Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы
Методом Agrobacterium-опосредованной трансформации in planta с использованием штамма LBA4404, несущего рВі2Е с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы (ProDH), получено семенное поколение трансгенных растений кукурузы (Zea mays L.), выдержавших при прорастании моделированное маннитом...
Saved in:
| Published in: | Физиология растений и генетика |
|---|---|
| Date: | 2014 |
| Main Authors: | , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України
2014
|
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/159462 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы / С.И. Михальская, Л.Е. Сергеева, А.Ю. Матвеева, Н.И. Коберник, А.В. Кочетов, Е.Н. Тищенко, В.В. Моргун // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 482-489. — Бібліогр.: 35 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-159462 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Михальская, С.И. Сергеева, Л.Е. Матвеева, А.Ю. Коберник, Н.И. Кочетов, А.В. Тищенко, Е.Н. Моргун В.В. 2019-10-04T20:37:21Z 2019-10-04T20:37:21Z 2014 Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы / С.И. Михальская, Л.Е. Сергеева, А.Ю. Матвеева, Н.И. Коберник, А.В. Кочетов, Е.Н. Тищенко, В.В. Моргун // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 482-489. — Бібліогр.: 35 назв. — рос. 2308-7099 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/159462 577.21 Методом Agrobacterium-опосредованной трансформации in planta с использованием штамма LBA4404, несущего рВі2Е с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы (ProDH), получено семенное поколение трансгенных растений кукурузы (Zea mays L.), выдержавших при прорастании моделированное маннитом летальное обезвоживание. Определено многократное возрастание содержания свободного L-пролина в побегах осмотолерантных Т2-растений в условиях водного стресса. Полученные данные свидетельствуют о перспективности siPHК-технологий для повышения уровня устойчивости кукурузы к водному дефициту. Методом Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta з використанням штаму LBA4404, який містить рВі2Е з дволанцюговим РНК-супресором гена проліндегідрогенази (ProDH), отримано насіннєве покоління трансгенних рослин кукурудзи (Zea mays L.), яке витримало при пророщуванні модельоване манітом летальне зневоднення. Визначено багаторазове зростання вмісту вільного L-проліну в пагонах осмотолерантних Т2-рослин за умов водного стресу. Отримані дані свідчать про перспективність siРНК-технологій для підвищення рівня стійкості кукурудзи до водного дефіциту. The transgenic corn plants (Zea mays L.) were obtained via in planta Agrobacterium-mediated transformation by LBA4404 strain harboring pBi2E with dsRNA suppressor of proline dehydrogenase gene. Their seeds survived under lethal water deficit simulating by mannitol. High levels of free proline in shoots of osmotolerant T2-plants under water stress were observed. Those data indicate the promising scope of siRNA technologies towards maize water deficit tolerance. Работа поддержана грантом совместных научных проектов НАН Украины (16-05-2012) — СО РАН (№ 11). ru Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України Физиология растений и генетика Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы Залежність між фотосинтетичною активністю і вмістом цукрів у прапорцевому листку наприкінці наливання зерна у контрастних за продуктивністю сортів озимої пшениці за різного рівня мінерального живлення The elevation of free proline content in osmotolerant transgenic corn plants with dsRNA suppressor of proline dehydrogenase gene Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы |
| spellingShingle |
Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы Михальская, С.И. Сергеева, Л.Е. Матвеева, А.Ю. Коберник, Н.И. Кочетов, А.В. Тищенко, Е.Н. Моргун В.В. |
| title_short |
Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы |
| title_full |
Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы |
| title_fullStr |
Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы |
| title_full_unstemmed |
Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы |
| title_sort |
повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным рнк-супрессором гена пролиндегидрогеназы |
| author |
Михальская, С.И. Сергеева, Л.Е. Матвеева, А.Ю. Коберник, Н.И. Кочетов, А.В. Тищенко, Е.Н. Моргун В.В. |
| author_facet |
Михальская, С.И. Сергеева, Л.Е. Матвеева, А.Ю. Коберник, Н.И. Кочетов, А.В. Тищенко, Е.Н. Моргун В.В. |
| publishDate |
2014 |
| language |
Russian |
| container_title |
Физиология растений и генетика |
| publisher |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Залежність між фотосинтетичною активністю і вмістом цукрів у прапорцевому листку наприкінці наливання зерна у контрастних за продуктивністю сортів озимої пшениці за різного рівня мінерального живлення The elevation of free proline content in osmotolerant transgenic corn plants with dsRNA suppressor of proline dehydrogenase gene |
| description |
Методом Agrobacterium-опосредованной трансформации in planta с использованием штамма LBA4404, несущего рВі2Е с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы (ProDH), получено семенное поколение трансгенных растений кукурузы (Zea mays L.), выдержавших при прорастании моделированное маннитом летальное обезвоживание. Определено многократное возрастание содержания свободного L-пролина в побегах осмотолерантных Т2-растений в условиях водного стресса. Полученные данные свидетельствуют о перспективности siPHК-технологий для повышения уровня устойчивости кукурузы к водному дефициту.
