью и дело не в транспорте веществ, а в разном окружении этих клеток, авторы предположили наличие внеклеточ ных факторов, ответственных за МЛУ. В поисках этих факторов они стали изучать корреляции меж ду хемочувствительностью изучаемого материала и белковым составом сред инкубирования гистокуль- тур и монослойных клеток опухолей. Было показа но, что хемоустойчивость связана с присутствием в среде инкубирования двух белков. Ими оказались соответственно кислый и основный факторы роста фибробластов a F G F и b F G F . Сам по себе первый не важен, но действие второго он значительно усиливает. Ингибиторы и антитела к этим факто рам восстанавливали чувствительность клеток к ингибиторам. Д л я мышей удалось показать выраженный л е чебный эффект в случае метастаз легких, исполь зуя обычную химиотерапию в сочетании с ингиби торами F G F . Каким будет результат для человека и каков механизм действия F G F , повышение содер жания в злокачественных клетках которого вызы вает фенотип МЛУ этих клеток? Это еще предстоит установить. О б э ф ф е к т а х в н у т р и к л е т о ч - 199 ЧЕРЕПЕНКО Е. И., ГОВОРУН Д. Н. н ы х м о л е к у л я р н ы х « с т о л п о т в о р е н и й » , г е о м е т р и и ц и т о п л а з м ы , м о л е к у л я р н ы х т р а н с л о к а ц и й и п р и р о д н о й н е с т р у к т у р и р о в а н н о с т и б е л к о в . Свойства большинства белков и з у ч е н ы в условиях р а з б а в л е н н ы х растворов (0,1 % ) . В клетке же их концентрация составляет от 20 до 35 % [53, 55 ]. Автор обзора по этой теме подчеркивает: «The persistent neglect of this proper ty by biochemists should be remedied* [56 ]. («Необ ходимо положить конец постоянному игнорирова нию этого свойства биохимиками».) В работах [57—63 ] предложен термин «crowding» (и overcro wding). Математический расчет показал , что при скученности количество степеней свободы молекул сокращается и влияние одних молекул на актив ность других становится значимым. Уже в 10 %-х белковых растворах уровни компактизации моле кул резко повышаются так же , как и реакции само- и гетероассоциаций. Константы молекуляр ных ассоциаций в плотных растворах на два—три порядка выше таковых для разбавленных растворов и в таких условиях возрастает роль шаперонной и шаперониновой а к т и в н о с т е й белков [64—68 ]. (Действительно, из «забитой» белками раковой клетки оказалось возможным выделить шаперон Hsp70, удерживающий обрабатываемый им пептид, являющийся раковым антигеном конкретного боль ного, и с помощью этого пептида удалось эффек тивно активировать Т-лимфоциты, убивающие ра ковые клетки [69 ].) Одной из возможностей экспериментального изучения внутриклеточного пространства являются исследования так называемой Min системы бакте риальной клетки, создающей ориентиры плоскости деления клетки [52 ]. При делении этой клетки специальный белок FtsZ охватывает клетку посере дине кольцом (Z r ing) , которое удерживает все, что нужно для образования в правильном месте пере городки между дочерними клетками. З а правиль ную посадку белка FtsZ в нужном месте клетки и отвечают три белка min оперона, состоящего соот ветственно из трех генов minC, minD и тіпЕ. Если MinC и MinD не допускают произвольной локали зации Z кольца, то MinE, осциллируя вдоль длин ной оси клетки (что позволяет измерять расстояние между локализацией нуклеоида и серединой клет к и ) , определяет закладку перегородки деления клетки точно посередине клетки. Можно получить мутант (rodА), обращающий палочку в шар так, что для внутриклеточного пространства понятие «длинная ось» теряет смысл. Как MinE будет себя вести в таком пространстве? Оказалось, что и в этом случае белок движется в клетке на расстоя- Рис. 3. Монтаж аппаратуры атомарины как модели внутреннего содержания клетки [85] ние, самое отдаленное от места своего синтеза [52 ]. Таким образом, исследование свойств белков min оперона открывает возможности изучения внутри клеточного пространства и роли его геометрии для функционирования клетки. Как движутся молекулы внутри клетки? Для изучения этого вопроса в настоящее время исполь зуется в основном метод FRAP (f luorescence recovery after photobleaching). Его суть состоит в измерении скорости восстановления в небольшом участке клетки (< 1 % поверхности фибробласта), заполненном флуоресцентным красителем, флуо ресценции после ее тушения с помощью специаль ной лазерной аппаратуры. Три фактора определяют подвижность молекул в клетке: 1) вязкость жидкой фазы; 2) химическое связывание с макромолекулами; 3) эффект столк новений малых молекул с макромолекулами (рис. 3) . Малые молекулы движутся в клетке в четыре раза медленнее, чем в воде, и чем больше объем клетки, тем больше расстояния, на которые они перемещаются, и наоборот [70] . Более того, во внутриклеточном пространстве движутся и молеку лы белков. 