Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці
За допомогою мультиплексних полімеразних ланцюгових реакцій на основі STS-маркерів РРО29 і РРО33 проаналізовано алельні варіанти генів поліфенолоксидази (РРО), які пов’язані з потемнінням борошна пшениці. В більшості сортів ідентифіковано фрагменти 391 та 490 пар нуклеотидів, що зумовлюють високу ак...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Физиология растений и генетика |
|---|---|
| Datum: | 2014 |
| Hauptverfasser: | , , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України
2014
|
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/159463 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці / А.І. Степаненко, А.В. Трояновська, Б.В. Моргун, Т.В. Чугункова, Л.Г. Великожон, О.І. Рибалка, С.С. Поліщук // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 490-497. — Бібліогр.: 18 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-159463 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Степаненко, А.І. Трояновська, А.В. Моргун, Б.В. Чугункова, Т.В. Великожон, Л.Г. Рибалка, О.І. Поліщук, С.С. 2019-10-04T20:42:36Z 2019-10-04T20:42:36Z 2014 Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці / А.І. Степаненко, А.В. Трояновська, Б.В. Моргун, Т.В. Чугункова, Л.Г. Великожон, О.І. Рибалка, С.С. Поліщук // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 490-497. — Бібліогр.: 18 назв. — укр. 2308-7099 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/159463 633.11:577.21 За допомогою мультиплексних полімеразних ланцюгових реакцій на основі STS-маркерів РРО29 і РРО33 проаналізовано алельні варіанти генів поліфенолоксидази (РРО), які пов’язані з потемнінням борошна пшениці. В більшості сортів ідентифіковано фрагменти 391 та 490 пар нуклеотидів, що зумовлюють високу активність ферменту і відповідають алелям Рро-А1а, Рро-D1b. Виявлено зразки з комплексом алелів низької активності поліфенолоксидази. С помощью мультиплексных полимеразных цепных реакций на основе STS-маркеров РРО29 и РРО33 проанализированы аллельные варианты генов полифенолоксидазы (РРО), связанные с потемнением муки пшеницы. У большинства сортов идентифицированы фрагменты 391 и 490 пар нуклеотидов, которые обусловливают высокую активность фермента и соответствуют аллелям Рро-А1а и Рро-D1b. Выявлены образцы с комплексом аллелей низкой активности полифенолоксидазы. The allelic variation of polyphenol oxidase genes (PPO) associated with browning of wheat flour were defined using STS-markers PPO33 and PPO29. For most cultivars studied 391 bp and 490 bp fragments with high activity (PPO-A1a and PPO-D1b) were identified. The samples with complex of alleles determining low activity of polyphenol oxidase were revealed. uk Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України Физиология растений и генетика Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці Маркерный анализ генов полифенолоксидазы (РРО) в сортах мягкой пшеницы Marker analysis of polyphenol oxidase genes (PPO) in bread wheat cultivars Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці |
| spellingShingle |
Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці Степаненко, А.І. Трояновська, А.В. Моргун, Б.В. Чугункова, Т.В. Великожон, Л.Г. Рибалка, О.І. Поліщук, С.С. |
| title_short |
Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці |
| title_full |
Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці |
| title_fullStr |
Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці |
| title_full_unstemmed |
Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці |
| title_sort |
маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (рро) у сортах м'якої пшениці |
| author |
Степаненко, А.І. Трояновська, А.В. Моргун, Б.В. Чугункова, Т.В. Великожон, Л.Г. Рибалка, О.І. Поліщук, С.С. |
| author_facet |
Степаненко, А.І. Трояновська, А.В. Моргун, Б.В. Чугункова, Т.В. Великожон, Л.Г. Рибалка, О.І. Поліщук, С.С. |
| publishDate |
2014 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Физиология растений и генетика |
| publisher |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Маркерный анализ генов полифенолоксидазы (РРО) в сортах мягкой пшеницы Marker analysis of polyphenol oxidase genes (PPO) in bread wheat cultivars |
| description |
За допомогою мультиплексних полімеразних ланцюгових реакцій на основі STS-маркерів РРО29 і РРО33 проаналізовано алельні варіанти генів поліфенолоксидази (РРО), які пов’язані з потемнінням борошна пшениці. В більшості сортів ідентифіковано фрагменти 391 та 490 пар нуклеотидів, що зумовлюють високу активність ферменту і відповідають алелям Рро-А1а, Рро-D1b. Виявлено зразки з комплексом алелів низької активності поліфенолоксидази.
