Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli
Запропоновано ефективний і недорогий метод ренатурації химерного білка ScFv-CBD із тілець включення E. coli. Метод грунтується на ступінчастому розведенні солюбілізованого в розчині 6 М гуанідингідрохлориду ScFv-CBD буфером для ренатурації, який містить L-аргінін та глутатіон. Досліджено вплив вихід...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Дата: | 2008 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2008
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157663 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli / О.Б. Горбатюк, Ю.С. Ніколаєв, Д.М. Іродов, І.Я. Дубей, П.В. Гільчук // Біополімери і клітина. — 2008. — Т. 24, № 1. — С. 51-59. — Бібліогр.: назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859504439437557760 |
|---|---|
| author | Горбатюк, О.Б. Ніколаєв, Ю.С. ІродовІродов, Д.М. Дубей, І.Я. Гільчук, П.В. |
| author_facet | Горбатюк, О.Б. Ніколаєв, Ю.С. ІродовІродов, Д.М. Дубей, І.Я. Гільчук, П.В. |
| citation_txt | Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli / О.Б. Горбатюк, Ю.С. Ніколаєв, Д.М. Іродов, І.Я. Дубей, П.В. Гільчук // Біополімери і клітина. — 2008. — Т. 24, № 1. — С. 51-59. — Бібліогр.: назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Біополімери і клітина |
| description | Запропоновано ефективний і недорогий метод ренатурації химерного білка ScFv-CBD із тілець включення E. coli. Метод грунтується на ступінчастому розведенні солюбілізованого в розчині 6 М гуанідингідрохлориду ScFv-CBD буфером для ренатурації, який містить L-аргінін та глутатіон. Досліджено вплив вихідної концентрації білка та різного співвідношення реагентів окисно-відновної пари GSSG:GSН, які додавали на певних стадіях ренатурації, на вихід функціонально активного ScFv-CBD і його агрегацію. Показано, що зниження виходу активного ScFv-CBD відбувається за рахунок формування значної кількості його розчинних агрегатів при вихідній концентрації, вищій за 0,53 мг/мл. Визначено умови ренатурації, які забезпечують найбільший вихід розчинного ScFv-CBD у мономерній формі, та найвищу функціональну активність його антигензв’язувального (ScFv) і целюлозозв’язувального (CBD) компонентів (відповідно ~63 і ~96 %).
An inexpensive and effective refolding method for ScFv-CBD fusion protein recovery from E. coli inclusion bodies has been developed. The principle of the proposed method is the stepwise dilution of solubilized ScFv-CBD in the presence of 6 M guanidine hydrochloride with refolding buffer containing L-arginine and glutathione. The influence of initial protein concentration and the molar ratio of oxidized and reduced form of glutathione that was introduced at certain refolding stages has been carefully investigated. It was shown that the decrease in the yield of functional ScFv-CBD and formation of significant amount of soluble aggregates take place when the initial protein concentration is higher then 0.53 mg/ml. The optimal refolding conditions providing highest yield of soluble monomeric ScFv-CBD as well as the highest functional activity of antigen-binding (ScFv) and cellulose-binding (CBD) moieties (~63 % and ~96 %, respectively) have been found.
Предложен эффективный и недорогой метод ренатурации химерного белка ScFv-CBD из телец включения E. coli, основанный на ступенчатом разведении солюбилизированного в растворе 6 М гуанидингидрохлорида ScFv-CBD буфером для ренатурации, содержащим L-аргинин и глутатион. Исследовано влияние исходной концентрации белка и разного соотношения реагентов окислительно-восстановительной пары GSSG/GSH, вносимых на определенных стадиях ренатурации, на выход функционально активного ScFv-CBD и его агрегацию. Показано, что снижение выхода активного ScFv-CBD происходит из-за формирования значительного количества его растворимых агрегатов при исходной концентрации выше 0,53 мг/мл. Определены условия ренатурации, обеспечивающие наибольший выход растворимого ScFv-CBD в мономерной форме, а также наивысшую активность его антигенсвязывающего (ScFv) и целлюлозосвязывающего (CBD) компонентов (соответственно ~63 и ~96 %).
|
| first_indexed | 2025-11-25T07:20:49Z |
| format | Article |
| fulltext |
Ðå íà òó ðàö³ÿ õè ìåð íî ãî á³ëêà ScFv-CBD ç ò³ëåöü
âêëþ ÷åí íÿ Escherichia ñî li
Î. Á. Ãîð áà òþê1, Þ. C. ͳêîëàºâ1, Ä. Ì. ²ðî äîâ, ². ß. Äó áåé, Ï. Â. óëü÷óê
1Êè¿âñüêèé íàö³îíàëü íèé óí³âåð ñè òåò ³ìåí³ Òà ðà ñà Øåâ ÷åí êà
Âóë. Âî ëî äè ìè ðñüêà, 64, Êè¿â, 01003, Óêðà¿ íà
²íñòè òóò ìî ëå êó ëÿð íî¿ á³îëî㳿 i ãå íå òè êè ÍÀÍ Óêðà¿ íè
Âóë. Àêàäåì³êà Çà áî ëîò íî ãî, 150, Êè¿â, 03680, Óêðà¿ íà
gilchuk@ukr.net
Çàï ðî ïî íî âà íî åôåê òèâ íèé ³ íå äî ðî ãèé ìå òîä ðå íà òó ðàö³¿ õè ìåð íî ãî á³ëêà ScFv-CBD ³ç ò³ëåöü
âêëþ ÷åí íÿ E. coli. Ìå òîä ãðóíòóºòüñÿ íà ñòóï³í÷àñòîìó ðîç âå äåíí³ ñî ëþá³ë³çî âà íî ãî â ðîç ÷èí³ 6 Ì
ãóàí³äèíã³äðîõ ëî ðè äó ScFv-CBD áó ôå ðîì äëÿ ðå íà òó ðàö³¿, ÿêèé ì³ñòèòü L-àðã³í³í òà ãëó òàò³îí.
Äîñë³äæå íî âïëèâ âèõ³äíî¿ êîí öåí òðàö³¿ á³ëêà òà ð³çíî ãî ñï³ââ³äíî øåí íÿ ðå à ãåíò³â îêèñ íî-â³äíîâ íî¿
ïàðè GSSG:GSÍ, ÿê³ äî äà âà ëè íà ïåâ íèõ ñòàä³ÿõ ðå íà òó ðàö³¿, íà âèõ³ä ôóíêö³îíàëü íî àê òèâ íî ãî
ScFv-CBD ³ éîãî àã ðå ãàö³þ. Ïî êà çà íî, ùî çíè æåí íÿ âè õî äó àê òèâ íî ãî ScFv-CBD â³äáó âàºòüñÿ çà ðà -
õó íîê ôîð ìó âàí íÿ çíà÷ íî¿ ê³ëüêîñò³ éîãî ðîç ÷èí íèõ àã ðå ãàò³â ïðè âèõ³äí³é êîí öåí òðàö³¿, âèù³é çà
0,53 ìã/ìë. Âèç íà ÷å íî óìî âè ðå íà òó ðàö³¿, ÿê³ çà áåç ïå ÷óþòü íàéá³ëüøèé âèõ³ä ðîç ÷èí íî ãî ScFv-CBD ó
ìî íî ìåðí³é ôîðì³, òà íà é âè ùó ôóíêö³îíàëü íó àê òèâí³ñòü éîãî àí òè ãå íçâ’ÿ çó âàëü íî ãî (ScFv) ³ öå -
ëþ ëî çîç â’ÿ çó âàëü íî ãî (CBD) êîì ïî íåíò³â (â³äïîâ³äíî ~63 ³ ~96 %).
Êëþ ÷îâ³ ñëî âà: õè ìåð íèé á³ëîê, ò³ëüöÿ âêëþ ÷åí íÿ, ðå íà òó ðàö³ÿ, îä íî ëàí öþ ãîâ³ àí òèò³ëà, öå ëþ ëî -
çîç â’ÿ çó âàëü íèé äî ìåí.
Âñòóï. Íà ñüî ãîäí³ ð³âåíü ðîç âèò êó ãåí íî-³íæå íåð -
íèõ òåõ íî ëîã³é çà áåç ïå ÷óº øè ðîê³ ìîæ ëè âîñò³ äëÿ
îäåð æàí íÿ ðå êîìá³íà íòíèõ á³ëê³â, ÿê³ ìà þòü âàæ -
ëè âå ïðàê òè÷ íå çíà ÷åí íÿ, ìå òî äîì áàê òåð³àëü íî ãî
ñèí òå çó. Ó áà ãàòü îõ âè ïàä êàõ ïðè åêñïðåñ³¿ ãå òå ðî -
ëîã³÷íèõ ãåí³â ó êë³òè íàõ E. ñîli ñïîñ òåð³ãàºòüñÿ àã -
ðå ãàö³ÿ ñèí òå çî âà íèõ á³ëê³â, ùî ïðè çâî äèòü äî
óòâî ðåí íÿ öè òîï ëàç ìà òè÷ íèõ ò³ëåöü âêëþ ÷åí íÿ.
Âè êî ðèñ òàí íÿ òà êèõ ïðî äó öåíò³â ñòâî ðþº ïåâí³
ñêëàä íîù³, ïî â’ÿ çàí³ ç íå îáõ³äí³ñòþ âèä³ëåí íÿ
ö³ëüî âî ãî á³ëêà ðå íà òó ðàö³ºþ ó ôóíêö³îíàëü íî àê -
òèâí³é ôîðì³ äëÿ ïîä àëü øî ãî çà ñòî ñó âàí íÿ â ñòðóê -
òóð íèõ àáî á³îõ³ì³÷íèõ äîñë³äæåí íÿõ. Êî æåí
³íäèâ³äó àëü íèé á³ëîê ïî òðå áóº åìï³ðè÷ íî ãî ïî øó -
êó àäàï òî âà íèõ ñõåì ðå íà òó ðàö³¿. Ó ðàç³ á³ëê³â, ÿê³
ì³ñòÿòü äåê³ëüêà äî ìåí³â àáî/³ äèñ óëüô³äí³ ì³ñòêè,
ïðî áëå ìà óñêëàä íþºòüñÿ íå îáõ³äí³ñòþ â³äíîâ ëåí -
íÿ àê òèâ íîñò³ êîæ íî ãî ôóíêö³îíàëü íî ãî êîì ïî íåí -
òà òà êî ðåê òíèì ïà ðó âàí íÿì SH-ãðóï [1–3]. Äî òà -
êèõ á³ëê³â íà ëå æàòü ðå êîìá³íà íòí³ àí òèò³ëà, ÿê³
íàä çâè ÷àé íî øè ðî êî âè êî ðèñ òî âó þòü ÿê àëü òåð íà -
òè âó Mabs äëÿ òå ðàﳿ ³ ä³àã íîñ òè êè ð³çíèõ çà õâî ðþ -
âàíü, à òà êîæ ó ôóí äà ìåí òàëü íèõ ìå äè -
êî-á³îëîã³÷íèõ äîñë³äæåí íÿõ [4]. Íàé ïî øè ðåí³-
øèì ôîð ìà òîì äëÿ êî íñòðó þ âàí íÿ ³ åêñïðåñ³¿ â
Å. ñîli º îä íî ëàí öþ ãîâ³ àí òèò³ëà ScFv’s
(single-chain Fv-antibodies), ÿê³ îäåð æó þòü òðàíñ -
ëÿö³ºþ îá’ºäíà íèõ â îäèí ãåí ïîñë³äîâ íîñ òåé
âàð³àáåëü íèõ (V) äî ìåí³â âàæ êî ãî ³ ëåã êî ãî ëàí -
öþã³â âèõ³äíî ãî àíòèò³ëà [5].