200 К ПРОБЛЕМЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ Используя природную флуоресценцию белка G F P , удалось показать, что сам по себе белок двигался внутри клетки Е. coli так , что восстанов ление флуоресценции на обесцвеченной лазерным лучом поверхности происходило со «скоростью» 7 ,7±2 ,5 м к м 2 / с . При слиянии G F P с белком МВР (связывающим мальтозу) эта скорость снижалась до 2 ,5±0 ,6 м к м 2 / с . Примечательно, что упомяну тая скорость также снижалась в два раза в услови ях сверхэкспрессии G F P в клетке . Это указывает на зависимость подвижности молекул от конфигу рации внутриклеточного пространства. Оказалось, однако, что прибавление шести His остатков к молекуле G F P резко замедляло и подвижность молекулы, модифицированной подобным образом. Следовательно, не только вязкость и геометрия цитоплазмы, но и различные факторы, определяю щие возможность химических взаимодействий, от ражаются на внутриклеточном потоке веществ [55]. В связи с выявлением роли конфигурации внутриклеточного пространства в определении воз можности свободного потока веществ наше внима ние привлек феномен природно неструктурирован ных белков (natively unfolded proteins) . Начало их изучения положено в работах [71, 72] (см. обзор [73]) . Анализ первичных последовательностей мно жества белков показал, что очень часто обнаружи ваются последовательности длиной 40—50 амино кислотных остатков, не подчиняющиеся законам глобулярной упаковки молекулы белка. Как эти участки организованы, в настоящее время остается неизвестным, и такие белки называют «intrinsically destructured proteins*. В клетках эукариотов их доля варьирует в пределах 30 % и обнаруживаются они также в клетках эу- и архебактерий. Даже высказывается предположение о том, что в физио логических условиях наличие таких белков являет ся скорее правилом, чем исключением [73 ]. Изуче нию биологического значения упомянутых белков уделяется большое внимание [74, 7 5 ] . Считается, что по сравнению с жесткой 3-D структурой они обладают большей гибкостью, что особенно важно для эффективного протекания процессов молеку лярных узнаваний и ассоциаций. Огромную биологическую роль играет способ ность этих белков к переходам от неупорядоченно сти к упорядоченности (d i sorder /o rder ) , от гибкой структуры к жесткой. Какие преимущества это свойство дает клеткам для функционирования, пе речислено в [73] (возможность обеспечения высо кой специфичности взаимодействий при низком сродстве взаимодействующих компонентов; воз можность взаимодействия с несколькими различ ными мишенями; расширение поверхности взаимо действий; упрощение регуляции молекулярных связываний; возможность снижения времени жизни белковой молекулы, что особенно важно для моле кул регуляторных белков) . Установлены факторы, обусловливающие переходы от гибкой к жесткой структуре белка. Это — ди- и тривалентные ионы металлов, повышение концентрации белка в рас творе, димеризация молекул белков, возможность взаимодействий доменов одних белков с доменами других, а в случае рибосомных белков — это пере ход рибосом из нефункционального в функцио нальное состояние. Возникает вопрос о возможно сти индукции в генах, кодирующих такие белки, мутаций, способных обусловить переход от гибкой к жесткой структуре белка и таким образом изме нить конфигурацию внутриклеточного пространст ва клетки. Не открывается ли возможность исследования этого вопроса при изучении основ гипермутабиль- ности по признаку возникновения устойчивости клетки к мишенному ингибитору, а также основ возникновения с высокой вероятностью множест венной устойчивости? Почему мутации, с о о б щ а ю щ и е за счет секве страций устойчивость клетки к мишенным инги биторам, возникают на два п о р я д к а ч а щ е мутиро вания самих мишеней и почему клетки с такими мутациями становятся , как правило , множествен но устойчивыми? Итак , изучение одного из полу ченных в опыте по мутагенезу глифосатустойчиво- го мутанта клеток Е. coli, неспособных гидролизо- вать токсическую С-Р связь в молекуле этого ингибитора, показало, что глифосат не является для указанных клеток аллокритом и процесс его поступления в клетки названного мутанта