Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе
Изучено влияние модифицированного нуклеозида 6-азацитидина (6-АЗЦ) (2-β-Э-рибофуранозил-5-амино-1,2,4-триазин-3(2Н)-он) на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной культуре. Показано, что 6-АЗЦ в низких концентрациях эффективно подавляет цитопатогенное действие цитомегаловируса (ЦМВ) человек...
Saved in:
| Published in: | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Date: | 2004 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2004
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157990 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе / М.В. Абдуллаева, А.Ф. Фролов, И.В. Алексеева, Л.И. Пальчиковская , Н.Е. Федорова // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 4. — С. 337-342. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-157990 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Абдуллаева, М.В. Фролов, А.Ф. Алексеева, И.В. Пальчиковская, Л.И. Федорова, Н.Е. 2019-06-22T10:53:13Z 2019-06-22T10:53:13Z 2004 Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе / М.В. Абдуллаева, А.Ф. Фролов, И.В. Алексеева, Л.И. Пальчиковская , Н.Е. Федорова // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 4. — С. 337-342. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0006B9 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157990 578.835.12:615.281 Изучено влияние модифицированного нуклеозида 6-азацитидина (6-АЗЦ) (2-β-Э-рибофуранозил-5-амино-1,2,4-триазин-3(2Н)-он) на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной культуре. Показано, что 6-АЗЦ в низких концентрациях эффективно подавляет цитопатогенное действие цитомегаловируса (ЦМВ) человека. Эффективная доза соединения, ингибирующая развитие ЦМВ инфекции на 50 %, составляет 0,005 мг/мл. Изучение жизнеспособности клеток, их ростовых характеристик и синтеза клеточной ДНК показало, что 6-АЗЦ обладает низким цитотоксическим действием. Индекс цитотоксичности этого соединения, по данным разных тестов, варьирует от 2,4 до 24 мг/мл. Результаты подсчетов свидетельствуют о том, что индекс селективности для 6-АЗЦ находится в пределах 48–480 для лечебной схемы и 240–2400 – для профилактической, что сравнимо с таковым для ганцикловира (100–1000). Иммуноцитохимический анализ вирусных белков в зараженных клетках продемонстрировал, что 6-АЗЦ подавляет синтез позднего гликопротеина ЦМВ gB, продуцируемого после репликации вирусной ДНК. Effects of a modified nucleoside analog 6-Azacytidine (2-b-D-ribofuranosyl-5-amino-1,2,4-triazin-3(2H)-one) on cytomegalovirus (CMV) infection in vitro, have been studied. 6-AZC inhibits the CMV cytopathic action, the effective dose of 6-AZC being 0.005 mg/ml. The analysis of cell viability, growth characteristics, and DNA synthesis has revealed that the cytotoxic effect of 6-AZC in human diploid fibroblasts is negligible. The cytotoxicity index range is 2.4 to 24 mg/ml when tested by different methods. The selectivity index of 6-AZC is 48-480, which differs negligibly from that of gancyclovir (100-1000), while the cytotoxicity of 6-AZC is essentially lower. The immunocytochemical analysis of virus proteins in the infected cells has shown that 6-AZC inhibits the production of late structural CMV protein gB, but does not influence the expression of early nonstructural protein pp72 and early protein p65. Вивчено вплив модифікованого нуклеозиду 6-азацитидину (6-АЗЦ) (2-β-0-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-он) на цитомегаловірусну інфекцію в культурі клітин. Показано, що 6-АЗЦ у низьких концентраціях ефективно пригнічує цитопатогенну дію цитомегаловірусу людини (ЦМВ). Ефективна доза сполуки, що пригнічувала розвиток ЦМВ на 50 %, складала 0,005 мг/мл. Отримані дані узгоджуються з припустимим механізмом дії 6-АЗЦ, що базується на пригніченні синтезу ДНК вірусу. Вивчення життєздатності клітин, їхніх ростових характеристик і синтезу ДНК показало, що 6-АЗЦ має низьку цитотоксичну дію. Індекс цитотоксичності препарату, за даними різних тестів, становив 2,4–24 мг/мл. За результатами розрахунку, індекс селективності для 6-АЗЦ знаходиться в межах 48–480 у лікувальній схемі та 240– 2400 – у профілактичній, що порівнянно з таким для ганцикловіру (100–1000). 1муноцитохімічний аналіз синтезу вірусних білків в інфікованих клітинах продемонстрував, що 6-АЗЦ пригнічує синтез пізнього структурного білка ЦМВ gB, який синтезується після реплікації вірусної ДНК. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Біомедицина Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе Inhibitory effect of 6-azacytidine on human cytomegalovirus infection in cellular system Пригнічуюча дія 6-азацитидину на цитомегаловірусну інфекцію людини в клітинній системі Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе |
| spellingShingle |
Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе Абдуллаева, М.В. Фролов, А.Ф. Алексеева, И.В. Пальчиковская, Л.И. Федорова, Н.Е. Біомедицина |
| title_short |
Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе |
| title_full |
Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе |
| title_fullStr |
Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе |
| title_full_unstemmed |
Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе |
| title_sort |
ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе |
| author |
Абдуллаева, М.В. Фролов, А.Ф. Алексеева, И.В. Пальчиковская, Л.И. Федорова, Н.Е. |
| author_facet |
Абдуллаева, М.В. Фролов, А.Ф. Алексеева, И.В. Пальчиковская, Л.И. Федорова, Н.Е. |
| topic |
Біомедицина |
| topic_facet |
Біомедицина |
| publishDate |
2004 |
| language |
Russian |
| container_title |
Біополімери і клітина |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Inhibitory effect of 6-azacytidine on human cytomegalovirus infection in cellular system Пригнічуюча дія 6-азацитидину на цитомегаловірусну інфекцію людини в клітинній системі |
| description |
Изучено влияние модифицированного нуклеозида 6-азацитидина (6-АЗЦ) (2-β-Э-рибофуранозил-5-амино-1,2,4-триазин-3(2Н)-он) на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной культуре. Показано, что 6-АЗЦ в низких концентрациях эффективно подавляет цитопатогенное действие цитомегаловируса (ЦМВ) человека. Эффективная доза соединения, ингибирующая развитие ЦМВ инфекции на 50 %, составляет 0,005 мг/мл. Изучение жизнеспособности клеток, их ростовых характеристик и синтеза клеточной ДНК показало, что 6-АЗЦ обладает низким цитотоксическим действием. Индекс цитотоксичности этого соединения, по данным разных тестов, варьирует от 2,4 до 24 мг/мл. Результаты подсчетов свидетельствуют о том, что индекс селективности для 6-АЗЦ находится в пределах 48–480 для лечебной схемы и 240–2400 – для профилактической, что сравнимо с таковым для ганцикловира (100–1000). Иммуноцитохимический анализ вирусных белков в зараженных клетках продемонстрировал, что 6-АЗЦ подавляет синтез позднего гликопротеина ЦМВ gB, продуцируемого после репликации вирусной ДНК.
Effects of a modified nucleoside analog 6-Azacytidine (2-b-D-ribofuranosyl-5-amino-1,2,4-triazin-3(2H)-one) on cytomegalovirus (CMV) infection in vitro, have been studied. 6-AZC inhibits the CMV cytopathic action, the effective dose of 6-AZC being 0.005 mg/ml. The analysis of cell viability, growth characteristics, and DNA synthesis has revealed that the cytotoxic effect of 6-AZC in human diploid fibroblasts is negligible. The cytotoxicity index range is 2.4 to 24 mg/ml when tested by different methods. The selectivity index of 6-AZC is 48-480, which differs negligibly from that of gancyclovir (100-1000), while the cytotoxicity of 6-AZC is essentially lower. The immunocytochemical analysis of virus proteins in the infected cells has shown that 6-AZC inhibits the production of late structural CMV protein gB, but does not influence the expression of early nonstructural protein pp72 and early protein p65.
Вивчено вплив модифікованого нуклеозиду 6-азацитидину (6-АЗЦ) (2-β-0-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-он) на цитомегаловірусну інфекцію в культурі клітин. Показано, що 6-АЗЦ у низьких концентраціях ефективно пригнічує цитопатогенну дію цитомегаловірусу людини (ЦМВ). Ефективна доза сполуки, що пригнічувала розвиток ЦМВ на 50 %, складала 0,005 мг/мл. Отримані дані узгоджуються з припустимим механізмом дії 6-АЗЦ, що базується на пригніченні синтезу ДНК вірусу. Вивчення життєздатності клітин, їхніх ростових характеристик і синтезу ДНК показало, що 6-АЗЦ має низьку цитотоксичну дію. Індекс цитотоксичності препарату, за даними різних тестів, становив 2,4–24 мг/мл. За результатами розрахунку, індекс селективності для 6-АЗЦ знаходиться в межах 48–480 у лікувальній схемі та 240– 2400 – у профілактичній, що порівнянно з таким для ганцикловіру (100–1000). 1муноцитохімічний аналіз синтезу вірусних білків в інфікованих клітинах продемонстрував, що 6-АЗЦ пригнічує синтез пізнього структурного білка ЦМВ gB, який синтезується після реплікації вірусної ДНК.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157990 |
| citation_txt |
