Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929
Виконано порівняльне дослідження функціонального і метаболічного потенціалу фібробластів клітинної лінії L 929 за умов моношарового (2D) і об'ємного (3D) культивування. З'ясовано, що спосіб культивування фібробластів впливає на їхню життєздатність і проліферативний потенціал. Зокрема, піс...
Saved in:
| Published in: | Доповіді НАН України |
|---|---|
| Date: | 2019 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2019
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/160136 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 / А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна // Доповіді Національної академії наук України. — 2019. — № 8. — С. 93-101. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-160136 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Моісєєв, А.І. Божок, Г.А. Горіна, О.Л. 2019-10-24T14:30:37Z 2019-10-24T14:30:37Z 2019 Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 / А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна // Доповіді Національної академії наук України. — 2019. — № 8. — С. 93-101. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. 1025-6415 DOI: doi.org/10.15407/dopovidi2019.08.093 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/160136 611.013.395.085.23 Виконано порівняльне дослідження функціонального і метаболічного потенціалу фібробластів клітинної лінії L 929 за умов моношарового (2D) і об'ємного (3D) культивування. З'ясовано, що спосіб культивування фібробластів впливає на їхню життєздатність і проліферативний потенціал. Зокрема, після об'ємного культивування фібробластів протягом 7 діб виявлено, що кількість життєздатних клітин та їхній проліферативний потенціал вірогідно (р < 0,05) перевищували аналогічні показники після моношарового культивування. За даними гель-проникної хроматографії встановлені достовірні відмінності за кількісним та якісним складом речовин білково-пептидної природи в середовищах культивування клітин у 2D і 3D форматах. Особливу увагу привертають результати щодо розбіжності за кількістю пептидів у діапазоні молекулярних мас 705 1607 Да у середовищі об'ємного культивування, що може бути наслідком активного синтезу ростових факторів. Отримані результати свідчать про істотний вплив об'ємного (3D) культивування на синтетичні і морфофункціональні показники фібробластів клітинної лінії L 929 порівняно з 2D форматом. The comparative study of the functional and metabolic potentials of fibroblasts of cell line L 929 under conditions of the monolayer (2D) and threedimensional cultivations is performed. It is found that the method of cultivation of fibroblasts affects their viability and proliferative potential. In particular, it is shown that, after the volumetric cultivation of fibroblasts during 7 days, the number of viable cells and their proliferative potential significantly (p < 0.05) exceed similar indicators after the monolayer cultivation. According to data of the gel permeation chromatography, we established significant differences (p < 0.05) in the quantitative and qualitative compositions of proteinpeptide substances in cell culture media in 2D and 3D formats. Special attention is attracted by the results on the difference in the amounts of peptides in the range of molecular masses (705—1607 Da) in the medium of volumetric cultivation, which may be due to the active synthesis of growth factors. The results obtained indicate that the volumetric cultivation has a significant impact on the synthetic and morphofunctional indicators of fibroblasts of the cell line L 929 in comparison with the 2D format. Выполнено сравнительное исследование функционального и метаболического потенциала фибробластов клеточной линии L 929 в условиях монослойного (2D) и объемного (3D) культивирования. Показано, что способ культивирования фибробластов влияет на их жизнеспособность и пролиферативный потенциал. В частности, после объемного культивирования фибробластов в течение 7 сут установлено, что количество жизнеспособных клеток и их пролиферативный потенциал достоверно (р < 0,05) превышали аналогичные показатели после монослойного культивирования. По данным гель-проникающей хроматографии установлены достоверные отличия (р < 0,05) по количественному и качественному составу веществ белково-пептидной природы в средах культивирования клеток в 2D и 3D форматах. Особое внимание привлекают результаты по отличию количества пептидов в диапазоне молекулярных масс 705—1607 Да в среде объемного культивирования, что может быть следствием активного синтеза ростовых факторов. Полученные результаты свидетельствуют о значительном влиянии объемного (3D) культивирования на синтетические и морфофункциональне показатели фибробластов клеточной линии L 929 по сравнению с 2D форматом. uk Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Доповіді НАН України Біологія Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 The comparative characteristic of monolayer and three-dimensional cultivations of the continuous cell line of fibroblasts L 929 Сравнительная характеристика трёхмерного и монослойного культивирования перевиваемой линии фибробластов L 929 Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 |
| spellingShingle |
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 Моісєєв, А.І. Божок, Г.А. Горіна, О.Л. Біологія |
| title_short |
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 |
| title_full |
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 |
| title_fullStr |
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 |
| title_full_unstemmed |
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 |
| title_sort |
порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів l 929 |
| author |
Моісєєв, А.І. Божок, Г.А. Горіна, О.Л. |
| author_facet |
Моісєєв, А.І. Божок, Г.А. Горіна, О.Л. |
| topic |
Біологія |
| topic_facet |
Біологія |
| publishDate |
2019 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Доповіді НАН України |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
The comparative characteristic of monolayer and three-dimensional cultivations of the continuous cell line of fibroblasts L 929 Сравнительная характеристика трёхмерного и монослойного культивирования перевиваемой линии фибробластов L 929 |
| description |
Виконано порівняльне дослідження функціонального і метаболічного потенціалу фібробластів клітинної лінії L 929 за умов моношарового (2D) і об'ємного (3D) культивування. З'ясовано, що спосіб культивування
фібробластів впливає на їхню життєздатність і проліферативний потенціал. Зокрема, після об'ємного культивування фібробластів протягом 7 діб виявлено, що кількість життєздатних клітин та їхній проліферативний потенціал вірогідно (р < 0,05) перевищували аналогічні показники після моношарового культивування.