Методом Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta з використанням штаму LBA4404, який містить рВі2Е з дволанцюговим РНК-супресором гена проліндегідрогенази (ProDH), отримано насіннєве покоління трансгенних рослин кукурудзи (Zea mays L.), яке витримало при пророщуванні модельоване манітом летальне зневоднення. Визначено багаторазове зростання вмісту вільного L-проліну в пагонах осмотолерантних Т2-рослин за умов водного стресу. Отримані дані свідчать про перспективність siРНК-технологій для підвищення рівня стійкості кукурудзи до водного дефіциту.
The transgenic corn plants (Zea mays L.) were obtained via in planta Agrobacterium-mediated transformation by LBA4404 strain harboring pBi2E with dsRNA suppressor of proline dehydrogenase gene. Their seeds survived under lethal water deficit simulating by mannitol. High levels of free proline in shoots of osmotolerant T2-plants under water stress were observed. Those data indicate the promising scope of siRNA technologies towards maize water deficit tolerance.
|
| issn |
2308-7099 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/159462 |
| citation_txt |
Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных трансгенных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы / С.И. Михальская, Л.Е. Сергеева, А.Ю. Матвеева, Н.И. Коберник, А.В. Кочетов, Е.Н. Тищенко, В.В. Моргун // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 482-489. — Бібліогр.: 35 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT mihalʹskaâsi povyšeniesoderžaniâsvobodnogoprolinavosmotolerantnyhtransgennyhrasteniâhkukuruzysdvuhcepočečnymrnksupressoromgenaprolindegidrogenazy AT sergeevale povyšeniesoderžaniâsvobodnogoprolinavosmotolerantnyhtransgennyhrasteniâhkukuruzysdvuhcepočečnymrnksupressoromgenaprolindegidrogenazy AT matveevaaû povyšeniesoderžaniâsvobodnogoprolinavosmotolerantnyhtransgennyhrasteniâhkukuruzysdvuhcepočečnymrnksupressoromgenaprolindegidrogenazy AT kobernikni povyšeniesoderžaniâsvobodnogoprolinavosmotolerantnyhtransgennyhrasteniâhkukuruzysdvuhcepočečnymrnksupressoromgenaprolindegidrogenazy AT kočetovav povyšeniesoderžaniâsvobodnogoprolinavosmotolerantnyhtransgennyhrasteniâhkukuruzysdvuhcepočečnymrnksupressoromgenaprolindegidrogenazy AT tiŝenkoen povyšeniesoderžaniâsvobodnogoprolinavosmotolerantnyhtransgennyhrasteniâhkukuruzysdvuhcepočečnymrnksupressoromgenaprolindegidrogenazy AT morgunvv povyšeniesoderžaniâsvobodnogoprolinavosmotolerantnyhtransgennyhrasteniâhkukuruzysdvuhcepočečnymrnksupressoromgenaprolindegidrogenazy AT mihalʹskaâsi zaležnístʹmížfotosintetičnoûaktivnístûívmístomcukrívupraporcevomulistkunaprikíncínalivannâzernaukontrastnihzaproduktivnístûsortívozimoípšenicízaríznogorívnâmíneralʹnogoživlennâ AT sergeevale zaležnístʹmížfotosintetičnoûaktivnístûívmístomcukrívupraporcevomulistkunaprikíncínalivannâzernaukontrastnihzaproduktivnístûsortívozimoípšenicízaríznogorívnâmíneralʹnogoživlennâ AT matveevaaû zaležnístʹmížfotosintetičnoûaktivnístûívmístomcukrívupraporcevomulistkunaprikíncínalivannâzernaukontrastnihzaproduktivnístûsortívozimoípšenicízaríznogorívnâmíneralʹnogoživlennâ AT kobernikni zaležnístʹmížfotosintetičnoûaktivnístûívmístomcukrívupraporcevomulistkunaprikíncínalivannâzernaukontrastnihzaproduktivnístûsortívozimoípšenicízaríznogorívnâmíneralʹnogoživlennâ AT kočetovav zaležnístʹmížfotosintetičnoûaktivnístûívmístomcukrívupraporcevomulistkunaprikíncínalivannâzernaukontrastnihzaproduktivnístûsortívozimoípšenicízaríznogorívnâmíneralʹnogoživlennâ AT tiŝenkoen zaležnístʹmížfotosintetičnoûaktivnístûívmístomcukrívupraporcevomulistkunaprikíncínalivannâzernaukontrastnihzaproduktivnístûsortívozimoípšenicízaríznogorívnâmíneralʹnogoživlennâ AT morgunvv zaležnístʹmížfotosintetičnoûaktivnístûívmístomcukrívupraporcevomulistkunaprikíncínalivannâzernaukontrastnihzaproduktivnístûsortívozimoípšenicízaríznogorívnâmíneralʹnogoživlennâ AT mihalʹskaâsi theelevationoffreeprolinecontentinosmotoleranttransgeniccornplantswithdsrnasuppressorofprolinedehydrogenasegene