С помощью мультиплексных полимеразных цепных реакций на основе STS-маркеров РРО29 и РРО33 проанализированы аллельные варианты генов полифенолоксидазы (РРО), связанные с потемнением муки пшеницы. У большинства сортов идентифицированы фрагменты 391 и 490 пар нуклеотидов, которые обусловливают высокую активность фермента и соответствуют аллелям Рро-А1а и Рро-D1b. Выявлены образцы с комплексом аллелей низкой активности полифенолоксидазы.
The allelic variation of polyphenol oxidase genes (PPO) associated with browning of wheat flour were defined using STS-markers PPO33 and PPO29. For most cultivars studied 391 bp and 490 bp fragments with high activity (PPO-A1a and PPO-D1b) were identified. The samples with complex of alleles determining low activity of polyphenol oxidase were revealed.
|
| issn |
2308-7099 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/159463 |
| citation_txt |
Маркерний аналіз генів поліфенолоксидази (РРО) у сортах м'якої пшениці / А.І. Степаненко, А.В. Трояновська, Б.В. Моргун, Т.В. Чугункова, Л.Г. Великожон, О.І. Рибалка, С.С. Поліщук // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 490-497. — Бібліогр.: 18 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT stepanenkoaí markerniianalízgenívpolífenoloksidazirrousortahmâkoípšenicí AT troânovsʹkaav markerniianalízgenívpolífenoloksidazirrousortahmâkoípšenicí AT morgunbv markerniianalízgenívpolífenoloksidazirrousortahmâkoípšenicí AT čugunkovatv markerniianalízgenívpolífenoloksidazirrousortahmâkoípšenicí AT velikožonlg markerniianalízgenívpolífenoloksidazirrousortahmâkoípšenicí AT ribalkaoí markerniianalízgenívpolífenoloksidazirrousortahmâkoípšenicí AT políŝukss markerniianalízgenívpolífenoloksidazirrousortahmâkoípšenicí AT stepanenkoaí markernyianalizgenovpolifenoloksidazyrrovsortahmâgkoipšenicy AT troânovsʹkaav markernyianalizgenovpolifenoloksidazyrrovsortahmâgkoipšenicy AT morgunbv markernyianalizgenovpolifenoloksidazyrrovsortahmâgkoipšenicy AT čugunkovatv markernyianalizgenovpolifenoloksidazyrrovsortahmâgkoipšenicy AT velikožonlg markernyianalizgenovpolifenoloksidazyrrovsortahmâgkoipšenicy AT ribalkaoí markernyianalizgenovpolifenoloksidazyrrovsortahmâgkoipšenicy AT políŝukss markernyianalizgenovpolifenoloksidazyrrovsortahmâgkoipšenicy AT stepanenkoaí markeranalysisofpolyphenoloxidasegenesppoinbreadwheatcultivars AT troânovsʹkaav markeranalysisofpolyphenoloxidasegenesppoinbreadwheatcultivars AT morgunbv markeranalysisofpolyphenoloxidasegenesppoinbreadwheatcultivars AT čugunkovatv markeranalysisofpolyphenoloxidasegenesppoinbreadwheatcultivars AT velikožonlg markeranalysisofpolyphenoloxidasegenesppoinbreadwheatcultivars AT ribalkaoí markeranalysisofpolyphenoloxidasegenesppoinbreadwheatcultivars AT políŝukss markeranalysisofpolyphenoloxidasegenesppoinbreadwheatcultivars |
| first_indexed |
2025-11-25T16:10:12Z |
| last_indexed |
2025-11-25T16:10:12Z |
| _version_ |
1850517661300031488 |
| fulltext |
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКА. 2014. Т. 46. № 6
УДК 633.11:577.21
МАРКЕРНИЙ АНАЛІЗ ГЕНІВ ПОЛІФЕНОЛОКСИДАЗИ (РРО) У
СОРТАХ М’ЯКОЇ ПШЕНИЦІ
А.І. СТЕПАНЕНКО1, А.В. ТРОЯНОВСЬКА2, Б.В. МОРГУН1,3, Т.В. ЧУГУНКОВА3,
Л.Г. ВЕЛИКОЖОН3, О.І. РИБАЛКА2,3, С.С. ПОЛІЩУК2
1Інститут клітинної біології та генетичної інженерії Національної академії наук
України
03143 Київ, вул. Академіка Заболотного, 148
e-mail: molgen@icbge.org.ua
2Селекційно-генетичний інститут—Національний центр насіннєзнавства та
сортовивчення Національної академії аграрних наук України
65036 Одеса, Овідіопольська дорога, 3
3Інститут фізіології рослин і генетики Національної академії наук України
03022 Київ, вул. Васильківська, 31/17
За допомогою мультиплексних полімеразних ланцюгових реакцій на основі STS-
маркерів РРО29 і РРО33 проаналізовано алельні варіанти генів поліфенолокси-
дази (РРО), які пов’язані з потемнінням борошна пшениці. В більшості сортів
ідентифіковано фрагменти 391 та 490 пар нуклеотидів, що зумовлюють високу
активність ферменту і відповідають алелям Рро-А1а, Рро-D1b. Виявлено зразки з
комплексом алелів низької активності поліфенолоксидази.