За даними гель-проникної хроматографії встановлені достовірні відмінності за кількісним та якісним
складом речовин білково-пептидної природи в середовищах культивування клітин у 2D і 3D форматах.
Особливу увагу привертають результати щодо розбіжності за кількістю пептидів у діапазоні молекулярних мас 705 1607 Да у середовищі об'ємного культивування, що може бути наслідком активного синтезу
ростових факторів. Отримані результати свідчать про істотний вплив об'ємного (3D) культивування на
синтетичні і морфофункціональні показники фібробластів клітинної лінії L 929 порівняно з 2D форматом.
The comparative study of the functional and metabolic potentials of fibroblasts of cell line L 929 under conditions
of the monolayer (2D) and threedimensional
cultivations is performed. It is found that the method of
cultivation of fibroblasts affects their viability and proliferative potential. In particular, it is shown that, after the
volumetric cultivation of fibroblasts during 7 days, the number of viable cells and their proliferative potential
significantly (p < 0.05) exceed similar indicators after the monolayer cultivation.
According to data of the gel permeation chromatography, we established significant differences (p < 0.05) in
the quantitative and qualitative compositions of proteinpeptide
substances in cell culture media in 2D and
3D formats. Special attention is attracted by the results on the difference in the amounts of peptides in the range
of molecular masses (705—1607 Da) in the medium of volumetric cultivation, which may be due to the active
synthesis of growth factors. The results obtained indicate that the volumetric cultivation has a significant
impact on the synthetic and morphofunctional indicators of fibroblasts of the cell line L 929 in comparison
with the 2D format.
Выполнено сравнительное исследование функционального и метаболического потенциала фибробластов клеточной линии L 929 в условиях монослойного (2D) и объемного (3D) культивирования. Показано,
что способ культивирования фибробластов влияет на их жизнеспособность и пролиферативный потенциал. В частности, после объемного культивирования фибробластов в течение 7 сут установлено, что количество жизнеспособных клеток и их пролиферативный потенциал достоверно (р < 0,05) превышали
аналогичные показатели после монослойного культивирования.
По данным гель-проникающей хроматографии установлены достоверные отличия (р < 0,05) по количественному и качественному составу веществ белково-пептидной природы в средах культивирования клеток в 2D и 3D форматах. Особое внимание привлекают результаты по отличию количества пептидов в диапазоне молекулярных масс 705—1607 Да в среде объемного культивирования, что может быть
следствием активного синтеза ростовых факторов. Полученные результаты свидетельствуют о значительном влиянии объемного (3D) культивирования на синтетические и морфофункциональне показатели фибробластов клеточной линии L 929 по сравнению с 2D форматом.