AT sergeevale theelevationoffreeprolinecontentinosmotoleranttransgeniccornplantswithdsrnasuppressorofprolinedehydrogenasegene AT matveevaaû theelevationoffreeprolinecontentinosmotoleranttransgeniccornplantswithdsrnasuppressorofprolinedehydrogenasegene AT kobernikni theelevationoffreeprolinecontentinosmotoleranttransgeniccornplantswithdsrnasuppressorofprolinedehydrogenasegene AT kočetovav theelevationoffreeprolinecontentinosmotoleranttransgeniccornplantswithdsrnasuppressorofprolinedehydrogenasegene AT tiŝenkoen theelevationoffreeprolinecontentinosmotoleranttransgeniccornplantswithdsrnasuppressorofprolinedehydrogenasegene AT morgunvv theelevationoffreeprolinecontentinosmotoleranttransgeniccornplantswithdsrnasuppressorofprolinedehydrogenasegene |
| first_indexed |
2025-11-25T23:08:46Z |
| last_indexed |
2025-11-25T23:08:46Z |
| _version_ |
1850578954941890560 |
| fulltext |
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКА. 2014. Т. 46. № 6
УДК 577.21
ПОВЫШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА В
ОСМОТОЛЕРАНТНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ КУКУРУЗЫ С
ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫМ РНК-СУПРЕССОРОМ ГЕНА
ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ
С.И. МИХАЛЬСКАЯ1, Л.Е. СЕРГЕЕВА1, А.Ю. МАТВЕЕВА1, Н.И. КОБЕРНИК1,
А.В. КОЧЕТОВ2, Е.Н. ТИЩЕНКО1, В.В. МОРГУН1
1Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины
03022 Киев, ул. Васильковская, 31/17
2Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10
Методом Agrobacterium-опосредованной трансформации in planta с использовани-
ем штамма LBA4404, несущего рВі2Е с двухцепочечным РНК-супрессором гена
пролиндегидрогеназы (ProDH), получено семенное поколение трансгенных расте-
ний кукурузы (Zea mays L.), выдержавших при прорастании моделированное ман-
нитом летальное обезвоживание. Определено многократное возрастание содержа-
ния свободного L-пролина в побегах осмотолерантных Т2-растений в условиях
водного стресса. Полученные данные свидетельствуют о перспективности siPHК-
технологий для повышения уровня устойчивости кукурузы к водному дефициту.
Ключевые слова: Zea mays L., пролин, двухцепочечный РНК-супрессор ProDH,
Agrobacterium-опосредованная трансформация in planta.
Одно из направлений генетической инженерии по повышению уровня
устойчивости культурных растений к осмотическим стрессам связано с
использованием генов, контролирующих метаболизм свободного L-про-
лина (Pro). Всесторонние генетические и физиолого-генетические ис-
следования, в том числе с использованием методов генетической инже-
нерии и экспериментального мутагенеза, сформировали точку зрения о
Pro как о полифункциональной аминокислоте, которая может прини-
мать участие в сложных интегральных процессах адаптации/устойчивос-
ти растений. Развивается также представление о Pro как о сигналь-
ной/регуляторной молекуле в ходе роста, дифференцировки клеток и их
программированной гибели [3, 4, 9, 14, 19, 25, 29, 31, 35]. Вместе с тем
участие свободного пролина в процессах осмотолерантности не всегда
очевидно. Об этом свидетельствуют результаты анализа трансгенных
растений и некоторых диких видов, включая культурные злаки [20, 31].
Помимо этого повышение содержания Pro может быть сопряжено толь-
ко с одним из стрессовых факторов — водным дефицитом или засоле-
нием [2, 22]. Ряд аспектов биологической функции Pro, в том числе свя-
занных с ролью отдельных генов, контролирующих его метаболизм,
остаются недостаточно изученными и противоречивыми.
При разработке молекулярных биотехнологий, направленных на
повышение уровня стрессоустойчивости культурных растений, основное
внимание уделяется генам синтеза — P5CS и катаболизма — ProDH про-
© С.И. МИХАЛЬСКАЯ, Л.Е. СЕРГЕЕВА, А.Ю. МАТВЕЕВА, Н.И. КОБЕРНИК, А.В. КОЧЕТОВ, Е.Н. ТИЩЕНКО,
В.В. МОРГУН, 2014
482
лина, кодирующим ферменты соответственно 1-пирролин-5-карбокси-
латсинтетазу (КФ 2.7.2.11.1.2.1.41) и пролиндегидрогеназу (КФ 1.5.99.8).