Ингибирующее действие 6-азацитидина на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной системе / М.В. Абдуллаева, А.Ф. Фролов, И.В. Алексеева, Л.И. Пальчиковская , Н.Е. Федорова // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 4. — С. 337-342. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT abdullaevamv ingibiruûŝeedeistvie6azacitidinanacitomegalovirusnuûinfekciûčelovekavkletočnoisisteme AT frolovaf ingibiruûŝeedeistvie6azacitidinanacitomegalovirusnuûinfekciûčelovekavkletočnoisisteme AT alekseevaiv ingibiruûŝeedeistvie6azacitidinanacitomegalovirusnuûinfekciûčelovekavkletočnoisisteme AT palʹčikovskaâli ingibiruûŝeedeistvie6azacitidinanacitomegalovirusnuûinfekciûčelovekavkletočnoisisteme AT fedorovane ingibiruûŝeedeistvie6azacitidinanacitomegalovirusnuûinfekciûčelovekavkletočnoisisteme AT abdullaevamv inhibitoryeffectof6azacytidineonhumancytomegalovirusinfectionincellularsystem AT frolovaf inhibitoryeffectof6azacytidineonhumancytomegalovirusinfectionincellularsystem AT alekseevaiv inhibitoryeffectof6azacytidineonhumancytomegalovirusinfectionincellularsystem AT palʹčikovskaâli inhibitoryeffectof6azacytidineonhumancytomegalovirusinfectionincellularsystem AT fedorovane inhibitoryeffectof6azacytidineonhumancytomegalovirusinfectionincellularsystem AT abdullaevamv prigníčuûčadíâ6azacitidinunacitomegalovírusnuínfekcíûlûdinivklítinníisistemí AT frolovaf prigníčuûčadíâ6azacitidinunacitomegalovírusnuínfekcíûlûdinivklítinníisistemí AT alekseevaiv prigníčuûčadíâ6azacitidinunacitomegalovírusnuínfekcíûlûdinivklítinníisistemí AT palʹčikovskaâli prigníčuûčadíâ6azacitidinunacitomegalovírusnuínfekcíûlûdinivklítinníisistemí AT fedorovane prigníčuûčadíâ6azacitidinunacitomegalovírusnuínfekcíûlûdinivklítinníisistemí |
| first_indexed |
2025-11-26T23:49:41Z |
| last_indexed |
2025-11-26T23:49:41Z |
| _version_ |
1850783821830553600 |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2004. Т. 20. № 4
БІОМЕДИЦИНА
Ингибирующее действие 6-азацитидина на
цитомегаловирусную инфекцию человека
в клеточной системе
М. В. Абдуллаева, А, Ф. Фролов, И. В. Алексеева 1,
Л. И. Пальчиковская 1, Н. Е. Федорова 2
Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского АМН Украины
Ул. Амосова, 4, Киев, 03038 , Украина
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143 , Украина
2
Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН Р Ф
Ул. Гамалеи, 16, Москва, 123098, Российская Федерация
Изучено влияние модифицированного нуклеозида 6-азацитидина (6-АЗЦ) (2-р-Э-рибофуранозил-5-
амино-1,2,4-триазин-3(2Н)-он) на цитомегаловирусную инфекцию человека в клеточной культуре.
Показано, что 6-АЗЦ в низких концентрациях эффективно подавляет цитопатогенное действие
цитомегаловируса (ЦМВ) человека. Эффективная доза соединения, ингибирующая развитие ЦМВ
инфекции на 50 %, составляет 0,005 мг/мл. Изучение жизнеспособности клеток, их ростовых
характеристик и синтеза клеточной ДНК показало, что 6-АЗЦ обладает низким цитотоксиче-
ским действием. Индекс цитотоксичности этого соединения, по данным разных тестов,
варьирует от 2,4 до 24 мг/мл. Результаты подсчетов свидетельствуют о том, что индекс
селективности для 6-АЗЦ находится в пределах 48—480 для лечебной схемы и 240—2400 — для
профилактической, что сравнимо с таковым для ганцикловира (100—1000). Иммуноцитохимиче-
ский анализ вирусных белков в зараженных клетках продемонстрировал, что 6-АЗЦ подавляет
синтез позднего гликопротеина ЦМВ gB, продуцируемого после репликации вирусной ДНК.
Введение. Структурные аналоги природных пури-
новых и пиримидиновых нуклеозидов относятся к
числу мощных ингибиторов репродукции РНК и
ДНК геномных вирусов, непосредственно влияя на
общий метаболизм клетки и вируса [1—4]. Много
летнее изучение модифицированного нуклеозида
(6-АЗЦ) (2-/3-0-рибофуранозил-5-амино-1,2,4-три-
азин-3(2Н)-он) как антиаденовирусного препарата
показало, что механизм его действия состоит в
подавлении репликационного цикла и функцио
нальной активности ДНК. Суммарным эффектом
влияния 6-АЗЦ является угнетение синтеза струк
турных вирусных белков и вирусспецифических
полипептидов [5, 6 ].
6-АЗЦ в низких концентрациях ингибирует
© М В АБДУЛЛАЕВА, А Ф . Ф Р О Л О В , И В АЛЕКСЕЕВА,
Л. И П А Л Ь Ч И К О В С К А Я , Н Е. Ф Е Д О Р О В А , 2 0 0 4
репродукцию аденовирусов типов 1, 2 и 5, а-гер-
песвирусов, вирусов осповакцины и гриппа [4—6],
являясь малотоксичным соединением [10] с высо
ким химиотерапевтическим индексом.
Известно, что цитомегаловирусная инфекция
(ЦМВИ) имеет широкое распространение и играет
важную роль в инфекционной патологии человека.
Цитомегаловирус человека (ЦМВ) может вызывать
тяжелые заболевания взрослых, особенно при им-
мунодефицитных состояниях, а также поражать
детей раннего возраста и приводить к смерти плода
и новорожденных. ЦМВИ является также одной из
самых распространенных оппортунистических ин
фекций при СПИДе [11, 18—20]. Наиболее широ
ко используемыми в клинической практике препа
ратами для лечения ЦМВИ являются ганцикловир
и фоскарнет. Оба соединения обладают высокой
токсичностью и, кроме того, в процессе примене-
337
А Б Д У Л Л А Е В А М. В. И Д Р .