Ключові слова: Triticum aestivum L., поліфенолоксидаза, гени РРО, полімеразна
ланцюгова реакція, молекулярні маркери.
Тісто, отримане з борошна біло- і червонозерних сортів пшениці, має
різну здатність до потемніння. Ферментативне побуріння сировини в
процесі технологічної переробки є небажаним явищем, яке може істот-
но впливати на товарний вигляд продуктів із зерна пшениці. Передусім
це стосується таких продуктів, як локшина, різні сорти плоского білого
хліба, млинці, вареники, макарони тощо. Особливо негативно по-
темніння впливає на якість продуктів із білозерних сортів пшениці, які,
за визначенням, повинні мати високу білизну і відповідну споживчу
вартість. Встановлено, що зміна забарвлення тіста має генетичну приро-
ду [18]. Тому спеціалісти провідних науково-дослідних центрів світу ве-
дуть селекцію сортів м’якої і твердої пшениці з використанням джерел,
у яких відсутня ознака потемніння тіста, а також ретельно контролюють
її в процесі схрещувань.
Ключову роль у перебігу реакції потемніння відіграє фермент
поліфенолоксидаза (ПФО, РРО; КФ 1.10.3.2 або КФ 1.14.18.1, відомий
також як тирозиназа). Загалом це складний фізіолого-біохімічний про-
цес, зумовлений активністю кількох ферментів, які каталізують окиснен-
ня киснем повітря амінокислоти тирозину з утворенням темнозабарвле-
них меланінів. ПФО виявляють у більшості як рослинних, так і
тваринних тканин. В організмі тварин і людини вона бере участь в утво-
ренні меланінів — пігментів шкіри, волосся, райдужної оболонки ока.
© А.І. СТЕПАНЕНКО, А.В. ТРОЯНОВСЬКА, Б.В. МОРГУН, Т.В. ЧУГУНКОВА, Л.Г. ВЕЛИКОЖОН, О.І. РИБАЛКА,
С.С. ПОЛІЩУК, 2014
490
Потемніння зрізів картоплі, фруктів, грибів, та інших рослинних тканин
переважно або й повністю залежить від її дії. ПФО окиснює дубильні ре-
човини чайного листка, зумовлює колір житнього хліба, родзинок та ін.
Зміна забарвлення причавлених фруктів та овочів на коричневе (зазви-
чай), червоне чи синє також є результатом дії цього ферменту. До 50 %
втрат свіжих тропічних фруктів в усьому світі пов’язують з ним. Йдеть-
ся не лише про небажаний колір, а й про втрату поживних речовин, на-
буття побічного присмаку та загальне зниження якості плодів [18]. У
харчовій промисловості його в основному вивчають з метою запобіган-
ня ферментативному потемнінню продуктів при виготовленні виробів з
борошна з підвищеною активністю ПФО.
Відомо, що активність ПФО в сортах твердої пшениці нижча, ніж
у сортах гексаплоїдної м’якої пшениці (Triticum aestivum L.). Вона зрос-
тає з дозріванням зерна і досягає максимуму в ендоспермі на 21—25-ту
добу після запилення. В сухому зрілому зерні пшениці та борошні фер-
мент знаходиться в неактивній формі [4, 5].
За синтез ферменту ПФО відповідають гени РРО, які представлені
мультигенною родиною і розміщені в різних локусах [12]. У багатьох
культур, зокрема картоплі, томату, цукрової тростини, квасолі, гени РРО
вже клоновані й секвеновані [2, 5, 7]. Схарактеризовано також структу-
ру генів ПФО у різних видів диплоїдної (T. monococcum, T. urartu, Aegilops
tauschii, Ae. speltoides), тетраплоїдної (T. turgidum ssp. dicoccoides i durum)
та гексаплоїдної (T. aestivum Klasic ID377s) пшениці [3, 10].
У праці [17] вперше доведено, що підвищена активність алелів РРО
пов’язана з хромосомами 2АL та 2DL. Низька активність цього фермен-
ту залежить від генів, які локалізовані у хромосомах 2В, 3D, 6B [4, 6].