|
| issn |
1025-6415 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/160136 |
| citation_txt |
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії фібробластів L 929 / А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна // Доповіді Національної академії наук України. — 2019. — № 8. — С. 93-101. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT moísêêvaí porívnâlʹnaharakteristikatrivimírnogotamonošarovogokulʹtivuvannâpereŝeplûvanoílíníífíbroblastívl929 AT božokga porívnâlʹnaharakteristikatrivimírnogotamonošarovogokulʹtivuvannâpereŝeplûvanoílíníífíbroblastívl929 AT gorínaol porívnâlʹnaharakteristikatrivimírnogotamonošarovogokulʹtivuvannâpereŝeplûvanoílíníífíbroblastívl929 AT moísêêvaí thecomparativecharacteristicofmonolayerandthreedimensionalcultivationsofthecontinuouscelllineoffibroblastsl929 AT božokga thecomparativecharacteristicofmonolayerandthreedimensionalcultivationsofthecontinuouscelllineoffibroblastsl929 AT gorínaol thecomparativecharacteristicofmonolayerandthreedimensionalcultivationsofthecontinuouscelllineoffibroblastsl929 AT moísêêvaí sravnitelʹnaâharakteristikatrehmernogoimonosloinogokulʹtivirovaniâperevivaemoiliniifibroblastovl929 AT božokga sravnitelʹnaâharakteristikatrehmernogoimonosloinogokulʹtivirovaniâperevivaemoiliniifibroblastovl929 AT gorínaol sravnitelʹnaâharakteristikatrehmernogoimonosloinogokulʹtivirovaniâperevivaemoiliniifibroblastovl929 |
| first_indexed |
2025-11-27T00:45:16Z |
| last_indexed |
2025-11-27T00:45:16Z |
| _version_ |
1850789264663511040 |
| fulltext |
93ISSN 10256415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2019. № 8: 93—101
На сьогодні відомо, що трансплантація фібробластів є одним із перспективних методів в об
ласті регенеративної медицини. Доведено, що моношарова культура фібробластів, яка ши
роко використовується в доклінічних випробуваннях, за багатьма параметрами не відобра
жає справжньої картини зростання і диференціювання клітин на рівні організму, де велике
значення мають міжклітинні взаємодії [1]. Тому альтернативою моношаровій культурі як
інформативні модельні системи можуть використовуватися мультиклітинні сфероїди
(МС), в яких умови функціонування фібробластів максимально наближені до умов in vivo.
За сто сування сфероїдів як модельних систем може надати нові можливості в області реге
неративної медицини.
Відомо, що одним із способів отримання багатоклітинних сфероїдів є культивування
в неадгезивних умовах (Carlsson, Yuhas, 1984; Ivascu, Kubbies, 2006; Friedrich et al., 2009).
© А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна, 2019
https://doi.org/10.15407/dopovidi2019.08.093
УДК 611.013.395.085.23
А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків
Email: bozhokgaru@gmail.com
Порівняльна характеристика тривимірного
та моношарового культивування
перещеплюваної лінії фібробластів L 929
Представлено академіком НАН України А.М. Гольцевим
Виконано порівняльне дослідження функціонального і метаболічного потенціалу фібробластів клітинної лі
нії L 929 за умов моношарового (2D) і об’ємного (3D) культивування. З’ясовано, що спосіб культивування
фібробластів впливає на їхню життєздатність і проліферативний потенціал. Зокрема, після об’ємного куль
тивування фібробластів протягом 7 діб виявлено, що кількість життєздатних клітин та їхній проліфера
тивний потенціал вірогідно (р < 0,05) перевищували аналогічні показники після моношарового культивування.
За даними гельпроникної хроматографії встановлені достовірні відмінності за кількісним та якісним
складом речовин білковопептидної природи в середовищах культивування клітин у 2D і 3D форматах.
Особ ливу увагу привертають результати щодо розбіжності за кількістю пептидів у діапазоні молекуляр
них мас 705—1607 Да у середовищі об’ємного культивування, що може бути наслідком активного синтезу
рос тових факторів. Отримані результати свідчать про істотний вплив об’ємного (3D) культивування на
синтетичні і морфофункціональні показники фібробластів клітинної лінії L 929 порівняно з 2D форматом.
Ключові слова: моношарове і об’ємне культивування, фібробласти, речовини білковопептидної природи,
проліферативний потенціал.
94 ISSN 10256415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2019. № 8
А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна
Ос кільки в таких умовах клітини не здатні прикріплятися до поверхні культивування, вони
самоорганізовуються в агрегати, що містять від одного до декількох типів клітин. Вста нов
лено, що клітини, культивовані у складі багатоклітинних утворень, відрізняються від клі
тин моношарових культур за деякими структурнофункціональними ознаками [2, 3].
Однак отримання життєздатних клітин у складі МС в неадгезивних умовах є непростим
завданням. Зокрема, в роботі [4], було встановлено, що на життєздатність і на повноцінну
дифузію поживних речовин сформованих клітинних конгломератів впливають їхні розмі
ри, які залежать від посівної концентрації клітин. Тому дослідження безпосередньо впливу
об’ємного культивування клітин на їхні функціональні та метаболічні показники в порів
нянні з моношаровою культурою є актуальним завданням.