ния этих лекарственных средств отмечено быстрое
формирование вариантов ЦМВ с лекарственной
устойчивостью [11 —14]. Поэтому расширение
спектра веществ, обладающих анти-ЦМВ активно
стью, является актуальной проблемой медицины и
биологии.
Цель настоящего исследования состояла в изу
чении влияния 6-АЗЦ на развитие ЦМВ инфекции
в клеточной системе.
Материалы и методы. Нуклеозидный аналог.
Используемый в работе в качестве ингибитора
ЦМВ 6-азацитидин синтезирован в Институте мо
лекулярной биологии и генетики НАН Украины
[15, 16].
Клетки. Первичная культура диплоидных
фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ)
получена из банка клеточных культур Института
вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН РФ.
Клетки культивировали в среде ДМЕМ (ПанЭко,
РФ) с добавлением 5 % сыворотки эмбриона коро
вы («Ну Оопе», США) и 5 % пуповинной сыворот
ки человека (Пан Эко).
Вирус. В работе использовали референс-штамм
ЦМВ АД-169, любезно предоставленный проф.
Л. Перейрой (Медицинский Центр, Университет
Сан-Франциско, США).
Определение цитотоксичности 6-АЗЦ. Цито-
токсичность определяли по жизнеспособности кле
ток ФЛЭЧ, обработанных различными концентра
циями 6-АЗЦ. В течение 12 дней наблюдения
клетки ежедневно снимали смесью трипсина и
версена и окрашивали 0,4 %-м раствором трипано-
вого синего. Затем в камере Горяева подсчитывали
число нежизнеспособных (окрашенных) и жизне
способных (неокрашенных) клеток. Жизнеспособ
ность клеток выражали в процентах от общего
числа клеток в популяции.
Определение антипролиферативного дейст
вия. Влияние 6-АЗЦ на синтез ДНК в фибробла-
стах человека анализировали по включению радио
активно меченного тимидина ( 3Н-ТД) методом ра
диоавтографии. Для этого клетки ФЛЭЧ в низкой
концентрации (6-Ю 4 клеток/мл) высаживали на
покровные стекла, помещенные в лунки 24-луноч
ных панелей. На следующий день вносили 6-АЗЦ
в различных концентрациях. Через 1, 2 и 3 сут
инкубации в культуральную среду добавляли 3 Н-
ТД на 1 ч в концентрации 5 мкКи/мл. После
отмывки клетки фиксировали смесью спирта и
концентрированной уксусной кислоты в соотноше
нии 3:1. Затем препараты обрабатывали 5 %-м
раствором трихлоруксусной кислоты 3 раза по
5 мин, промывали дистиллированной водой и по
крывали радиоавтографической эмульсией типа М
(НИИ ХимФотоПроект, РФ). Через 3 дня препара
ты проявляли, окрашивали гематоксилином («Sha-
ndon», США) и подсчитывали число клеток, содер
жащих меченые и немеченые ядра.
О действии 6-АЗЦ на рост клеток судили по
изменению их количества на цитологическом пре
парате через 3 сут культивирования в присутствии
различных концентраций 6-АЗЦ. Для этого под
считывали количество клеток на 1 мм 2 покровного
стекла в контроле и опыте [11 ].
Определение антивирусной активности 6-
АЗЦ. Для определения анти-ЦМВ активности ис
пользовали три схемы: лечебную, профилактиче
скую и вирулицидную.
Лечебная схема. Монослой клеток заражали
вирусом с различной множественностью инфициро
вания (МИ)—от 1,0 до 0,0001 БОЕ/кл. После
адсорбции вируса (1 ч, 37 °С) клетки дважды
промывали, вносили среду поддержки, содержащую
2 % сыворотки и 6-АЗЦ в различных концентра
циях.
Профилактическая схема. На клеточный мо
нослой наносили среду поддержки с различными
концентрациями 6-АЗЦ и инкубировали в термо
стате в течение 24 ч. После этого монослой клеток
дважды промывали и заражали вирусом с различ
ной МИ —от 1,0 до 0,0001 БОЕ/кл (1 ч, 37 °С),
затем клетки снова дважды промывали и вносили
среду поддержки.
Вирулицидная схема. Вирус с различной МИ —
от 1,0 до 0,0001 БОЕ/кл — инкубировали совмест
но с различными концентрациями 6-АЗЦ в течение
1 ч при температуре 37 °С. Далее наносили на
монослой клеток и выдерживали в течение 1 ч.
Монослой клеток дважды промывали и вносили
среду поддержки.
Антивирусную активность оценивали по цито-
патогенному действию вируса (ЦПД) и способно
сти ЦМВ к бляшкообразованию. Химиотерапевти-
ческий индекс (ХТИ), или индекс селективности
(ИС), рассчитывали как отношение концентрации
препарата, вызывающей клеточную деструкцию
(ЦД 5 0) или снижающей синтез клеточной ДНК на
50 % (ИПД 5 0 ) , к концентрации 6-АЗЦ, приводя
щей к 50 %-му ингибирующему действию (ИД 5 0).
