Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності
Розглянуто формування неканонічних комплексів двох ізоформ еукаріотного фактора елонгації eEF1A з деацильованими тРНК різних специфічностей та виміряно уявні константи дисоціації. Виявлено більшу спорідненість до тРНК тканиноспецифічної ізоформи фактора елонгації eEF1A2 порівняно з eEF1A1. Вперше по...
Saved in:
| Published in: | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Date: | 2008 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157883 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності / П.В. Футерник, Б.С. Негруцький, Г.В. Єльська // Біополімери і клітина. — 2008. — Т. 24, № 6. — С. 453-462. — Бібліогр.: 19 назв. — укр., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859611191157981184 |
|---|---|
| author | Футерник, П.В. Негруцький, Б.С. Єльська, Г.В. |
| author_facet | Футерник, П.В. Негруцький, Б.С. Єльська, Г.В. |
| citation_txt | Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності / П.В. Футерник, Б.С. Негруцький, Г.В. Єльська // Біополімери і клітина. — 2008. — Т. 24, № 6. — С. 453-462. — Бібліогр.: 19 назв. — укр., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Біополімери і клітина |
| description | Розглянуто формування неканонічних комплексів двох ізоформ еукаріотного фактора елонгації eEF1A з деацильованими тРНК різних специфічностей та виміряно уявні константи дисоціації. Виявлено більшу спорідненість до тРНК тканиноспецифічної ізоформи фактора елонгації eEF1A2 порівняно з eEF1A1. Вперше показано принципову можливість утворення неканонічних комплексів eEF1A з ініціаторною тРНКі Меt. Визначено роль окремих сайтів у структурі тРНК, відповідальних за взаємодію з eEF1A.
The formation of noncanonical complexes of two eEF1A isoforms with different types of deacylated tRNAs was examined and apparent dissociation constants were measured. A higher affinity to tRNA was found for the tissue specific isoform of elongation factor eEF1A2, as compared with that of eEF1A1. For the first time the formation of noncanonic complex of eEF1A with initiator tRNAiMet was found to be possible. A specific role of some tRNA sites in the interaction with eEF1A was discovered.
Рассмотрено формирование неканонических комплексов двух изоформ фактора элонгации eEF1A с деацилированными тРНК разных специфичностей и измерены кажущиеся константы диссоциации. Выявлено большее сродство к тРНК тканеспецифической изоформы фактора элонгации eEF1A2 по сравнению с eEF1A1. Впервые показана принципиальная возможность образования неканонических комплексов eEF1A с инициаторной тРНКiMet. Определена роль отдельных сайтов в структуре тРНК, ответственных за взаимодействие с eEF1A.
|
| first_indexed | 2025-11-28T12:17:14Z |
| format | Article |
| fulltext |
ÑÒÐÓÊÒÓÐÀ ² ÔÓÍÊÖ²¯ Á²ÎÏÎ˲ÌÅвÂ
Íåêàíîí³÷í³ êîìïëåêñè eEF1A ññàâö³â ç
äåàöèëüîâàíèìè òÐÍÊ ð³çíî¿ ñïåöèô³÷íîñò³
Ï. Â. Ôó òåð íèê, Á. Ñ. Íåã ðóöü êèé, Ã. Â. ªëüñüêà
²íñòè òóò ìî ëå êó ëÿð íî¿ á³îëî㳿 ³ ãå íå òè êè ÍÀÍ Óêðà¿ íè
Âóë. Àêàäåì³êà Çà áî ëîò íî ãî, 150, Êè¿â, Óêðà¿ íà, 03680
p.v.futernyk@imbg.org.ua
Ðîç ãëÿ íó òî ôîð ìó âàí íÿ íå êà íîí³÷íèõ êîì ïëåêñ³â äâîõ ³çî ôîðì åó êàð³îò íî ãî ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿
eEF1A ç äå à öèëü î âà íè ìè òÐÍÊ ð³çíèõ ñïå öèô³÷íîñ òåé òà âèì³ðÿíî óÿâí³ êîí ñòàí òè äèñ îö³àö³¿. Âè -
ÿâ ëå íî á³ëüøó ñïîð³äíåí³ñòü äî òÐÍÊ òêà íè íîñ ïå öèô³÷íî¿ ³çî ôîð ìè ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿ eEF1A2
ïîð³âíÿ íî ç eEF1A1. Âïåð øå ïî êà çà íî ïðè íöè ïî âó ìîæ ëèâ³ñòü óòâî ðåí íÿ íå êà íîí³÷íèõ êîì ïëåêñ³â
eEF1A ç ³í³ö³àòîð íîþ òÐÍʳ
Ìåt. Âèç íà ÷å íî ðîëü îêðå ìèõ ñàéò³â ó ñòðóê òóð³ òÐÍÊ, â³äïîâ³äàëü íèõ
çà âçàºìîä³þ ç eEF1A.
Êëþ ÷îâ³ ñëî âà: òðàíñ ëÿö³ÿ, ôàê òîð åëîí ãàö³¿, êà íà ëþ âàí íÿ.
Âñòóï. Á³îñèí òåç á³ëêà âêëþ ÷ຠäâà îñíîâ íèõ ïðî -
öå ñè – àì³íî à öè ëþ âàí íÿ òÐÍÊ òà òðàíñ ëÿö³þ
ìÐÍÊ íà ðè áî ñîì³. Îñòàíí³é ïðî öåñ º ñêëàä íî
îðãàí³çî âà íèì, çîê ðå ìà, ó âè ùèõ åó êàð³îò³â. Éîãî
ïå ðåá³ã õà ðàê òå ðè çóºòüñÿ âè ñî êèì ñòó ïå íåì ñòðóê -
òóð íî¿ òà ôóíêö³îíàëü íî¿ êîì ïàð òìåí òàë³çàö³¿.
Âëàñ íå îäíèì ³ç ìå õàí³çì³â, ùî ðåàë³çóº ïî òåíö³éí³
ïå ðå âà ãè êîì ïàð òìåí òàë³çàö³¿ â á³îñèí òåç³ á³ëêà, º
êà íà ëþ âàí íÿ [1]. Ïî êà çà íî, ùî òÐÍÊ í³êîëè íå
áóâຠâ³ëüíîþ â êë³òèí³, âîíà âåñü ÷àñ çâ’ÿ çà íà ç
ïåâ íè ìè ïàð òíå ðà ìè – ç ôàê òî ðîì åëîí ãàö³¿ 1À, ó
ñêëàä³ êîì ïëåê ñó eEF1A*GTP*àì³íî à öèë-òÐÍÊ,
àì³íî à öèë-òÐÍÊ ñèí òå òà çîþ (AARS) àáî ç ðè áî ñî -
ìîþ [2]. Çã³äíî ç êîí öåïö³ºþ êà íà ëþ âàí íÿ, ìàº
ì³ñöå ïå ðå äà âàí íÿ òÐÍÊ â³ä Å-ñàé òà ðè áî ñî ìè äî
ÀÀRS òà àì³íî à öèë-òÐÍÊ – â³ä ÀÀRS äî À-ñàé òà
ðè áî ñî ìè áåç äèñ îö³àö³¿ ó öè òîï ëàç ìó [2].
Ïðèïóñêàþòü, ùî ôàê òîð åëîí ãàö³¿ 1À ìîæå âèñ òó -
ïà òè íå ëèøå ÿê ïå ðå íîñ íèê àì³íî à öèë-òÐÍÊ, àëå é
âè êî íó âà òè íå êà íîí³÷íó ôóíêö³þ ïå ðå íîñ íè êà äå -
à öèëü î âà íî¿ òÐÍÊ â³ä ðè áî ñî ìè äî AARS ó ñêëàä³
ïîòð³éíî ãî êîì ïëåê ñó eEF1A*GDP*òÐÍÊ [3], ³ñíó -
âàí íÿ ÿêî ãî âæå ï³äòâåð äæå íî åê ñïå ðè ìåí òàëü íî in
vitro.
Ðàí³øå ìåòî äîì ïî ëÿ ðè çàö³¿ ôëó î ðåñ öåíö³¿ íà -
ìè äîñë³äæå íî ôîð ìó âàí íÿ íå êà íîí³÷íèõ ïî -
òð³éíèõ êîì ïëåêñ³â ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿ 1À1 ç GDP òà
òÐÍÊPhe [4, 5], à òà êîæ ìå òî äîì çà òðèì êè ñìó ãè â
ÏÀÀà äî âå äå íî ôîð ìó âàí íÿ ïî òð³éíèõ êîì ïëåêñ³â
eEF1A1 òà eEF1A2 ç òÐÍÊSer [6], ùî ñâ³ä÷èòü ïðî
ìîæ ëè âó óí³âåð ñàëüí³ñòü çà çíà ÷å íî ãî ïðî öå ñó.