Результати сучасних досліджень підтвердили, що активність ПФО визна-
чається в основному алелями РРО хромосом другої гомеологічної групи
геномів пшениці А і D [4, 11, 15, 16].
Для визначення алельного складу генів, які кодують ПФО пше-
ниці, ефективними виявились маркери STS (sequence tagged site). Так, із
використанням двох кодомінантних функціональних STS-маркерів
РРО18 [14] i PPO33 [8] та двох комплементарних домінантних STS-мар-
керів РРО16 і РРО29 [8] було протестовано 57 сортів пшениці з різних
агрокліматичних зон Індії [12]. Маркери РРО18 та РРО33 ідентифікують
фрагменти, які відповідають алелям Рро-А1а тa Ppo-A1b з високою й
низькою активністю ферменту ПФО. В результаті використання марке-
ра РРО16 при дослідженні 41 сорту виявлено фрагмент, що вказує на на-
явність алеля Ppo-D1a, який зумовлює низьку активність ПФО. У 16 із
41 проаналізованого генотипу таких продуктів ампліфікації не виявлено,
що може свідчити про наявність у рослинному матеріалі алеля Ppo-D1b,
який відповідає за високу активність ферменту. В тих же 16 генотипах за
використання комплементарного STS-маркера РРО29 було ампліфікова-
но фрагмент, який відповідає алелю Ppo-D1b. Це доводить, що компле-
ментарні домінантні STS-маркери досить ефективні для проведення
маркер-супровідної селекції (MAS) пшениці, і можуть бути використані
в селекційних програмах. Перспективним є створення сортів пшениці,
геноми яких містять гени низької активності ферменту ПФО, адже при
виготовленні виробів з борошна таких пшениць ризик потемніння буде
значно меншим [3].
Слід зазначити, що сорти пшениці української селекції практично
не досліджували у напрямі встановлення алельного складу генів РРО.
491
МАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ (РРО)
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Разом з тим в Україні ініційовано селекційну програму зі створення
сортів пшениці з низькою активністю ПФО. Для ефективної реалізації
такого завдання актуальним є застосування сучасних методів MAS-се-
лекції.
Метою наших досліджень була валідація STS-маркерів РРО29,
РРО33 для виявлення алельного поліморфізму генів Рро-А1 та Ppo-D1 у
сортах, синтетичних лініях і амфідиплоїдах м’якої пшениці.
Методика
Матеріалом дослідження було зерно 143 сортів пшениці вітчизняної та
зарубіжної селекції, 39 ліній білозерної озимої м’якої пшениці та 64
амфідиплоїди. Загальну ДНК виділяли зі шроту пришвидшеним мо-
дифікованим ЦТАБ-методом [13]. Алельний стан генів ПФО досліджу-
вали за допомогою мультиплексних полімеразних ланцюгових реакцій
(ПЛР) із використанням STS-маркерів РРО29, РРО33 [8]. Для гена Рро-
А1 (маркер РРО33) застосовували праймери: (F) 5'-CCA GAT ACA CAA
CTG CTG GC-3'; (R) 5'-TGA TCT TGA GGT TCT CGT CG-3', розмір
очікуваних ампліконів — 391 і 582 пн, згідно з базою даних Генетично-
го банку (GenBank, The National Center for Biotechnology Information).
Умови ампліфікації: первинна денатурація 94 °С 4 хв та 34 цикли: дена-
турація 94 °С 30 с, реасоціація 59 °С 30 с, елонгація 72 °С 1 хв, кінцева
елонгація 72 °С 5 хв. Для визначення алельного стану гена Ppo-D1 (мар-
кер РРО29) використовували праймери: (F) 5'-TGA AGC TGC CGG TCA
TCT AC-3'; (R) 5'-AAG TTG CCC ATG TCC TCG CC-3', розмір очіку-
ваного амплікона 490 пн. Програма мультиплексної низхідної (touch-
down) ПЛР: первинна денатурація 94 °С 3 хв та 8 циклів: 94 °С 30 с, ре-
асоціація 68 °С 30 с (з кожним циклом температуру знижували на 1 °С),
елонгація 72 °С 1 хв та 25 циклів, кінцева елонгація 72 °С 5 хв. У роботі
застосовували праймери до референтного гена пшениці ТаТМ20 (934 пн)
із послідовностями: (F) 5'-AAG GGT TGC TCC TCT TCG CGA TCT
TG-3'; (R) 5'-GTA CAT GCC AGC ACC GTA TGG ATT G-3' [1, 9]. Про-
дукти ампліфікації розділяли методом електрофорезу в 1,2 %-му агароз-
ному гелі з додаванням бромистого етидію на основі 1 SB електродно-
го буфера.
