Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів

Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів

Досліджено вплив генетичних особливостей штамів В. subtilis на динаміку біосинтезу по­ заклітинних лектинів. Спектри позаклітинних білків усіх досліджених штамів містили дев'ять основних компонентів, але в різних кількісних співвідношеннях. На момент максимальної лектинової активності в культур...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :Біополімери і клітина
Дата:2004
Автори: Карпова, І.С., Коваленко, Е.О., Корецька, Н.В., Гетьман, К.І.
Формат: Стаття
Мова:Russian
Опубліковано: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2004
Теми:
Структура та функції біополімерів
Онлайн доступ:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157992
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів / І.С. Карпова, Е.О. Коваленко, Н.В. Корецька, К.І. Гетьман // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 4. — С. 290-294. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-157992
record_format dspace
spelling Карпова, І.С.
Коваленко, Е.О.
Корецька, Н.В.
Гетьман, К.І.
2019-06-22T10:55:53Z
2019-06-22T10:55:53Z
2004
Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів / І.С. Карпова, Е.О. Коваленко, Н.В. Корецька, К.І. Гетьман // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 4. — С. 290-294. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.
0233-7657
DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0006B1
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157992
547.9 6
Досліджено вплив генетичних особливостей штамів В. subtilis на динаміку біосинтезу по­ заклітинних лектинів. Спектри позаклітинних білків усіх досліджених штамів містили дев'ять основних компонентів, але в різних кількісних співвідношеннях. На момент максимальної лектинової активності в культуральному середовищі штаму дикого типу переважають низькомо­лекулярні білки з молекулярною масою (м. м.) від 23 до 10 кДа, а у мутантів — більш інтенсивно виражені білки з м. м. 70,4—59,0 кДа, шр може свідчити про утворення агрегатів. Показано, що мутаційні порушення метаболізму амінокислот і структури білка, який бере участь у реплікативних та репаративних процесах, призводять до міжштамових відмінностей у продукуванні і вивільненні позаклітинних лектинів.
The influence of genotype of B. subtilis strains on the dynamics of extracellular lectins biosynthesis was studied. The spectrum of extracellular proteins presented in all strains under study contains nine main components though in different proportion. The maximum of lectin activity in the culture liquid of the wild type strain coincides with predominance of low molecular weigt proteins about 23 to 10 kDa, while in mutant strains the most intensively expressed proteins have molecular weigt of 70.4-59.0 kDa, that may be due to the aggregate formation. It was shown that mutational changes in the aminoacid pathways as well as changes in the structure of protein participating in replication and reparation resulted in strain differencies in the production and release of lectins.
Исследовано влияние генетических особенностей штаммов В. subtilis на динамику биосинтеза внеклеточных лектинов. Спек­тры внеклеточных белков всех исследуемых штаммов содержали девять основных компонентов, но в разных количественных соотношениях. К моменту достижения максимальной лектиновой активности в кулыпуральной среде штамма дико­го типа преобладают низкомолекулярные белки от 23 до 10 кДа, а у мутантов — более интенсивно выражены белки с молекулярной массой 70,4—59,0 кДа, что может свидетель­ствовать о формировании агрегатов. Показано, что мутаци­онные нарушения метаболизма аминокислот, а также струк­туры белка, участвующего в репликативных и регшративных процессах, приводят к междуштаммовым различиям в проду­цировании и высвобождении внеклеточных лектинов.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Біополімери і клітина
Структура та функції біополімерів
Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів
Extracellular lectins of saprophytyc bacteria Bacillus subtilis and it's mutants
Внеклеточные лектины сапрофитной бактерии Bacillus subtilis и е е мутантов
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів
spellingShingle Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів
Карпова, І.С.
Коваленко, Е.О.
Корецька, Н.В.
Гетьман, К.І.
Структура та функції біополімерів
title_short Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів
title_full Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів
title_fullStr Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів
title_full_unstemmed Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів
title_sort позаклітинні лектини сапрофітної бактерії bacillus subtilis та її мутантів
author Карпова, І.С.
Коваленко, Е.О.
Корецька, Н.В.
Гетьман, К.І.
author_facet Карпова, І.С.
Коваленко, Е.О.
Корецька, Н.В.