³äî ìî, ùî ó âè ùèõ åó êàð³îò³â ôóíêö³îíó þòü
äâ³ ³çî ôîð ìè ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿ – eEF1A1 òà
eEF1A2. Ïåð øó çíàé äå íî ìàé æå â óñ³õ òêà íè íàõ,
îêð³ì íå ðâî âî¿ òà ì’ÿ çî âî¿, à äðó ãó – âè íÿò êî âî ó
íå ðâîâ³é òà ì’ÿ çîâ³é, äå âî íà ç’ÿâ ëÿºòüñÿ ó ïðî öåñ³
îíòî ãå íå çó â³äðà çó ï³ñëÿ íà ðîä æåí íÿ [7]. Äî öüî ãî
÷à ñó ùå íå âè ÿâ ëå íî ôóíêö³îíàëü íèõ â³äì³ííîñòåé
ì³æ öèìè äâîìà ³çîôîðìàìè.
Ó ïðåäñòàâëåí³é ðî áîò³ ìè äîñë³äè ëè ôîð ìó -
âàí íÿ íå êà íîí³÷íèõ êîì ïëåêñ³â eEF1A1 òà eEF1A2
ç òÐÍÊ òà êèõ ñïå öèô³÷íîñ òåé: Phe, Tyr, Asp, Leu,
Ile, Met, Lys, à òà êîæ âèç íà ÷è ëè çíà ÷åí íÿ óÿâ íèõ Kd
äëÿ êîæ íî ãî êîì ïëåê ñó. Îêð³ì òî ãî, íà ìè âïåð øå
453
ISSN 0233-7657. Á³îïîë³ìåðè ³ êë³òèíà. 2008. Ò. 24. ¹ 6
Ó Ï. Â. ÔÓÒÅÐÍÈÊ, Á. Ñ. ÍÅÃÐÓÖÜÊÈÉ, Ã. Â. ªËÜÑÜÊÀ, 2008
ïî êà çà íî ìîæ ëèâ³ñòü ôîð ìó âàí íÿ íå êà íîí³÷íèõ
ïî òð³éíèõ êîì ïëåêñ³â äâîõ ³çî ôîðì eEF1A ç
³í³ö³àòîð íîþ òÐÍÊi
Met. Çà äî ïî ìî ãîþ ìó òàö³éíî ãî
àíàë³çó âèâ ÷å íî ðîëü ñïå öèô³÷íèõ ñàéò³â ó ñòðóê -
òóð³ òÐÍÊ, ùî âïëè âà þòü íà ¿¿ âçàºìîä³þ ç eEF1A.
Äëÿ öüî ãî ìè âè êî ðèñ òà ëè îò ðè ìàí³ in vitro òðàíñ -
êðèï òè òÐÍÊ3
Lys, äî ÿêèõ áó ëî âíåñåíî ìóòàö³¿ ó
çîí³ Ò-ñòåáëà òà àêöåïòîðíîãî ñòåáëà.
Ìà òåð³àëè ³ ìå òî äè. Ìà òåð³àëè. ÀÒP, GDP,
GTP, CTP, UTP, ðåñ òðèê òà çà BshNI («Fermentas»,
Ëèò âà); N,N-ìå òè ëåíá³ñàê ðè ëàì³ä, òðèñ, HEPES,
äî äå öèë ñóëü ôàò íà òð³þ (SDS) («Helicon», ÐÔ);
b-ìåð êàï òî å òà íîë, ãë³öå ðèí, NH4Cl, MgCl2
(«Merck», ͳìå÷ ÷è íà); àê ðè ëàì³ä (äâ³÷³ ïå ðå êðèñ -
òàë³çî âà íèé), TEMED, PMSF, DTT, EDTA («Serva»,
ͳìå÷ ÷è íà); ô³ëüòðè GF/C («Whatman», Âå ëè êà
Áðè òàí³ÿ); ïåð ñóëü ôàò àìîí³þ, êó ìàñ³ R-250
(«Bio-Ràd», Âå ëè êà Áðè òàí³ÿ); ñöèí òè ëÿö³éíà ð³äè -
íà OptiPhase «HiSafe» («Sed», ÑØÀ); GMP, ôîñ -
ôîä³åñ òå ðà çà ç쳿íî¿ îò ðó òè PDE I Type IV ³ç
Crotalus athrox venom («Sigma», ÑØÀ);
[32P-a]-ATP, [U-14C]-L-òè ðî çèí, [U-14C]-L-ôåí³ë-
àëàí³í, [U-14C]-L-ëåé öèí, [U-14C]-L-³çî ëåé öèí,
[U-14C]-L-àñ ïàð òàò, [U-14C]-L-ë³çèí, («GE-
Amersham», ÑØÀ); [L-14C]-L-ìåò³îí³í, [L-14C]-
L-ïðîë³í («Moravec Biochemicals», ÑØÀ); Ò4-ë³ãà -
çà, Õ-Gal, T4-ïîë³íóê ëå î òèäê³íà çà, ðåñ òðèê òà çè
BamHI, HindIII («Roche Boehringer», ͳìå÷ ÷è íà);
Qiagen Maxiprep Kit («Qiagen», ÑØÀ).
Ðåøòó ðå àê òèâ³â ìàð êó âàëè ÿê «õ. ÷.» àáî
«oc. ÷».
T7 ÐÍÊ-ïîë³ìå ðà çó ëþá ’ÿç íî íàä à íî ïðîô.
Ì. À. Òó êà ëî (²ÌÁ³Ã ÍÀÍ Óêðà¿ íè).
Íóê ëå î òè äèë òðàí ñôå ðà çó äð³æäæ³â âèä³ëå íî,
ÿê îïè ñà íî â ðîáîò³ [8].
Îòðè ìàí íÿ ïðå ïà ðàò³â ñó ìàð íî¿ òÐÍÊ. Ïðå -
ïà ðà òè ñó ìàð íî¿ òÐÍÊ ç ïå÷³íêè áè êà îäåð æó âà ëè,
âè êî ðèñ òî âó þ ÷è ïðÿ ìó äåï ðî òå¿í³çàö³þ ãî ìî ãå íà -
òó òêà íè íè ôå íî ëîì ç íà ñòóï íîþ õðî ìà òîã ðàô³ºþ
íà ÄÅÀÅ-öå ëþ ëîç³ [9]. Ïðå ïà ðà òè ³íäèâ³äó àëü íèõ
òÐÍÊ îò ðè ìó âà ëè ç ñó ìàð íî¿ òÐÍÊ ïå÷³íêè áè êà çà
ñõå ìîþ, ÿêà âêëþ ÷à ëà õðî ìà òîã ðàô³þ íà ÂD-öå ëþ -
ëîç³ òà â ñèñ òåì³ HPLC Gold íà êî ëîí êàõ
Spherogel-TSK DÅÀÅ 5PW, Ñ3 RPSC 5u Ultrapore òà
Hypersil 5C4 («Beckman», ÑØÀ). ²í³ö³àòîð íó òÐÍÊ
íà â³äì³íó â³ä åëîí ãà òîð íî¿ ìîæ íà àì³íî à öè ëþ âà òè
ñó ìàð íèì ïðå ïà ðà òîì AARS ç Escherichia coli ç
[14C]-ìåò³îí³íîì, ùî é áó ëî âè êî ðèñ òà íî äëÿ ¿¿ î÷è -
ùåí íÿ. Ïðå ïà ðà òè òÐÍÊ ì³òè ëè ïî 3'-ê³íöþ
[a-32P]-ATP çà äî ïî ìî ãîþ íóê ëå î òè äèë-òÐÍÊ
òðàíñ ôå ðà çè äð³æäæ³â, ÿê îïè ñà íî â [10].
Ïðå ïà ðà òè eEF1A1 òà eEF1A2 ç ïå÷³íêè êðî ëÿ
âèä³ëÿ ëè, ÿê ó ðî áîò³ [4].
Ìå òîä çà òðèì êè ñìó ãè â ïîë³àê ðè ëàì³äíî ìó
ãåë³. Ôîð ìó âàí íÿ êîì ïëåêñ³â ìàê ðî ìî ëå êóë
äîñë³äæó âà ëè ìå òî äîì çà òðèì êè ñìó ãè ó ÏÀÀÃ.