Эти гены представлены в ядерном геноме двумя копиями, показывают
высокий уровень гомологии среди двудольных и однодольных и могут
выполнять различные функции, связанные с реакцией на стресс и (или)
с пролиферацией, дифференцировкой клеток растений [16, 20, 21, 26,
28, 32]. Вместе с тем экспрессия гомологичных копий генов синтеза или
катаболизма пролина в условиях стресса может осуществляться диффе-
ренциально как в ответ на разные типы стрессоров, так и при последу-
ющем восстановлении после стресса [9, 10, 15]. Относительно генов
ProDH растений известно, что их экспрессия преимущественно регули-
руется на транскрипционном уровне де- и регидратацией, а также экзо-
генным L-пролином. В ответ на стресс уменьшается количество мРНК
и снижается ее накопление при регидратации [17, 23, 27].
В связи с полифункциональностью и различиями в уровнях экс-
прессии генов метаболизма Pro целесообразен предварительный анализ
эффективности их применения для получения биотехнологических про-
дуктов. При этом для аккумуляции свободного L-пролина используют
два основных подхода: 1 — введение дополнительного числа копий
кДНК P5CS; 2 — частичная супрессия эндогенных генов пролиндегидро-
геназы за счет фрагментов генов ProDH в антисмысловой ориентации или
в форме обращенного повтора, в результате чего изменения в их экспрес-
сии осуществляются путем посттранскрипционного сайленсинга РНК.
Целью данной работы был анализ содержания свободного L-проли-
на в побегах на ранних этапах онтогенеза кукурузы, трансформирован-
ной in planta с использованием обезоруженного агробактериального
штамма LBA4404, несущего плазмиду рВі2Е с двухцепочечным (дц) РНК-
супрессором гена пролиндегидрогеназы, в условиях водного дефицита.
Методика
Объектами исследования были инбредные линии кукурузы 370, 390, 1555
селекции Института физиологии растений и генетики НАН Украины.
Agrobacterium-опосредованную трансформацию in planta проводили час-
тично модифицированным нами способом Чумакова и соавт. [11], где
после изоляции пестичных нитей осуществляли инокуляцию штаммом
LBA4404 (рВі2Е) с последующим опылением пыльцой того же растения
[12]. Для повышения частоты трансформации в модифицированную на-
ми среду инокуляции добавляли сурфактант — Silwet L-77 («Lehle Seed»,
США) концентрацией 0,01 %.
Двухцепочечный РНК-супрессор гена пролиндегидрогеназы куку-
рузы получен на основе фрагмента первого экзона гена ProDH1 араби-
допсиса, расположенного как обращенный повтор, включающий фраг-
мент первого интрона этого же гена [8]. Интеграцию рекомбинантных
молекул ДНК анализировали ПЦР-методом по наличию фрагментов эк-
зона, интрона гена ProDH1 арабидопсиса и гена селективного агента —
канамицинсульфата [5]. При этом отсутствие агробактериальной приме-
си в трансгенных растениях определяли по гену virD1.
Стрессоустойчивые варианты отбирали в условиях моделированного
летального обезвоживания (0,5 М раствор маннита). Их семенное поколе-
ние (Т2) выращивали, увеличивая стрессовое давление до 0,8 М маннита.
Уровень свободного L-пролина в побегах проростков определяли
по стандартной методике [1]. Пробы отбирали и фиксировали в одно и
483
ПОВЫШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
то же время суток. Динамику содержания свободного Pro в условиях
стресса и в период восстановления после стресса определяли в побегах
каждого индивидуально развивающегося проростка (по 3 аналитических
и 4—6 биологических повторов). В качестве контроля принимали содер-
жание L-пролина в нетрансформированных побегах, культивируемых в
условиях стресса и (или) в нормальных условиях. При статистической
обработке результатов сравнительных исследований применяли крите-
рий Стьюдента.
Результаты и обсуждение
В условиях действия летальной дозы стрессора жизнеспособными оста-
вались только трансгенные растения, молекулярно-генетический анализ
которых показал наличие элементов векторной конструкции, образую-
щих дцРНК-супрессор гена пролиндегидрогеназы (рис. 1). При этом аг-
робактериальная примесь отсутствовала. Очевидно, в таких условиях ген
ProDH выступает детерминантой в поддержании активного метаболизма
пролина. Объективным критерием этого являются динамичные изменения
в содержании свободного пролина в условиях норма стресс норма
(повышение при стрессе и снижение при регидратации). Он основан на
результатах исследования характера экспрессии гена ProDH растений
при умеренных дозах стрессора и используется в исследованиях, связан-
ных с изучением роли генов пролиндегидрогеназы в процессах адапта-
ции (устойчивости) растений к абиотическим стрессам [17, 20].
Результаты такого экспери-
мента на примере трансгенных
Т2-растений инбредной линии
370 представлены на рис. 2. В дан-
ном случае зерновки, которые
прорастали при наличии 0,5 М
раствора маннита, параллельно
переносили в условия регидрата-
ции и сверхжесткого стресса (0,8
М раствор маннита). При регидра-
тации за короткий период культи-
вирования (в течение 1 сут) проис-
ходило резкое падение содержания
свободного пролина до значений,
сопоставимых с таковыми у кон-
трольных растений, растущих в
нормальных условиях. При сверх-
жестком стрессе культивирования
(в течение 15 сут) происходило
~5—9-кратное повышение уровня
аккумулированного Pro (см. рис.