не нару шен. Т а к и е ж е свойства проявили еще 12 изучен ных мутантов из этого ж е опыта по мутагенезу [42, 4 3 ] . (Эти мутанты возникают на два порядка чаще, чем мутанты, несущие мутации по мишени, делающей ее нечувствительной к действию ингиби тора, — 10~4 и 10~ь соответственно.) Полученные данные указывают на то, что самым высоковероят ным механизмом возникновения устойчивости дан ных клеток к мишенным ингибиторам может быть процесс секвестрации в клетке лиганда и мишени. Как может осуществляться этот процесс? Мы показали, что высокая вероятность возник новения глифосатустойчивости или гипермутабиль- ность признака перехода клетки от ингибиторочув- ствительности к ингибитороустойчивости связана с наличием в геноме большого числа генов и мутиро вание хотя бы одного из них приводит к фенотипу 201 ЧЕРЕПЕНКО Е И , ГОВОРУН Д Н. устойчивости. Крупномасштабное картирование 21 glyf мутации выявило их разбросанность по всему геному [76] . Исходя из частоты возникновения таких мутаций ясно, что в данном геноме должно быть около 100 локусов, ответственных за возник новение хеморезистентности. Могут ли они содер жать какие-то специальные гены хеморезистентно сти или гены, определяющие самые разные функ ции, и отвечать при этом за фенотип устойчи вости? То, что последнее верно, подтверждает изу чение множественной устойчивости у мутантов, отобранных по устойчивости только к одному, ми шенному ингибитору. При тестировании на основе всего лишь трех различных ингибиторов (глифоса- та — gly, 6-азаурацила — баи и Б-2-амино-Ь-цис- теина — аес) мутантов, отобранных по устойчиво сти к глифосату, до 80 % из них оказались множественно устойчивыми [77 ]. (Ясно, что при увеличении ассортимента используемых ингибито ров эта цифра может возрастать вплоть до 100 %.) Удивительным оказалось то, что если выход двой ных, тройных и т. д. мутантов зависит от концен трации мутагена, то величина МЛУ изучаемых мутантов от нее не зависела при варьировании этой концентрации в пределах двух порядков [77 ]. При измерении вероятности возникновения устой чивых к различным ингибиторам мутантов в одной и той же популяции клеток эта величина оказалась одинаково высокой (10~4) для всех случаев. Следо вательно, специальных генов хеморезистентности быть не может (емкости генома просто не хватило бы) и гены, выполняющие различные функции, причастны к явлению хеморезистентности. Мутации в каком гене могут приводить к секвестрации лиганда и мишени? Для изучения одного примера из 100 возможных мы выбрали множественно устойчивый рецессивный мутант gl)f 6-аи аес. Поскольку доминантным является дикий аллель искомого гена, мутации в котором обуслов ливает фенотип устойчивости к глифосату, то при внесение в клетки устойчивого мутанта нуклеотид- ной последовательности, содержащей такой аллель, не позволит клеткам мутанта расти на ингибиторе и искомый ген таким образом может быть найден. Нуклеотидные последовательности всего генома клетки Е. coli в виде фрагментов, упорядоченных согласно генетической карте, представлены в биб лиотеке генов, созданной на основе векторного фага лямбда EMBL3 [78] . Определив методами генетического сцепления, в каком месте генома находится изучаемая мутация , стало ясно, в каком фаговом клоне библиотеки хромосомных генов на ходится искомая нуклеотидная последовательность. Субклонирование ее различных участков, а также трансформация клеток изучаемого мутанта и по зволяют установить «кто есть кто». Проделав та кую работу [77 ], мы выяснили, что мутация, сообщающая устойчивость к глифосату, содержится в нуклеотидной последовательности, кодирующей ген fis. С ней на 85 % сцеплена мутация , сообща ющая устойчивость ко второму ингибитору — аес и находящаяся на участке последовательности, коди рующей ген acrEF, отстоящий от гена fis на рассто янии 4 тыс. п. н. (Для краткости опустим здесь описание функций этих генов.) Мутация, опреде ляющая устойчивость к третьему ингибитору, рас положена также недалеко и сцеплена с мутацией гена fis на 52 % . Таким образом, возникновение фенотипа МЛУ связано с одновременным мутиро ванием даже при низких концентрациях мутагена трех различных тесносцепленных генов, отвечаю щих за фенотип хеморезистентности и попадающих под определение кассеты генов. В результате установления этого факта воз никли два вопроса: 1) как достигается первоочеред ность мутирования генов в кассетах хеморезистен тности и 2) как может происходить секвестрация лиганда и мишени в клетке вследствие мутирова ния