²íêó áàö³þ ôàê òîð³â åëîí ãàö³¿ òà ³í³ö³àö³¿ (50–
2000 íÌ), 200 ìêÌ GDP òà 5000 ³ìï/õâ ðàä³îàê òèâ -
íî ì³÷å íî¿ òÐÍÊ ïðî âî äè ëè â 10 ìêë ñóì³ø³, ùî
ì³ñòè ëà 20 ìM òðèñ-HCl, pH 7,5, 50 ìM KCl, 5 ìM
MgCl2, 2 ìM DTT òà 10 %-é ãë³öå ðèí. ²íêó áàö³þ
ïðî âî äè ëè ïðî òÿ ãîì 15 õâ çà t = 37 °Ñ, ï³ñëÿ ÷î ãî
íà íî ñè ëè íà 5 %-é ÏÀÀÃ (áåç äå íà òó ðó âàëü íèõ
àãåíò³â, ñï³ââ³äíî øåí íÿ àê ðè ëàì³ä/N,N-ìå òè -
ëåíá³ñàê ðè ëàì³ä – 39/1), ùî ãî òó âà ëè â 25 ìM áî -
ðàò íî ìó áó ôåð³, pÍ 7,5, ÿêèé ì³ñòèâ 0,5 ìM EÄTA
òà 5 %-é ãë³öå ðèí. Åëåê òðî ôî ðåç ïðî âî äè ëè â ïëàñ -
òè íàõ ÏÀÀà ðîçì³ðîì 0,1 ́ 10 ́ 7,5 ñì ïðî òÿ ãîì
2 ãîä çà t = 4 °Ñ òà íà ïðó ãè 100 Â. Åëåê òðîä íèé áó -
ôåð âè êî ðèñ òî âó âà ëè òà êèé æå, ÿê ³ â ãåë³. Ðàä³îàâ -
òîãðàô³þ ãå ëþ, ïå ðåíå ñå íî ãî íà ïàï³ð òà âè ñó øå -
íî ãî, çä³éñíþ âà ëè, åê ñïî íó þ ÷è éîãî ïðî òÿ ãîì
18 ãîä çà òåì ïå ðà òó ðè 4 îÑ íà ïë³âö³ ÎͲÊÎ-ÐÏ1Ñ
(«AGFA»). Îòðè ìàí³ ðàä³îàâ òîã ðà ôè àíàë³çó âà ëè
çà äî ïî ìî ãîþ ïðî ãðà ìè «GelProAnaliser».
Ìå òîä îò ðè ìàí íÿ ìó òàö³é â ãåí³ òÐÍÊ3
Lys. Äëÿ
ñòâî ðåí íÿ êî íñòðóêö³é ãåí³â ìó òàí òíèõ òÐÍÊ3
Lys òà
êîí òðîëü íî¿ òÐÍÊ3
Lys – WT âè êî ðèñ òà íî òàê³ îë³ãî -
íóê ëå î òè äè:
RS101 5'-AGC TTA ATA CGA CTC ACT-3';
RS111 5'-CTA TAG TGA GTC GTA TTA-3';
HK11 5'-ATA GCC CGG ATA GCT CAG TCG-3';
HK21 5'-GTA GAG CAT CAG ACT TT-3';
HK31 5'-TAA TCT GAG GGT CCA GGG TTC-3';
HK311 5'-TAA TCT GAG GGT CCG GGG TTC-3';
HK41 5'-AAG TCC CTG TTC GGG CGC CAG-3';
HK411 5'-AAG TCC CTG TCC GGG CGC CAG-3';
HK12 5'-CTA CCG ACT GAG CTA TCC GGG-3';
HK22 5'-GAT TAA AAG TCT GAT GCT-3';
HK32 5'-GAC TTG AAC CCT GGA CCC TCA-3';
454
ÔÓÒÅÐÍ²Ê Ï. Â., ÍÅÃÐÓÖÜÊÈÉ Á. Ñ., ªËÜÑÜÊÀ Ã. Â.
HK321 5'-GAC TTG AAC CCC GGA CCC TCA-3';
HK413 5'-AAG TCC TTG TTC GGG CGC CAG-3';
HK422 5'-GAT CCT GGC GCC CGA ACA AG-3';
HK42 5'-GAT CCT GGC GCC CGA ACA GG-3';
HK421 5'-GAT CCT GGC GCC CGG ACA GG-3',
ñèí òå çî âàí³ MWG-Biotech AG.
Îë³ãî íóê ëå î òè äè RS111, HK12, HK22, HK32,
HK321 ôîñ ôî ðè ëþ âà ëè Ò4-ïîë³íóê ëå î òèäê³íà çîþ,
ï³ñëÿ ÷î ãî ã³áðè äè çó âà ëè ç ðåø òîþ ïî ïàð íî ç óòâî -
ðåí íÿì äóï ëåêñ³â
RS101 + RS11 = A;
HK11 + HK12 = B;
HK21 + HK22 = C;
HK31 + HK32 = D;
HK311+ HK321= E;
HK411+ HK421= F;
HK41 + HK42 = H;
HK413+ HK422 = I,
ã³áðè äè çî âà íèõ ç ïëàçì³äîþ pUC18 ïî ñàé òàõ
BamHI ³ HindIII, ÿê öå ïî êà çà íî ó òàáë. 1, òà çøè òèõ
Ò4-ë³ãà çîþ. Çà ãàëü íèé âèã ëÿä êî íñòðóêö³¿ çîá ðà æå -
íî íà ñõåì³.
Çà äî ïî ìî ãîþ îò ðè ìà íèõ ïëàçì³ä òðàíñ ôîð ìî -
âàëè êîì ïå òåíòí³ êë³òè íè E. coli XL-1-Blue, ÿê îïè -
ñà íî â [11]. Ïî çè òèâí³ êëî íè â³äáè ðà ëè àìï³öèë³íî -
âîþ òà X-Gal ñåëåêö³ºþ.
Ç êóëü òó ðè êë³òèí âèä³ëÿ ëè ïëàçì³äè çà äî ïî ìî -
ãîþ Qiagen Maxiprep Kit. Ïîñë³äîâí³ñòü ïå ðåâ³ðÿ -
ëè, âè êî ðèñ òî âó þ ÷è àâ òî ìà òè÷ íèé ñåê âå íà òîð ABI
377 («Applied Biosystems», ÑØÀ).
Ò7-ñèí òåç òÐÍÊ. Ïëàçì³äè ðîçð³çà ëè ðåñ òðèê -
òà çîþ BshNI ïî ñàé òó, ùî òåðì³íóº ñèí òåç òðàíñ -
êðèïò³â òàê, ùî â ¿õí³é ñòðóê òóð³ çíèêàþòü äâà
îñòàíí³õ íóê ëå î òè äè (Ñ òà À), òîá òî ðîçì³ð íîð -
ìàëü íî¿ òÐÍÊ, ÿêèé ñòà íî âèòü 76 íóê ëå î òèä³â,
çìåí øóºòüñÿ äî 74. Òà êèì ÷è íîì ìè ë³íå à ðè çó âà ëè
ïëàçì³äó òà âèç íà ÷è ëè òî÷ êó çà âåð øåí íÿ ñèí òå çó.
Ñèí òåç òÐÍÊ ïðî âî äè ëè Ò7 ÐÍÊ-ïîë³ìå ðà çîþ çà
ïðè ñóò íîñò³ 40 ìM òðèñ-HCl, pH 7,9, 6 ìM MgCl2,
10 ìM DTT, 10 ìM NaCl, 2 ìM ñïåðì³äè íó (êîí -
öåí òðàö³¿ ATP, GTP, CTP òà UTP â³äïîâ³äà ëè
ñï³ââ³äíî øåí íþ íóê ëå î òèä³â ó ïî ñë³äîâ íîñò³).
Ñóì³ø îá ðîá ëÿ ëè ÄÍÊà çîþ ². Äëÿ ïîä àëü øî ãî
î÷è ùåí íÿ òÐÍÊ ïðî âî äè ëè õðî ìà òîã ðàô³þ íà
ÄÅÀÅ-öå ëþ ëîç³ (â áó ôåð³ 100 ìM NH4Ac, 10 ìM
MgCl2, 100 ìM NaCl) òà åëåê òðî ôî ðåç ó 10 %-ìó
ÏÀÀà (19:1) çà ïðè ñóò íîñò³ 7 Ì ñå ÷î âè íè. Äëÿ ðå -
íà òó ðàö³¿ òÐÍÊ íà ãð³âà ëè äî t = 72 °Ñ ç ïîä àëü øèì
ïîâ³ëüíèì îõî ëîä æåí íÿì. Àêòèâí³ñòü òðàíñ -
êðèïò³â ïå ðåâ³ðÿ ëè â ðå àêö³¿ àì³íî à öè ëþ âàí íÿ. Âñ³
òðàíñ êðèï òè ì³òè ëè [32Ð]ATP, ÿê îïè ñà íî âè ùå.
Ðå çóëü òà òè ³ îá ãî âî ðåí íÿ. Ïîð³âíÿí íÿ
ñïîð³äíå íîñò³ òÐÍÊ ð³çíî¿ ñïå öèô³÷íîñò³ äî äâîõ
³çî ôîðì eEF1A. ßê çà çíà ÷à ëî ñÿ âè ùå, òÐÍÊ í³êî ëè
íå áó âຠâ³ëüíà â êë³òèí³, âî íà âåñü ÷àñ çâ’ÿ çà íà ç
ïåâ íè ìè ïàð òíå ðà ìè – ôàê òî ðîì åëîí ãàö³¿ 1À, ó
ñêëàä³ êîì ïëåê ñó eEF1A*GTP*aì³íîa öèë-òÐÍÊ,
AARS àáî ðè áî ñî ìîþ. Íà ðîëü òà êî ãî ïàð òíå ðà äëÿ
äå àöèëü î âà íî¿ òÐÍÊ, ùî ìຠïî òðà ïè òè â³ä ðè áî ñî -
ìè äî AARS ó öèêë³ êà íà ëþ âàí íÿ, çà ïðî ïî íî âà íî
ôàê òîð åëîí ãàö³¿ 1À, ùî é áó ëî ï³äòâåð äæå íî
åêñïå ðè ìåí òàëü íî [3]. Ðàí³øå ìå òî äîì ïî ëÿ ðè çàö³¿
ôëó î ðåñ öåíö³¿ íà ìè äîñë³äæå íî ôîð ìó âàí íÿ íå êà -
íîí³÷íèõ ïî òð³éíèõ êîì ïëåêñ³â ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿
1À1 ç GDP òà òÐÍÊPhe [4], à òà êîæ ìå òî äîì çà òðèì -
êè ñìó ãè â ÏÀÀà âèâ÷åíî óòâî ðåí íÿ ïî òð³éíèõ
êîì ïëåêñ³â eEF1A1 ³ eEF1A2 ç òÐÍÊSer [6] òà
âèì³ðÿ íî óÿâí³ Kd äëÿ âñ³õ êîì ïëåêñ³â.