Результати та обговорення
Для визначення алельного стану генів ПФО у сортах пшениці проводи-
ли їх тестування за допомогою STS-маркерів РРО33, РРО29. Як уже за-
значалось, використання двох кодомінантних функціональних маркерів
РРО18 та РРО33 [12] дає змогу виявити алелі, локалізовані на хромосомі
2А. РРО18 ідентифікує послідовності 685 та 876 пн, які відповідають але-
лям Рро-А1а, Рро-А1b з високою й низькою активністю ферменту. При
проведенні ПЛР з маркером РРО33 очікували амплікони розміром 290 і
481 пн відповідно для алелів Рро-А1а, Рро-А1b [8, 12]. Однак ми спос-
терігали амплікони 391 та 582 пн, що підтверджено аналізом нуклеотид-
ної послідовності гена Рро-А1 з Генетичного банку.
Комплементарні домінантні маркери РРО16, РРО29 виявляють ли-
ше по одному фрагменту — 713 і 490 пн — на хромосомі 2D, які визна-
чають алелі Ppo-D1a з низькою активністю й Ppo-D1b з високою ак-
тивністю ПФО [12].
492
А.И. СТЕПАНЕНКО, А.В. ТРОЯНОВСКАЯ, Б.В. МОРГУН и др.
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Результати аналізу ДНК досліджених сортів пшениці за допомогою
STS-маркера РРО33 засвідчили, що вони є носіями алеля Рро-А1а, який
відповідає за високу активність ферменту ПФО. На всіх проаналізованих
електрофореграмах були амплікони завдовжки 391 пн. Типову електро-
фореграму наведено на рис. 1.
Водночас у сортах Єдність (доріжки 6, 7, рис. 2) та Білява ідентифіко-
вано алель Рро-А1b, який зумовлює низьку активність ферменту ПФО.
Слід зазначити, що серед проаналізованого матеріалу (рис. 2, 3)
траплялись сорти, зокрема Заграва, Гілея, Фаворитка та інші, в яких
493
МАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ (РРО)
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Рис. 1. Електрофореграма мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції до гена Рро-А1
та референтного гена пшениці ТаТМ20 :
1, 2 — Золотоколоса; 3, 4 — Солоха; 5, 6 — Смуглянка; 7, 8 — Славна; 9, 10 — Чорнява; 11, 12 —
Спасівка; 13, 14 — Сотниця; 15, 16 — Полянка; 17 — ТЕ буфер; 18 — позитивний контроль на алель
Рро-А1а, лінія 3118; 19 — позитивний контроль на алель Рро-А1b, лінія 3162; М — тут і на рис. 2—4
маркер молекулярної маси GeneRulerТМ DNA Ladder Mix
Рис. 2. Електрофореграма мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції до гена Рро-А1
та референтного гена пшениці ТаТМ20 :
1 — Дворянка; 2, 3 — Древлянка; 4, 5 — Скарбниця; 6, 7 — Єдність; 8, 9 — Доброчинна; 10, 11 — За-
грава; 12 — позитивний контроль на алель Рро-А1а, лінія 3118; 13 — позитивний контроль на алель Рро-
А1b, лінія 3162
Рис. 3. Електрофореграма мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції до гена Рро-А1
та референтного гена пшениці ТаТМ20 :
1 — Борія; 2 — Фаворитка; 3 — Княгиня Ольга; 4 — Заграва; 5, 6 — Солоха; 7, 8 — Донецька 46; 9,
10 — Херсонська б/о; 11 — ТЕ буфер; 12, 13 — Антонівка; 14, 15 — Nirit; 16 — позитивний контроль
на алель Рро-А1а, лінія 3118; 17 — позитивний контроль на алель Рро-А1b, лінія 3162; 18, 19 — Ми-
ронівська 65; 20, 21 — Гілея
934 пн
582 пн
391 пн
1000 пн
500 пн
300 пн
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 М
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М
1000 пн
500 пн
300 пн
934 пн
582 пн
391 пн
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 М 12 13 14 15 16 17 М 18 19 20 21
934 пн
582 пн
391 пн
крім амплікону 391 пн (гени високої активності ферменту) проявлявся
також амплікон завдовжки 582 пн та нерозпізнаний амплікон близько
500 пн, що може свідчити про поліморфізм ДНК у цьому локусі й гете-
рогенність досліджуваного матеріалу.