Гетьман, К.І.
topic Структура та функції біополімерів
topic_facet Структура та функції біополімерів
publishDate 2004
language Russian
container_title Біополімери і клітина
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Extracellular lectins of saprophytyc bacteria Bacillus subtilis and it's mutants
Внеклеточные лектины сапрофитной бактерии Bacillus subtilis и е е мутантов
description Досліджено вплив генетичних особливостей штамів В. subtilis на динаміку біосинтезу по­ заклітинних лектинів. Спектри позаклітинних білків усіх досліджених штамів містили дев'ять основних компонентів, але в різних кількісних співвідношеннях. На момент максимальної лектинової активності в культуральному середовищі штаму дикого типу переважають низькомо­лекулярні білки з молекулярною масою (м. м.) від 23 до 10 кДа, а у мутантів — більш інтенсивно виражені білки з м. м. 70,4—59,0 кДа, шр може свідчити про утворення агрегатів. Показано, що мутаційні порушення метаболізму амінокислот і структури білка, який бере участь у реплікативних та репаративних процесах, призводять до міжштамових відмінностей у продукуванні і вивільненні позаклітинних лектинів. The influence of genotype of B. subtilis strains on the dynamics of extracellular lectins biosynthesis was studied. The spectrum of extracellular proteins presented in all strains under study contains nine main components though in different proportion. The maximum of lectin activity in the culture liquid of the wild type strain coincides with predominance of low molecular weigt proteins about 23 to 10 kDa, while in mutant strains the most intensively expressed proteins have molecular weigt of 70.4-59.0 kDa, that may be due to the aggregate formation. It was shown that mutational changes in the aminoacid pathways as well as changes in the structure of protein participating in replication and reparation resulted in strain differencies in the production and release of lectins. Исследовано влияние генетических особенностей штаммов В. subtilis на динамику биосинтеза внеклеточных лектинов. Спек­тры внеклеточных белков всех исследуемых штаммов содержали девять основных компонентов, но в разных количественных соотношениях. К моменту достижения максимальной лектиновой активности в кулыпуральной среде штамма дико­го типа преобладают низкомолекулярные белки от 23 до 10 кДа, а у мутантов — более интенсивно выражены белки с молекулярной массой 70,4—59,0 кДа, что может свидетель­ствовать о формировании агрегатов. Показано, что мутаци­онные нарушения метаболизма аминокислот, а также струк­туры белка, участвующего в репликативных и регшративных процессах, приводят к междуштаммовым различиям в проду­цировании и высвобождении внеклеточных лектинов.
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/157992
citation_txt Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів / І.С. Карпова, Е.О. Коваленко, Н.В. Корецька, К.І. Гетьман // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 4. — С. 290-294. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT karpovaís pozaklítinnílektinisaprofítnoíbakterííbacillussubtilistaíímutantív
AT kovalenkoeo pozaklítinnílektinisaprofítnoíbakterííbacillussubtilistaíímutantív
AT korecʹkanv pozaklítinnílektinisaprofítnoíbakterííbacillussubtilistaíímutantív
AT getʹmankí pozaklítinnílektinisaprofítnoíbakterííbacillussubtilistaíímutantív
AT karpovaís extracellularlectinsofsaprophytycbacteriabacillussubtilisanditsmutants
AT kovalenkoeo extracellularlectinsofsaprophytycbacteriabacillussubtilisanditsmutants
AT korecʹkanv extracellularlectinsofsaprophytycbacteriabacillussubtilisanditsmutants