Ó ö³é ðî áîò³ ìå òî äîì çà òðèì êè ñìó ãè â ÏÀÀÃ
ìè äîñë³äèëè ôîð ìó âàí íÿ íå êà íîí³÷íèõ êîì -
455
ÍÅÊÀÍÎͲ×Ͳ ÊÎÌÏËÅÊÑÈ åEF1A ÑÑÀÂÖ²Â Ç òÐÍÊ Ð²ÇÍί ÑÏÅÖÈÔ²×ÍÎÑÒ²
WT M1 (U67:C67) M2 (À50:G50) M3 (Ñ63:U63)
À À À À
   Â
Ñ Ñ Ñ Ñ
D D Å D
Í F Í ²
Òàá ëè öÿ 1
Âàð³àíòè ìî äèô³êàö³¿ ãåíà òÐÍÊ3
Lys
Êî íñòðóêö³ÿ ãåíà òÐÍÊ3
Lys, êëî íî âà íî ãî â ïëàçì³ä³ pUC18
ïëåêñ³â eEF1A1 òà eEF1A2 â GDP-çâ’ÿ çàí³é ôîðì³ ç
òÐÍÊ òà êèõ ñïå öèô³÷íîñ òåé: Asp (ðèñ. 1), Ile (ðèñ.
2), Tyr, Phe, Met, Leu, Pro (ðèñ. 3). Ñïîð³äíåí³ñòü
îö³íþ âà ëè çà çíà ÷åí íÿì Êd, ùî â³äîá ðà æຠòà êó
êîí öåí òðàö³þ ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿, çà ÿêî¿ ïî ëî âè íà
òÐÍÊ çà ëè øàºòüñÿ íå çâ’ÿ çà íîþ. ʳëüê³ñòü â³ëüíî¿
òÐÍÊ âèç íà ÷à ëè äåí ñè òî ìåòð³ºþ. Ç ïðåä ñòàâ ëå íèõ
äà íèõ âèä íî, ùî çíà ÷åí íÿ Kd äëÿ êîì ïëåêñ³â
eEF1A1*GDP ç òÐÍÊ ð³çíèõ ñïå öèô³÷íîñ òåé çíà õî -
äÿòü ñÿ ó ìåæ àõ 200–750 íÌ, òîä³ ÿê äëÿ êîì ïëåêñ³â
eEF1A2*GDP*òÐÍÊ – â ä³àïà çîí³ 50–400 íÌ. Ìàé -
æå äëÿ êîæ íî¿ òÐÍÊ Kd ïî òð³éíî ãî êîì ïëåê ñó
eEF1A2*GDP ó 2–4 ðàçè ìåí øà, í³æ Kd äëÿ êîì -
ïëåêñ³â ç eEF1A1*GDP. Ö³êà âî, ùî ó ðàç³ òÐÍÊPhe Kd
ð³âí³ äëÿ îá îõ ôàê òîð³â. Ó òàáë. 2 íà âå äå íî óçà ãàëü -
íåí³ çíà ÷åí íÿ Kd äëÿ ïî òð³éíèõ êîì ïëåêñ³â
eEF1A*GDP*òÐÍÊ, îò ðè ìàí³ â ö³é òà ïî ïå ðåäí³õ
ðî áî òàõ [4, 6].
dzðî÷ êîþ ïî çíà ÷å íî ðå çóëü òà òè, îò ðè ìàí³ â ïî -
ïå ðåäí³õ ðî áî òàõ [3, 5].
ßê âèä íî ç òàáë. 2, îò ðè ìàí³ íà ìè çíà ÷åí íÿ Kd
äëÿ òÐÍÊPhe ³ñòîò íî â³äð³çíÿ þòü ñÿ â³ä çíà ÷åí íÿ Kd
äëÿ òÐÍÊPhe, îäåð æà íî ãî â ïî ïå ðåäí³é ðî áîò³. Àëå
ïðè ïîð³âíÿíí³ íå îáõ³äíî âðà õî âó âà òè òå, ùî òå -
ïåð³øí³ ðå çóëü òà òè â³äð³çíÿ þòü ñÿ â³ä ïî ïå ðåäí³õ
óìî âà ìè ïðî âå äåí íÿ ðîç ðà õóíê³â: ïåðø³ îò ðè ìà íî
çà íåð³âíî âàæ íèõ óìîâ íà â³äì³íó â³ä îñòàíí³õ, äå
óìî âè áó ëè ð³âíî âàæ íè ìè ³ äîñë³äæåí íÿ âè êî íà íî
³íøèì ìå òîäîì.
Ó íàø³é ðî áîò³ äî âå äå íî ôîð ìó âàí íÿ íå êà -
íîí³÷íèõ êîì ïëåêñ³â eEF1A ç äå à öèëü î âà íè ìè
òÐÍÊ âîñü ìè ð³çíèõ ñïå öèô³÷íîñ òåé, ùî ñâ³ä÷èòü
íà êî ðèñòü óí³âåð ñàëü íîñò³ çà ïðî ïî íî âà íî ãî
ðàí³øå ìå õàí³çìó êà íà ëþ âàí íÿ òÐÍÊ. ³äî ìî, ùî
eEF1A çâ’ÿ çóº âñ³ àì³íî à öèë-òÐÍÊ ç ïðè áëèç íî
îäíà êî âîþ ñïîð³äíåí³ñòþ. Âè ÿâ ëå íó ð³çíè öþ ó
çíà ÷åí íÿõ Kd êîì ïëåêñ³â eEF1A ç ð³çíè ìè òÐÍÊ äëÿ
êîæ íî¿ ³çî ôîðìè ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿ ìîæ íà ïî ÿñ íè -
òè íå îáõ³äí³ñòþ êîì ïåí ñàö³¿ âíåñ êó àì³íî êèñ ëîò -
íî ãî çà ëèø êó ó ïî òð³éíî ìó êîì ïëåêñ³ eEF1A*
GTP*aì³íîa öèë-òÐÍÊ.
Òà êèì ÷è íîì, óòâî ðåí íÿ ïî òð³éíî ãî êîì ïëåê ñó
eEF1A*GTP*aì³íîaöèë-òÐÍÊ ç îäíà êî âè ìè òåð -
ìî äè íàì³÷íè ìè õà ðàê òå ðèñ òè êà ìè ìî æå áó òè âàæ -
ëè âèì ïðè âçàºìî䳿 ç ðè áî ñî ìîþ [12]. Ïðè ïóñ -
êàºòüñÿ, ùî ñà ìå òà êèé ìå õàí³çì êîì ïåí ñàö³¿ ³ñíóº ³
456
ÔÓÒÅÐÍ²Ê Ï. Â., ÍÅÃÐÓÖÜÊÈÉ Á. Ñ., ªËÜÑÜÊÀ Ã. Â.
Ðèñ. 1. Äîñë³äæåí íÿ ñòàá³ëüíîñò³ êîì ïëåêñ³â òÐÍÊAsp ç eEF1A1*GDP òà eEF1A2*GDP: a
– ðàä³îàâ òîã ðàô åëåê òðî ôî ðåã ðà ìè êîì ïëåê ñó eEF1A1*GDP*òÐÍÊAsp ó ä³àïà çîí³ êîí -
öåí òðàö³é eEF1A1 â³ä 2 äî 0,1 ìêÌ çà óìîâ, êîëè á³ëêè òà òÐÍÊ íå äå íà òó ðó þòü; á –
ðàä³îàâ òîã ðàô åëåê òðî ôî ðåã ðà ìè êîì ïëåê ñó eEF1A2*GDP*òÐÍÊAsp ó ä³àïà çîí³ êîí öåí -
òðàö³é eEF1A2 â³ä 2 äî 0,1 ìêÌ çà óìîâ, êîëè á³ëêè òà òÐÍÊ íå äå íà òó ðó þòü; â – äåí ñè òî -
ìåò ðè÷ íå äîñë³äæåí íÿ òîãî æ ðàä³îàâ òîã ðà ôà çà äî ïî ìî ãîþ ïðî ãðà ìè GelProAnalyser
(êðè âà â³äîá ðà æຠçìåí øåí íÿ ³íòåí ñèâ íîñò³ â³ëüíî¿ [32P]òÐÍÊAsp ïðè ôîð ìó âàíí³ êîì -
ïëåê ñó eEF1A1*GDP*[32P]òÐÍÊAsp; çà 100 % ïðè é íÿ òî ³íòåí ñèâí³ñòü ñèã íà ëó â³ëüíî¿
[32P]òÐÍÊAsp); ã – òàê ñàìî, ÿê ó â, ò³ëüêè äëÿ eEF1A2
â ïðî êàð³îò íèõ òÐÍÊ [13]. Ïî êà çà íî, ùî ïðè ðî äà
òÐÍÊ âïëè âຠíà âçàºìîä³þ àì³íî à öèë-òÐÍÊ ç ïðî -
êàð³îò íèì ôàê òî ðîì åëîí ãàö³¿ EF1A [14].