Ó íàø ÷àñ íå ³ñíóº ºäè íî ãî ³ óí³âåð ñàëü íî ãî
ñïî ñî áó ïðî äó êó âàí íÿ ScFv’s â Å. ñî li, îñê³ëüêè éî -
ãî âèá³ð ó êîæ íî ìó âè ïàä êó âèç íà ÷àºòüñÿ ïåâ íè ìè
51
ISSN 0233-7657. Á³îïîë³ìåðè ³ êë³òèíà. 2008. Ò. 24. ¹ 1
Ó Î. Á. ÃÎÐÁÀÒÞÊ, Þ. C. ͲÊÎËÀªÂ, Ä. Ì. ²ÐÎÄÎÂ, ². ß. ÄÓÁÅÉ,
Ï. Â. òËÜ×ÓÊ, 2008
ïðàê òè÷ íè ìè âè ìî ãà ìè ³ ïîä àëü øèì çà ñòî ñó âàí -
íÿì ö³ëüî âî ãî ïðî äóê òó. Äî ñèòü ïî øè ðå íîþ ñòðà -
òå㳺þ á³îñèí òå çó ScFv’s º âè êî ðèñ òàí íÿ ë³äåð íî ãî
ïåï òè äó äëÿ ñåê ðåö³¿ ó ïå ðèï ëàç ìó E. coli. Ñåê ðå -
òîð íà åêñïðåñ³ÿ ñïðèÿº íà êî ïè ÷åí íþ ScFv’s ó ðîç -
÷èíí³é ³ ôóíêö³îíàëüí³é ôîðì³, ùî äî ñÿ ãàºòüñÿ çà
ðà õó íîê ôîð ìó âàí íÿ äèñ óëüô³äíèõ çâ’ÿçê³â îá îõ
âàð³àáåëü íèõ äî ìåí³â çà ó÷àñò³ ïåâ íèõ ïå ðèï ëàç ìà -
òè÷ íèõ ôàê òîð³â [6–7]. Ïðî õîä æåí íÿ êî ðåê òíî ãî
ôîë äèí ãó ScFv’s ó ïå ðèï ëàçì³ º «âóçü êèì» åòà ïîì
ñåê ðå òîð íî¿ åêñïðåñ³¿, ùî ë³ì³òóº øâèäê³ñòü
¿õíüîãî íàêîïè÷åííÿ ó íàòèâíîìó ñòàí³ ³
â³äïîâ³äíî âèõ³ä ö³ëüîâîãî ïðîäóêòó [8].
Àëüòåðíàòèâíîþ ñòðà òå㳺þ ïðî äó êó âàí íÿ
ScFv’s â Å. ñî li º íà êî ïè ÷åí íÿ ¿õ ó öè òîï ëàç ìà òè÷ -
íèõ ò³ëüöÿõ âêëþ ÷åí íÿ. Îñòàííº äî ñÿ ãàºòüñÿ âè äà -
ëåí íÿì ñèã íàëü íî¿ ïî ñë³äîâ íîñò³ òà âè êî ðèñ òàí íÿì
äëÿ åêñïðåñ³¿ ñèëü íî ãî ïðî ìî òî ðó [9]. Ïå ðå âà ãà ìè
òà êî ãî ñèí òå çó º âè ñî êèé ð³âåíü íà êî ïè ÷åí íÿ
ö³ëüî âî ãî á³ëêà, à òà êîæ ñïðî ùåí³ ïðî öå äó ðè éî ãî
âèä³ëåí íÿ ³ î÷è ùåí íÿ. Çàç íà ÷å íèé ï³äõ³ä º ïåð ñïåê -
òèâ íèì äëÿ âå ëè êî ìàñ øòàá íî ãî îäåð æàí íÿ ScFv’s,
îäíàê íà ñüî ãîäí³ ïðî ìèñ ëî âå éî ãî âè êî ðèñ òàí íÿ
îá ìå æå íå â³äñóòí³ñòþ óí³âåð ñàëü íèõ ñõåì ðå íà òó -
ðàö³¿, íèç ü êèì âè õî äîì ôóíêö³îíàëü íî àê òèâ íî ãî
ïðî äóê òó ³ âè ñî êîþ ñîá³âàðò³ñòþ. Öå, â ñâîþ ÷åðãó,
ñòèìóëþº ðîçðîáêó åôåêòèâí³øèõ ³ äåøåâøèõ
ìåòîä³â ðåíàòóðàö³¿ [10].
Ó ïî ïå ðåäí³õ ðî áî òàõ íà ìè îïè ñà íî ñòâî ðåí íÿ
áàê òåð³àëü íèõ íàä ïðî äó öåíò³â õè ìåð íî ãî á³ëêà
ScFv-CBD, ÿêèé ïðè åêñïðåñ³¿ íà êî ïè ÷óºòüñÿ ó öè -
òîï ëàç ìà òè÷ íèõ ò³ëüöÿõ âêëþ ÷åí íÿ, òà ïî êà çà íî
âè êî ðèñ òàí íÿ ðå íà òó ðî âà íî ãî ScFv-CBD ÿê
àô³ííî ãî ³ìó íî ñîð áåí òó [11, 12]. Ìå òà äà íî¿ ðî áî -
òè ïî ëÿ ãà ëà â îïòèì³çàö³¿ ëà áî ðà òîð íî ãî ìå òî äó ðå -
íà òó ðàö³¿ ScFv-CBD äëÿ çà áåç ïå ÷åí íÿ âèñîêîãî
éîãî âèõîäó ó ôóíêö³îíàëüíî àêòèâí³é ôîðì³.
Ìà òåð³àëè ³ ìå òî äè. Âèä³ëåí íÿ òà î÷è ùåí íÿ
ò³ëåöü âêëþ ÷åí íÿ. Íà ðî ùó âàí íÿ áàê òåð³àëü íî¿
êóëü òó ðè òà ³íäó êó âàí íÿ åêñïðåñ³¿ ScFv-CBD ïðî -
âî äè ëè, ÿê îïè ñà íî â ðî áîò³ [11]. Îñàä æåí³ öåí òðè -
ôó ãó âàí íÿì êë³òè íè ïðî äó öåí òà ñóñ ïåí äó âà ëè â
áó ôåð³ ÒÅ (20 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,0, 1 ìÌ ÅÄÒÀ),
ÿêèé ì³ñòèâ 1 ìã/ìë ë³çî öè ìó («Sigma», ÑØÀ), òà
³íêó áó âà ëè ïðî òÿ ãîì 20 õâ íà ëüî äó. Äëÿ ðóé íó âàí -
íÿ õðî ìî ñîì íî¿ ÄÍÊ îäåð æà íèé êë³òèí íèé ë³çàò
îá ðîá ëÿ ëè óëüòðàç âó êîì, ôðàêö³þ íå ðîç ÷èí íèõ
á³ëê³â âèä³ëÿ ëè öåí òðè ôó ãó âàí íÿì (5000 g, 5 õâ).
Ò³ëüöÿ âêëþ ÷åí íÿ ÷àñ òêî âî î÷è ùó âà ëè ê³ëüêî ìà
ïî ñë³äîâ íè ìè ïðî ìè âàí íÿ ìè áó ôå ðîì ÒÅ ç 0,3 %-ì
äåç îêñè õî ëà òîì íà òð³þ, äëÿ ÷î ãî îñàä ïî âí³ñòþ
ñóñ ïåí äó âà ëè íà óëüòðàç âó êî âî ìó äåç³íòåã ðà òîð³ ç
íà ñòóï íèì â³ää³ëåí íÿì ôðàêö³¿ íå ðîç ÷èí íî ãî á³ëêà
öåí òðè ôó ãó âàí íÿì. Îäåð æàí³ ò³ëüöÿ âêëþ ÷åí íÿ
çáåð³ãà ëè ïðè –70 îÑ.
Î÷è ùåí íÿ ScFv-CBD. Ôðàêö³þ ò³ëåöü âêëþ ÷åí -
íÿ ñóñ ïåí äó âà ëè â áó ôåð³ äëÿ äå íà òó ðàö³¿ A (20 ìÌ
òðèñ-HCl, ðÍ 8,0, 200 ìÌ NaCl, 6 Ì ãó -
àí³äèíã³äðîõ ëî ðèä (ÃÃÕ), 10 ìÌ 2-ìåð êàï òî å òà -
íîë) ³ ³íêó áó âà ëè ïðî òÿ ãîì 1 ãîä ïðè ê³ìíàòí³é
òåì ïå ðà òóð³. Íå ðîç ÷èí íèé ìà òåð³àë â³äîê ðåì ëþ âà -
ëè ô³ëüòðàö³ºþ ÷å ðåç 0,45-ìêì ìåì áðàí íèé ô³ëüòð
(«Millipore», ÑØÀ). Äëÿ î÷è ùåí íÿ ñî ëþá³ë³çî âà -
íî ãî á³ëêà ScFv-CBD âè êî ðèñ òî âó âà ëè ìå òîä
³ììîá³ë³çàö³éíî¿ ìå òà ëàô³ííî¿ õðî ìà òîã ðàô³¿
(²ÌÀÕ). Ñî ëþá³ë³çî âà íèé ScFv-CBD î÷è ùó âà ëè
íà êî ëîíö³ Hi Trap Chelating HP (16/25) («GE
Helthcare», ÑØÀ) ç 5 ìë ñî ðáåí òó Ni-IDA Chelating
Sepharose. Êî ëîí êó âð³âíî âà æó âà ëè ³ ïðî ìè âà ëè
áó ôå ðîì A áåç 2-ìåð êàï òî å òà íî ëó, çâ’ÿ çà íèé á³ëîê
åëþ þ âà ëè áó ôå ðîì Á (100 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,0,
200 ìÌ NaCl, 6 Ì ÃÃÕ, 500 ìÌ ³ì³äà çîë). Êîí öåí -
òðàö³þ î÷è ùå íî ãî ScFv-CBD ðîç ðà õî âó âà ëè çà
âì³ñòîì SH-ãðóï (ï’ÿòü çà ëèøê³â öèñ òå¿ íó íà ìî ëå -
êó ëó ScFv-CBD), âè êî ðèñ òî âó þ ÷è äëÿ ¿õíüî ãî òèò -
ðó âàí íÿ ìå òîä Åëìà íà. Ãî ìî ãåíí³ñòü î÷èùåíîãî
ïðåïàðàòó àíàë³çóâàëè åëåêòðîôîðåçîì â 15 %-ìó
ïîë³àêðèëàì³äíîìó ãåë³ ç äîäåöèëñóëüôàòîì
íàòð³þ (ÄÑÍ-ÏÀÀÃ).