AT getʹmankí extracellularlectinsofsaprophytycbacteriabacillussubtilisanditsmutants
AT karpovaís vnekletočnyelektinysaprofitnoibakteriibacillussubtilisieemutantov
AT kovalenkoeo vnekletočnyelektinysaprofitnoibakteriibacillussubtilisieemutantov
AT korecʹkanv vnekletočnyelektinysaprofitnoibakteriibacillussubtilisieemutantov
AT getʹmankí vnekletočnyelektinysaprofitnoibakteriibacillussubtilisieemutantov
first_indexed 2025-11-24T02:44:18Z
last_indexed 2025-11-24T02:44:18Z
_version_ 1850838592644972544
fulltext I S S N 0 2 3 3 - 7 6 5 7 . Б і о п о л і м е р и і к л і т и н а . 2 0 0 4 . Т . 2 0 . № 4 СТРУКТУРА І ФУНКЦІЇ БІОПОЛІМЕРІВ Позаклітинні лектини сапрофітної бактерії Bacillus subtilis та її мутантів І. С. Карпова, Е. О. Коваленко 1, Н. В. Корецька, К. І. Гетьман1 І н с т и т у т м о л е к у л я р н о ї б іолог і ї і г е н е т и к и Н А Н У к р а ї н и В у л . А к а д е м і к а З а б о л о т н о г о , 1 5 0 , К и ї в , 0 3 1 4 3 , У к р а ї н а І н с т и т у т м ікроб іолог і ї і в і р у с о л о г і ї ім . Д . К . З а б о л о т н о г о Н А Н У к р а ї н и В у л . А к а д е м і к а З а б о л о т н о г о , 1 5 4 , К и ї в , 0 3 1 4 3 , У к р а ї н а Досліджено вплив генетичних особливостей штамів В. subtilis на динаміку біосинтезу по­ заклітинних лектинів. Спектри позаклітинних білків усіх досліджених штамів містили дев'ять основних компонентів, але в різних кількісних співвідношеннях. На момент максимальної лектинової активності в культуральному середовищі штаму дикого типу переважають низькомо­ лекулярні білки з молекулярною масою (м. м.) від 23 до 10 кДа, а у мутантів — більш інтенсивно виражені білки з м. м. 70,4—59,0 кДа, шр може свідчити про утворення агрегатів. Показано, що мутаційні порушення метаболізму амінокислот і структури білка, який бере участь у реплі- кативних та репаративних процесах, призводять до міжштамових відмінностей у продукуванні і вивільненні позаклітинних лектинів. Вступ. Лектини складають особливий клас нефер- ментних білків неімунної природи, мікробного, рос­ линного або тваринного походження, здатних до специфічного розпізнавання та нековалентного зв 'язування цукрів, а також вуглеводних залишків у складі субклітинних структур, зокрема, поверх­ невих рецепторів клітинних мембран [1 , 2 ] . В усіх живих організмів біологічні реакції за участі лек­ тинів поділяються на два типи: перший — безпосе­ редня взаємодія з відповідними вуглеводними за­ лишками, котра призводить до реакції аглютинації, адгезії або преципітації; другий — опосередкований сигнальний вплив, який індукує складний ланцюг метаболічних перетворень (регуляція поділу клі­ тин, міграція лейкоцитів, секреція цитокінів моно- нуклеарами, апоптоз тощо) [1—4] . Інтерес до лектинів базується на широкому спектрі їхньої дії. Традиційним є використання лектинів як молекулярних зондів при вивченні структури і функціонування мембран найрізно­ манітніших клітин у нормі та при патологічних станах. © І С КАРПОВА, Е О К О В А Л Е Н К О , Н. В К О Р Е Ц Ь К А , К. І. ГЕТЬМАН, 2 0 0 4 Останнім часом лектини досліджуються як фармакологічно активні реагенти з діагностични­ ми, антивірусними, імуномодулюючими та проти­ пухлинними властивостями [5, 6 ]. Перспективни­ ми у цьому відношенні є нещодавно відкриті лек­ тини сапрофітних бацил , д л я яких показано направлену дію на імунну відповідь макроорга­ нізму та на індукцію гама-інтерферону [2, 7 ]. Технологічною перевагою даної групи мікроорга­ нізмів є здатність синтезувати позаклітинні лекти­ ни з високим виходом у культуральне середовище. Серед них добре досліджені екзолектини В. subtilis spp., які розподіляються на дві