Для ідентифікації алеля Ppo-D1b, пов’язаного з високою активністю
ПФО, використовували STS-маркер РРО29, який виявляє один фраг-
мент завдовжки 490 пн. На рис. 4 наведено типову електрофореграму
мультиплексної ПЛР до алелів гена, що кодують синтез ферменту ПФО
в геномі D.
Загалом було показано, що хромосома 2 геному D більшості про-
аналізованих сортів містила алель Ppo-D1b, який визначає високу ак-
тивність ПФО. Як зазначено у праці [12], де для аналізу генів РРО в ге-
номі D було використано крім маркера РРО29 також комплементарний
домінантний маркер РРО16, за відсутності в сорті алеля Ppo-D1b у ньому
має бути алель Ppo-D1а, який відповідає за низьку активність ферменту.
Цей встановлений факт ми використали у своїй роботі. У таблиці наведе-
но результати аналізу сортів за алельним станом генів Рро-А1, Рро-D1.
Аналіз сортів за наявністю алелів гена РРО у геномах А і D показав,
що більшість із них несе алелі високої активності ПФО — до 98,6 % Рро-
А1а та до 66,4 % Ppo-D1b. Разом з тим два сорти з алелями низької ак-
тивності ПФО в обох досліджених геномах можуть бути донорами у
відповідних селекційних програмах.
Крім сортів ми проаналізували також лінії білозерної пшениці.
Більшість із 39 зразків (32) містили алель Рро-А1а (82,1 %). У геномах
інших ліній було виявлено алелі низької активності ПФО — Рро-А1b
(17,9 %). Стосовно геному D фрагмент завдовжки 490 пн, який
відповідає алелю Рро-D1b, траплявся серед проаналізованого матеріалу з
частотою в 46,6 %, тобто розподіл алелів високої і низької активності
ПФО виявився приблизно однаковим. Результати маркерного аналізу
свідчать про перспективність ліній білозерної пшениці для отримання
селекційного матеріалу з низькою активністю ПФО.
Аналіз амфідиплоїдів показав наявність у 59 (92,2 %) із 64 про-
аналізованих зразків алеля Рро-А1а. Серед них виявлено 5 зразків з
ампліконами 582 та близько 500 пн, які ідентифікувалися також у дея-
ких досліджених сортах пшениці.
Цікавий розподіл алелів гена поліфенолоксидази у геномі D. Серед
усіх генотипів амфідиплоїдів лише один зразок був носієм алеля високої
активності Ppo-D1b. Це означає, що решта зразків досліджених амфідип-
лоїдів містили алель Ppo-D1а низької активності ферменту.
494
А.И. СТЕПАНЕНКО, А.В. ТРОЯНОВСКАЯ, Б.В. МОРГУН и др.
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Рис. 4. Електрофореграма мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції до гена Рро-D1
та референтного гена пшениці ТаТМ20 :
1, 2 — Золотоколоса; 3, 4 — Солоха; 5, 6 — Смуглянка; 7, 8 — Славна; 9 — Чорнява; 10 — ТЕ буфер;
11 — позитивний контроль на алель Рро-D1b, сорт Антонівка; 12, 13 — Спасівка; 14, 15 — Сотниця; 16,
17 — Полянка; 18, 19 — Борія; 20, 22 — позитивний контроль на алель Рро-D1b, сорт Антонівка; 21 —
негативний контроль на алель Рро-D1b, сорт Білява
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 М 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 М
1000 пн
500 пн
934 пн
490 пн
Отже, в результаті проведеного маркерного аналізу виявлено, що
майже всі проаналізовані сорти пшениці у хромосомі 2 геному А містять
алель Рро-А1а, який визначає високу активність ферменту ПФО. Серед
новоствореного селекційного матеріалу білозерної пшениці частота
трапляння цього алеля становить 82,1 %. Частота алеля Ppo-D1b, який
також визначає високу активність ПФО, для сортів становила 66,4 %,
для ліній білозерної пшениці — 46,6 %, для амфідиплоїдів — лише 1,6 %,
тобто у більшості створених амфідиплоїдів у геномі D переважають гени
низької активності ПФО.
Ми довели, що використання молекулярно-генетичних маркерів мо-
же бути ефективним для аналізу геномів пшениці на наявність алелів,
відповідальних за активність ПФО. Такий підхід є сучасним і перспектив-
ним для створення сортів пшениці з новими оригінальними ознаками.
1. Степаненко А.І., Моргун Б.В., Чугункова Т.В. та ін. Скринінг сортів озимої м’якої пше-
ниці на наявність пшенично-житньої транслокації за ДНК-маркерами // Вісн. Укр.