À ÷èì ìîæ íà ïî ÿñ íè òè òå, ùî ç îäíèì òè ïîì
òÐÍÊ äâ³ ³çî ôîð ìè eEF1A âçàºìîä³þòü ïî-ð³çíî -
ìó? ³äïîâ³äü íà öå çà ïè òàí íÿ ùå íå çîâñ³ì ç’ÿ ñî âà -
íà. Âñòà íîâ ëå íî, ùî eEF1A1 ìຠâ ðîç ÷èí³ ðîç ãîð -
íóò³øó êîí ôîð ìàö³þ, í³æ eEF1A2 [15]. Öå ìî æå
áó òè ìîæ ëè âèì ïî ÿñ íåí íÿì ñòðóê òóð íèõ
â³äì³ííîñ òåé âçàºìî䳿. Íà æàëü, îò ðè ìàí³ ðå çóëü -
òà òè äîç âî ëÿ þòü ëè øå ïðè ïóñ òè òè ³ñíó âàí íÿ
â³ðîã³äíèõ â³äì³ííîñ òåé ó ôóíêö³îíó âàíí³ ôàê òî ðà
åëîí ãàö³¿ 1À ó òèõ òêàíèíàõ, ç ÿêèõ ïîõîäÿòü ö³ äâ³
³çîôîðìè.
Âàæ ëè âèì º é òå, ùî ìè âïåð øå ïî êà çà ëè ìîæ -
ëèâ³ñòü ôîð ìó âàí íÿ íå êà íîí³÷íèõ ïî òð³éíèõ êîì -
ïëåêñ³â äâîõ ³çî ôîðì eEF1A ç ³í³ö³àòîð íîþ
òÐÍÊi
Met (ðèñ. 4). ßê âèä íî ç ðèñ. 2, òàê³ êîì ïëåê ñè
ä³éñíî ôîð ìó þòü ñÿ, ïðè ÷î ìó ¿õíÿ ñòàá³ëüí³ñòü º
ïðàê òè÷ íî òà êîþ æ, ÿê ³ äëÿ åëîí ãà òîð íèõ òÐÍÊ.
Òàê, äëÿ êîì ïëåê ñó eEF1A1*GDP*òÐÍÊi
Met Kd ñòà -
íî âèòü 370 íM, à äëÿ êîì ïëåê ñó eEF1A2*GDP*
òÐÍÊi
Met âî íà äîð³âíþº 250 íM, òîá òî òà êà òÐÍÊ
âçàºìî䳺 ç ôàê òî ðîì åëîí ãàö³¿ íàâ³òü êðà ùå, í³æ
äå ÿê³ åëîí ãà òîðí³ òÐÍÊ, ó òî ìó ÷èñë³ é òÐÍÊå
Met.
Ôîð ìó âàí íÿ íå êà íîí³÷íèõ êîì ïëåêñ³â ôàê òî ðà
åëîí ãàö³¿ 1À ç äå à öèëü î âà íîþ ³í³ö³àòîð íîþ òÐÍÊ
âè ÿ âè ëî ñÿ äå ùî äèâ íèì, îñê³ëüêè ³ñíó âàí íÿ
ïîä³áíî ãî êîì ïëåê ñó íå ïðî ãíî çó âà ëî ñÿ [16].
Á³ëüøå òî ãî, ïî êà çà íî, ùî Ìåò-òÐÍÊi
Met íå ìî æå
áó òè âè êî ðèñ òà íà ÿê åëîí ãà òîð íà òÐÍÊ ó
áåçêë³òèíí³é á³ëîê-ñèí òå çó âàëü íèé ñèñ òåì³. Âèç íà -
÷å íî, ùî òÐÍÊi
Met ññàâö³â ìຠäâà ñàé òè, ùî âè êî íó -
þòü ôóíêö³þ àí òè äå òåðì³íà íò ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿
1À: íà àê öåï òîð íî ìó ñòåáë³ – A1:U72, â Ò-ñòåáë³ –
A50:U64 òà U51:A63 [17]. Ç ³íøî ãî áî êó, ó
Ìåò-òÐÍÊi
Met ðîñ ëèí òà äð³æäæ³â àí òè äå òåðì³íàí-
òîþ ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿ ñëó ãóº ïî ñòòðàí ñëÿö³éíà ìî -
äèô³êàö³ÿ À64 – 2-Î-ðè áî çè ëþ âàí íÿ, ÿêà òà êîæ
ðîç òà øî âà íà íà Ò-ñòåáë³ [18]. ²ìîâ³ðíî, ùî
457
ÍÅÊÀÍÎͲ×Ͳ ÊÎÌÏËÅÊÑÈ åEF1A ÑÑÀÂÖ²Â Ç òÐÍÊ Ð²ÇÍί ÑÏÅÖÈÔ²×ÍÎÑÒ²
Ðèñ. 2. Äîñë³äæåí íÿ ñòàá³ëüíîñò³ êîì ïëåêñ³â òÐÍÊIle ç eEF1A1*GDP òà eEF1A2*GDP: à –
ðàä³îàâ òîã ðàô åëåê òðî ôî ðåã ðà ìè êîì ïëåêñ³â eEF1A1*GDP*òÐÍÊIle (ë³âî ðó÷) òà
eEF1A1*GDP*òÐÍÊIle (ïðà âî ðó÷) ó ä³àïà çîí³ êîí öåí òðàö³é eEF1A1 òà eEF1A2 â³ä 2 äî 0,1
ìêÌ (ç ìåí øèì êðî êîì, í³æ íà ðèñ. 1) çà óìîâ, êîëè á³ëêè òà òÐÍÊ íå äå íà òó ðó þòü; á –
äåí ñè òî ìåò ðè÷ íå äîñë³äæåí íÿ òîãî æ ðàä³îàâ òîã ðà ôà çà äî ïî ìî ãîþ ïðî ãðà ìè
GelProAnalyser (êðè âà â³äîá ðà æຠçìåí øåí íÿ ³íòåí ñèâ íîñò³ â³ëüíî¿ [32P]òÐÍÊIle ïðè
ôîð ìó âàíí³ êîì ïëåêñ³â eEF1A1*GDP*[32P]òÐÍÊIle òà eEF1A2*GDP*[32P]òÐÍÊIle; çà
100 % ïðè é íÿ òî ³íòåí ñèâí³ñòü ñèã íà ëó â³ëüíî¿ [32P]òÐÍÊIle)
458
ÔÓÒÅÐÍ²Ê Ï. Â., ÍÅÃÐÓÖÜÊÈÉ Á. Ñ., ªËÜÑÜÊÀ Ã. Â.
Ðèñ. 3. Ñòàá³ëüí³ñòü êîì ïëåêñ³â òÐÍÊ*eEF1A1*GDP/eEF1A2*GDP ç ð³çíè ìè åëîí ãà òîð íè ìè òÐÍÊ. Ðàä³îàâ òîã ðà ôè åëåê òðî ôî ðå- ãðàì äëÿ: à – òÐÍÊTyr; á – òÐÍÊPhe; â – òÐÍÊe
Met; ã –
òÐÍÊLeu; ä – òÐÍÊPro
âçàºìî䳿 ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿ ç Ìåò-òÐÍÊi
Met íå
â³äáó âàºòüñÿ ÷å ðåç â³äñóòí³ñòü êîí òàê òó ç àì³íî êèñ -
ëîò íèì çà ëèø êîì (ùî, äî ðå÷³, ðîç òà øî âà íèé â
åëîí ãà òîðí³é Ìåò-òÐÍÊå
Met ï³ä ³íøèì êó òîì
â³äíîñ íî àê öåï òîð íî ãî ñòåá ëà). Íà ÿâí³ñòü ñàé òà
U51:A63 â Ò-ñòåáë³ òÐÍÊ, âî ÷å âèäü, º íå äîñ òàò -
íüîþ àí òè äå òåðì³íà íòîþ ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿, ùî ³ º ,
íà íà øó äóì êó, ïðè ÷è íîþ ôîð ìó âàí íÿ âè ÿâ ëå íî ãî
íà ìè íå êà íîí³÷íî ãî êîì ïëåê ñó eEF1A*GDP*
òÐÍÊi
Met.