групи за молекуляр­ ною масою та вуглеводною специфічністю. Першу групу складають білки з молекулярною масою (м. м.) 19—26 кДа та спорідненістю до обох типів сіалових і уронових кислот та фруктозо-1,6-дифос- фату. До другої групи належать низькомолекулярні лектини (м. м. яких 7,7—10,0 кДа) з більш вузь­ кою вуглеводною специфічністю, а саме: до N-аце - тилнейрамінової та D-глюкуронової кислот. Обидва типи лектинів є глікополімерами, здатними утво­ рювати агрегати з м. м. 77—260 кДа [7 ]. Раніше було визначено, що біосинтез лектинів бактеріями В. subtilis залежить як від зовнішніх 290 ПОЗАКЛІТИННІ Л Е К Т И Н И БАКТЕРІЇ BACILLUS SUBTILIS факторів (температура, рН, склад середовища, особливо від джерела вуглецю), так і від особливо­ стей штаму. Певні вуглеводи могли індукувати синтез лектинів у одних штамів і блокувати — у інших. Проте пошук генів, які контролюють біо­ синтез лектинів, а також дослідження впливу на цей процес відомих генів у В. subtilis не проводили. Необхідність подібних досліджень випливає з перс­ пектив практичного використання бактеріальних лектинів як більш доступних та незатратних реа­ гентів у порівнянні з лектинами рослинного поход­ ження. У теоретичному відношенні важливо виявити зв 'язок лектинів з основними метаболічними про­ цесами клітини та їхню можливу роль у регуляції фізіологічних функцій бактеріальної популяції. Метою нашої роботи було вивчення впливу двох біохімічних мутацій, а також мутації в гені гесЕ, продукт якого входить до реплікативно/репа- ративного комплексу, на біосинтез позаклітинних лектинів у динаміці росту культури. Матеріали і методи. Об'єктами дослідження слугували три культури В. subtilis: штам В-7014 з Української колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України, ізольо­ ваний із шлунково-кишкового тракту новонародже­ ного теляти [7); ізогенні штами BD170 (гес+) та BD224 (гесЕ) з Міжнародної колекції (Колумбус, СІЛА [8 ]), одержані від професора Прозорова (НДІ «Генетика» РАН, Москва). Два останніх штами несуть біохімічних мутації в генах thr-5 (треонін- синтаза) та trpC2 ( індол-гліцерол-фосфатсинтаза). Штам BD224 додатково має мутацію в гені гесЕ, продукт якого є аналогом RecA білка кишкової палички, що входить до комплексу, залученого до реплікації, рекомбінації та репарації. Бактерії культивували в колбах Ерленмейера об'ємом 0,25 л (0,1 л середовища) на качалках (160 об/хв) при температурі 37 °С у середовищі Гаузе з 1,0 % - м вмістом галактози як джерела вуглецю [9 ]. Посівним матеріалом слугували куль­ тури, які вирощували на 3 %-му триптозному агарі «Difco» (США) протягом ночі при 37 °С. У день досліду клітини змивали та стандартизували за показниками нефелометру таким чином, щоб оп­ тична густина відповідала 1 • 107 клітин в 1 мл. Через певні проміжки часу у різних фазах росту відбирали проби культури об'ємом 1 мл. Бак­ теріальні клітини відділяли від культурального се­ редовища центрифугуванням при 6000 g упродовж 20 хв та тричі відмивали забуференим фізіологіч­ ним розчином (ЗФР) . Проби культурального сере­ довища та відповідний осад клітин зберігали при температурі -18 °С. Активність лектинів визначали в реакції гемаг­ лютинації (ГАА) з еритроцитами кроля, обробле­ ними трипсином та фіксованими глутаровим аль­ дегідом, у серії двократних розведень в полісти- ролових мікропланшетах з U-подібними лунками при кімнатній температурі. Д л я цього зразки куль­ турального середовища та осаду бактеріальних клі­ тин швидко розморожували на водяній бані при 37 °С. У випадку розчинної форми лектину в першу лунку планшета, яка містила 50 мкл З Ф Р , вносили 50 мкл культурального