495
МАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ (РРО)
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Розподіл сортів пшениці за алельним станом генів, які визначають активність ферменту
поліфенолоксидази
Генотип Очікувана
активність ПФО
Сорт
Рро-А1а
Рро-D1b
Висока Актер (Akteur), Альбатрос одеський, Безоста 1,
Благодарка, Борвій, Бунчук, Ватажок, Вихованка,
Вікторія, Гармонія, Дворянка, Доброслава, Доброчин,
Донецька 46,* Досконала, Дюк, Епоха, Жайвір,
Журавка, Задумка, Заможність, Запорука, Здобуток,
Землячка, Зиск, Зміна, Знахідка, Золотоколоса,
Зорепад, Кірія, Княгиня Ольга, Колега, Колумбія,
Корелі, Косовиця, Красень, Куяльник, Лад, Лановий,
Ластівка одеська, Лебідка, Литанівка, Лідер,
Миронівська 61, Миронівська 65, Наталка, Небокрай,
Нива одеська, Ніконія, Новокиївська, Новосмуглянка,
Одеська 51, Писанка, Повага, Подяка, Поліська 90,
Полянка, Польовик, Пошана, Селянка, Славна,
Соломія, Солоха, Статна, Супутниця, Трипільська,
Турунчук, Українка, Українська 246, Хист, Чорнява,
Ятрань 60, Bankuti, Federer, Glenlea, Oslo
Ppo-A1a/b**,
Ppo-D1b
Висока Антонівка, Аранка, Володарка, Гілея, Гурт,
Доброчинна, Донецька 46,* Древлянка, Заграва,
Зимоярка, Крижинка, Миронівська 808, Пивна,
Торчинська, Трізо, Тюбальт, Фаворитка, Nirit
Рро-А1а/b**,
Ppo-D1a
Висока Гренні, Миронівська 30, Панна, Херсонська б/о,*
Хуторянка, Chinese spring, Norin 16
Ppo-A1a,
Ppo-D1a
Висока Білоцерківська н/к, Богдана, Борія, Годувальниця,
Господиня, Грездівлиця, Дальницька, Донецька 48,
Донська н/к, Звитяга, Золото України, Істина,
Київська остиста, Ласуня, Ліона, Ліра, Місія, Недра,
Нива Київщини, Новосибірська 67, Одеська 265,
Одеська 267, Отаман, Переяславка, Пилипівка,
Подолянка, Скарбниця, Служниця, Смуглянка,
Соната, Сонечко, Сотниця, Спасівка, Ужинок,
Херсонська б/о*, Чорноброва, Щедрівка Київська,
Bobwhite, Marquis, Norin 35
Ppo-A1b,
Ppo-D1a
Низька Білява, Єдність
*Для сортів Донецька 46 та Херсонська б/о спостерігали гетерогенність вихідного
матеріалу.
**Генотипи з невизначеним ампліконом.
тов-ва генетиків і селекціонерів. — 2012. — 10, № 2. — С. 311—318.
2. Anderson J.V., Fuerst E.P., Hurkman W.J. et al. Biochemical and genetic characterization of
wheat (Triticum spp.) kernel polyphenol oxidases // J. Cereal Sci. — 2006. — 44, N 3. —
P. 353—367.
3. Chang C., Zhang H.P., Xu J. et al. Variation in two PPO genes associated with polyphenol oxi-
dase activity in seeds of common wheat // Euphytica. — 2007. — 154. — P. 181—193.
4. Demeke T., Morris C.F., Campbelle K.J. et al. Wheat polyphenol oxidase // Crop Sci. — 2001. —
41, N 6. — P. 1750—1757.
5. Demeke T., Morris C. Molecular characterization of wheat polyphenol oxidase (PPO) //
Theor. Appl. Genet. — 2002. — 104, N 5. — P. 813—818.
6. Fuerst E.P., Xu S.S., Beecher B. Genetic characterization of kernel polyphenol oxidase in
wheat and related species // J. Cereal. Sci. — 2008. — 48. — P. 359—368.
7. He X.Y., He Z.H., Morris C.F., Xia X.C. Cloning and phylogenetic analysis of polyphenol oxi-
dase genes in common wheat and related species // Genet. Res. Crop Evolution. — 2009. —
56, N 3. — P. 311—321.
8. He X.Y., He Z.H., Zhang L.P. et al. Allelic variation of polyphenol oxidase (PPO) genes loca-
ted on chromosomes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes
in common wheat // Theor. Appl. Genet. — 2007. — 115. — P. 47—58.