2, а). По мере дальнейшего уве-
личения (до 22 сут) продолжи-
тельности стрессового давления
при сверхжестком стрессе он зна-
чительно снижался (см. рис. 2, б).
Такая реакция на водный дефи-
цит является отражением процес-
484
С.И. МИХАЛЬСКАЯ, Л.Е. СЕРГЕЕВА, А.Ю. МАТВЕЕВА и др.
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амп-
лификации ДНК образцов Т1-растений ку-
курузы, отобранных в условиях летального
обезвоживания:
1,3 — с использованием праймеров к фрагментам
соответственно экзона и интрона гена ProDH ара-
бидопсиса, размер ампликонов которых составля-
ет 545 и 700 пн; 2, 4 — ДНК нетрансформирован-
ных растений; 5 — негативный контроль; М —
маркер молекулярных масс GeneRulerTM DNA
Ladder Mix (Fermentas)
сов адаптации трансгенных растений кукурузы. Полученные данные да-
ют основание полагать, что повышенный уровень свободного пролина,
конститутивно синтезируемого в трансгенных растениях на ранних эта-
пах онтогенеза кукурузы, будет способствовать преодолению негативно-
го влияния водного дефицита в условиях in vivo.
Изучение содержания свободного L-пролина в побегах 14-суточ-
ных проростков индивидуальных трансформантов кукурузы, которые
проращивали и культивировали на фоне летального обезвоживания
(0,5 М раствор маннита), показало 2—4-кратное превышение этого по-
казателя относительно контроля — исходных инбредных линий (рис. 3).
Это также свидетельствует в пользу участия свободного L-пролина в ре-
акции на стресс, вызванный водным дефицитом.
Жизнеспособность трансформантов, сопряженная с повышением
уровня содержания Pro, поддерживалась и при адаптации к условиям
сверхжесткого стресса, моделированного с применением 0,8 М раствора
маннита (рис. 4). В данном случае проростки предварительно культиви-
ровали в нормальных условиях на воде или среде МС, содержащей мак-
ро- и микроэлементы половинного состава (МС/2), а далее в условиях
стресса (0,8 М раствора маннита). Независимо от типа используемых
сред у трансгенных вариантов на ранних этапах культивирования проис-
ходило значительное превышение количества Pro (~16—20-кратное)
относительно контроля — растений, выращиваемых в нормальных усло-
виях или при стрессе.
Повышение уровня свободного пролина наблюдалось не только на
ранних этапах роста и дифференцировки клеток проростков при осмо-
тическом стрессе, но и в верхних листьях трансгенных растений в фазу
молочной спелости, культивируемых в условиях вегетационного опыта.
485
ПОВЫШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Рис. 2. Изменение содержания свободного L-пролина в побегах индивидуальных Т2-транс-
формантов кукурузы (варианты I, II, III) инбредной линии 370 в условиях культивирова-
ния при сверхжестком стрессе (I-1, II-2, III-3) и при регидратации (I-0, II-0, III-0):
а — культивирование в нормальных условиях в течение 1 сут (на воде) и при стрессе (0,8 М водный рас-
твор маннита) в течение 15 сут; б — продолжение культивирования при сверхжестком стрессе (до 22 сут)
III-0 III-3
Его уровень втрое превышал значения, определенные в контрольных
(нетрансгенных) растениях исходной инбредной линии в нормальных
условиях культивирования in
vivo. При этом фенотипических
различий между анализируемы-
ми вариантами не обнаружено.
Можно ожидать, что конститу-
тивная аккумуляция свободного
L-пролина на ранних и поздних
этапах онтогенеза будет способ-
ствовать поддержанию роста и
развития растений кукурузы в
неблагоприятных условиях ок-
ружающей среды в течение ве-
гетации.
Следует отметить, что одно
из первых среди немногочислен-
ных до настоящего времени ис-
следований, которое свидетель-
ствует в пользу регуляторной
роли siRNA, связано с повыше-
нием уровня толерантности ара-
бидопсиса к засолению как ре-
зультатом антисмыслового
перекрывания пары генов
P5CDH (смысловой) и SR05
(антисмысловой) [13]. Первый
из них — P5CDH — связан с ме-
таболизмом L-пролина (коди-
рует Р5С-дегидрогеназу, пре-
вращающую Р5С в глутамат),
486
С.И. МИХАЛЬСКАЯ, Л.Е. СЕРГЕЕВА, А.Ю. МАТВЕЕВА и др.