генов в кассетах хеморезистентности? На оба этих вопроса можно найти ответы в рамках разви ваемых нами следующих представлений. Все гены генома делятся на две группы. Одну из них составляют гены, не реагирующие непосред ственно на условия функционирования клетки и отвечающие только на внутренние сигналы. Воз можно, они специально локализованы во внутрен них структурах клетки и организованы так, что их можно было бы обозначить термином «доместосо- ма» (domestic — для внутреннего пользования) . Другая группа включает гены, предназначенные для узнавания окружающей среды и их можно было бы обозначить термином энвиронсома (от environment — окружение) . (О возможности суще ствования в клетке машинерии, чувствующей ок ружение клетки, отмечается в [79].) Отличитель ной чертой организации этих генов может быть их обязательное экспонирование во внутриклеточное пространство и возможность непосредственного контакта со свободным потоком веществ внутри клетки. Таким образом, эти гены реагируют на появление в клетке мутагена первыми. Кассетная организация генов хеморезистентности, обусловли вающая, возможно, какое-то структурное единооб разие, обеспечивает высокую локальную эффек тивность мутационного процесса и высокую веро я т н о с т ь его о д н о в р е м е н н о г о п р о т е к а н и я на протяжении всей кассеты. Как мутирование генов в энвиронсомных кас- 202 К ПРОБЛЕМЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ сетах может обусловить МЛУ фенотип клетки за счет секвестраций лигандов и мишеней? Это воз можно в том случае, если продукты мутантных генов способны изменить конфигурацию внутри клеточного пространства клетки и тем самым пере крыть свободный поток в клетке или молекуляр ную транслокацию (по терминологии [70]) для того или иного вещества (в качестве модели клетки см. рис 3, демонстрирующий способ монтажа аппа ратуры в атомарине, при нарушении которого не обходимые просветы в монтировке не образуются). Каковы факторы изменения конфигурации внутриклеточного пространства? С большой веро ятностью на эту роль могут претендовать природно неструктурированные белки (natively unfolded pro teins) с их возможностью перехода от гибкой к жесткой структуре. Если дикий аллель соответст вующего гена детерминирует гибкую структуру, обладающую большей плотностью упаковки и большей эффективностью молекулярных ассоциа ций по сравнению с жесткой структурой, то он должен быть доминантным, что и наблюдается в опыте [43 ]. Экспериментально еще предстоит дока зать, кодируют ли энвиронсомные гены белки этого класса и возможен ли переход в их молекулах от гибкости к жесткости в результате мутации. Если —30 % белков клетки могут принадлежать к моле кулам этого типа [73 ], то примерно одна треть генов бактериальной клетки должна быть вовлече на в процессы сканирования химического окруже ния клетки. Поскольку новые данные генетическо го картирования позволили связать возникновение с вероятностью 10 4 мутантов, устойчивых к ми шенному ингибитору, с возможностью индукции мутаций в одном из 100 различных локусов генома и, таким образом, с наличием 100 энвиронсом на клетку, то энвиронсома может содержать кассету из ~10 генов (в то время как доместосома — примерно в три раза больше). Если доместосомы и энвиронсомы структурируются в клетке регулярно, то внутренность клетки может напоминать отсеки субмарины, которые, однако, закрываются подобно жалюзи все сразу от сигнала, исходящего с любой энвиронсомы. Клетка переходит в режим строго контролиру емой, адресной канальной передачи субстратов, доступ ксенобиотиков к мишеням невозможен и клетка становится хемоустойчивой. Если энвиронсомы существуют и их интакт- ность — это свидетельство благополучия клетки в борьбе за выживание, то как влияют на возникно вение хеморезистентности клетки такие факторы перестроек молекул Д Н К , как процессы генетиче ской рекомбинации и интеграция в геном клетки вирусных Д Н К ? На примере одного из штаммов Е. coli показано, что дочерние продукты рекомбина ции геномов генетического донора и реципиента устойчивы к шестикратным количествам ингибито ра по сравнению с родительскими клетками [80 ]. В случае же клеток, в геном которых встроена вирус ная Д Н К , вероятность возникновения устойчивых к мишенному ингибитору мутантов повышается в 2—3 раза [42] . Еще предстоит определить вклад каждого возможного фактора, определяющего эти результаты (включая возможность переполнения клетки белками) . Т а к ж е представляло интерес изу чить поведение