середовища і по закінченні титрування в кожну лунку додавали 50 мкл 2 %-ї суспензії еритроцитів кроля. Ана­ логічно визначали ГАА поверхневої форми лекти­ ну. В цьому варіанті до осаду клітин додавали 100—300 мкл З Ф Р залежно від показників нефело­ метру у певній точці кривої росту для одержання стандартизованої суспензії з титром 1-Ю 9 клітин в 1 мл. Одержану суспензію клітин титрували, як описано вище. ГАА розчинної та поверхневої форм лектину визначали за останнім розведенням, де ще спостерігається реакція гемаглютинації після 30— 40 хв інкубації з еритроцитами кроля, представле­ ним як log 2 титру досліджуваної проби [7, 9 ] . Електрофоретичний аналіз білків проводили у системі ПААГ—SDS за Леммлі [10, 11 ] з викори­ станням 10 %-го гелю. Для відокремлення перифе­ ричних білків, нековалентно зв 'язаних з поверх­ нею мембрани, емпірично підбирали м'які умови, за яких ще не відбувається лізису. До осаду клітин додавали буфер для зразків (250 мМ трис-НСІ, рН 6,8, сахароза — 10 %; SDS — 5 %; бета-меркапто- етанол — 5 %; фарба — 0,01 %-й бромфеноловий синій) об'ємом 100—300 мкл, щоб одержати стан­ дартизовану суспензію з титром 1 • 10<;. Проби ак­ тивно перемішували протягом 1 хв на струшувачі для пробірок (тип ВП) при частоті 5—6 тис. об /хв і витримували упродовж 20 хв при кімнатній тем­ пературі. Далі проби кип 'ятили на водяній бані (5 хв) та центрифугували при 6000 g протягом 5 хв. Супернатант об'ємом 20 мкл вносили в ко­ мірки 4,5 % концентрувального гелю під електрод­ ний буфер. Зразки готували безпосередньо перед електрофоретичним дослідженням і не зберігали. Приготування зразків культурального середовища відрізнялося тим, що матеріал розводили згаданим буфером у співвідношенні 1:3 безпосередньо перед кип 'ят інням. Білкові фракції візуалізували фарбуванням ге­ лів 0,25 % Кумасі блакитним R-250 («Serva», Німеччина) . Для визначення молекулярних мас використовували такі маркерні білки: альбумін си­ роватки бика (68,0 кДа) , лізоцим (14,4 кДа) («Sig- ma», США) та мономерні форми комерційних лек- 291 КАРПОВА 1 С. ТА Ш. тинів («ЛЕКТИНОТЕСТ» , Україна) — конканава- лін А (СопА), 26,0 кДа, та лектин зародків пше­ ниці (WGA) — 36,0 кДа. Для проведення порівняльного аналізу складу позаклітинних білків використовували денситогра- ми цифрового зображення гелів («Kodak», США, CD-50) , одержані за комп'ютерною програмою Image for Windows. Результати і обговорення. При культивуванні штаму дикого типу В. subtilis В-7014 у середині фази логарифмічного росту з 'являється поверхнева форма лектину, активність якої ілюструється кри­ вою з двома максимумами (рис. 1, а). Розчинна форма лектину виникає у фазі сповільненого росту. З цього моменту і до середини стаціонарної фази обидві форми лектинів існують одночасно, але зміна їхньої активності має різнонаправлений ха­ рактер. Наростання активності розчинної форми до максимуму через 24 год росту супроводжується падінням активності поверхневої форми до нульо­ вого значення. У пізній стаціонарній фазі знову зростає активність поверхневої форми і відповідно зменшується така розчинної форми. Ц я картина створює враження фазозалежного переходу зв ' яза ­ ної форми екзолектину у розчинну і навпаки. В ауксотрофного мутанта BD170 (гес+) (рис. 1, б) обидві форми лектинів з 'являються одночасно в середині фази логарифмічного росту, після чого активність поверхневої форми тримається приблиз­ но на одному рівні, а активність розчинної форми зростає, проходить через максимум на початку фази відмирання (48 год) і знижується до рівня поверхневої форми. У штаму BD224 (гесЕ) (рис. 1, в) першою з 'являється поверхнева