9. Kim Y.Y., Kim D.Y., Donghwan Shim et al. Expression of the novel wheat gene TM20 confers
enhanced cadmium tolerance to bakers’ yeast // J. Biol. Chem. — 2008. — 283, N 23. —
P. 15893—15902.
10. Massa A.N., Beecher B. Polyphenol oxidase (PPO) in wheat and wild relatives: molecular evi-
dence for a multigene family // Theor. Appl. Genet. — 2007. — 114. — P. 1239—1247.
11. Raman R., Raman H., Martin P. Functional gene markers for polyphenol oxidase locus in
bread wheat (Triticum aestivum L.) // Mol. Breed. — 2007. — 19, N 4. — P. 315—328.
12. Singh R., Goutam U., Gupta R. et al. Allelic variations of functional markers for polyphenol
oxidase (PPO) genes in Indian bread wheat (Triticum aestivum L.) cultivars // J. Genet. —
2009. — 88, N 3. — P. 325—329.
13. Stewart C.N., Via L.E. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprin-
ting and other PCR applications // Bio Techniques. — 1993. — 14, N 5. — P. 748—749.
14. Sun D.J., He Z.H., Xia X.C. et al. A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in bread
wheat // Mol. Breed. — 2005. — 16, N 3. — P. 209—218.
15. Sun Y., He Z., Ma W., Xia X. Alternative splicing in the coding region of Ppo-A1 directly
influences the polyphenol oxidase activity in common wheat (Triticum aestivum L.) // Funct.
Integr. Genomics. — 2011. — 11, N 1. — P. 85—93.
16. Vatanabe N., Takeuchi A., Nakayama A. Inheritance and chromosomal location of the homeo-
logous genes affecting phenol color reaction of kernels in durum wheat // Euphytica. —
2004. — 139. — P. 87—93.
17. Wrigley C.W., McIntoch R.A. Genetic control of factors regulating of phenol reaction of wheat
and rye grain // Wheat Inf. Serv. — 1975. — 40. — P. 6—10.
18. Chemical changes in food during processing / Ed. by Thomas Richardson, John W. Finley. —
New York: AVI Book; Van Nostrand Reinhold Company, 1986. — 519 p.
Отримано 29.09.2014
МАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ (РРО) В СОРТАХ
МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ
А.И. Степаненко1, А.В. Трояновская2, Б.В. Моргун1,3, Т.В. Чугункова3, Л.Г. Великожон3,
А.И. Рыбалка2,3, С.С. Полищук2
1Институт клеточной биологии и генетической инженерии Национальной академии наук
Украины, Киев
2Селекционно-генетический институт—Национальный центр семеноведения и сортоизу-
чения Национальной академии аграрных наук Украины, Одесса
3Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины, Киев
С помощью мультиплексных полимеразных цепных реакций на основе STS-маркеров
РРО29 и РРО33 проанализированы аллельные варианты генов полифенолоксидазы (РРО),
связанные с потемнением муки пшеницы. У большинства сортов идентифицированы
фрагменты 391 и 490 пар нуклеотидов, которые обусловливают высокую активность фер-
мента и соответствуют аллелям Рро-А1а и Рро-D1b. Выявлены образцы с комплексом ал-
лелей низкой активности полифенолоксидазы.
496
А.И. СТЕПАНЕНКО, А.В. ТРОЯНОВСКАЯ, Б.В. МОРГУН и др.
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
MARKER ANALYSIS OF POLYPHENOL OXIDASE GENES (PPO) IN BREAD WHEAT
CULTIVARS
A.I. Stepanenko1, A.V. Troyanovska2, B.V. Morgun1,3, T.V. Chugunkova3, L.G. Velykozhon3,
A.I. Rybalka2,3, S.S. Polischuk2
1Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine
148 Akademika Zabolotnoho St., Kyiv, 03143, Ukraine
2Plant Breeding and Genetics Institute—National Center of Seed and Cultivars Investigation,
National Academy of Agricultural Sciences of Ukraine
3 Ovidiopolska road, Odesa, 65036, Ukraine
3Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine
31/17 Vasylkivska St., Kyiv, 03022, Ukraine
The allelic variation of polyphenol oxidase genes (PPO) associated with browning of wheat
flour were defined using STS-markers PPO33 and PPO29. For most cultivars studied 391 bp
and 490 bp fragments with high activity (PPO-A1a and PPO-D1b) were identified. The samples
with complex of alleles determining low activity of polyphenol oxidase were revealed.
Key words: Triticum aestivum L., polyphenol oxidase, PPO genes, polymerase chain reaction,
molecular markers.
497
МАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ (РРО)
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
|