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Рис. 3. Аккумуляция свободного L-пролина (мг% массы сырого вещества) в побегах 14-су-
точных проростков индивидуальных трансформантов инбредных линий кукурузы 370 и
1555 (варианты I, II, III), которые проращивали и культивировали в условиях летального
обезвоживания (0,5 М раствор маннита); К — контроль (линии 370 и 1555 при тех же ус-
ловиях моделированного водного дефицита)
Рис. 4. Содержание свободного L-пролина (мг%
массы сырого вещества) в побегах проростков
кукурузы инбредной линии 390, трансформи-
рованной с использованием LBA4404 (рВі2Е),
при адаптации к условиям сверхжесткого
стресса:
1, 1а — контроль; 2, 2а — трансформанты соответ-
ственно на 4-е (1, 2) и 14-е (1а, 2а) сутки в нормаль-
ных условиях культивирования; 3, 4 — проростки
трансформантов, культивируемых в течение 4 сут в
нормальных условиях и далее 10 сут в условиях вод-
ного стресса (общий возраст проростков 14 сут), мо-
делированного 0,8 М раствором маннита соответст-
венно в воде и среде МС/2
функция второго, который индуцировался при засолении, не выяснена.
Вместе с тем, хотя продемонстрирована важная роль nat-siRNA в про-
цессе осмотолерантности, снижение активности фермента Р5СDH мо-
жет приводить к аккумуляции Р5С (токсичного промежуточного метабо-
лита) и, как результат, к программированной клеточной гибели. В связи
с этим при разработке молекулярных биотехнологий рассматриваются
возможности направления, связанного с частичной супрессией гена про-
линдегидрогеназы.
В целом сведения о siRNA-технологиях растений ограничены и не-
однозначны. В частности, показано 1,5—6-кратное повышение содержа-
ния свободного L-пролина в трансформантах табака относительно не-
трансгенного контроля, тогда как изменения в аккумуляции этой
аминокислоты в растениях, несущих «антисмысловые» конструкции,
варьировали в более узких пределах (1,5—3 раза) [8]. Наряду с этим
представлены данные о том, что применение siRNA-технологий, кото-
рые теоретически считаются более эффективными для частичной су-
прессии генов, чем «антисмысловые», не всегда себя оправдывает. Так,
активность фермента NtProDH в трансгенных клеточных линиях табака,
содержащих дцРНК-супрессор гена пролиндегидрогеназы, повышалась
всего лишь на 4,9—32,2 % относительно дикого типа, при этом повыше-
ние уровня свободного L-пролина колебалось в пределах 1,2—3 раза [33].
В наших исследованиях, где использовалась указанная выше конструк-
ция [8], устойчивость трансгенных растений кукурузы к летальным дозам
сульфатнохлоридного засоления сопровождалась значительной аккумуля-
цией Pro [6]. Такая же реакция наблюдалась и у трансгенных растений
подсолнечника, устойчивых к летальному обезвоживанию и разным ти-
пам засоления [10]. Повышение содержания свободного пролина отмеча-
ли Моисеева и соавт. [7] в трансгенных растениях кукурузы, несущих
фрагмент гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации.
Таким образом, получено семенное поколение трансгенных расте-
ний кукурузы с дцРНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы, устой-
чивых к летальному обезвоживанию. Показано 15—20-кратное повыше-
ние содержания свободного L-пролина в побегах осмотолерантных
Т2-растений на ранних этапах их развития при водном дефиците. Со-
пряженность осмотолерантности и аккумуляции Pro свидетельствует о
перспективности метаболической инженерии по повышению уровня ус-
тойчивости кукурузы к водному дефициту с использованием дцРНК-су-
прессора гена пролиндегидрогеназы.
Работа поддержана грантом совместных научных проектов НАН
Украины (16-05-2012) — СО РАН (№ 11).
1. Андрющенко В.К., Саянова В.В., Жученко А.А. и др. Модификация метода определения
пролина для выявления засухоустойчивых форм Lycopersicon Tourn // Изв. АН МССР. —
1981. — 4. — С. 55—60.
2. Ибрагимова С.С., Колодяжная Я.С., Герасимова С.В., Кочетов А.В. Частичная супрессия
гена пролиндегидрогеназы увеличивает устойчивость растений к различным видам
абиотических стрессов // Физиология растений. — 2012. — 59. — С. 99—107.
3. Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С. и др. Повышение содержания пролина и ос-
мотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысло-
вой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. — 2004. — 40, № 2. — С. 282—285.
4. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм,
регуляция // Физиология растений. — 1999. — 46. — С. 321—336.
5. Михальская С.И., Адаменко Н.И., Моргун Б.В. и др. Компетентность к Agrobacterium-опо-
средованной трансформации сегментов побега элитных инбредных линий кукурузы //
Біотехнологія. — 2012. — 5, № 3. — С. 98—105.
487
ПОВЫШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
6. Михальская С.И., Матвеева А.Ю., Сергеева Л.Е. и др. Исследование содержания свобод-
ного пролина в растениях кукурузы, трансформированных in planta с использованием
LBA4404, несущего pBi2E с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидроге-
назы // Изв. Самар. науч. центра РАН. — 2013. — 15, № 3 (5). — С. 1662—1665.