Ðå íà òó ðàö³ÿ ScFv-CBD. Ðå íà òó ðàö³þ ïðî âî äè -
ëè ³ç çà ñòî ñó âàí íÿì ðàí³øå ðîç ðîá ëå íî ãî íà ìè ìå -
òî äó ñòóï³í÷àñ òî ãî ðîç âå äåí íÿ [10]. Áó ôå ðîì äëÿ
äå íà òó ðàö³¿ (äèâ. âè ùå) êîí öåí òðàö³þ î÷è ùå íî ãî
õè ìåð íî ãî á³ëêà äî âî äè ëè äî 0,26–1,06 ìã/ìë, ïðî -
áó îõî ëîä æó âà ëè íà ëüî äó ³ øâèä êî ðîç âî äè ëè ïðè
³íòåí ñèâ íî ìó ïå ðåì³øó âàíí³ îõî ëîä æå íèì äî òåì -
ïå ðà òó ðè 4 îÑ áó ôå ðîì äëÿ ðå íà òó ðàö³¿  (100 ìÌ
òðèñ-HCl, ðÍ 8,0, 200 ìÌ NaCl, 1 ìÌ ÅÄÒÀ) äî
âñòà íîâ ëåí íÿ 3 Ì êîí öåí òðàö³¿ ÃÃÕ. Êîí öåí -
òðàö³þ ÃÃÕ íàä àë³ çíè æó âà ëè ïî ñòàä³éíèì ðîç âå -
äåí íÿì ðîç ÷è íó á³ëêà áó ôå ðîì  òà êèì ÷è íîì, ùîá
çà áåç ïå ÷è òè âñòà íîâ ëåí íÿ ïåâ íèõ êîí öåí -
52
ÃÎÐÁÀÒÞÊ Î. Á. ÒÀ ²Í.
òðàö³éíèõ ñòó ïåí³â ÃÃÕ: 3 Ì ® 2 Ì ® 1 Ì ® 0,5
Ì. Íà åòà ïàõ 2 Ì ® 1 Ì òà 1 Ì ® 0,5 Ì äî ñêëà äó
áó ôå ðà  äî äà âà ëè L-àðã³í³í äî ê³íöå âî¿ éî ãî êîí -
öåí òðàö³¿ 0,4 Ì òà ãëó òàò³îí â îêè ñíåí³é ³ â³äíîâ -
ëåí³é ôîð ìàõ (GSSG:GSÍ, «Sigma»). Ìî ëÿð íå
ñï³ââ³äíî øåí íÿ ScFv-CBD:GSSG â óñ³õ åê ñïå ðè -
ìåí òàõ ñòà íî âè ëî 1:50, ó òîé ÷àñ ÿê ñï³ââ³äíî øåí íÿ
GSSG:GSÍ âàð³þâà ëî â ìåæ àõ â³ä 1:5 äî 1:0.
Åëåê òðî ôî ðåç á³ëê³â. Åëåê òðî ôî ðåç á³ëê³â ïðî -
âî äè ëè çà ìå òî äîì Ëåììë³, âè êî ðèñ òî âó þ ÷è äëÿ
¿õíüî ãî ðîçä³ëåí íÿ 15 %-é ÄÑÍ-ÏÀÀà [13].
ʳëüê³ñòü òà âì³ñò (ó â³äñîòêàõ) ScFv îö³íþ âà ëè ìå -
òî äîì äåí ñè òî ìåò𳿠åëåê òðî ôî ðåã ðàì ç íà ñòóï íèì
¿õí³ì àíàë³çîì çà äî ïî ìî ãîþ ïðî ãðà ìè TîtalLab.
Ñòàí äàðòîì äëÿ ïî áó äî âè êàë³áðó âàëü íî¿ êðè âî¿
ñëó ãó âàâ ðå êîìá³íà íòíèé ³íòåð ôå ðîí a2b ëþäèíè
(rhIFN-a2b) ç â³äîìîþ êîíöåíòðàö³ºþ.
Ãåëü-õðî ìà òîã ðàô³ÿ (Size Exclusion Chromato-
graphy, SEC). Á³ëêè ôðàêö³îíó âà ëè íà êî ëîíö³
Superdex-75 (10/300) GL («GE Helthcare») ç âè êî -
ðèñ òàí íÿì àâ òî ìà òè çî âà íî ãî õðî ìà òîã ðà ôà FPLC
(«GE Helthcare»). Ñîð áåíò óð³âíî âà æó âà ëè ôîñ ôàò -
íî-ñî ëüî âèì áó ôå ðîì (PBS), øâèäê³ñòü ïî òî êó
åëþ åí òà ïðè õðî ìà òîã ðàô³¿ ñòà íî âè ëà 0,2 ìë/õâ.
Êî ëîí êó êàë³áðó âà ëè ñóì³øøþ á³ëê³â-ìàð êåð³â ç
â³äî ìîþ ìî ëå êó ëÿð íîþ ìà ñîþ.
Çâ’ÿ çó âàí íÿ ScFv ç IFN-a2b.  ëóí êàõ ïîë³ñòè -
ðî ëî âî ãî ïëàí øå òà äëÿ ELISA («Titertek», ÑØÀ)
ïî ñë³äîâ íî ðîç âî äè ëè ïðî áè, ÿê³ ì³ñòè ëè ðå íà òó ðî -
âà íèé ScFv-CBD. ϳñëÿ áëî êó âàí íÿ ì³ñöü íå ñïå -
öèô³÷íî ãî çâ’ÿ çó âàí íÿ âíî ñè ëè rhIFN-a2b (ÂÍÄÊ
«Ôàðì Á³îò åê», Óêðà¿ íà) â êîí öåí òðàö³¿ 10 ìêã/ìë
òà ³íêó áó âà ëè ïðî òÿ ãîì 1 ãîä çà òåì ïå ðà òó ðè 37 îÑ.
Äàë³ ëóí êè ïðî ìè âà ëè áó ôå ðîì PBS, ÿêèé ì³ñòèâ
0,1 % òâ³íó-20 (PBSÒ), âíî ñè ëè î÷è ùåí³ ïîë³êëî -
íàëüí³ àí òèò³ëà ìèø³ ïðî òè rhIFN-a2b òà âòî ðèíí³
àí òèò³ëà, êîí ’þ ãî âàí³ ç ïå ðîê ñè äà çîþ õðî íó
(«²ÌÒÅÊ», ÐÔ).
Óòâî ðåí³ ³ìóíí³ êîì ïëåê ñè ïðî ÿâ ëÿ ëè çà äî ïî -
ìî ãîþ õðî ìî ãåí íî ãî ñóá ñòðà òó TMB («Sigma»).
ϳñëÿ ðîç âèò êó çà áàð âëåí íÿ ðå àêö³þ çó ïè íÿ ëè äî -
äà âàí íÿì 1 Ì ñ³ð÷à íî¿ êèñ ëî òè ³ âèì³ðþ âà ëè âå ëè -
÷è íó àä ñîðáö³¿ À450 íà áà ãà òî êà íàëü íî ìó ôî òî ìåòð³
Multiscan MCC/340 («Titertek»).
Ñòà òèñ òè÷ íó îá ðîá êó ðå çóëü òàò³â çä³éñíþ âà ëè
ç âè êî ðèñ òàí íÿì ïà êå òó ïðî ãðàì «Origin 7».
Âèç íà ÷åí íÿ åôåê òèâ íîñò³ ðå íà òó ðàö³¿ ScFv-
êîì ïî íåí òà õè ìåð íî ãî á³ëêà (Å1). Äî 50 ìêë îäåð -
æà íî ãî àô³ííî ãî ñî ðáåí òó, ÿêèé ì³ñòèâ 40–75 ìêã
³ììîá³ë³çî âà íî ãî ScFv-CBD, âíî ñè ëè íàä ëè øîê
î÷è ùå íî ãî rhIFN-a2b (100–150 ìêã) òà ³íêó áó âà ëè
óïðî äîâæ 60 õâ ïðè ïî ñò³éíî ìó ïå ðåì³øó âàíí³.
Ñîð áåíò îñàä æó âà ëè öåí òðè ôó ãó âàí íÿì ³ ïðî ìè âà -
ëè ïî ñë³äîâ íî áó ôå ðîì  òà äèñ òèëü î âà íîþ âî äîþ.
Óñ³ çâ’ÿ çàí³ ç ñî ðáåí òîì á³ëêè åëþ þ âà ëè, ïðî ãð³âà -
þ ÷è ïðè òåì ïå ðà òóð³ 100 îÑ ó ðîç ÷èí³, ÿêèé ì³ñòèâ
4 Ì ñå ÷î âè íó, 0,1 %-é ÄÑÍ, 0,1 Ì 2-ìåð êàï òî å òà -
íîë. Åëþ éî âàí³ á³ëêè ðîçä³ëÿ ëè â 15 %-ìó
ÄÑÍ-ÏÀÀÃ.
Äëÿ îö³íêè ìî ëÿð íî ãî ñï³ââ³äíî øåí íÿ ScFv-
CBD/rhIFN-a2b â ³ìóí íèõ êîì ïëåê ñàõ îäåð æàí³
åëåê òðî ôî ðåã ðà ìè ñêà íó âà ëè òà àíàë³çó âà ëè ç âè -
êî ðèñ òàí íÿì ïðî ãðà ìè TîtalLab. Åôåê òèâí³ñòü ðå -
íà òó ðàö³¿ ScFv-êîì ïî íåí òà ðîç ðà õî âó âà ëè çà ôîð -
ìó ëîþ
E
m M
m M
rhIFN b ScFv CBD
ScFv CBD rhIFN b
1
2
2
100
(%) =
× ×
×
- -
- -
a
a
,
äå m – ê³ëüê³ñòü â³äïîâ³äíî ãî á³ëêà, âèç íà ÷å íà çà ðå -
çóëü òà òà ìè äåí ñè òî ìåòð³¿; Ì – ìî ëå êó ëÿð íà ìàñà
á³ëêà.