энвиронсом по отношению к физи ческим факторам внешней среды. Воздействие в течение 7 мин на растущие клетки электромагнит ного излучения в диапазоне частот 54—76 ГГц не изменило характера устойчивости клеток к глифо сату (Н. Теплюк, Е. Черепенко — неопубликован ные данные) . Итак , на пути решения обезоруживающей со временную фармакологию проблемы МЛУ, изуче ние которой в настоящее время связано в основном с исследованиями МЛУ экспортеров и констатации роли в феномене хеморезистентности факта пере полнения клетки белками, сформулировано новое представление. Оно связано с возможностью суще ствования генов, не «спрятанных» в толще клеточ ных структур, а выходящих во внутриклеточное пространство (энвиронсом) и контактирующих не посредственно со свободным внутриклеточным по током веществ. При попадании в клетку мутагена мутацион ный процесс протекает с высокой локальной э ф фективностью на основе именно этих генов, изме ненные продукты которых за счет возможных пе реходов от гибкой к жесткой структуре (не влияя на каталитическую ф у н к ц и ю белка) изменяют к о н ф и г у р а ц и ю внутриклеточного пространства, предотвращая доступ лиганда к мишени в клетке. Вероятность такой гипермутабильности клетка мо жет использовать как механизм метаболической защиты при функционировании в неблагоприятных условиях. Возможно, такая ситуация сложилась в области мировой проблемы борьбы с туберкулезом. Д л я преодоления МЛУ в рамках развиваемых представлений возникают два вопроса — существу ют ли факторы, обращающие продукты генов энви ронсом от жесткой структуры к гибкой, и возможна ли регуляция геометрии внутриклеточного про странства с помощью полимерной терапии и нано- технологий [81—84]? Изучение механизмов МЛУ открывает перспективы исследования принципов устройства клетки и особенно монтажа клеточных структур. 203 ЧЕРЕПЕНКО Е. И., ГОВОРУН Д. Н. Таким образом, в изучении проблемы МЛУ, базирующемся в настоящее время на исследовани ях МЛУ экспортеров, предлагается новый подход, основанный на изучении возможностей регуляции геометрии внутриклеточного пространства, опреде ляющей условия свободного потока веществ в клет ке и доступ лиганда к метаболической мишени. Е. I. Cherepenko, D. М. Hovorun On the problem of multidrug resistance: hypermutability as a mechanism to defense metabolic targets from toxic xenobiotics Summary Multidrug resistance (mdr), a scourge of modern pharmacology, is studied mainly as related to the function of multidrug exporters and cell overcrowding with proteins. However, often it brings no solution to the problem. Here we briefly summarize achievements in the mdr study and analyze our results showing that mdr may emerge due to simultaneous mutations arisen in different tightly linked genes united into a cassette. The latter may be specially localized inside the cell (we dubbed this as an environsome) so that it faces, unlike other genes, the intracellular space and the main intracellular flux. There are ~ 100 environsomes per cell, the chemoresistant pheno- type may be due to a mutation in one of them In case of a mutagen involved into the flux the cassette is the first to become an area of effective local mutagenesis and develops many mutations simulta neously. If the cassette codes for natively unfolded proteins and the transition disorder!order due to mutations becomes possible it may change the geometry of intracellular space and cause ligand and target sequestration, leading to the cell multiple chemoresistance). О. Й. Черепенко, Д. M. Говорун До проблеми множинної лікарської стійкости: гіпермутабільність як механізм захисту метаболічних мішеней бактеріальної клітини від цитотоксичних ксенобіотиків Резюме Множинну стійкість до ліків (МСЛ) вивчають переважно з позицій функціонування множинних експортерів та переван таження клітини білками. Проте в багатьох випадках ця проблема не знаходить свого вирішення. У представленому огляді на тлі основних досягнень вивчення МЛС стисло подаються власні результати виявлення МЛС за рахунок тісно зчеплених генів, що утворюють касети, в яких мутації виникають одночасно. Касети (на відміну від інших генів-до- местосом) мають, на нашу думку, спеціальне розташування (енвіронсоми), шр забезпечує їхній контакт із внутрішньо клітинним простором та головним внутрішньоклітинним потоком речовин. Геном містить ~100 енвіронсом і стійкість виникає, якщо хоч би в одній з них з'явилася мутація. Коли мутаген опиняється у внутрішньоклітинному потоці, касета енвіронсоми першою сприймає мутагенний удар. Якщо вона кодує білки з притаманною їм природною неструктурова- ністю, а мутація може спричинити перехід у молекулі білка від гнучкості до жорсткості, то це може викликати зміни геометрії внутрішньоклітинного простору. Внаслідок цих змін ліганди не зможуть потрапляти до мішеней, що призведе до фенотипу множинної стійкості до ліків. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Drews J. Genomic sciences and the medicine tomorrow / / Nat. Biotechnol .—1996.—14.—P. 1516—1518. 2. Bugg C, Carson W., Montgomery J. Drug by design / / Sci. Amer.—1993.—269.—P. 92—98 . 3. Pfost D. R. The engineering of drug discovery / / Nat. Biotechnol .—1998.—16.—P. 313—315 . 4. Scangos G. Drug discovery in the postgenomic era / / Nat. Biotechnol .—1997.—15.—P. 1220—1221 . 5. Drews J. Drug discovery: a historical perspective / / Science.— 2000 .—287 .—P. 1960—1964. 6. Torchillin V. P., Lukyanov A. Peptide and protein drug delivery to and into tumors: challenges and solutions / / Drug Discov. T o d a y — 2 0 0 3 . — 8 , — P . 259—266. 7. Phelps M., Foraker A., Swaan P. Cytoskeletal motors and cargo in membrane trafficking: opportunities for high specificity in drug intervention / / Drug Discov. Today .—2003 .—8.— P. 494—502 . 8. Venter J. C, Adams M., Myers E. The sequence of the human genome / / Sc ience .—2001.—291.—P. 1304—1305. 9. Lander E., Rogers J., Sulston J. International human genome sequencing consortium initial sequencing and analysis of the human genome / / Nature .—2001.—409.—P. 8 6 0 — 9 2 1 . 10. Ewing В., Green P. Analysis of expressed sequence tags indicates 35000 human genes / / Nat. Genet .—2001.—25.— P. 232—234 . 11. Rubinstein K. High throughput screening: Overcoming the innovation deficit. D and MD Rpts.—London, 2000 .—207 p. 12. Hemmila I., Hurskainen P. Novel detection strategies for drug discovery / / Drug Discov. Today .—2002 .—7.—P. S150— SI 56. 13. Drews J. Strategic trends in the drug industry / / Drug Discov. Today .—2003 .—8.—P. 411—420 . 14. Hayes J., Wolf C. R. Molecular mechanisms of drug resistance / / Biochem. J .—1990 .—272 .—P. 281—285. 15. Bacterial resistance to antimicrobials / Ed. K. Lewis.—New York: Marcel Dekker, Inc., 2002 .—495 p. 16. Comai L., Sen L., Stalker D. An altered aroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate / / Science.— 1983 .—221.—P. 370—371 . 17. Song S., Wientjes M., Gan Y., Au J. Fibroblast growth factors: an epigenetic mechanism of broad spectrum resistance to anticancer drugs / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—2000 .—97.— P. 8658—8663 . 18. Davies J. Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes / / Sc ience .—1994.—264.—P. 375—382 . 19. Ильина Т. Структурная организация и механизмы пере мещений генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам и факторам вирулентности бактерий / / Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология.-— 2001 .—№ 1.—С. 3—12. 20. Ковалевская Н. П. Мобильные генные кассеты и ин- тегроны / / Молекуляр. биология.—2002.—36.—С. 261 — 267. 21 . Hooper D. Target modification as a mechanism of antimicrobial resistance / / Bacterial resistance to antimicrobials / Ed. K. Lewis.—New York: Marcel Dekker Inc., 2002 .—P. 161 — 197. 22. Kishore G., Shah D. Aminoacid biosynthesis inhibitors as herbicides / / Ann. Rev. Biochem.—1988.—57.—P. 627—663. 23. Padgette S. R., Re D. В., Barry G. Г. New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup rea dy gene / / Herbicide-resistant crops.—Boca Raton: CRC publ., 1996 .—P. 53—84 . 24. Nikaido H., Saier V., Jr. Transport proteins in bacteria / / Common themes in their design / / Science.—1992.—258.— P. 936—942 . 204 К ПРОБЛЕМЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ 25. Nikaido Н. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability barriers and active efflux / / Science.—1994.— 264 .—P. 382—388. 26. Ames G. F. L., Mimura C, Shyamalo V. Bacterial periplasmic permeases belong to a family of transport proteins operating from E. coli humans: traffic ATPases / / FEMS Microbiol. Rev .—1990.—75.—P. 429—446 . 27. Hyde S., Emsley P., Hartson M. Structural model of ABC- proteins associated with cystic fibrosis, multidrug resistance and Bacterial transport / / Nature .—1992.—346.—P. 362—365. 28. Ames G. F. L. Bacterial periplasmic transport systems: struc ture, mechanisms and evolution / / Ann. Rev. Biochem.— 1986.—55.—P. 397—425. 29. Dana K., Roninson I. Interviews / / J. NIH Res .