Определение продукции инфекционно активно
го вируса. Для анализа действия 6-АЗЦ на продук
цию инфекционно активного вируса отбирали
культуральную среду на 5-е сут после инкубации
клеток, зараженных в присутствии препарата. Ото
бранной вируссодержащей жидкостью заражали
неинфицированные клетки ФЛЭЧ. Урожай актив
ного вируса оценивали по бляшкообразующей спо
собности.
338
И Н Г И Б И Р У Ю Ш В Б Д Е Й С Т В И Е 6 - А З А Ц И Т И Д И Н А НА ЦМВ И Н Ф Е К Ц И Ю
Рис. 1. Цитотоксическое действие соединения 6-АЗЦ на жизне
способность диплоидных клеток человека: 1— 1-е сут; 2 —
3-й сут; 3 — 7-е сут
Выявление вирусспецифических белков. Сверх
ранний рр72, ранний р65 и поздний структурный
gB белки ЦМВ определяли в инфицированных
клетках ФЛЭЧ методом иммуноцитохимического
окрашивания. Для этого монослой клеток промыва
ли 0,1 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН
7,4) и фиксировали абсолютным метанолом в тече
ние 10 мин при температуре ~20 °С На промытые
препараты наносили очищенные моноклональные
антитела (МКА), полученные в лаборатории кле
точной инженерии Института вирусологии им.
Д. И. Ивановского АМН РФ [18], инкубировали в
течение 1 ч при 37 °С, идентифицировали, исполь
зуя поликлональные кроличьи анти-мышиные им
муноглобулины, конъюгированные с пероксидазой
хрена («Dako Cytomation», Дания). Реакцию про
являли диаминобензидином (ДАБ) («Biosciences»,
США). Препараты просматривали с помощью мик
роскопа Leitz, (объективы: х20, х40, *100).
Результаты и обсуждение. В первой серии
опытов изучали цитотоксичность 6-АЗЦ в культуре
ФЛЭЧ с помощью теста исключения витального
красителя. Для этого клетки культивировали в
среде, содержащей 6-АЗЦ в концентрациях 0,1 —
30 мг/мл. Полученные результаты представлены
на рис. 1. Присутствие ингибитора в концентрации
30 мг/мл вызывало 100 %-ю гибель клеток на
третьи сутки культивирования, в концентрации
26 мг/мл — 70 % -ю, а концентрации 20 мг/ мл —
20 %-ю гибель клеток. 6-АЗЦ в концентрации
10 мг/мл оказывал незначительное цитотоксиче
ское действие — количество клеток с поврежденной
мембраной не превышало 5 %. 6-АЗЦ в концент
рациях от 5 до 0,1 мг/мл не влиял на жизнеспособ
ность клеток в течение 3 сут культивирования.
100 %-я жизнеспособность клеток сохранялась в
течение 7 сут в присутствии 6-АЗЦ в концентра
ции 2 мг/мл, и в течение 12 сут — при концентра
циях вещества 0,5—0,1 мг/мл. Расчеты, сделанные
по графику (рис. 1), показали, что 50 %-я гибель
клеток (ЦД 5 0) на 3-й сут наблюдалась при концен
трации 6-АЗЦ 24 мг/мл. Таким образом, 6-АЗЦ
оказывал незначительное цитотоксическое дейст
вие на фибробласты человека, ЦД 5 0 составляла
24 мг/мл.
Результаты действия 6-АЗЦ на пролифератив-
ную активность клеток ФЛЕЧ представлены на
рис. 2. Подсчет количества клеток, содержащих
3Н-ТД-метку, показал, что в культуре, не обрабо
танной веществом, через 1 сут после посева около
30 % клеток находилось в стадии синтеза ДНК. В
процесе культивирования количество меченых кле
ток в контрольной культуре постепенно снижалось
и через 3 сут составляло 12 %. Эти данные хорошо
согласуются с результатами, полученными другими
авторами [17]. В культуре, обработанной 6-АЗЦ в
концентрациях от 12 до 0,24 мг/мл, количество
клеток, содержащих 3Н-ТД-метку, через 24 ч не
значительно отличалось от контроля. Спустя 72 ч
количество клеток, синтезирующих ДНК, снизи
лось относительно контрольной популяции на 50 %
при концентрации 6-АЗЦ 2,4 мг/мл и практически
на 100 % — при его концентрации 24 мг/мл.
Ростовую активность клеток в контрольных и
опытных культурах определяли по приросту коли
чества клеток на единицу площади. Через 3 сут
культивирования происходило уменьшение количе
ства клеток на 50 % относительно контрольной
популяции при концентрации 6-АЗЦ 2,4 мг/мл.
Таким образом, концентрация препарата, вы
зывающая 50 %-е подавление синтеза ДНК и
50 %-е ингибирование прироста клеток, составля
ла 2,4 мг/мл, что на порядок ниже концентрации,
влияющей на их жизнеспособность (24 мг/мл). Эти
данные свидетельствуют о том, что клетки, прекра
тившие синтез ДНК, остаются жизнеспособными и
при более высокой концентрации препарата.
- 100
Ї
339
АБДУЛЛАЕВА М. В. И Д Р .