Çíà ÷åí íÿ óòâî ðåí íÿ êîì ïëåê ñó eEF1A1/
eEF1A2*GDP*òÐÍÊi
Met ïî ëÿ ãàº, ñêîð³ø çà âñå, ó
ìîæ ëè âîñò³ âè êî ðèñ òàí íÿ eEF1A äëÿ êà íà ëþ âàí íÿ
³í³ö³àòîð íî¿ òÐÍÊ ï³ñëÿ òî ãî, ÿê âî íà çà ëè øàº
Å-ñàéò ðè áî ñî ìè òà, éìîâ³ðíî, ñà ìå ó ñêëàä³ òà êî ãî
ïî òð³éíî ãî êîì ïëåê ñó ïî òðàï ëÿº äî ÀÀRS. Ïî ðÿä ç
öèì, ç’ÿ ñî âà íà íà ìè ðàí³øå çäàòí³ñòü ôàê òî ðà
³í³ö³àö³¿ eIF2, g-ñóá îäè íè öÿ ÿêî ãî º ãî ìî ëî ãîì
eEF1A, âçàºìîä³ÿòè ç äå à öèëü î âà íè ìè òÐÍÊi
Met ³
òÐÍÊå
Met òà íå âçàºìîä³ÿòè ç ³íøè ìè åëîí ãà òîð íè ìè
òÐÍÊ [19], äî ïîâ íþº öåé ìå õàí³çì ùå îäí³ºþ ëàí -
êîþ. Ðå çóëü òàò ïîð³âíÿí íÿ çíà ÷åíü Kd äëÿ öèõ êîì -
ïëåêñ³â ðàç îì ç â³äïîâ³äíè ìè çíà ÷åíí íÿ ìè äëÿ
eEF1A1 òà eEF1A2 íà âå äå íî ó òàáë. 3. ßê âèä íî,
çíà ÷åí íÿ Kd äëÿ ïî òð³éíèõ êîì ïëåêñ³â ³çî ôîð ìè
ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿ 1À º çíà÷ íî á³ëüøè ìè, í³æ ¿¿ çíà -
÷åí íÿ äëÿ êîì ïëåêñ³â eIF2*GDP ç òÐÍÊe
Met ³
òÐÍʳ
Met, ùî, íà íà øó äóì êó, íå çà âà æຠôàê òî ðó
åëîí ãàö³¿ âçàºìîä³ÿòè ç óñ³ìà äå à öèëü î âà íè ìè
òÐÍÊ òà äîñ òàâ ëÿ òè ¿õ ó ñêëàä³ ïî òð³éíî ãî êîì -
ïëåê ñó äî AARS. Îòæå, îò ðè ìàí³ ðå çóëü òà òè ìî -
æóòü áó òè ùå îäíèì äî êà çîì íà êî ðèñòü êà íà ëþ -
459
ÍÅÊÀÍÎͲ×Ͳ ÊÎÌÏËÅÊÑÈ åEF1A ÑÑÀÂÖ²Â Ç òÐÍÊ Ð²ÇÍί ÑÏÅÖÈÔ²×ÍÎÑÒ²
Ðèñ. 4. Ñòàá³ëüí³ñòü êîì ïëåêñ³â òÐÍÊi
Met *eEF1A1/eEF1A2*GDP (ðàä³îàâ òîã ðàô åëåê òðî ôî ðåã ðà ìè)
òÐÍÊ Kd, íM
eEF1A1 eEF1A2
Pro 200 50
Phe 250 250
Phe 9* –
Tyr 750 400
Ile 470 100
Metå 700 300
Leu 600 150
Ser 350* 120*
Asp 750 250
Ìeti 370 250
dzðî÷ êîþ ïî çíà ÷å íî ðå çóëü òà òè, îò ðè ìàí³ â ïî ïå ðåäí³õ ðî áî òàõ [3, 5].
Òàá ëè öÿ 2
Óçà ãàëü íå íå ïîð³âíÿí íÿ ñïîð³äíå íîñò³ ³çî ôîðì eEF1A äî
ð³çíèõ òÐÍÊ
Êîìïëåêñ
Kd, íM
òÐÍÊe
Met òÐÍÊi
Met òÐÍÊLeu
eIF2*GDP 100 160 >1500
eEF1A1*GDP 600 370 600
eEF1A2*GDP 250 250 150
Òàá ëè öÿ 3
Ïîð³âíÿí íÿ ñïîð³äíå íîñò³ êîì ïëåêñ³â ôàê òîð³â òðàíñ ëÿö³¿ ç
GDP äî åëîí ãà òîð íèõ òà ³í³ö³àòîð íî¿ òÐÍÊMet
460
ÔÓÒÅÐÍ²Ê Ï. Â., ÍÅÃÐÓÖÜÊÈÉ Á. Ñ., ªËÜÑÜÊÀ Ã. Â.
Ðèñ. 5. Ñòàá³ëüí³ñòü êîì ïëåêñ³â òÐÍÊ*eEF1A1/eEF1A2*GDP (ðàä³îàâ òîã ðà ôè åëåê òðî ôî ðåã ðàì): à – òÐÍÊ3
Lys-WT; á – òÐÍÊ3
Lys- M1; â – òÐÍÊ3
Lys-M2; ã – òÐÍÊ3
Lys-M3
âàí íÿ òÐÍÊ ó ïðî öåñ³ òðàíñ ëÿö³¿ ÿê íà åòàï³ åëîí -
ãàö³¿, òàê ³ ï³ä ÷àñ ³í³ö³àö³¿.
Âèç íà ÷åí íÿ ðîë³ G:U-ïàð â ïî ëî æåí íÿõ 51:63
òà 50:64 ó âçàºìî䳿 òÐÍÊ ç ôàê òî ðîì åëîí ãàö³¿
1À. Íå ùî äàâ íî âèç íà ÷å íî ñàé òè íà òÐÍÊ òà ïðî -
êàð³îò íî ìó EF1A, â³äïîâ³äàëüí³ çà âçàºìîä³þ ç
òÐÍÊ [13]. ßê âè ÿ âè ëî ñÿ, G:C-ïà ðà ó ïî ëî æåíí³
63:51 ó Ò-ñòåáë³ òÐÍÊ ìຠá³ëüøó ïðå âà ãó, í³æ A:U.
³äî ìî, ùî ñå ðåä òÐÍÊ ññàâö³â ëè øå òÐÍÊQUU
Asn,
òÐÍÊUGA
Ser ³ òÐÍÊi
Met ì³ñòÿòü A:U ïà ðó â ïî ëî æåíí³
63:51, à òÐÍÊPhe ³ òÐÍÊTyr ìà þòü G:U.
Ùîá ç’ÿ ñó âà òè ìå õàí³çì âçàºìî䳿 ôàê òî ðà
åëîí ãàö³¿ ç ð³çíè ìè òÐÍÊ íà ìè âñòà íîâ ëå íî ðîëü
îêðå ìèõ ñàéò³â íà ìî ëå êóë³ òÐÍÊ, ÿê³ âïëè âà þòü íà
¿¿ âçàºìîä³þ ç eEF1A. Ìó òàö³¿ ââî äè ëè â ñòðóê òó ðó
òÐÍÊ3
Lys ó ñïîñ³á, îïè ñà íèé â «Ìà òåð³àëàõ ³ ìå òî -
äàõ». Ìó òàíòí³ òà íîð ìàëü íà òÐÍÊ ìà ëè îäíà êî âó
àê òèâí³ñòü ó ðå àêö³¿ àì³íî à öè ëþ âàí íÿ. Ìå òî äîì
çà òðèì êè ñìó ãè â ÏÀÀà ìè äîñë³äè ëè
ñïîð³äíåí³ñòü ìó òàí òíèõ òÐÍÊ äî îá îõ ³çî ôîðì
eEF1A (ðèñ. 5). Ðå çóëü òà òè ñâ³ä÷àòü ïðî íå çíà÷ íèé
âíå ñîê ââå äåí íÿ G:U-ïàð ó âçàºìîä³þ ç eEF1A1.
Ââå äåí íÿ G:U-ïàð â ïî ëî æåíí³ 51:63 íå çì³íþº Kd,
à â ïî ëî æåíí³ 50:64 – çá³ëüøóº ¿¿ ç 250 äî 400 íM,
òîá òî ìåíø í³æ ó 2 ðàçè. Äëÿ êîì ïëåê ñó ç eEF1A2
íà ÿâí³ñòü G:U-ïà ðè â ïî ëî æåíí³ 50:64 çá³ëüøóº Kd
ç 30 äî 170 íM, à â ïî ëî æåíí³ 51:63 – äî 100 íM,
òîá òî â 5,5 òà 3 ðàçè â³äïîâ³äíî.