форма. ї ї ак­ тивність досягає максимуму на середині фази лога­ рифмічного росту і поступово знижується. Невисо­ ка активність вільної форми реєструється на дві години пізніше і тримається на цьому рівні до початку фази відмирання, після чого різко зростає, досягаючи високого титру. Отже, всі досліджені культури проявили здат­ ність до біосинтезу лектинів, але динаміка і фазо- специфічність утворення розчинної та поверхневої форм має виражені штамові відмінності. Електрофоретичний аналіз білків культураль- ного середовища штаму дикого типу В. subtilis В-7014, одержаного в момент максимальної гемаг- лютинуючої активності, дозволяє зареєструвати як мінімум дев 'ять білкових зон з різною молекуляр­ ною масою, оптична густина яких відображена на денситограмі окремими піками (рис. 2, а). Окрему групу утворюють білки з м. м. від 70,4 до 59,0 кДа (піки № 1—4). Чітко також виражений мажорний компонент з м. м. 19—23 кДа (пік № 8), який Р и с . 1. А к т и в н і с т ь л е к т и н і в у д и н а м і ц і р о с т у ш т а м і в В. subtilis н а с е р е д о в и щ і Г а у з е : а—штам 6 6 8 І М В ; б — ш т а м B D 1 7 0 ( г е с + ) ; в—штам B D 2 2 4 (recE) (І — г е м а г л ю т и н у ю ч а а к т и в ­ ність ( Г А А ) п о з а к л і т и н н и х л е к т и н і в ; 2 — Г А А п о в е р х н е в и х л е к ­ тинів ; 3 — б і о м а с а , О Г ( о п т и ч н а г у с т и н а ) ) можна співвіднести з екзолектинами В. subtilis spp. першої групи та умовно позначити Л І . Аналогічно білкова зона від 10 кДа і нижче збігається з екзолектинами другої групи, відповідно Л2. Оче­ видно, що в даного штаму сумарний вміст низько­ молекулярних білків типу Л І та Л2 значно перева­ жає такий для білків з більшою м. м. (70,4— 59,0 к Д а ) . Між групою високомолекулярних білків і піком ЛІ знаходиться проміжна зона з гетероген­ ним матеріалом 48,0—34,0 кДа, що має на денси­ тограмі складний контур з трьома підйомами (піки № 5—7). Білковий профіль культурального середовища 292 П О З А К Л І Т И Н Н І Л Е К Т И Н И БАКТЕРІЇ BACILLUS SUBTILIS Р и с . 2 . Д е н с и т о г р а м а е л е к т р о ф о р е з у п о з а к л і т и н н и х б ілків В. subtilis на стаді ї м а к с и м а л ь н о ї г е м а г л ю т и н у ю ч о ї а к т и в н о с т і : а — ш т а м 6 6 8 І М В ; б — ш т а м B D 1 7 0 (red-); в — ш т а м B D 2 2 4 (гесЕ) U — б ілки к у л ь т у р а л ь н о г о с е р е д о в и щ а ; / / — п о в е р х н е в і б і л к и ; х — д о в ж и н а проб ігу ; у — а б с о р б ц і я ; 1—9 — піки м а ж о р н и х білків) обох досліджених мутантів (рис. 2, б, в) відріз­ няється від такого для штаму дикого типу перш за все відсутністю мажорного піка Л І . Спостерігається також перегрупування компонентів проміжної зо­ ни, де пік № 7 згладжується, область піків № 5 та 6 змінює контур, особливо у мутанта BD224 (гесЕ). В цілому серед позаклітинних білків культурально­ го середовища мутантів помітне переважання групи високомолекулярних білків (70,4—59,0 кДа) . Білки, що зберігають контакт з поверхнею клітини, у досліджених мутантів мають свої особ­ ливості. В обох мутантів чітко виражений компо­ нент Л І , а також пік № 7, але відсутній пік у зоні, що відповідає Л2. Можна відмітити також перегру­ пування матеріалу в області від 62,7—48,0 кДа, що має вигляд злиття трьох сусідніх піків № 3—5, яке особливо виражене у штаму BD224 (гесЕ). Якщо лектинову активність позаклітинних біл­ ків пов'язати з низькомолекулярними компонента­ ми, то у штаму дикого типу в момент максимальної гемаглютинуючої активності в культуральному се­ редовищі присутні обидва екзолектини (ЛІ і Л2) , причому Л І є домінуючим. Відсутність мажорного