—1994.—6.— P. 66—74. 30. Holland I. В., Blight M. A. ABC-ATPases, adaptable energy generators fuelling transmembrane movement of a variety of molecules in organization from bacteria to humans / / J. Мої. Biol .—1999.—293.—P. 381—389 . 31. Ставровская А. А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток / / Био химия.—2000.—65,—Р. 112—125. 32. Higgins С. ABC-transporters: from microorganisms to man / / Ann. Rev. Cell Bio l .—1992.—8.—P. 6 7 — 1 1 3 . 33. Hipfner D. A., Delley R. G., Cole S. P. C. Structural mechanistic and clinical aspects of MRP1 / / Biophys. et biochim. acta .—1999.—1461.—P. 359—376 . 34. Ambdukar S. V., Dey S., Yruczyna C. A. Biochemical, cellular and pharmacological aspects of the multidrug transporter / / Annu. Rev. Pharmacol, and Toxicol .—1999.—39.—P. 361 — 368. 35. Borst P. Toxicological relevance of the multidrug resistance proteinl MRP1 (ABCC1) and related transporters / / Toxicolo gy .—2001 .—67 .—P. 3 — 2 3 . 36. Sung H. Le., Altenberg G. Transport of leucotrene CH by a cysteine-less multidrug resistance protein MRP / / Biochem. J .—2003 .—370.—P. 357—360 . 37. Paulsen I., Brown M., Skurray R. Proton-dependent multidrug efflux systems / / Microbiol. Rev. — 1 9 9 6 . — 6 0 . — P . 575—608. 38. Pao S., Paulsen J., Saier V. Major facilitator family / / Microbiol. Мої. Biol. Rev .—1998 .—9.—P. 263—269. 39. Lewis K., Lomovskaya O. Drug efflux / / Bacterial resistance to antimicrobials / Ed. K. Lewis.—New York: Marcel Dekker, Inc., 2 0 0 2 — P . 61—90. 40. Steinrucken H., Amrhein N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvyl-shikimic acid-3-phosphate synthase / / Biochem. and Biophys. Res. Communs.—1980.— 9 4 — P. 1207—1212. 41. Pipke R., Amrhein N. Carbon-phosphorus lyase activity in permeabilized cells of Arthrobacter sp. GLP-1 / / FEBS Lett .—1988.—236.—P. 135—138. 42. Cherepenko E. I. Genetic mechanisms of the resistance of E. coli to amino acid antimetabolites / / Биополимеры и клет ка.— 1997.—13.—P. 493—496 . 43. Черепенко E. И. Рецессивные гены хеморезистентности Escherichia coli, не определяющие поступление веществ в клетку / / Доп. НАН України.—2003.—№ 2.—С. 200—203. 44. Jeffrey С. J. Moonlightening proteins / / Trends Biochem. Sc i .—1999.—24.—P. 8—11 . 45. Neuhard J., Nygaard P. Purines and pyrimidines / / Es cherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and mole cular biology / Ed. F. Neidhardt.—Washington: ASM press, 1987.—Vol. 1.—P. 445—473 . 46. Jochimsen В., Nygaard P., Vestergaard T. Location on the chromosome of Escherichia coli of genes governing purine metabolism / / Мої. and Gen. Genet .—1975 .—143 .—P. 85— 91. 47. Craig S. Purine salvage enzymes as targets for the chemothe- rapeutic treatment of parasitic diseases / / Биополимеры и клетка.—1991.—6.—P. 6 5 — 7 1 . 48. Cherepenko E. I., Craig S. Genetic mechanisms of E. coli resistance to target inactivation: Genes governing purine meta bolism in enterobacteria and an unexpected sequence found via complementation selection / / Биополимеры и клетка.— 1997 .—13.—P. 403—407. 49. Viswanathan A., Lanjuin S. L. Identification of RNAse T as a highcopy suppressor of the UV sensitivity associated with single-strand DNA exonuclease deficiency in Escherichia coli II Genetics .—1999.—151 — P . 9 2 9 — 9 3 4 . 50 . Yavachev L., fvanov I. What does homology between E. coli tRNAs and RNAs controlling ColEI plasmid replication mean? / / J. Theor. Bio l .—1988 .—131.—P. 131 — 137. 5 1 . Черепенко E. И. Предотвращение термоинактивации фе- нилаланил-тРНК синтетазы с помощью плазмид ColEI ряда / / Биополимеры и клетка.—1994.—10.—С. 75—78. 52. СогЫп В. D, Yu X. С, Margolin W. Exloring intracellular space: function of the Min system in round-shape Escherichia coli II EMBO J .—2002 .—21 .—P. 1998—2008 . 53 . Sanford JC, Soucailte P., Whited G., Chotani G. Genomics to fluxomics and physiomics-pathway engineering / / Curr. Opin. Microbiol .—2002.—5.—P. 3 1 8 — 3 2 2 . 54 . Miller P., Rather P. Global response systems that cause resistance / / Bacterial resistance to antimicrobials / Ed. K. Lewis.—New York: Marcel Dekker, Inc., 2002 .—P. 37—60. 55 . EllowitzM. В., Surette M. G., Wolf R. E., Stock J. В., Leibler S. Protein mobility in the cytoplasm of Escherichia coli II J. Bacteriol .—1999.—181.—P. 197—203 . 56. Ellis R. J. Macromolecular crowding: obvious but underap preciated / / Trends Biochem. Sci .—2001 — 2 6 . — P . 597— 604. 57. Fulton A. How crowded is the cytoplasm? / / Cell. — 1 9 8 2 . — 3 0 . — P . 