7. Моисеева Е.М., Агапонов Д.А., Великов В.А. и др. Повышение содержания пролина в рас-
тениях кукурузы, экспрессирующих фрагмент гена пролиндегидрогеназы в антисмыс-
ловой ориентации // Физиология растений. — 2012. — 59, № 3. — С. 457—460.
8. Титов С.Е. Изучение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana
tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы:
Автореф. дис. … канд. биол. наук. — Новосибирск, 2008. — 18 с.
9. Тищенко Е.Н. Генетическая инженерия с использованием генов метаболизма L-проли-
на для повышения осмотолерантности растений // Физиология растений и генетика. —
2013. — 45, № 1. — С. 489—500.
10. Тищенко Е.Н., Комисаренко А.Г., Михальская С.И. и др. Agrobacterium-опосредованная
трансформация подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro и in planta c использовани-
ем штамма LBA4404, несущего плазмиду pBi2E с двухцепочечным РНК-супрессором
гена пролиндегидрогеназы // Цитология и генетика. — 2014. — 48, № 4. — С. 19—30.
11. Чумаков М.И., Рожок Н.А., Великов В.А. и др. Трансформация кукурузы путем иноку-
ляции агробактериями пестичных нитей in planta // Генетика. — 2006. — 42, № 8. —
С. 1083—1088.
12. Патент на корисну модель № 77331 від 11.02.2013. Спосіб отримання трансгенних рос-
лин кукурудзи за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta /
О.Ю. Матвєєва, О.М. Тищенко, Б.В. Моргун.
13. Borsani O., Zhu J., Verslues E.P. et al. Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-
antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis // Cell. — 2005. — 123. — P. 1279—
1291.
14. Cecchini N.M., Monteoliva M., Alvares M.E. Proline dehydrogenase is a positive regulator of
cell death in different kingdoms // Plant Signal Behav. — 2011. — 6, N 8. — P. 1195—1197.
15. Dobra J., Vankova R., Havlova M. et al. Tobacco leaves and roots differ in the expression of
proline metabolism-related genes in the course of drought stress and subsequent recovery // J.
Plant Physiol. — 2011. — 168, N 13. — P. 1588—1597.
16. Hur J., Jung K.H., Lee C.H., An G. Stress-inducible OsP5CS2 gene is essential for salt and
cold tolerance in rice // Plant Sci. — 2004. — 167. — P. 417—426.
17. Kiyosue T., Yoshiba Y., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. A nuclear gene encoding mito-
chondrial proline dehydrogenase, an enzyme involved in proline metabolism, is upregulated by
proline but downregulated by dehydration in Arabidopsis // Plant Cell. — 1996. — 8. — P. 1323—
1335.
18. Ma A., Mitchell H.J., Deuschle K., Pryor A.J. Comparative analysis in cereals of a key proline
catabolism gene // Mol. Gen. Genomics. — 2005. — 274, N 5. — P. 494—505.
19. Maggio A., Miyazaki S., Veronese P. et al. Does proline accumulation play an active role in
stress-induced growth reduction? // Plant J. — 2002. — 3, N 16. — P. 699—712.
20. Mani S., Van de Cotte B., Van Montagu M., Verbruggen N. Altered levels of proline dehydro-
genase cause hypersensitivity to proline and its analogs in Arabidopsis // Plant Physiol. —
2002. — 128. — P. 73—83.
21. Miller G., Stein H., Honig A. et al. Responsive modes of Medicago sativa proline dehydroge-
nase genes during salt stress and recovery dictate proline accumulation // Planta. — 2005. —
222, N 1. — P. 70—79.
22. Nanjo T., Kobayashi M., Yoshiba Y. et al. Antisense suppression of proline degradation
improves tolerance to freezing and salinity in Arabidopsis thaliana // FEBS Let. — 1999. —
461. — P. 205—210.
23. Oono Y., Seki M., Nanjo T. et al. Monitoring expression profiles of Arabidopsis gene expres-
sion during rehydration process after dehydration using ca 7,000 full-length cDNA microar-
ray // Plant J. — 2003. — 34, N 6. — P. 868—887.
24. Peng Z., Lu Q., Verna D.P. Reciprocal regulation of delta 1-pyrroline-5-carboxylate syntetase
and proline dehydrogenase genes controls proline levels during and after osmotic stress in
plants // Mol. Gen. Genet. — 1996. — N 3. — P. 334—341.
25. Polavarapu B., Kavi K., Nese S. Is proline accumulation per se correlated with stress tolerance
or is proline homeostasis a more critical issue? // Plant Cell Environ. — 2014. — 37. — P. 300—
311.
26. Saeid M.A.-R., Ammari T.G., Irshaid L.А. et al. Cloning and expression patterns of the
HvP5CS gene from barley (Hordeum vulgare) // J. Food, Agricult. Environ. — 2011. — 9,
N 3—4. — P. 279—284.