Âèç íà ÷åí íÿ åôåê òèâ íîñò³ ðå íà òó ðàö³¿
CBD-êîì ïî íåí òà õè ìåð íî ãî á³ëêà (Å2). Äî ðîç ÷è íó
ðå íà òó ðî âà íî ãî ScFv-CBD âíî ñè ëè ñóñ ïåíç³þ
ì³êðîã ðà íóëü î âà íî¿ öå ëþ ëî çè ÑÑ31 («Whatman»,
Âå ëè êà Áðè òàí³ÿ) ³ç ðîç ðà õóí êó 1 ìë ÑÑ31 íà 1 ìã
á³ëêà. Àô³ííå çâ’ÿ çó âàí íÿ ScFv-CBD ïðî âî äè ëè
ïðè ïî ñò³éíî ìó ïå ðåì³øó âàíí³ ñóñ ïåí糿 ïðî òÿ ãîì
1 ãîä. Ïîâ íî òó ³ììîá³ë³çàö³¿ á³ëêà êîí òðî ëþ âà ëè,
âèì³ðþ þ ÷è éî ãî êîí öåí òðàö³þ â ñó ïåðíà òàíò³ ÷å -
ðåç ïåâí³ ³íòåð âà ëè ÷à ñó. Äëÿ ðîç ðà õóí êó ê³ëüêîñò³
³ììîá³ë³çî âà íî ãî ScFv-CBD (ó ìã á³ëêà/ìë ÑÑ31)
éî ãî åëþ þ âà ëè ç 5 ìêë öå ëþ ëî çè ðîç ÷è íîì òà êî ãî
ñêëà äó: 6 Ì ñå ÷î âè íà, 0,1 %-é ÄÑÍ, 0,1 Ì 2-ìåð -
êàï òî å òà íîë. ϳñëÿ ðîçä³ëåí íÿ â 15 %-ìó
ÄÑÍ-ÏÀÀÃ îäåð æàí³ åëåê òðî ôî ðåã ðà ìè ñêà íó âà -
ëè òà àíàë³çó âà ëè ç âè êî ðèñ òàí íÿì ïðî ãðà ìè
TîtalLab. Åôåê òèâí³ñòü ðåíàòóðàö³¿ CBD-êîì ïî -
íåí òà ðîçðàõîâóâàëè çà â³äñîòêîì çâ’ÿçàíîãî ç
öåëþëîçîþ ScFv-CBD ï³ñëÿ ðåíàòóðàö³¿.
Ðå çóëü òà òè ³ îá ãî âî ðåí íÿ. Êî æåí ³íäèâ³äó àëü -
íèé á³ëîê ïî òðå áóº ñïå öèô³÷íèõ óìîâ ðå íà òó ðàö³¿,
53
ÐÅÍÀÒÓÐÀÖ²ß ÕÈÌÅÐÍÎÃÎ Á²ËÊÀ ScFv-CBD Ç Ò²ËÅÖÜ ÂÊËÞ×ÅÍÍß E. coli
îäíàê îïòèì³çàö³ÿ ïðî öå ñó â ö³ëî ìó íå çâî äèòü ñÿ
äî ¿õíüî ãî åìï³ðè÷ íî ãî ïå ðå áè ðàí íÿ. ²íòåí ñèâ íî
ðîç ðîá ëÿ þòü ñÿ ï³äõî äè, ÿê³ äîç âî ëÿ þòü âèç íà ÷à òè
çà ãàëü íó ñòðà òåã³þ ðå íà òó ðàö³¿, âè õî äÿ ÷è ëè øå ç
³íôîð ìàö³¿ ïðî ñòðóê òó ðó òà á³îëîã³÷í³ âëàñ òè âîñò³
ö³ëüî âî ãî á³ëêà [1, 2].
Îñîá ëè âîñ òÿ ìè îá ðà íî ãî äëÿ äîñë³äæåíü á³ëêà
ScFv-CBD º íà ÿâí³ñòü äâîõ àô³ííèõ öåíòð³â – àí òè -
ãå íçâ’ÿ çó âàëü íî ãî êîì ïî íåí òà (ScFv’s ïðî òè
rhIFN-a2b) ³ öå ëþ ëî çîç â’ÿ çó âàëü íî ãî äî ìå íó ç öå -
ëþ ëî çîë³òè÷ íî ãî êîì ïëåê ñó Clostridium
thermocellum (Cellulose Binding Domain, CBD),
ç’ºäíà íèõ çà äî ïî ìî ãîþ 13-àì³íî êèñ ëîò íî ãî ë³íêå -
ðà ó ïåâí³é îð³ºíòàö³¿ [11]. Ðîëü îñòàí íüî ãî ïî ëÿ ãàº
ó ïðî ñòî ðî âî ìó ðîçä³ëåíí³ äâîõ àô³ííèõ öåíòð³â
õè ìåð íî ãî á³ëêà äëÿ çà áåç ïå ÷åí íÿ ¿õíüî ãî íå çà ëåæ -
íî ãî ôîë äèí ãó. Ðàí³øå íà ìè ïî êà çà íî, ùî ïðè ðå -
íà òó ðàö³¿ ScFv-CBD ³ç ò³ëåöü âêëþ ÷åí íÿ îá ìå æó -
âàëü íèì ôàê òî ðîì º â³äíîâ ëåí íÿ ôóíêö³îíàëü íî¿
àê òèâ íîñò³ ScFv-êîì ïî íåí òà [10], îñê³ëüêè âè íè êàº
íå îáõ³äí³ñòü êî ðåê òíî ãî ôîð ìó âàí íÿ äâîõ äè-
ñóëüô³äíèõ çâ’ÿçê³â V-äî ìåí³â. Çâà æà þ ÷è íà öå, ó
äàí³é ðî áîò³ îñíîâ íó óâà ãó ñêîí öåí òðî âà íî íà ïî -
øó êó îïòè ìàëü íèõ óìîâ ðå íà òó ðàö³¿ ñà ìå
ScFv-êîì ïî íåí òà õè ìåð íî ãî á³ëêà.
Âå ëè êó ê³ëüê³ñòü åê ñïå ðè ìåí òàëü íèõ ðîá³ò ïðè -
ñâÿ ÷å íî ðîç ðîáö³ åôåê òèâ íèõ ï³äõîä³â äî îäåð æàí -
íÿ ôóíêö³îíàëü íî àê òèâ íèõ ScFv’s ðå íà òó ðàö³ºþ ç
ò³ëåöü âêëþ ÷åí íÿ. Îñîá ëè âî¿ óâà ãè çà ñëó ãî âóº ìå -
òîä ñòóï³í÷àñ òî ãî ð³âíî âàæ íî ãî ä³àë³çó [14], çà ñíî -
âà íèé íà ñòâî ðåíí³ îïòè ìàëü íèõ óìîâ äëÿ ôîð ìó -
âàí íÿ åëå ìåíò³â âòî ðèí íî¿/òðå òèí íî¿ ñòðóê òó ðè
ScFv’s ó ðàç³ âñòà íîâ ëåí íÿ ñòóï³í÷àñ òî ãî ãðà䳺íòà
êîí öåí òðàö³¿ ÃÃÕ (ðèñ. 1). Âíå ñåí íÿì íà îêðå ìèõ
åòà ïàõ ðå íà òó ðàö³¿ òà êèõ ðå à ãåíò³â, ÿê L-àðã³í³í ³
GSSG, äî ñÿ ãàºòüñÿ ï³äòðè ìàí íÿ ïå ðåõ³äíèõ ñòàí³â
á³ëêî âèõ ìî ëå êóë ó ðîç ÷èí íî ìó ñòàí³ ³ êî ðåê òíå
ôîð ìó âàí íÿ äèñ óëüô³äíèõ ì³ñòê³â îá îõ V-äî ìåí³â
[15]. Àâòîðàìè ðî áî òè [15] ïî êà çà íî, ùî óòâî ðåí íÿ
äèñ óëüô³äíèõ çâ’ÿçê³â â³äáó âàºòüñÿ íà ñòà䳿, êî ëè
âòî ðèí íà ñòðóê òó ðà V-äî ìåí³â âæå ñôîð ìî âà íà;
êð³ì òî ãî, íà ö³é ñòà䳿 â³äïîâ³äí³ çà ëèø êè öèñ òå¿ íó
ïðî ñòî ðî âî çáëè æåí³, ùî ñïðèÿº êî ðåê òíî ìó ôîð -
ìó âàí íþ S-S-ì³ñòê³â ïðè âíå ñåíí³ îêèñ íþ âàëü íî ãî
ðå à ãåí òó GSSG. Òà êîæ âñòà íîâ ëå íî åòà ïè ðå íà òó -
ðàö³¿, íà ÿêèõ âíå ñåí íÿ L-àðã³í³íó åôåê òèâ íî ïå ðå -
øêîä æຠàã ðå ãàö³¿ ö³ëüî âî ãî á³ëêà.
Îäíàê ìå òîä ð³âíî âàæ íî ãî ä³àë³çó íå º òåõ íî -
ëîã³÷íèì ³ ïî òðå áóº çíà÷ íèõ âèò ðàò íà ðå à ãåí òè.
Äëÿ çìåí øåí íÿ ñîá³âàð òîñò³ ïðî öå ñó íà ìè ðîç ðîá -
ëå íî ìå òîä êîí òðîëü î âà íî ãî ðîç âå äåí íÿ, çà ñíî âà -
íèé íà çà ñòî ñó âàíí³ ñèñ òå ìè ðå à ãåíò³â, ³ çà ãàëü íî¿
ñõå ìè ðå íà òó ðàö³¿, íà âå äå íî¿ â îðèã³íà ëüí³é ðî áîò³
[14], ç äå ÿ êè ìè ìî äèô³êàö³ÿìè. Çîê ðå ìà, âñòà íîâ -
ëåí íÿ íå îáõ³äíèõ êîí öåí òðàö³éíèõ ñòó ïåí³â äå íà -
òó ðó âàëü íî ãî ðå à ãåí òó (ÃÃÕ) ó ðîç ÷èí³ ñî ëþá³ë³çî -
âà íî ãî ScFv-CBD äî ñÿ ãà ëè êîí òðîëü î âà íèì éî ãî
ðîç âå äåí íÿì áó ôå ðîì äëÿ ðå íà òó ðàö³¿  (äèâ. «Ìà -
òåð³àëè ³ ìå òî äè»).  ïðåäñòàâëåí³é ðî áîò³ íà ìè
äîñë³äæå íî âïëèâ âèõ³äíî¿ êîí öåí òðàö³¿ á³ëêà, à òà -
êîæ ð³çíå ñï³ââ³äíî øåí íÿ ðå à ãåíò³â îêèñ íî-â³äíîâ -
íî¿ ïà ðè GSSG:GSÍ, ÿê³ äî äà âà ëè íà ð³çíèõ ñòàä³ÿõ
54
ÃÎÐÁÀÒÞÊ Î. Á. ÒÀ ²Í.