компонента ЛІ у культуральному середовищі му­ тантів можна пояснити його міцнішим зв 'язком з клітинною поверхнею або утворенням високомоле­ кулярних агрегатів. Так, білок 48—50 кДа, вира­ жений піком № 5, гіпотетично може бути димером Л І , а група білків 70,4—59,0 кДа — агрегатами вищого порядку. Це характерно для лектинів, які легко утворюють комплекси з гомологічними та гетерологічними молекулами. Виявлені міжштамові відмінності можуть виз­ начатися опосередкованим впливом мутацій на клі­ тинний цикл бактерій. Ауксотрофність мутантів за треоніном і триптофаном — структурними елемен­ тами пептидів та білків, які можуть слугувати донорами азоту та використовуватися в процесі глюконеогенезу, очевидно, призводить до зростан­ ня періоду генерації, як це видно з різного нахилу кривих на стадії логарифмічного росту. Мутант BD224 (гесЕ), крім ауксотрофних маркерів, несе додаткову мутацію, що впливає на такі важливі генетичні процеси, як реплікація /рекомбінація /ре­ парація. Можливо, це є причиною значної затрим­ ки вивільнення лектинів з клітин у культуральне середовище та змін профілю позаклітинних білків за рахунок збільшення кількості високомолекуляр­ них компонентів 70,4—62,7 кДа . Отже, попередніми роботами було показано залежність процесу утворення екзолектинів В. sub­ tilis spp. від впливу зовнішніх факторів [2, 7, 9 ] . У даній роботі нами продемонстровано, що зміни внутрішніх процесів внаслідок мутаційних пору­ шень метаболізму суттєво впливають на динаміку синтезу екзолектинів представниками цього виду бактерій. Висновки. 1. Динаміка біосинтезу позаклітин­ них лектинів В. subtilis spp. залежить від генетич­ них особливостей бактерій: порушення метаболізму амінокислот (штам BD170) та відсутність білка, що бере участь у реплікативних та репаративних про­ цесах (штам BD224), призводять до значної за­ тримки періоду максимального вивільнення лек­ тинів у культуральне середовище. Гемаглютинуюча активність при цьому не лише зберігається, але й підвищується. 2. У штама дикого типу поверхнева та розчин­ на форми лектинів координовано з 'являються та зникають на різних фазах росту. У мутантів така узгодженість порушується: активність розчинної форми зростає, а поверхневої — залишається на одному рівні. 293 КАРПОВА [ С. ТА Ш 3. Усі досліджені штами синтезують як мі­ німум дев 'ять основних позаклітинних білків, два з яких відповідають описаним раніше лектинам ЛІ та Л2. В культуральному середовищі мутантів змі­ нюється співвідношення білкових компонентів за рахунок молекул з більшою молекулярною масою, що може свідчити на користь агрегації низькомоле­ кулярних фракцій. При цьому у мутантів білок типу ЛІ до кінця росту зберігає зв 'язок з клітин­ ною поверхнею. 4. Ефект мутацій на продукцію лектинів віро­ гідно опосередкований їхнім впливом на процес росту і поділу клітин, котрий залежить від пра­ вильного функціонування зв 'язаного з мембраною реплікативного комплексу. / . 5 . Karpova, Е. A. Kovalenko, N. V. Koretskaya, Е. I. Getman E x t r a c e l l u l a r l ec t ins of s a p r o p h y t y c bac ter ia Bacillus subtilis a n d it's mutants S u m m a r y The influence of genotype of B. subtilis strains on the dynamics of extracellular lectins biosynthesis was studied. The spectrum of extracellular proteins presented in all strains under study contains nine main components though in different proportion. The maxi­ mum of lectin activity in the culture liquid of the wild type strain coincides with predominance of low molecular weigt proteins about 23 to 10 kDa, while in mutant strains the most intensively expressed proteins have molecular weigt of 