345—347 . 58. Minton A. P. The effect of volume occupancy upon the thermodynamic activity of proteins: some biochemical conse- quencies / / Мої. and Cell. B iochem.—1983 .—55.—P. 119— 140. 59. Minton K. W., Karmis P., Hahn G. M., Minton A. P. Nonspecific stabilization of stress susceptible proteins by stress- resistant proteins: a model for the biological role of heat-shock proteins / / Proc. Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 8 2 . — 7 9 . — P. 7 1 0 9 — 7 1 1 1 . 60. Zimmerman S. В., Trach S. O. Estimation of macromolecular concentration and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli II J. Мої. B io l .—1991 .—222 .—P. 599—620. 61. Minton A. P. Confinement as a determinant of macromolecular structure and reactivity / / B iophys . J. — 1 9 9 2 . — 6 3 . — P. 1090—1100. 62. Minton A. P., Conclasure G. C. Parker J. C. Mode! for the role and macromolecular crowding in regulation of cellular volume / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1 9 9 2 . — 8 9 . — P. 10504—10506. 63. Zimmerman S. В., Minton A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical and physiological consequences / / Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct .—1993.—22.—P. 27—65. 64. Ellis R. J., Hartl F. V. Principles of protein folding in the cellular environment / / Curr. Opin. Struct. Bio l .—1999.—9.— P. 192—110. 65. Ellis R. J. Molecular chaperons: avoiding the crowd / / Curr. Bio l .—1997.—7.—P. R531—R533 . 66. Dobson С. M., Evans P., Radford S. E. Understanding how 205 ЧЕРЕПЕНКО Е И., ГОВОРУН Д. Н. proteins folf: the lysozyme story so far / / Trends Biochem. Sc i .—1994 .—19.—P. 31—37. 67- Ellis R. J., Hart I F. U. Protein foling in the cell: completing models of chaperonin function / / Faseb J .—1996 .—10.— P. 20—26. 68. Van der Berg В., Ellis R. J., Dobson C. Effects of macro- molecular crowding on protein folding and aggregation / / EMBO J . — 1 9 9 9 . — 1 8 . — P . 6927—6935 . 69. Sussman H. Personalized cancer vaccine promises remission / / Drug Discov. Today .—2003 .—8.—P. 657—658 . 70. Kao H. P., Abney J. R., Verkman A. S. Determinants of the translational mobility of a small solute in cell cytoplasm / / J. Cell B io l .—1993 .—120.—P. 175—184. 71. Wrigt P. E., Dyson H. J. Intrinsically unstructured proteins: Reassessing the protein structure-function paradigm 1/3. Мої. Bio l .—1999.—293.—P. 3 2 1 — 3 3 1 . 72. Dunker A. K. Intrinsically disordered proteins / / J. Мої. Graph. Model .—2001 .—19.—P. 26—59 . 73. Uverski V. Natively unfolded proteins: A point where biology waits for physics / / Protein Sc i .—2002 .—11.—P. 739—756. 74. Plaxco K. W., Gross M. The importance of being unfolded / / Nature .—1997,—386.—P. 657—659 . 75. Pontius B. W. Close encounters: why unstructured, polymeric domains can increase rates of specific macromolecular associa tions / / Trends Biochem. Sc i .—1993 .—18.—P. 181 — 186. 76. Черепенко E. И., Карпенко О. И., Малюта С. С. Гене тические механизмы устойчивости клеток Escherichia coli к ингибиторам синтеза аминокислот / / Биополимеры и клет ка .—1994 .—10.—С. 7 9 — 8 3 . 77. Черепенко Е. И. Множественная лекарственная устой чивость: обнаружение кассеты генов в клетках Escherichia coli II Доп. HAH України.—2002.—№ П . — С . 163—166. 78. Rudd К. Linkage map of Escherichia coli K-12. The physical map / / Microbiol. Мої. Biol. Rev .—1998 .—62 .—P. 985— 1019. 79. Olden K, Wilson S. Environmental health and genomics: visions and implications / / Nat. Rev. Genet .—2000 .—1.— P. 149—153. 80. Черепенко E. И. Рекомбинация в клетках Escherichia coli и многообразие форм цитотоксической устойчивости / / Укр. биохим. журн .—2003 .—75 .—С. 25—28 . 81 . Hunter С, Mohimi S. Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian roulettei / / Drug Discov. Today.—2002.—17.— P. 9 9 8 — 1 0 0 1 . 82. Bogunia-Kubik I., Sugisaka M. From molecular biology to nanotechnology and nanomedicine / / Biosystems.—2002.— 65 .—P. 123—138. 83 . Koh H.-L., Yau W.-P.-L., Ong P.S., Hedpe A. Current trends in modern pharmaceutical analysis for drug discovery / / Drug Discov. Today .—2003 .—8.—P. 889—897 . 84. Collins F., Green E., Guttmacher A., Guyer M. A vision for the future of genomic research / / Nature.—2003.—422.— P. 835—847 . 85. Русские подводники / Под ред. Н. Черкащина.—М.: Вся Россия, 2003 .—270 с. УДК 575.224 + 577 .352 .4 + 579 .252 + 615.015.8 Надійшла до редакції 31.10.03 206

Репозитарії

Схожі ресурси