Ðèñ. 1. Åòà ïè ôîð ìó âàí íÿ íà òèâ íî¿ ñòðóê òó ðè ñî -
ëþá³ë³çî âà íèõ ScFv’s ïðè ñòóï³í÷àñ òî ìó çíè æåíí³ êîí -
öåí òðàö³¿ ãóàí³äèíã³äðîõ ëî ðè äó (ÃÃÕ) (çà [15]): 1 – ñî -
ëþá³ë³çî âà íèé á³ëîê; 2 – çáëè æåí íÿ SH-ãðóï
V-äî ìåí³â; 3 – ôîð ìó âàí íÿ äèñ óëüô³äíèõ ì³ñòê³â; 4 –
àñîö³þâàí íÿ V-äî ìåí³â, ÿê³ ì³ñòÿòü ÷àñ òêî âî ñôîð ìî -
âàí³ åëå ìåí òè âòî ðèí íî¿/òðå òèí íî¿ ñòðóê òó ðè; 5 – êîì -
ïàê òè çàö³ÿ V-äî ìåí³â ³ ôîð ìó âàí íÿ àí òè ãå íçâ’ÿ çó âàëü -
íî ãî öåí òðà
ðå íà òó ðàö³¿, íà âèõ³ä ôóíêö³îíàëü íî àê òèâ íî ãî
ScFv-CBD.
Äëÿ îö³íêè óñï³øíîñò³ ðå íà òó ðàö³¿ ScFv-CBD ³ç
ò³ëåöü âêëþ ÷åí íÿ âèç íà ÷à ëè òàê³ ¿¿ ïî êàç íè êè, ÿê
âèõ³ä òà åôåê òèâí³ñòü. Âèõ³ä äå íà òó ðî âà íî¿ ôîð ìè
(ó â³äñîò êàõ) ðîç ðà õî âó âà ëè çà ñï³ââ³äíî øåí íÿì
îäåð æà íî ãî ï³ñëÿ ðå íà òó ðàö³¿ ðîç ÷èí íî ãî
ScFv-CBD äî éî ãî ê³ëüêîñò³ ó âèõ³äí³é ôîðì³ â
ò³ëüöÿõ âêëþ ÷åí íÿ. Åôåê òèâí³ñòü ðå íà òó ðàö³¿ (ó
â³äñîò êàõ) ðîç ðà õî âó âà ëè çà ñï³ââ³äíî øåí íÿì
ôóíêö³îíàëü íî àê òèâ íèõ öåíòð³â õè ìåð íî ãî á³ëêà
(ScFv ³ CBD) äî çà ãàëü íî¿ ¿õíüî¿ ê³ëüêîñò³ ï³ñëÿ ðå -
íà òó ðàö³¿. Çàç íà ÷å íèé ìå òîä áà çóºòüñÿ íà âè ÿâ ëåíí³
çâ’ÿ çó âàëü íî¿ àê òèâ íîñò³ êîæ íî ãî öåí òðà çà ðå çóëü -
òà òà ìè ¿õíüî¿ àô³ííî¿ âçàºìî䳿 ç â³äïîâ³äíèì
ë³ãàíäîì (äèâ. «Ìàòåð³àëè ³ ìåòîäè»).
Îäíèì ³ç ôàê òîð³â, ÿêèé âïëè âຠíà ôîð ìó âàí -
íÿ àã ðå ãàò³â ïðè ðå íà òó ðàö³¿, º êîí öåí òðàö³ÿ ö³ëüî -
âî ãî á³ëêà â ðîç ÷èí³. Ïðè ãðà䳺íòíî ìó âè äà ëåíí³
äå íà òó ðó âàëü íî ãî ðå à ãåí òó ôîð ìó þòü ñÿ ïðîì³æí³
ñòà íè á³ëêî âî¿ ìî ëå êó ëè – ðîç ïëàâ ëåí³ ãëî áó ëè, ÿê³
ì³ñòÿòü åê ñïî íî âàí³ ó ðîç ÷èí êëàñ òå ðè ã³äðî ôîá -
íèõ àì³íî êèñ ëîò íèõ çà ëèøê³â. Á³ëêè â òà êèõ ñòà íàõ
ìî æóòü âçàºìîä³ÿòè ì³æ ñî áîþ, ùî ñïðè ÷è íþº
ôîð ìó âàí íÿ àã ðå ãàò³â ³ çíè æåí íÿ âè õî äó ðå íà òó -
ðàö³¿ [3]. ³äïîâ³äíî äî äà íèõ ë³òå ðà òó ðè ï³ä ÷àñ ðå -
íà òó ðàö³¿ ìîæóòü óòâîðþâàòèñÿ ÿê ðîç÷èíí³, òàê ³
íåðîç÷èíí³ á³ëêîâ³ àãðåãàòè.
Äëÿ çíè æåí íÿ àã ðå ãàö³¿ á³ëê³â ï³ä ÷àñ ðå íà òó -
ðàö³¿ ðîç ðîá ëå íî íèç êó ï³äõîä³â. Çîêðå ìà, ó ðàç³ ðå -
íà òó ðàö³¿ ScFv’s ñòóï³í÷àñ òèì ä³àë³çîì ïî êà çà íî
åôåê òèâ íå çà ïîá³ãàí íÿ àã ðå ãàö³¿ ïðè ââå äåíí³ äî
ñêëà äó ä³àë³çíî ãî áó ôåða 0,4 Ì L-àðã³í³íó [16].
Îäíàê àâ òî ðà ìè ³íøî¿ ðî áî òè ïðè çà ñòî ñó âàíí³ çà -
çíà ÷å íèõ óìîâ ðå íà òó ðàö³¿ âè ÿâ ëå íî ôîð ìó âàí íÿ
ôðàêö³¿ ðîç ÷èí íèõ, àëå ôóíêö³îíàëü íî íå àê òèâ íèõ
ôîðì ScFv’s [17]. Îäåð æà íèé ðå çóëü òàò ìîæ íà ïî -
ÿñ íè òè óòâî ðåí íÿì àã ðå ãàò³â ³/àáî ïðî äóêò³â íå ïðà -
âèëü íî ãî ôîë äèí ãó ScFv’s. Âèð³øàëü íó ðîëü ó
öüî ìó ïðî öåñ³, íà íà øó äóì êó, â³ä³ãðຠêîí öåí -
òðàö³ÿ ScFv’s ïðè ðåíàòóðàö³¿, ïðîòå äàíå
ïðèïóùåííÿ ïîòðåáóâàëî åêñïåðèìåíòàëüíîãî
ï³äòâåðäæåííÿ.
Âðà õî âó þ ÷è âè ùåâ èêëàäå íå, ïåð øèì çà âäàí -
íÿì áó ëî âñòà íî âè òè îïòè ìàëü íó âèõ³äíó êîí öåí -
òðàö³þ ñî ëþá³ë³çî âà íî ãî ScFv-CBD, ÿêà á ïðè çà -
ñòî ñó âàíí³ âè ùå î ïè ñà íî¿ ñõå ìè ðå íà òó ðàö³¿ ³ñòîò -
íî íå âïëè âà ëà íà ôîð ìó âàí íÿ ðîç ÷èí íèõ àã ðå -
ãàò³â. Î÷è ùå íèé äî ãî ìî ãåí íî ãî ñòà íó ScFv-CBD
(>95 %) ðîç âî äè ëè äî íå îáõ³äíî¿ êîí öåí òðàö³¿ áó -
ôå ðîì, ÿêèé ì³ñòèâ 6 Ì ÃÃÕ. Äëÿ äîñë³äæåí íÿ îá -
ðà íî ä³àïà çîí êîí öåí òðàö³é ScFv-CBD â³ä 0,26 äî
1,06 ìã/ìë (òàáë. 1). Ìîí³òî ðèíã åôåê òèâ íîñò³ ðå -
íà òó ðàö³¿ ScFv- òà CBD-êîìïîíåíò³â õèìåðíîãî
á³ëêà ïðîâîäèëè, ÿê îïèñàíî âèùå.
³äïîâ³äíî äî ðå çóëü òàò³â, îäåð æà íèõ ïðè ðîç -
ðà õóíêó ìî ëÿð íèõ ñï³ââ³äíî øåíü á³ëê³â ó êîì ïëåê -
ñàõ «ScFv-CBD/rhIFN-a2b», íà é íèæ ÷ó åôåê -
òèâí³ñòü ðå íà òó ðàö³¿ ScFv-êîì ïî íåí òà õè ìåð íî ãî
á³ëêà (~12,7 %) ñïîñ òåð³ãà ëè ó ðàç³ ðå íà òó ðàö³¿ ïðè
íà é âèù³é éî ãî âèõ³äí³é êîí öåí òðàö³¿ (1,06 ìã/ìë).
Ïî äàëü øå çíè æåí íÿ âèõ³äíî¿ êîí öåí òðàö³¿
ScFv-CBD äî 0,26 ìã/ìë ñïðè ÿ ëî ï³äâè ùåí íþ
âì³ñòó ôóíêö³îíàëü íî àê òèâ íèõ öåíòð³â ScFv’s
ï³ñëÿ ðå íà òó ðàö³¿ äî ~67 % (òàáë. 1).
Àíòèãåíçâ’ÿçóâàëüíó àê òèâí³ñòü ScFv-êîì ïî -
íåí òà õè ìåð íî ãî á³ëêà, ðå íà òó ðî âà íî ãî ïðè ð³çíèõ
âèõ³äíèõ êîí öåí òðàö³ÿõ, îö³íþ âà ëè òà êîæ çà äî ïî -
ìî ãîþ ìå òî äó ELISA. Äëÿ öüî ãî îäí³ é ò³ ñàì³
ê³ëüêîñò³ ðå íà òó ðî âà íî ãî ScFv-CBD â îäíà êî âèõ
ðîç âå äåí íÿõ íà íî ñè ëè â ïëàí øå òè äëÿ ELISA ³
çä³éñíþ âà ëè ³ìó íîõ³ì³÷íèé àíàë³ç, ÿê îïè ñà íî âè -
55
ÐÅÍÀÒÓÐÀÖ²ß ÕÈÌÅÐÍÎÃÎ Á²ËÊÀ ScFv-CBD Ç Ò²ËÅÖÜ ÂÊËÞ×ÅÍÍß E. coli
¹ Äîñë³äó
(äèâ. ðèñ. 2)
Âèõ³äíà êîíöåíòðàö³ÿ
ScFv-CBD, ìã/ìë
Åôåêòèâí³ñòü ðåíàòóðàö³¿
ScFv-êîìïîíåíòà, %*, **
1 1,06 12,7
2 0,79 40,0
3 0,53 56,9
4 0,40 64,3
5 0,26 67,0
Ï ð è ì ³ ò ê à. Ó êîæ íî ìó äîñë³ä³ íà ñòàä³ÿõ ðå íà òó ðàö³¿
2 Ì ® 1 Ì òà 1 Ì ® 0,5 Ì ÃÃÕ âíî ñè ëè GSSG (ìî ëÿð íå
ñï³ââ³äíî øåí íÿ GSSG:ScFv-CBD ñòà íî âèòü 50:1). *Åôåê -
òèâí³ñòü ðå íà òó ðàö³¿ ScFv-êîì ïî íåí òà ðîç ðà õî âó âà ëè, ÿê îïè -
ñà íî ó ðîçä³ë³ «Ìà òåð³àëè ³ ìå òî äè»); **äëÿ êîæ íî ãî äîñë³äó
íà âå äå íî ñå ðåäíº àðèô ìå òè÷ íå ïî êàç íèê³â Å1, îäåð æà íèõ ó
òðüîõ íå çà ëåæ íèõ åê ñïå ðè ìåí òàõ ç ðå íà òó ðàö³¿ ScFv-CBD.