Рис. 3. Анти-ЦМВ активность 6-АЗЦ в лечебной (а) и профилактической (б) схемах: У — множественность инфицирования
0,001 БОЕ/кл; 2 — 0,0001 БОЕ/кл
Следующая серия экспериментов была направ
лена на исследование антивирусной активности
6-АЗЦ. Результаты опытов показали, что в лечеб
ной схеме использование препарата в концентра
циях от 0,5 до 3 мг/мл приводило к 100 %-му
подавлению развития ЦПД вируса при МИ 0,001 и
0,0001 БОЕ/кл. Как следует из рис. 3, а, 50 %-я
ингибирующая доза при МИ 0,001 БОЕ/кл состав
ляла 0Л мг/мл, а при МИ 0,0001 БОЕ/кл —
0,05 мг/мл.
Влияние 6-АЗЦ на развитие вирусного ЦПД в
профилактической схеме исследовали при МИ
ЦМВ 0,001 и 0,0001 БОЕ/кл. При МИ 0,0001
БОЕ/кл присутствие 6-АЗЦ в концентрациях 0,01
и 0,1 мг/мл приводило к подавлению вирусспеци-
фического ЦПД на 70 %. При использовании
6-АЗЦ в концентрации 1 мг/мл — на 90 %. При
более высокой МИ (0,001 БОЕ/кл) наблюдалось
менее выраженное анти-ЦМВ действие соединения.
Так, 6-АЗЦ в концентрации 0,01 мг/мл ингибиро-
вал способность вируса к бляшкообразованию на
13 %, в концентрациях 0,1 и 1 мг/мл — на 30 и
33 % соответственно (рис 3, б).
Таким образом, в профилактической схеме
ингибирующая доза 6-АЗЦ, при которой наблюда
лось 70 %-е подавление ЦПД ЦМВ, составляла
0,01 мг/мл.
При изучении вирулицидного действия 6-АЗЦ
использовали вирус с МИ 0,001 БОЕ/кл и препарат
в концентрациях 0,1 и 1 мг/мл. В концентрации
1 мг/мл соединение подавляло ЦПД вируса на
70 %, а в концентрации 0,1 мг/мл — на 10 %.
Таким образом, ИД 7 и в данной схеме соответство
вал 1 мг/мл.
В дальнейшем было изучено действие 6-АЗЦ
на продукцию инфекционно активного вируса.
Исследование вируссодержащей культуральной
среды после культивирования клеток, зараженных
ЦМВ с МИ 0,001 БОЕ/кл, позволило установить,
что 6-АЗЦ при концентрации 3 мг/мл вызывал
55 %-е подавление репродукции вируса относи
тельно контроля и на 40 % снижал продукцию
инфекционно активного вируса при концентрации
1 мг/мл.
Анализ результатов позволяет сделать вывод о
том, что 6-АЗЦ достоверно подавляет репродукцию
ЦМВ.
Как отмечалось ранее, ингибирующее действие
6-АЗЦ связано со снижением уровня синтеза ви
русных белков [5, 6 ]. Опосредованное влияние
6-АЗЦ на синтез вирусных белков в наших иссле
дованиях анализировали в трех схемах: лечебной,
профилактической и вирулицидной. В каждой схе
ме определяли число клеток в контрольных и
опытных культурах, содержащих сверхранний
(рр72), ранний (р65) и поздний (gB) белки. В
качестве препарата сравнения использовали ган-
цикловир, механизм анти-ЦМВ действия которого
описан ранее [12—14]. Накопление вирусных бел
ков в инфицированных клетках изучали методом
иммуноцитохимического окрашивания после внесе
ния вируса с МИ 0,001 БОЕ/кл. 6-АЗЦ использо
вали в концентрациях 0,1 и 1 мг/мл. Анализ
сверхранних и ранних вирусных белков в конт
рольных и опытных клетках проводили в течение
3 сут развития инфекции. Через 1 сут в контроль
ной культуре количество клеток, содержащих рр72,
составляло 7 %, а клеток, синтезирующих белок
р65, — 5 %. На 2-е сут количество клеток, содер
жащих эти белки, возрастало и составляло 16 и
8 % и на 3-й сут — 50 и около 17 % популяции
соответственно. В присутствии препарата 6-АЗЦ
340
И Н Г И Б И Р У Ю Щ Е Е Д Е Й С Т В И Е 6 - А З А Ц И Т И Д И Н А НА ЦМВ И Н Ф Е К Ц И Ю
Рис. 4. Влияние 6-АЗЦ на экспрессию позднего белка gB в
клетках фибробластов легкого эмбриона человека, зараженных
цитометаловирусом (ЦМВ): 1 — ЦМВ инфицированные клетки;
2 — то же в присутствии 0,006 мг/мл ганцикловира; 3 , 4 — в
присутствии 1 и 3 мг/мл 6-АЗЦ соответственно
количество ЦМВ инфицированных клеток, содер
жащих белки рр72 и р65, практически не отлича
лось как от контрольной популяции клеток (без
внесения веществ), так и от культуры, обработан
ной ганцикловиром. Схожие результаты получены
при анализе синтеза вирусных белков для всех
трех схем исследования антивирусной активности
6-АЗЦ.