Òà êèì ÷è íîì, ìè âñòàíîâèëè, ùî ñàé òè 63:51 òà
64:50 â åëîí ãà òîðí³é òÐÍÊ3
Lys º âàæ ëè âè ìè äëÿ
âçàºìî䳿 òÐÍÊ ç eEF1A. ßê ç’ÿ ñó âà ëî ñÿ, á³ëüøå
çíà ÷åí íÿ âî íè ìà þòü äëÿ eEF1A2, äå ñïîð³äíåí³ñòü
äî òÐÍÊ çìåí øóºòüñÿ íàâ³òü ïðè çàì³í³ U64:A50 íà
á³ëüø âèã³äíó U64:G50-ïà ðó ïðè áëèç íî ó 5 ðàç³â, à
çàì³íà Ñ63:G51 íà U63:G51 ïðèçâîäèòü äî çìåí -
øåí íÿ ñïîð³äíå íîñò³ ó 3 ðàçè (äàí³ íà âå äåíî ó
ïîð³âíÿëüí³é òàáë. 4).
Âè ÿâ ëå íà ð³çíè öÿ ì³æ çíà ÷åí íÿ ìè Kd ïî òð³éíèõ
êîì ïëåêñ³â ð³çíèõ ìó òàí òíèõ ôîðì òÐÍÊ ³ òÐÍÊ
äè êî ãî òè ïó, à òà êîæ íå îäíà êî âà ñïîð³äíåí³ñòü
îäí³º¿ òÐÍÊ äî ð³çíèõ ³çî ôîðì ôàê òî ðà åëîí ãàö³¿ º
ñâ³ä÷åí íÿì òî ãî, ùî âíå ñîê ó öþ âçàºìîä³þ ðî áèòü
ÿê ñòðóê òó ðà òÐÍÊ, òàê ³ îñîá ëè âîñò³ ñòðóê òó ðè
eEF1A.
Îòæå, ìè ç’ÿ ñó âà ëè, ùî ôîð ìó âàí íÿ íå êà -
íîí³÷íèõ êîì ïëåêñ³â òÐÍÊ ç eEF1A*GDP õà ðàê òå -
ðè çóºòüñÿ óí³âåð ñàëüí³ñòþ ³ âëàñ òèâå âñ³ì åëîí ãà -
òîð íèì òÐÍÊ, òàê³ êîì ïëåê ñè ïðè òà ìàíí³ òàêîæ
îá îì ³çî ôîð ìàì ôàê òîðà åëîí ãàö³¿. Äî òî ãî æ íàìè
âè ÿâ ëåíî ìîæ ëèâ³ñòü óòâî ðåí íÿ íå êà íîí³÷íèõ ïî -
òð³éíèõ êîì ïëåêñ³â ³í³ö³àòîð íî¿ òÐÍÊ ç îá îìà ³çî -
ôîð ìà ìè ôàê òîðà åëîí ãàö³¿. Ìè âñòà íî âèëè, ùî
eEF1A2 ôîð ìóº íå êà íîí³÷í³ êîì ïëåê ñè ç âè ùîþ
àô³íí³ñòþ, í³æ eEF1A1, ìàé æå ç óñ³ìà äîñë³äæó âà -
íè ìè äå à öèëü î âà íè ìè òÐÍÊ. Íà ìè âèâ ÷å íî åëå -
ìåí òè òÐÍÊ, â³äïîâ³äàëüí³ çà çâ’ÿ çó âàí íÿ ôàê òîðà
åëîí ãàö³¿ 1À, ³ ç’ÿ ñî âà íî, ùî çàì³íà ïàð G64:C50 íà
G64:U50 ³ Ñ63:G50 íà U63:G50 â Ò-ñòåáë³ ïðè çâî -
äèòü äî ñóòòºâî ãî çíèæ åí íÿ ñïîð³äíå íîñò³ òÐÍÊ3
Lys
äî îá îõ ³çî ôîðì ôàê òîðà åëîí ãàö³¿ 1À. Öå çàñâ³ä÷óº
îñî áëè âó ðîëü çàçíà÷åíèõ ñàéò³â ó ôîð ìóâàíí³ íå -
êà íîí³÷íèõ êîì ïëåêñ³â òÐÍÊ*eEF1A*GDP.
Îêðå ìó ïîä ÿ êó âèñëîâ ëþºìî Î. Â. Íî âî ñèëüí³é
çà äî ïî ìî ãó ïðè î÷è ùåíí³ ïðå ïà ðàò³â ôàê òîð³â
åëîí ãàö³¿.
Äîñë³äæåí íÿ ÷àñ òêî âî ï³äòðè ìà íî Ïðîã ðà ìîþ
ç ô³íà íñó âàí íÿ ñï³ëüíèõ ïðî åêò³â ÍÀÍ Óêðà¿ íè ³
ÐÔÔÄ 2008–2009 ðð. (äîã. 21).
P. V. Futernyk, B. S. Negrutskii, G. V. El’ska
Noncanonical complexes of mammalian eEF1À with various
deacylated tRNAs
Summary
The formation of noncanonical complexes of two eEF1A isoforms
with different types of deacylated tRNAs was examined and
apparent dissociation constants were measured. A higher affinity to
tRNA was found for the tissue specific isoform of elongation factor
eEF1A2, as compared with that of eEF1A1. For the first time the
formation of noncanonic complex of eEF1A with initiator tRNAi
Met
was found to be possible. A specific role of some tRNA sites in the
interaction with eEF1A was discovered.
Keywords: translation, elongation factor 1A, channeling.
461
ÍÅÊÀÍÎͲ×Ͳ ÊÎÌÏËÅÊÑÈ åEF1A ÑÑÀÂÖ²Â Ç òÐÍÊ Ð²ÇÍί ÑÏÅÖÈÔ²×ÍÎÑÒ²
òÐÍÊ
Kd, íM
eEF1A1 eEF1A2
LysWT 250 30
LysM1 (U67:C67) 330 120
LysM2 (A50:G50) 400 170
LysM3 (C63:U63) 250 100
Òàá ëè öÿ 4
Ïîð³âíÿí íÿ ñïîð³äíå íîñò³ íîð ìàëü íî¿ òà ìó òàí òíèõ
òÐÍÊ3
Lys äî äâîõ ³çî ôîðì eEF1A
Ï. Â. Ôó òåð íèê, Á. Ñ. Íåã ðóö êèé, À. Â. Åëüñêàÿ
Íå êà íî íè ÷åñ êèå êîì ïëåê ñû eEF1A ìëå êî ïè òà þ ùèõ
ñ äå à öè ëè ðî âàí íû ìè òÐÍÊ ðàç íîé ñïå öè ôè÷ íîñ òè
Ðå çþ ìå
Ðàñ ñìîò ðå íî ôîð ìè ðî âà íèå íå êà íî íè ÷åñ êèõ êîì ïëåê ñîâ äâóõ
èçî ôîðì ôàê òî ðà ýëîí ãà öèè eEF1A ñ äå à öè ëè ðî âàí íû ìè
òÐÍÊ ðàç íûõ ñïå öè ôè÷ íîñ òåé è èç ìå ðå íû êà æó ùè å ñÿ êîí -
ñòàí òû äèñ ñî öè à öèè. Âû ÿâ ëå íî áîëü øåå ñðî äñòâî ê òÐÍÊ
òêà íåñ ïå öè ôè ÷åñ êîé èçî ôîð ìû ôàê òî ðà ýëîí ãà öèè eEF1A2 ïî
ñðàâ íå íèþ ñ eEF1A1. Âïåð âûå ïî êà çà íà ïðè íöè ïè àëü íàÿ âîç -
ìîæ íîñòü îá ðà çî âà íèÿ íå êà íî íè ÷åñ êèõ êîì ïëåê ñîâ eEF1A ñ
èíè öè à òîð íîé òÐÍÊi
Met. Îïðå äå ëå íà ðîëü îò äåëü íûõ ñàé òîâ â
ñòðóê òó ðå òÐÍÊ, îò âå òñòâåí íûõ çà âçà è ìî äå éñòâèå ñ
eEF1A.
Êëþ ÷å âûå ñëî âà: òðàíñ ëÿ öèÿ, ôàê òîð ýëîí ãà öèè 1À, êà íà -
ëè ðî âà íèå.
ÏÅÐÅË²Ê Ë²ÒÅÐÀÒÓÐÈ
1. Ryazanov, A. G., Ovchinnikov, L. P., Spirin, A. S. Develop-
ment of structural organization of protein- synthesizing
machinery from prokaryotes to eukaryotes //
Biosystems.–1987.–20.–P. 275–288.
2. Negrutskii B. S., Deutscher M. P. Channeling of aminoacyl-
tRNA for protein synthesis in vivo // Proc. Nat. Acad. Sci.
USA.–1991.–88.–P. 4991–4995.
3. Negrutskii B. S., El’skaya A. V. Eukaryotic translation elon-
gation factor 1A: structure, expression, functions, and
possible role in aminoacyl-tRNA channeling // Progr. Nucl.
Acid Res. Mol. Biol.–1998.–60.–P. 48–77.