Òàá ëè öÿ 1
Âïëèâ âèõ³äíî¿ êîí öåí òðàö³¿ õè ìåð íî ãî á³ëêà íà
åôåê òèâí³ñòü ðå íà òó ðàö³¿ éîãî ScFv-êîì ïî íåí òà
ùå. Íà âå äåí³ íà ðèñ. 2 ã³ñòîã ðà ìè äå ìî íñòðó þòü,
ùî ôóíêö³îíàëü íà àê òèâí³ñòü ScFv-êîì ïî íåí òà
ScFv-CBD, ðå íà òó ðî âà íî ãî ïðè âèõ³äí³é êîí öåí -
òðàö³¿ 0,4 ìã/ìë, â³ðîã³äíî âè ùà çà àê òèâí³ñòü
ScFv-CBD, ðåíàòóðîâàíîãî ïðè âèõ³äí³é
êîíöåíòðàö³¿ 1,06 ìã/ìë.
Âì³ñò ðîç ÷èí íèõ àã ðå ãàò³â ó ôðàêö³¿ ðå íà òó ðî -
âà íî ãî ïðè ð³çíèõ âèõ³äíèõ êîí öåí òðàö³ÿõ
ScFv-CBD àíàë³çó âà ëè ìå òî äîì SEC. Ó ðå çóëü òàò³
õðî ìà òîã ðàô³¿ îò ðè ìà íî òðè ôðàêö³¿ á³ëê³â, ùî
ñâ³ä÷èòü ïðî íà ÿâí³ñòü ðîç ÷èí íèõ àã ðå ãàò³â, óòâî -
ðå íèõ çà ðà õó íîê àñîö³àö³¿ äåê³ëüêîõ ìî ëå êóë
ScFv-CBD (ðèñ. 3, à, á). Âàæ ëè âî â³äì³òè òè, ùî ïðè
ðå íà òó ðàö³¿ çà ïî ÷àò êî âî¿ êîí öåí òðàö³¿ ScFv-CBD
0,53 ìã/ìë âèõ³ä éî ãî ìî íî ìåð íî¿ ôîð ìè (~46 êÄà)
áóâ çíà÷ íî âè ùèì, í³æ ïðè ðå íà òó ðàö³¿ ScFv-CBD ó
êîí öåí òðàö³¿ 1,06 ìã/ìë. Îäåð æàí³ ðå çóëü òà òè äîç -
âî ëÿ þòü ñòâåð äæó âà òè, ùî çíè æåí íÿ åôåê òèâ íîñò³
ðå íà òó ðàö³¿ õè ìåð íî ãî á³ëêà â³äáó âàºòüñÿ çà ðà õó -
íîê ôîð ìó âàí íÿ çíà÷ íî¿ ê³ëüêîñò³ ðîç ÷èí íèõ éî ãî
àã ðå ãàò³â ïðè êîí öåí òðàö³¿, âèù³é çà 0,53 ìã/ìë.
Âñòà íîâ ëåí íÿ îïòè ìàëü íî¿ êîí öåí òðàö³¿ ö³ëüî âèõ
á³ëê³â º âàæ ëè âèì åòà ïîì ïðè îïòèì³çàö³¿ ïðî ìèñ -
ëî âèõ ñõåì ¿õíüî¿ ðå íà òó ðàö³¿, îñê³ëüêè äîç âî ëÿº
ïðî âî äè òè ðå íà òó ðàö³þ ïðè ìàêñèìàëüíî âèñîêèõ
êîíöåíòðàö³ÿõ á³ëêà òà çìåíøóâàòè âèòðàòè íà ðå à -
ãåí òè ³ ïðî öå äó ðè ïîä àëü øî ãî êîí öåí òðó âàí íÿ.
Íàñ òóïíå çà âäàí íÿ ïî ëÿ ãà ëî ó âè ÿâ ëåíí³ îïòè -
ìàëü íèõ óìîâ, çà ÿêèõ â³äáó âàºòüñÿ êî ðåê òíå ôîð -
ìó âàí íÿ äâîõ äèñ óëüô³äíèõ ì³ñòê³â ScFv-êîì ïî -
íåí òà õè ìåð íî ãî á³ëêà. Äëÿ çà ïîá³ãàí íÿ ñïîí òàí íî -
ìó îêèñ íåí íþ çà ëèøê³â öèñ òå¿ íó ³ ôîð ìó âàí íþ
ì³æìî ëå êó ëÿð íèõ äèñ óëüô³ä³â äî ïðî áè ScFv-CBD
ïðè ñî ëþá³ë³çàö³¿, õðî ìà òîã ðàô³÷íî ìó î÷è ùåíí³ òà
56
ÃÎÐÁÀÒÞÊ Î. Á. ÒÀ ²Í.
Ðèñ. 2. Àíàë³ç çâ’ÿ çó âàí íÿ ScFv-CBD, ðå íà òó ðî âà íî ãî ïðè
ð³çíèõ âèõ³äíèõ êîí öåí òðàö³ÿõ, ç rhIFN-a2b â ELISA (M ± m;
n = 3; *ð < 0, 05). Âèõ³äíà êîí öåí òðàö³ÿ ScFv-CBD ïðè ðå íà òó -
ðàö³¿ ñòà íî âè ëà 1,06 (1); 0,79 (2); 0,53 (3) òà 0,4 ìã/ìë (4) (äèâ.
òàáë. 1). Çâ’ÿ çó âàëüíó àê òèâí³ñòü ïîð³âíþ âà ëè ïðè êîí öåí -
òðàö³¿ ScFv-CBD 0,68 ìêã/ìë
Ðèñ. 3. Àíàë³òè÷ íà SEC-õðî ìà òîã ðàô³ÿ ôðàêö³é î÷è ùå íî ãî ScFv-CBD. Îäíà êî âó ê³ëüê³ñòü ScFv-CBD, ðå íà òó ðî âà íî ãî ïðè
âèõ³äíèõ êîí öåí òðàö³ÿõ 1,06 (à) òà 0,53 ìã/ìë (á), íà íî ñè ëè íà êî ëîí êó Superdex 75 (10/300) GL ³ åëþ þ âà ëè áó ôå ðîì PBS.
Ñòð³ëêîþ ïî çíà ÷å íî ï³ê åëþö³¿ ìî íî ìåð íî¿ ôîð ìè ScFv-CBD (46 êÄà)
íà ïî ÷àò êîâ³é ñòà䳿 ðå íà òó ðàö³¿ âíî ñè ëè 2-ìåð êàï -
òî å òà íîë äî ê³íöå âî¿ êîí öåí òðàö³¿ 10 ìÌ.
ScFv-CBD ðå íà òó ðó âà ëè ïðè éîãî âèõ³äí³é êîí öåí -
òðàö³¿ 0,5 ìã/ìë, âèç íà ÷åí³é ÿê îïòè ìàëüíà ç ïî ïå -
ðåäí³õ åê ñïå ðè ìåíò³â. Ôîð ìó âàí íÿ äèñ óëüô³äíèõ
çâ’ÿçê³â çà áåç ïå ÷ó âà ëè äî äà âàí íÿì äî ñêëà äó ðå íà -
òó ðó âàëü íî ãî áó ôå ðà ð³çíèõ ñï³ââ³äíî øåíü îêèñ íå -
íî¿ òà â³äíîâ ëå íî¿ ôîðì ãëó òàò³îíó íà ñòàä³ÿõ ðå íà -
òó ðàö³¿ 2 Ì ® 1 Ì òà 1 Ì ® 0,5 Ì ÃÃÕ (òàáë. 2).
ijàïà çîí ñï³ââ³äíî øåíü ðå à ãåíò³â îêèñ íî-
â³äíîâíî¿ ïàðè îáèðàëè â³äïîâ³äíî äî äàíèõ
ë³òåðàòóðè ïî ðåíàòóðàö³¿ äèñóëüô³äâì³ñíèõ á³ëê³â
[18].
Îäåð æàí³ ðå çóëü òà òè ïðî äå ìî íñòðó âà ëè âè ñî êó
åôåê òèâí³ñòü ðå íà òó ðàö³¿ CBD-êîì ïî íåí òà õè ìåð -
íî ãî á³ëêà ó êîæ íî ìó ç åê ñïå ðè ìåíò³â (>90 %), ó
òîé ÷àñ ÿê åôåê òèâí³ñòü ðå íà òó ðàö³¿ éî ãî ScFv-êîì -
ïî íåí òà âàð³þâà ëà â ìåæ àõ â³ä 20 äî 63 % (òàáë. 2).
Âàð òî çà çíà ÷è òè, ùî CBD-êîì ïî íåíò ì³ñòèòü îäíó
íå ñïà ðå íó ñóëüôã³äðèëü íó ãðó ïó çà ëèø êó öèñ òå¿ -
íó, ÿêà âæå íà ïî ÷àò êî âèõ ñòàä³ÿõ ðå íà òó ðàö³¿ íå -
äîñ òóï íà äëÿ âçàºìî䳿 ç SH-ãðó ïà ìè ScFv-êîì ïî -
57
ÐÅÍÀÒÓÐÀÖ²ß ÕÈÌÅÐÍÎÃÎ Á²ËÊÀ ScFv-CBD Ç Ò²ËÅÖÜ ÂÊËÞ×ÅÍÍß E. coli
¹ Äîñë³äó
(äèâ. ðèñ. 4)
Ìîëÿðíå ñï³ââ³äíîøåííÿ
GSSG:GSH
Ñòàä³ÿ ðåíàòóðàö³¿, íà ÿê³é
âíîñèëè GSSG:GSH
Åôåêòèâí³ñòü ðåíàòóðàö³¿
ScFv-êîìïîíåíòà, %
Åôåêòèâí³ñòü ðåíàòóðàö³¿
CBD-êîìïîíåíòà, %
1 1:0
2 Ì ® 1 Ì ÃÃÕ
1 Ì ® 0,5 Ì ÃÃÕ
63,3 96,1
2 1:1
2 Ì ® 1 Ì ÃÃÕ
1 Ì ® 0,5 Ì ÃÃÕ
49,5 96,4
3 1:5
2 Ì ® 1 Ì ÃÃÕ
1 Ì ® 0,5 Ì ÃÃÕ
33,8 97,4
4 – – 20,0 98,3
5 1:1 2 Ì ® 1 Ì ÃÃÕ 52,3 97,0
6 1:5 2 Ì ® 1 Ì ÃÃÕ 36,9 92,0
Ï ð è ì ³ ò ê à. Åôåê òèâí³ñòü ðå íà òó ðàö³¿ ScFv- òà CBD-êîì ïî íåíò³â (Å1 ³ Å2 â³äïîâ³äíî) ðîç ðà õî âó âà ëè, ÿê îïè ñà íî ó ðîçä³ë³ «Ìà -
òåð³àëè ³ ìå òî äè»). Äëÿ êîæ íî ãî äîñë³äó íà âå äå íî ñå ðåäíº àðèô ìå òè÷ íå ïî êàç íèê³â Å1 òà Å2, îäåð æà íèõ ó òðüîõ íå çà ëåæ íèõ åê ñïå -
ðè ìåí òàõ ç ðå íà òó ðàö³¿ ScFv-CBD.