Поздний гликопротеин gB был зарегистрирован
в 2,5 % клеток в контрольной культуре через 3 сут
после заражения. В то время как в клетках, обра
ботанных 6-АЗС в концентрациях 1 и 3 мг/мл,
вирусный белок gB присутствовал только в 1 и
0,5 % клеток соответственно (рис. 4). На 5-е сут
после заражения количество клеток, синтезирую
щих гликопротеин gB, было значительно меньшим
в опытных, чем в контрольной популяциях. Уста
новлено, что 6-АЗЦ и ганцикловир снижают на
копление позднего вирусного гликопротеина gB
приблизительно в одинаковой мере — более чем в
10 раз.
Суммируя полученные данные, можно сделать
вывод о том, что 6-АЗЦ обладает избирательной
способностью подавлять ЦПД ЦМВ в культуре
клеток. 50 %-е подавление ЦПД ЦМВ наблюдает
ся при концентрации 6-АЗЦ 0,05 мг/мл (ИД 5 0 ). В
то время как цитотоксическое действие препарата
(ЦД 5 0 ), оцениваемое по различным тестам (влия
ние на количество жизнеспособных клеток, на
синтез ДНК, на прирост клеток), изменяется от 2,4
до 24 мг/мл. Индекс селективности, определяемый
как отношение ЦД 5 и к ИД 5 0 , находится в пределах
48—480 для лечебной схемы и 240—2400 — для
профилактической, что сравнимо с индексом селек
тивности ганцикловира [12]. Но следует отметить,
что концентрация 6-АЗЦ, приводящая к 50 %-му
цитотоксическому эффекту, примерно в 24 раза
больше таковой для ганцикловира, что может сви
детельствовать о низком цитотоксическом действии
6-АЗЦ.
Таким образом, показан значительный эффект
подавления 6-АЗЦ ЦМВИ человека в культуре
клеток, не уступающий по эффективности извест
ному и широко используемому в клинической
практике препарату — ганцикловиру. 6-АЗЦ явля
ется перспективным соединением для дальнейшего
изучения в качестве противовирусного препарата
при ЦМВИ.
М. V. Abdullaeva, A. F. Frolov, I. V. Alexeeva,
L. 1. Palchykovskaja, N. E. Fedorova
Inhibitory effect of 6-azacytidine on human cytomegalovirus infection
in cellular system
Summary
Effects of a modified nucleoside analog 6-Azacytidine (2-f$-D-
ribofuranosy 1-5-amino-1,2,4-triazin-3(2H)-one) on cytomegalovirus
(CMV) infection in vitro, have been studied. 6-AZC inhibits the
CMV cytopathic action, the effective dose of 6-AZC being 0.005
mg/ml. The analysis of cell viability, growth characteristics, and
DNA synthesis has revealed that the cytotoxic effect of 6-AZC in
human diploid fibroblasts is negligible. The cytotoxicity index range
is 2.4 to 24 mg/ml when tested by different methods. The selectivity
index of 6-AZC is 48—480, which differs negligibly from that of
gancyclovir (100—1000), while the cytotoxicity of 6-AZC is essen
tially lower. The immunocytochemical analysis of virus proteins in
the infected cells has shown that 6-AZC inhibits the production of
late structural CMV protein gB, but does not influence the
expression of early nonstructural protein pp72 and early protein
p65.
M. В. Абдуллаєва, А. Ф. Фролов, 1. В. Алексеева,
Л. F. Пальчиківська, Н. Є. Федорова
Пригнічуюча дія 6-азацитидину на цитомегаловірусну інфекцію
людини в клітинній системі
Резюме
Вивчено вплив модифікованого нуклеозиду 6-азацитидину (6-
АЗЦ) (2-р-0-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-он)
на цитомегаловірусну інфекцію в культурі клітин. Показано,
що 6-АЗЦ у низьких концентраціях ефективно пригнічує цито-
патогенну дію цитомегаловірусу людини (ЦМВ). Ефективна
доза сполуки, що пригнічувала розвиток ЦМВ на 50 %,
складала 0,005 мг/мл. Отримані дані узгоджуються з припу
стимим механізмом дії 6-АЗЦ, що базується на пригніченні
синтезу ДНК вірусу. Вивчення життєздатності клітин, їхніх
ростових характеристик і синтезу ДНК показало, що 6-АЗЦ
має низьку цитотоксичну дію. Індекс цитотоксичності препа
рату, за даними різних тестів, становив 2,4—24 мг/мл. За
результатами розрахунку, індекс селективності для 6-АЗЦ
знаходиться в межах 48—480 у лікувальній схемі та 240—
2400 — у профілактичній, що порівнянно з таким для ганцик-
ловіру (100—1000). 1муноцитохімічний аналіз синтезу ві
русних білків в інфікованих клітинах продемонстрував, що
6-АЗЦ пригнічує синтез пізнього структурного білка ЦМВ gB,
який синтезується після реплікації вірусної ДНК.
341
АБДУЛЛАЕВА М. В. И Д Р .
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. De Clercq Е. Targets for the antiviral activity of pyrimidine
and purine nucleoside analogues / / Nucleosides and Nuc
leotides.—1987.—6, N 1—2.—P. 197—207.
2. Краевский А. А. Молекулярные основы поиска препаратов
для лечения СПИДа. Достижения и вероятные перс
пективы / / Молекуляр. биология.—1999.—33, № 3 . —
С. 343—352 .