4. Petrushenko Z. M., Negrutskii B. S., Ladokhin A. S., Budke-
vich T. V., Shalak V. F., El`skaya A. V. Evidence for the for-
mation of an unusual ternary complex of rabbit liver EF-1a
with GDP and deacylated tRNA // FEBS Lett.–1997.– 407.–
P. 13–17.
5. Petrushenko Z. M., Budkevich T. V., Shalak V. F., Negrutskii
B. S., El’skaya A. V. Novel complexes of mammalian
translation elongation factor eEF1A*GDP with uncharged
tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase. Implications for
tRNA channeling // Eur. J. Biochem.–2002.–269.–P. 4811–
4818.
6. Ôó òåð íèê Ï. Â., Ïîãð³áíà À. Ï., Ïåò ðó øåí êî Ç. Ì., Íåã -
ðóöü êèé Á. Ñ., ªëüñüêà Ã. Â. Äîñë³äæåí íÿ êîì ïëåêñ³â ôàê -
òî ðà åëîí ãàö³¿ 1À ç òÐÍÊÑåð òà ñå ðèë-òÐÍÊ ñèí òå òà çîþ //
Á³îïîë³ìåðè ³ êë³òèíà.–2004.–20, ¹ 1–2.–C. 17–23.
7. Newbery H. J., Loh D. H., O’Donoghue J. E., Tomlinson V.
A. L., Chau Y.-Y., Boyd J. A., Bergmann J. H., Brownstein D.,
Abbott C. M. Translation elongation factor eEF1A2 is
essential for post-weaning survival in mice // J. Biol. Chem.–
2007.–282.–P. 28951–28959.
8. Sternbach H., von der Haar F., Schlimme E., Gaertner E.,
Cramer F. Isolation and properties of tRNA nucleotidyl
transferase from yeast // Eur. J. Biochem.–1971.–22.–P. 166–
172.
9. Brungraber E. F. A simplified procedure for the preparation
of «soluble» RNA from rat liver // Biochem. and Biophys.
Res. Communs.–1962.–8.–P. 1–3.
10. Silberclang M., Gillum A. M., RajBhandary U. L. Use of in
vitro 32P labeling in the sequence analysis of nonradioactive
tRNAs // Meth. Enzymol.–1979.–59.–P. 58–109.
11. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: a
laboratory manual.–New York: Cold Spring Harbor Lab.
press, 1989.
12. Louie A., Ribeiro S. N., Reid B. R., Jurnak F. Relative
affinities of all Escherichia coli aminoacyl-tRNAs for
elongation factor Tu-GTP // J. Biol. Chem.–1984.–259.–
P. 5010–5016.
13. LaRiviere F. J., Wolfson A. D., Uhlenbeck O. C. Uniform
binding of amynoacyl-tRNAs to elongation factor Tu by
thermodynamic compensation // Science.–2001.–294.–
P. 165–168.
14. Sanderson L. E., Uhlenbeck O. C. The 51-63 pair of tRNA
confers specificity for binding by EF-Tu // RNA.–2007.–13.–
P. 835–840.
15. Budkevich T. V., Timchenko A. A., Tiktopulo E. I., Negrutskii
B. S., Shalak V. F., Petrushenko Z. M., Aksenov V. L.,
Willumeit R., Kohlbrecher J., Serdyuk I. N., El’skaya A. V.
Extended conformation of mammalian translation elongation
factor 1A in solution // Biochemistry.–2002.–41.–P. 5342–
5349.
16. Stortchevoi A., Varshney U., RajBhandary U. L. Common
location of determinants in initiator transfer RNAs for
initiator-elongator discrimination in bacteria and in
eukaryotes // J. Biol. Chem.–2003.–278.–P. 17672–17679.
17. Drabkin H. J., Estrella M., RajBhandary U. L. Initiator-
elongator discrimination in vertebrate tRNAs for protein
synthesis // Mol. and Cell. Biol.–1998.–18.–P. 1459–1466.
18. Kiesewetter S., Ott G., Sprinzl M. The role of modified purine
64 in initiator/elongator discrimination of tRNAi
Met from
yeast and wheat germ // Nucl. Acids Res.–1990.–18.–
P. 4677–4682.
19. Ôó òåð íèê Ï. Â., Íåã ðóöü êèé Á. Ñ., ªëüñüêà Ã. Â. Ôîð ìó -
âàí íÿ íå êà íîí³÷íèõ êîì ïëåêñ³â òÐÍʳ
Ìåò òà òÐÍÊå
Ìåò ç
ôàê òî ðîì ³í³ö³àö³¿ 2 ññàâö³â / Íàóê. â³ñí. ×åðí³â. óí-òó:
Çá. íàóê. ïðàöü (Á³îëîã³ÿ).–×åðí³âö³: Ðóòà, 2006.–
Âèï. 297.–Ñ. 3–7.
ÓÄÊ 577.217: 577.112.7
Íàä³éøëà äî ðå äàêö³¿ 18.10.07
462
ÔÓÒÅÐÍ²Ê Ï. Â., ÍÅÃÐÓÖÜÊÈÉ Á. Ñ., ªËÜÑÜÊÀ Ã. Â.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-157883 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-11-28T12:17:14Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Футерник, П.В. Негруцький, Б.С. Єльська, Г.В. 2019-06-21T05:35:15Z 2019-06-21T05:35:15Z 2008 Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності / П.В. Футерник, Б.С. Негруцький, Г.В. Єльська // Біополімери і клітина. — 2008. — Т. 24, № 6. — С. 453-462. — Бібліогр.: 19 назв. — укр., англ. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0007BD https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157883 577.217: 577.112.7 Розглянуто формування неканонічних комплексів двох ізоформ еукаріотного фактора елонгації eEF1A з деацильованими тРНК різних специфічностей та виміряно уявні константи дисоціації. Виявлено більшу спорідненість до тРНК тканиноспецифічної ізоформи фактора елонгації eEF1A2 порівняно з eEF1A1. Вперше показано принципову можливість утворення неканонічних комплексів eEF1A з ініціаторною тРНКі Меt. Визначено роль окремих сайтів у структурі тРНК, відповідальних за взаємодію з eEF1A. The formation of noncanonical complexes of two eEF1A isoforms with different types of deacylated tRNAs was examined and apparent dissociation constants were measured. A higher affinity to tRNA was found for the tissue specific isoform of elongation factor eEF1A2, as compared with that of eEF1A1. For the first time the formation of noncanonic complex of eEF1A with initiator tRNAiMet was found to be possible. A specific role of some tRNA sites in the interaction with eEF1A was discovered. Рассмотрено формирование неканонических комплексов двух изоформ фактора элонгации eEF1A с деацилированными тРНК разных специфичностей и измерены кажущиеся константы диссоциации. Выявлено большее сродство к тРНК тканеспецифической изоформы фактора элонгации eEF1A2 по сравнению с eEF1A1. Впервые показана принципиальная возможность образования неканонических комплексов eEF1A с инициаторной тРНКiMet. Определена роль отдельных сайтов в структуре тРНК, ответственных за взаимодействие с eEF1A. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Структура та функції біополімерів Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності Неканонические комплексы eEF1A млекопитающихс деацилированными тРНК разной специфичности Noncanonical complexes of mammalian eEF1A with various deacylated tRNAs Article published earlier |
| spellingShingle | Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності Футерник, П.В. Негруцький, Б.С. Єльська, Г.В. Структура та функції біополімерів |
| title | Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності |
| title_alt | Неканонические комплексы eEF1A млекопитающихс деацилированными тРНК разной специфичности Noncanonical complexes of mammalian eEF1A with various deacylated tRNAs |
| title_full | Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності |
| title_fullStr | Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності |
| title_full_unstemmed | Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності |
| title_short | Неканонічні комплекси eEF1A ссавців з деацильованими тРНК різної специфічності |
| title_sort | неканонічні комплекси eef1a ссавців з деацильованими трнк різної специфічності |
| topic | Структура та функції біополімерів |
| topic_facet | Структура та функції біополімерів |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157883 |
| work_keys_str_mv | AT futernikpv nekanoníčníkompleksieef1assavcívzdeacilʹovanimitrnkríznoíspecifíčností AT negrucʹkiibs nekanoníčníkompleksieef1assavcívzdeacilʹovanimitrnkríznoíspecifíčností AT êlʹsʹkagv nekanoníčníkompleksieef1assavcívzdeacilʹovanimitrnkríznoíspecifíčností AT futernikpv nekanoničeskiekompleksyeef1amlekopitaûŝihsdeacilirovannymitrnkraznoispecifičnosti AT negrucʹkiibs nekanoničeskiekompleksyeef1amlekopitaûŝihsdeacilirovannymitrnkraznoispecifičnosti AT êlʹsʹkagv nekanoničeskiekompleksyeef1amlekopitaûŝihsdeacilirovannymitrnkraznoispecifičnosti AT futernikpv noncanonicalcomplexesofmammalianeef1awithvariousdeacylatedtrnas AT negrucʹkiibs noncanonicalcomplexesofmammalianeef1awithvariousdeacylatedtrnas AT êlʹsʹkagv noncanonicalcomplexesofmammalianeef1awithvariousdeacylatedtrnas |