Òàá ëè öÿ 2
Âïëèâ ñï³ââ³äíî øåí íÿ GSSG:GSH íà åôåê òèâí³ñòü ðå íà òó ðàö³¿ ScFv- òà CBD-êîì ïî íåíò³â õè ìåð íî ãî á³ëêà
Ðèñ. 4. Àíàë³ç çâ’ÿ çó âàí íÿ ScFv-CBD, ðå íà òó ðî âà -
íî ãî çà ïðè ñóò íîñò³ ð³çíèõ ñï³ââ³äíî øåíü ðå à -
ãåíò³â ïàðè GSSG:GSH, ç rhIFN-a2b â ELISA (M ±
m; n = 3; *ð < 0, 05; **ð < 0, 01; ***ð < 0,001). Äëÿ
âàð³àíò³â äîñë³ä³â 1–6 (äèâ. òàáë. 2) – ñï³ââ³äíî -
øåí íÿ GSSG:GSH, à òà êîæ ñòà䳿 ðå íà òó ðàö³¿, íà
ÿêèõ âíî ñè ëè çà çíà ÷åí³ ðå à ãåí òè. Çâ’ÿ çó âàëüíó àê -
òèâí³ñòü ïîð³âíþ âà ëè ïðè êîí öåí òðàö³¿ ScFv-CBD
0,97 ìêã/ìë
íåí òà. Öå îá óìîâ ëå íî óí³êàëü íîþ çäàòí³ñòþ CBD
äî ôîð ìó âàí íÿ êîì ïàê òíî¿ ³ ôóíêö³îíàëü íî¿
ñòðóêòóðè ïðè âèñîêèõ êîíöåíòðàö³ÿõ äå íà òó ðó -
âàëü íî ãî ðåàãåíòó [19, 20].
Àíòèãåíçâ’ÿçóâàëüíó àê òèâí³ñòü ScFv-êîì ïî -
íåí òà õè ìåð íî ãî á³ëêà, ðå íà òó ðî âà íî ãî ïðè ð³çíèõ
ñï³ââ³äíî øåí íÿõ ãëó òàò³îíó, îö³íþ âà ëè òà êîæ ìå -
òî äîì ELISA. Ïðåä ñòàâ ëåí³ íà ðèñ. 4 ã³ñòîã ðà ìè
ïî êà çó þòü, ùî ôóíêö³îíàëü íà àê òèâí³ñòü
ScFv-êîì ïî íåí òà, ðå íà òó ðî âà íî ãî çà â³äñóò íîñò³
ðå à ãåíò³â îêèñ íî-â³äíîâ íî¿ ïà ðè, â³ðîã³äíî íè æ÷à
çà éî ãî àê òèâí³ñòü ó âñ³õ ³íøèõ âàð³àí òàõ ðå íà òó -
ðàö³¿. Îäåð æàí³ ðå çóëü òà òè ñâ³ä÷àòü ïðî ìîæ -
ëèâ³ñòü åôåê òèâ íî¿ ðå íà òó ðàö³¿ ScFv-CBD çà
â³äñóò íîñò³ â³äíîâ ëå íî¿ ôîð ìè ãëó òàò³îíó, à òà êîæ
ïðî òå, ùî äî äàò êî âå âíå ñåí íÿ ãëó òàò³îíó íà
ê³íöåâ³é ñòà䳿 ðå íà òó ðàö³¿ (1 M ® 0,5 Ì ÃÃÕ)
ñóòòºâî íå âïëè âຠíà âèõ³ä ôóíêö³îíàëü íî àê òèâ -
íî ãî ScFv-êîì ïî íåí òà.
Âèñ íîâ êè. Âèç íà ÷å íî îïòè ìàëüí³ óìî âè ðå íà -
òó ðàö³¿ õè ìåð íî ãî á³ëêà ScFv-CBD ³ç ò³ëåöü âêëþ -
÷åí íÿ Å. ñî li ³ç çà ñòî ñó âàí íÿì ðîç ðîá ëå íî ãî íà ìè
ìå òî äó ñòóï³í÷àñ òî ãî ðîç âå äåí íÿ. Çàç íà ÷åí³ óìî âè
çà áåç ïå ÷ó þòü âè ñî êèé âèõ³ä ðîç ÷èí íî ãî ScFv-CBD
(> 90 %) òà âè ñî êó ôóíêö³îíàëü íó àê òèâí³ñòü éî ãî
àí òè ãåí- ³ öå ëþ ëî çîç â’ÿ çó âàëü íî ãî êîì ïî íåíò³â
(â³äïîâ³äíî ~63 ³ ~96 %). Ðå íà òó ðî âà íèé ScFv-CBD
ï³ñëÿ ³ììîá³ë³çàö³¿ íà íîñ³¿ ìî æå áó òè âè êî ðèñ òà -
íèé ÿê àô³ííèé ³ìóíîñîðáåíò äëÿ
õðîìàòîãðàô³÷íîãî î÷èùåííÿ rhIFN-a2b.
O. B. Gorbatuk, U. S. Nikolayev, D. M. Irodov, I.Ya. Dubey,
P. V.Gilchuk
Refolding of ScFv-CBD fusion protein from Escherichia coli
inclusion bodies
Summary
An inexpensive and effective refolding method for ScFv-CBD fusion
protein recovery from E. coli inclusion bodies has been developed.
The principle of the proposed method is the stepwise dilution of
solubilized ScFv-CBD in the presence of 6 M guanidine
hydrochloride with refolding buffer containing L-arginine and
glutathione. The influence of initial protein concentration and the
molar ratio of oxidized and reduced form of glutathione that was
introduced at certain refolding stages has been carefully
investigated. It was shown that the decrease in the yield of
functional ScFv-CBD and formation of significant amount of
soluble aggregates take place when the initial protein
concentration is higher then 0.53 mg/ml. The optimal refolding
conditions providing highest yield of soluble monomeric ScFv-CBD
as well as the highest functional activity of antigen-binding (ScFv)
and cellulose-binding (CBD) moieties (~63 % and ~96 %,
respectively) have been found.
Keywords: fusion protein, inclusion bodies, refolding,
single-chain antibodies, cellulose-binding domain.
Î. Á. Ãîð áà òþê, Þ. C. Íè êî ëà åâ, Ä. Ì. Èðî äîâ, È. ß. Äó áåé,
Ï. Â. Ãèëü ÷óê
Ðå íà òó ðà öèÿ õè ìåð íî ãî áåë êà ScFv-CBD èç òå ëåö âêëþ ÷å íèÿ
Escherichia coli
Ðå çþ ìå
Ïðåä ëî æåí ýô ôåê òèâ íûé è íå äî ðî ãîé ìå òîä ðå íà òó ðà öèè õè -
ìåð íî ãî áåë êà ScFv-CBD èç òå ëåö âêëþ ÷å íèÿ E. coli, îñíî -
âàííûé íà ñòó ïåí ÷à òîì ðàç âå äå íèè ñî ëþ áè ëè çè ðî âàí íî ãî â
ðàñ òâî ðå 6 Ì ãó à íè äèí ãèä ðîõ ëî ðè äà ScFv-CBD áó ôå ðîì äëÿ
ðå íà òó ðà öèè, ñî äåð æà ùèì L-àð ãè íèí è ãëó òà òè îí. Èññëå äî -
âà íî âëè ÿ íèå èñ õîä íîé êîí öåí òðà öèè áåë êà è ðàç íî ãî ñî îò íî -
øå íèÿ ðå à ãåí òîâ îêèñ ëè òåëü íî-âîñ ñòà íî âè òåëü íîé ïàðû
GSSG/GSH, âíî ñè ìûõ íà îïðå äå ëåí íûõ ñòà äè ÿõ ðå íà òó ðà öèè,
íà âû õîä ôóíê öè î íàëü íî àê òèâ íî ãî ScFv-CBD è åãî àã ðå ãà öèþ.
Ïî êà çà íî, ÷òî ñíè æå íèå âû õî äà àê òèâ íî ãî ScFv-CBD ïðî èñ -
õî äèò èç-çà ôîð ìè ðî âà íèÿ çíà ÷è òåëü íî ãî êî ëè ÷åñ òâà åãî ðàñ -
òâî ðè ìûõ àã ðå ãà òîâ ïðè èñ õîä íîé êîí öåí òðà öèè âûøå 0,53
ìã/ìë. Îïðå äå ëå íû óñëî âèÿ ðå íà òó ðà öèè, îá åñ ïå ÷è âà þ ùèå íà è -
áîëü øèé âû õîä ðàñ òâî ðè ìî ãî ScFv-CBD â ìî íî ìåð íîé ôîð ìå,
à òàê æå íà è âûñ øóþ àê òèâ íîñòü åãî àí òè ãåí ñâÿ çû âà þ ùå ãî
(ScFv) è öåë ëþ ëî çîñ âÿ çû âà þ ùå ãî (CBD) êîì ïî íåí òîâ (ñî îò -
âåòñòâåí íî ~63 è ~96 %).
Êëþ ÷å âûå ñëî âà: õè ìåð íûé áå ëîê, òåëü öà âêëþ ÷å íèÿ, ðå íà -
òó ðà öèÿ, îä íî öå ïî ÷å÷ íûå àí òè òå ëà, öåë ëþ ëî çîñ âÿ çû âà þ ùèé
äî ìåí.
ÏÅÐÅË²Ê Ë²ÒÅÐÀÒÓÐÈ
1. Vallejo L. F., Rinas U. Strategies for the recovery of active
proteins through refolding of bacterial inclusion body
proteins // Microb. Cell Fact.–2004.–3, N 1.–P. 11–.
2. Tsumoto K., Ejima D., Kumagai I., Arakawa T. Practical
considerations in refolding proteins from inclusion bodies //
Protein Exp. Purif.–2003.–28, N 1.–P. 1–8.
3. Ãèëü ÷óê Ï. Â. Îöåí êà ìå òî äîâ ðå íà òó ðà öèè äëÿ ïðî ìûø -
ëåí íî ãî ïî ëó ÷å íèÿ ðå êîì áè íàí òíûõ áåë êîâ èç òå ëåö
âêëþ ÷å íèÿ Escherichia coli â áè î ëî ãè ÷åñ êè àê òèâ íîé ôîð -
ìå // Á³îïîë³ìåðè ³ êë³òèíà.–2004.–20, ¹ 3.–C. 182–192.