3. Cheng У.-С. L-Nucleoside analogues against cancer-causing
viruses have potential in the prevention delayed onset and
treatment of viral associated cancers / / Antiviral Chem. and
Chemother.—2001.—12 (Suppl. 1 ) .—P. 5 — 1 1 .
4. Бектемиров Т. А., Линицкая Г. А., Чернецкий В. Я . ,
Галегов Г. А. Ингибирующее действие 6-азацитидина на
репродукцию вируса осповакцины в культуре ткани / /
Вопр. мед. химии.—1974 .—20 , № 3 .—С. 5 0 — 5 2 .
5. Носач Л. М., Бутенко С. И., Тимофеева М. Я., Дяченко
Я. С , Тихомирова Т. Я , Алексеева И. В., Чернецкий В. 77.
Анализ ДНК, синтезируемой в инфицированных адено
вирусом клетках, при воздействии аналогов нуклеозидов / /
Микробиол. ж у р н . — 1 9 8 9 . — 5 1 , № 6.—С. 73—75.
6. Носач Л. М., Дяченко Н. С, Шаламай А. С, Алексеева И.
Я , Куиіко Л. Я., Озвинчук И. И., Жовноватая В. Л.,
Бутенко С. И., Петровская И. А., Дранник Г. Н. Анти
аденовирусное и иммуностимулирующее действие 6-аза
цитидина / / Биополимеры и клетка.—1996.—12, № 1.—
С. 75—85.
7. Фролов А. Ф., Радолицкая Л. С , Чернецкий В. Я . Д е й
ствие аномальных нуклеозидов на экспериментальную
гриппозную инфекцию белых мышей / / Вирусы и вирус,
заболевания: Респ. сб.—Киев, 1986.—Вып. 14.—С. 3—6.
8. Dyachenko N., Rybalko S., Nosach L., Alexeeva I., Shalamay
A. Antiadenovirus and anti-herpes activity of 6-azacytidine / /
1 2 t h Int. Conf. on Antiviral Res. Int. Soc. for Antiviral Res.
(March 21—25 , 1999).—Jerusalem, 1999.—P. 87.
9. Старчеус А. Я . , Чернецкий В. Я . Вплив 6-азауридину,
6-азацитидину та 8-азагуаніну на репродукцію аденовірусу
4-го типу в культурі тканини / / Мікробіол. журн. —1967 .—
29, № 2 — С. 157—160.
10. Петруиш Н. А. Некоторые токсико-фармакологические
свойства 6-азацитидина / / Фармакология и токсиколо
гия.—1987.—№ 2.—С. 75—76.
11. Федорова Н. Е., Адуева С. М., Меджидова А. А., Романова
В. С, Парнес 3. С , Галегов Г. А., Куш, А. А. Подавление
цитомегаловирусной инфекции в клеточной системе ами
нокислотными производными фулерена / / Вопр. виру
сологии.—2002.—№ 1.—С. 30—34 .
12. Clyde S., Crumpacker М. D. Ganciclovir / / New England J.
Med.—1996.—335, N 10.—P. 721—729 .
13. Erice Л. Resistance of human cytomegalovirus to antiviral
drugs / / Clin. Microbiol. Rev .—1999 .—12.—P. 286.
14. Mar E. C , Chenng Y. C , Huang E. S. Effect of 9 (1 ,3 -
dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine on human cytomegalo
virus replication in vitro II Antimicrob. Agents Chemother.—
1983 .—24.—P. 5 1 8 — 5 2 1 .
15. Alexeeva I., Dyachenko N., Nosach L., Zhovnovataya K,
Rybalko S., Lozitskaya R., Fedchuk A., Lozitsky V., Gridina
Т., Shalamay A., Palchikovskaja L., Povnitsa O. 6-Azacy-
tidine-compound with wide spectrum of antiviral activity / /
Nucleosides, Nucleotides and Nucl. Acids .—2001.—20, N 4—
7.—P. 1147—1152 .
16. Самійленко С. Я. , Алексеева I. В., Пальчиківська Л. Г.,
Кондратюк 7. В., Степанюгін А. В., Шаламай А. С ,
Говорун Д. М. Структурні особливості 6-азацитидину та
його похідних: дані ПМР та 14 спектроскопії / / Био
полимеры и клетка.—1997.—13, № 6.—С. 445—452.
17. Епифанова О. И. Лекции о клеточном цикле.—M., 1997.—
144 с.
18. Макарова Я. Е., Кущ А. А., Иванова Л. А. Получение
моноклональных антител к сверхранним белкам цитоме-
галовируса человека и их применение для выявления
инфицированных клеток / / Вопр. вирусологии.—1996.—
№ 1.—С. 28—32 .
19. Snoeck R., Neyts J., De Clerq E. Strategies for the treatment
of cytomegalovirus infection / / Multidisciplinary approach to
understanding cytomegalovirus disease / Eds S. Michelson, S.
A. Plotkin.—Amsterdam, 1993.—P. 269—278 .
20. Webster A. Cytomegalovirus as possible cofactor in HIV disease
progression / / J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retro-
virol .—1991.—4.—P. 47—52.
УДК 578.835.12:615.281
Надійшла до редакції 26.03.03
342
|