27. Satoh R., Nakashima K., Seki M. et al. ACTCAT/ a novel cis-acting element for proline- and
hypoosmolarity-responsive expression of the ProDH gene encoding proline dehydrogenase
gene in Arabidopsis // Plant Physiol. — 2002. — 130, N 3. — P. 709—719.
488
С.И. МИХАЛЬСКАЯ, Л.Е. СЕРГЕЕВА, А.Ю. МАТВЕЕВА и др.
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
28. Servet C., Ghelis T., Richard L. et al. Proline dehydrogenase: a key enzyme in controlling cel-
lular homeostasis // Front Biosci. — 2012. — 1, N 17. — P. 607—620.
29. Sharma S., Villamor J.G., Verslues P.E. Essential role of tissue-specific proline synthesis and
catabolism in growth and redox balance at low water potential // Plant Physiol. — 2011. —
157. — P. 292—304.
30. Su M., Li X.-F., Ma X.-Y. et al. Cloning two P5CS genes from bioenergy sorghum and their
expression profiles under abiotic stresses and MeJA treatment // Plant Sci. — 2011. — 181. —
P. 652—659.
31. Szabados L., Savoure A. Proline: a multifunctional amino acid // Trends Plant Sci. — 2009. —
15, N 2. — P. 89—97.
32. Szekely G., Abraham E., Cseplo A. et al. Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct
roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis // Plant J. — 2008. —
53, N 1. — P. 11—28.
33. Tateishi Y., Nakagama T., Esaka M. Osmotolerance and growth stimulation of transgenic
tobacco cells accumulating free proline by dehydrogenase expression with double-stranded
RNA interference technique // Physiol. Plant. — 2005. — 125. — P. 224—234.
34. Turchetto-Zolet A.C., Margis-Pinheiro M., Margis R. The evolution of pyrroline-5-carboxylate
synthase in plants: a key enzyme in proline synthesis // Mol. Gen. Genomics. — 2009. —
281. — P. 87—97.
35. Verbruggen N., Hermans C. Proline accumulation in plants: A review // Amino Acids. —
2008. — 35. — P. 753—759.
Получено 12.09.2014
ПІДВИЩЕННЯ ВМІСТУ ВІЛЬНОГО ПРОЛІНУ В ОСМОТОЛЕРАНТНИХ
ТРАНСГЕННИХ РОСЛИНАХ КУКУРУДЗИ ІЗ ДВОЛАНЦЮГОВИМ
РНК-СУПРЕСОРОМ ГЕНА ПРОЛІНДЕГІДРОГЕНАЗИ
С.І. Михальська1, Л.Є. Сергєєва1, О.Ю. Матвєєва1, Н.І. Коберник1, О.В. Кочетов2,
О.М. Тищенко1, В.В. Моргун1
1Інститут фізіології рослин і генетики Національної академії наук України, Київ
2Інститут цитології і генетики Сибірського відділення Російської академії наук,
Новосибірськ
Методом Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta з використанням штаму
LBA4404, який містить рВі2Е з дволанцюговим РНК-супресором гена проліндегідрогенази
(ProDH), отримано насіннєве покоління трансгенних рослин кукурудзи (Zea mays L.), яке
витримало при пророщуванні модельоване манітом летальне зневоднення. Визначено ба-
гаторазове зростання вмісту вільного L-проліну в пагонах осмотолерантних Т2-рослин за
умов водного стресу. Отримані дані свідчать про перспективність siРНК-технологій для
підвищення рівня стійкості кукурудзи до водного дефіциту.
THE ELEVATION OF FREE PROLINE CONTENT IN OSMOTOLERANT TRANSGENIC
CORN PLANTS WITH dsRNA SUPPRESSOR OF PROLINE DEHYDROGENASE GENE
S.I. Mykhalska1, L.E. Sergeeva1, A.Yu. Matveyeva1, N.I. Kobernik1, A.V. Kochetov2,
O.M. Tishchenko1, V.V. Morgun1
1Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine
31/17 Vasylkivska St., Kyiv, 03022, Ukraine
2Institute of Cytology and Genetics, Russian Academy of Sciences
10 Lavrent’ev Pr., Novosibirsk, 630090, Russia
The transgenic corn plants (Zea mays L.) were obtained via in planta Agrobacterium-mediated
transformation by LBA4404 strain harboring pBi2E with dsRNA suppressor of proline dehydroge-
nase gene. Their seeds survived under lethal water deficit simulating by mannitol. High levels of
free proline in shoots of osmotolerant T2-plants under water stress were observed. Those data indi-
cate the promising scope of siRNA technologies towards maize water deficit tolerance.
Key words: maize (Zea mays L.), proline, dsRNA suppressor of proline dehydrogenase gene,
Agrobacterium-mediated transformation in planta.
489
ПОВЫШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
|