4. Moroney S., Pluckhun A. Modern antibody technology: The
impact on drug development // Modern Biopharmaceuticals /
Ed. J. Knablein.–Weinheim: Wiley-VCH, 2005.–Vol. 4.–
P. 1147–1186.
5. Blazek D., Celer V. The production and application of
single-chain antibody fragments // Folia Microbiol.–2003.–
48, N 5.–P. 687–698.
6. Skerra A., Pluckthun A. Assembly of a functional
immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli // Science.–
1988.–240, N 4855.–P. 1038–1041.
7. Glockshuber R., Schmidt T., Pluckthun A. The disulfide
bonds in antibody variable domains: effects on stability,
folding in vitro, and functional expression in Escherichia coli
// Biochemistry.–1992.–31, N 5.–P. 1270–1279.
58
ÃÎÐÁÀÒÞÊ Î. Á. ÒÀ ²Í.
8. Skerra A., Pluckthun A. Secretion and in vivo folding of the
Fab fragment of the antibody McPC603 in Escherichia coli:
influence of disulphides and cis-prolines // Protein
Eng.–1991.–4, N 8.–P. 971–979.
9. Ge L., Knappik A., Pack P., Freund C., Pluckthun A.
Expression antibodies in Escherichia coli // Antibody
Engineering / Ed. C. A. Borrebaeck.–Oxford: Univ. press,
1995.– P. 229–266.
10. óëü÷óê Ï. Â. Ðîç ðîá êà òåõ íî ëî㳿 îäåð æàí íÿ îä íî ëàí öþ -
ãî âèõ àí òèò³ë â Escherichia coli: Äèñ. ... êàíä. á³îë. íàóê /
²í-ò ìî ëå êó ëÿð. á³îëî㳿 ³ ãå íå òè êè ÍÀÍ Óêðà¿íè.–Ê.,
2006.–134 ñ.
11. óëü÷óê Ï. Â., Îêóíºâ Î. Â., Ïàâ ëî âà Ì. Â., ²ðî äîâ Ä. Ì.,
Ãîð áà òþê Î. Á. Îäåð æàí íÿ çëè òî ãî á³ëêà ScFv-CBD ³
éîãî çà ñòî ñó âàí íÿ äëÿ àô³ííî ãî î÷è ùåí íÿ ðå êîìá³íà -
íòíî ãî ³íòåð ôå ðî íó a2b ëþ äè íè // Óêð. á³îõ³ì. æóðí.–
2006.–78, ¹ 2.–Ñ. 18–27.
12. Gilchuk P. V., Volkov G. L. Immobilization of mouse single
chain antibodies for affinity chromatography using
cellulose-binding protein // Óêð. á³îõ³ì. æóðí.–2006.–78,
¹ 4.–Ñ. 156–159.
13. Westermeier R. Electrophoresis in practice: a guide to
methods and applications of DNA and protein
separations.–Weinheim: VCH, 1997.–331 p.
14. Tsumoto K., Shinoki K., Kondo H., Uchikawa M., Juji T.,
Kumagai I. Highly efficient recovery of functional
single-chain Fv fragments from inclusion bodies
overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction
of oxidizing reagent – application to a human single-chain Fv
fragment // J. Immunol. Meth.–1998.–219, N 1–2.–
P. 119–129.
15. Umetsu M., Tsumoto K., Hara M., Ashish K., Goda S.,
Adschiri T., Kumagai I. How additives influence the
refolding of immunoglobulin-folded proteins in a stepwise
dialysis system: Spectroscopic evidence for highly efficient
refolding of single-chain Fv-fragment // J. Biol.
Chem.–2003.–278, N 11.–P. 8979–8987.
16. Tsumoto K., Umetsu M., Kumagai I., Ejima D., Philo J.S.,
Arakawa T. Role of arginine in protein refolding,
solubilization and purification // Biotechnol.
Progr.–2004.–20, N 5.–P. 1301–1308.
17. Sinacola J. R., Robinson A. S. Rapid refolding and polishing
of single-chain antibodies from Escherichia coli inclusion
bodies // Protein Exp. Purif.–2002.–26, N 2.–P. 301–308.
18. Raina S., Missiakas D. Making and breaking disulphide
bonds // Annu. Rev. Microbiol.–1997.–51.–P. 179–202.
19. Tormo J., Lamed R., Chirino A. J., Morag E., Bayer E. A.,
Shoham Y., Steitz T. A. Crystal structure of a bacterial
family-III cellulose-binding domain: A general mechanism
for attachment to cellulose // EMBO J.–1996.–15, N 21.–
P. 5739–5751.
20. Berdichevsky Y., Lamed R., Frenkel D., Gophana U., Bayer
E. A., Yaron S., Shoham Y., Benhar I. Matrix-assisted
refolding of single-chain Fv-cellulose binding domain fusion
protein // Protein Exp. Purif.–1999.–17, N 2.–P. 249–259.
ÓÄÊ 579.69 + 577.112
Íàä³éøëà äî ðå äàêö³¿ 19.06.07
59
ÐÅÍÀÒÓÐÀÖ²ß ÕÈÌÅÐÍÎÃÎ Á²ËÊÀ ScFv-CBD Ç Ò²ËÅÖÜ ÂÊËÞ×ÅÍÍß E. coli
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-157663 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-11-25T07:20:49Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Горбатюк, О.Б. Ніколаєв, Ю.С. ІродовІродов, Д.М. Дубей, І.Я. Гільчук, П.В. 2019-06-20T16:17:56Z 2019-06-20T16:17:56Z 2008 Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli / О.Б. Горбатюк, Ю.С. Ніколаєв, Д.М. Іродов, І.Я. Дубей, П.В. Гільчук // Біополімери і клітина. — 2008. — Т. 24, № 1. — С. 51-59. — Бібліогр.: назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000790 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157663 579.69 + 577.112 Запропоновано ефективний і недорогий метод ренатурації химерного білка ScFv-CBD із тілець включення E. coli. Метод грунтується на ступінчастому розведенні солюбілізованого в розчині 6 М гуанідингідрохлориду ScFv-CBD буфером для ренатурації, який містить L-аргінін та глутатіон. Досліджено вплив вихідної концентрації білка та різного співвідношення реагентів окисно-відновної пари GSSG:GSН, які додавали на певних стадіях ренатурації, на вихід функціонально активного ScFv-CBD і його агрегацію. Показано, що зниження виходу активного ScFv-CBD відбувається за рахунок формування значної кількості його розчинних агрегатів при вихідній концентрації, вищій за 0,53 мг/мл. Визначено умови ренатурації, які забезпечують найбільший вихід розчинного ScFv-CBD у мономерній формі, та найвищу функціональну активність його антигензв’язувального (ScFv) і целюлозозв’язувального (CBD) компонентів (відповідно ~63 і ~96 %). An inexpensive and effective refolding method for ScFv-CBD fusion protein recovery from E. coli inclusion bodies has been developed. The principle of the proposed method is the stepwise dilution of solubilized ScFv-CBD in the presence of 6 M guanidine hydrochloride with refolding buffer containing L-arginine and glutathione. The influence of initial protein concentration and the molar ratio of oxidized and reduced form of glutathione that was introduced at certain refolding stages has been carefully investigated. It was shown that the decrease in the yield of functional ScFv-CBD and formation of significant amount of soluble aggregates take place when the initial protein concentration is higher then 0.53 mg/ml. The optimal refolding conditions providing highest yield of soluble monomeric ScFv-CBD as well as the highest functional activity of antigen-binding (ScFv) and cellulose-binding (CBD) moieties (~63 % and ~96 %, respectively) have been found. Предложен эффективный и недорогой метод ренатурации химерного белка ScFv-CBD из телец включения E. coli, основанный на ступенчатом разведении солюбилизированного в растворе 6 М гуанидингидрохлорида ScFv-CBD буфером для ренатурации, содержащим L-аргинин и глутатион. Исследовано влияние исходной концентрации белка и разного соотношения реагентов окислительно-восстановительной пары GSSG/GSH, вносимых на определенных стадиях ренатурации, на выход функционально активного ScFv-CBD и его агрегацию. Показано, что снижение выхода активного ScFv-CBD происходит из-за формирования значительного количества его растворимых агрегатов при исходной концентрации выше 0,53 мг/мл. Определены условия ренатурации, обеспечивающие наибольший выход растворимого ScFv-CBD в мономерной форме, а также наивысшую активность его антигенсвязывающего (ScFv) и целлюлозосвязывающего (CBD) компонентов (соответственно ~63 и ~96 %). uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Молекулярна та клітинна біотехнології Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli Ренатурация химерного белка ScFv-CBD из телец включения Escherichia coli Refolding of ScFv-CBD fusion protein from Escherichia coli inclusion bodies Article published earlier |
| spellingShingle | Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli Горбатюк, О.Б. Ніколаєв, Ю.С. ІродовІродов, Д.М. Дубей, І.Я. Гільчук, П.В. Молекулярна та клітинна біотехнології |
| title | Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli |
| title_alt | Ренатурация химерного белка ScFv-CBD из телец включения Escherichia coli Refolding of ScFv-CBD fusion protein from Escherichia coli inclusion bodies |
| title_full | Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli |
| title_fullStr | Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli |
| title_full_unstemmed | Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli |
| title_short | Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli |
| title_sort | ренатурація химерного білка scfv-cbd з тілець включення escherichia соli |
| topic | Молекулярна та клітинна біотехнології |
| topic_facet | Молекулярна та клітинна біотехнології |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157663 |
| work_keys_str_mv | AT gorbatûkob renaturacíâhimernogobílkascfvcbdztílecʹvklûčennâescherichiasoli AT níkolaêvûs renaturacíâhimernogobílkascfvcbdztílecʹvklûčennâescherichiasoli AT írodovírodovdm renaturacíâhimernogobílkascfvcbdztílecʹvklûčennâescherichiasoli AT dubeiíâ renaturacíâhimernogobílkascfvcbdztílecʹvklûčennâescherichiasoli AT gílʹčukpv renaturacíâhimernogobílkascfvcbdztílecʹvklûčennâescherichiasoli AT gorbatûkob renaturaciâhimernogobelkascfvcbdiztelecvklûčeniâescherichiacoli AT níkolaêvûs renaturaciâhimernogobelkascfvcbdiztelecvklûčeniâescherichiacoli AT írodovírodovdm renaturaciâhimernogobelkascfvcbdiztelecvklûčeniâescherichiacoli AT dubeiíâ renaturaciâhimernogobelkascfvcbdiztelecvklûčeniâescherichiacoli AT gílʹčukpv renaturaciâhimernogobelkascfvcbdiztelecvklûčeniâescherichiacoli AT gorbatûkob refoldingofscfvcbdfusionproteinfromescherichiacoliinclusionbodies AT níkolaêvûs refoldingofscfvcbdfusionproteinfromescherichiacoliinclusionbodies AT írodovírodovdm refoldingofscfvcbdfusionproteinfromescherichiacoliinclusionbodies AT dubeiíâ refoldingofscfvcbdfusionproteinfromescherichiacoliinclusionbodies AT gílʹčukpv refoldingofscfvcbdfusionproteinfromescherichiacoliinclusionbodies |