70.4—59.0 kDa, that may be due to the aggregate formation. It was shown that mutational changes in the aminoacid pathways as well as changes in the structure of protein participating in replication and reparation resulted in strain differencies in the production and release of lectins. И. С. Карпова, Э. А. Коваленко, H. В. Корецкия, Е. И. Гетьман В н е к л е т о ч н ы е л е к т и н ы с а п р о ф и т н о й б а к т е р и и Bacillus subtilis и е е м у т а н т о в Р е з ю м е Исследовано влияние генетических особенностей штаммов В. subtilis на динамику биосинтеза внеклеточных лектинов. Спек­ тры внеклеточных белков всех исследуемых штаммов содер­ жали девять основных компонентов, но в разных количествен­ ных соотношениях. К моменту достижения максимальной лектиновой активности в кулыпуральной среде штамма дико­ го типа преобладают низкомолекулярные белки от 23 до 10 кДа, а у мутантов — более интенсивно выражены белки с молекулярной массой 70,4—59,0 кДа, что может свидетель­ ствовать о формировании агрегатов. Показано, что мутаци­ онные нарушения метаболизма аминокислот, а также струк­ туры белка, участвующего в репликативных и регшративных процессах, приводят к междуштаммовым различиям в проду­ цировании и высвобождении внеклеточных лектинов. П Е Р Е Л І К Л І Т Е Р А Т У Р И 1. Луцик М. Д., Панасюк Е. Н., Луцик А. Д. Л е к т и н ы . — Львов: В и щ а ш к о л а , 1 9 8 1 . — 1 5 2 с. 2 . Подгорский В. С, Коваленко Э. А., Симоненко И. А. Л е к т и н ы б а к т е р и й . — К и е в : Н а у к , д у м к а , 1 9 9 2 . — 2 0 2 с. 3 . Тимошенко А. В. Г л и к о б и о л о г и я и б и о м е д и ц и н с к о е п р и ­ м е н е н и е л е к т и н о в / / В е с т н . Б Г У . С е р . 2 . — 1 9 9 7 . — № 2 . — С . 3 8 — 4 7 . 4 . Gabius И. J. An imal lect ins / / Eur . J. B i o c h e m . — 1 9 9 7 . — 2 4 5 . — P . 5 4 3 — 5 7 6 . 5 . Van Damme J. M., Peumans W. J., Pustai A., Bardocz S. H a n d b o o k of p lant lect ins: proper t i e s a n d b i o m e d i c a l a p p l i c a ­ t i o n s . — C h i c h e s t e r e t c . : J o h n W i l l e y a n d S o n s , 1 9 9 8 . — 4 5 1 p. 6 . Карпова И. С, Корецкая И. В., Римиїа В. М. Л е к т и н ы л е к а р с т в е н н ы х р а с т е н и й как ф а р м а к о л о г и ч е с к и а к т и в н ы е в е щ е с т в а / / К л і н і ч н а ф а р м а ц і я . — 1 9 9 9 . — 3 , № 2 . — С . 1 4 8 — 1 5 0 . 7. Коваленко Е. О. П о з а к л і т и н н і л е к т и н и б а к т е р і й р о д у Bacillus: А в т о р е ф . д и с . ... д - р а б і о л . н а у к . — К и ї в , 1 9 9 9 . — 3 6 с. 8 . Bacillus g e n e t i c s tock cen ter . S tra ins a n d d a t a . — C o l u m b u s , 1 9 8 9 . 9 . Подгорский В. С, Коваленко Э. А., Гетьман Е. И., Вьюницкая В. А. В л и я н и е у с л о в и й к у л ь т и в и р о в а н и я на п р о д у ц и р о в а н и е л е к т и н о в н е к о т о р ы м и п р е д с т а в и т е л я м и б а к т е р и й р о д а Bacillus II М и к р о б и о л . ж у р н . — 1 9 8 9 . — 5 1 , № 6 — С . 3 0 — 3 4 . 10 . Laemmli U. К. C l e a v a g e of structural p r o t e i n s dur ing the a s s e m b l y of the h e a d of b a c t e r i o p h a g e T 4 / / N a t u r e . — 1 9 7 0 . — 2 2 7 , N 5 2 5 9 . — P . 6 8 0 — 6 8 5 . 1 1 . Михильський Л. О., Фуртат I. М., Дем'яненко Ф. П., Костючик А. А. Е л е к т р о ф о р е т и ч н і с п е к т р и б ілків к л і т и н ­ ної с т і н к и як о д и н із к р и т е р і ї в і д е н т и ф і к а ц і ї та к л а с и ф і к а ­ ці ї к о р и н е б а к т е р і й / / У к р . б і о х і м . ж у р н . — 2 0 0 1 . — 7 3 , № З — С . 6 3 — 7 0 . У Д К 5 4 7 . 9 6 Н а д і й ш л а д о р е д а к ц і ї 2 3 . 0 1 . 0 3 294

Схожі ресурси