З огляду на вищесказане за мету дослідження ставилося вивчення в порівняльному
аспекті функціонального і метаболічного потенціалу фібробластів клітинної лінії L 929 за
умов моношарового (2D) і об’ємного (3D) культивування.
Матеріали та методи. Дослідження виконані на перещеплюваній лінії клітин L929, от
риманій після чотирьох пасажів з кріоконсервованої культури, що зберігалася при –196 °С.
Клітини культивували в живильному середовищі DMEM/F12 (“Biowest”, Франція) з до
даванням антибіотиків (200 Од/мл бензилпеніциліну (“Arterium”, Україна), 200 мкг/мл
стрептоміцину (“Arterium”, Україна)) та 10 % фетальної телячої сироватки при 37 °С в атмо
сфері з 5 % СО2. Для культивування моношарової культури використовували пластикові
флакони (“SPL Life Sciences”, Корея). МС отримували на чашках Петрі з площею поверхні
росту 22,1 см2 (“TPP”, Швейцарія), які попередньо обробляли 2 % розчином агару (“Ferak”,
Німеччина) для утворення низькоадгезивної поверхні. Посівна концентрація фіброблас
тів для моношарової культури та культури МС становила 2 ⋅ 105 кл/мл. Культивування про
водили протягом 7 діб, на 3тю добу здійснювали заміну середовища.
На 3тю та 7му добу збирали МС і моношарову культуру шляхом обробки 1 : 1 суміш
шю 0,5 % трипсину (“Sigmа”, США) та розчину Версену (“PAA”, США) у співвідношенні
1 : 1, витримували 5 хв і відмивали від ферментного розчину середовищем DMEM/F12.
У випадку МС розчин трипсину—Версену використовували для дезінтеграції на поодино
кі клітини. Досліджували загальну кількість та збереженість фібробластів за стандартною
методикою за допомогою забарвлення 0,4 %м розчином трипанового синього. Аналіз от
риманих результатів проводили за формулою Життєздатність = а/с⋅100 %, де а — кількість
клітин, які не забарвлювалися; с — загальна кількість клітин [5].
Для оцінки регенераційного потенціалу моношарової культури відтворювали модель
ушкодження моношару “ранової поверхні” у вигляді подряпини [6]. Такий метод харак
теризує міграцію і ступінь проліферації фібробластів. Ушкодження наносили на клітин
ну культуру зі 100 % конфлюентністю моношару, який пошкоджували за допомогою плас
тикового наконечника (для піпетдозатора об’ємом 200 мкл) діаметром 0,8 мм. Після від
творення подряпини поверхні оцінювали площу “загоєння” через 24 и 48 год за допомогою
програми Zeiss LSM Image Examiner.
Спектр низькомолекулярних речовин білковопептидної природи, що містяться в зраз
ках середовищ після 7 діб культивування, оцінювали за допомогою рідинної гельхро ма
то графії [7] на пластиковій колонці (1,6 × 40 см), заповненій полівініловим гелем TSKGel
Toyopearl 1HW40 Fine (“Toyo Soda”, Японія). Об’єм проби становив 0,2 мл. Як елюєнт ви
95ISSN 10256415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2019. № 8
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії...
користовували фосфатносольовий буфер
(Na2HPO4/ NaH2PO4 30 мM, NaCl 100 мM;
pH 7,4). Колонку калібрували стандартни
ми маркерними білками — БСА (67 кДа),
овальбумін (45 кДа) та декстран блакит
ний (2000 кДа).
Статистичний аналіз експерименталь
них даних здійснювали за допомогою ком
п’ю тер ної обробки з використанням про
грамного пакета “STATGRAPHIC plus for
Windows” версії 2.1 за непараметричним
критерієм Манна—Уітні. Експери мента ль
ні дані наведені як се реднє арифметичне ±
середнє квадратичне відхилення. Ступінь
вірогідності становив 0,05.
Результати та їх обговорення. На пер
шому етапі експерименту отримували куль
туру клітинної лінії фібробластів при по
сівній концентрації 2 ⋅ 105 кл/мл і двох варіантах культивування — за стандартних умов
на адгезивній (моношарова культура, 2D) та неадгезив ній (культура 3D) поверхні протягом
7 діб. У першу чергу після моношарового і об’ємного культивування фібробластів у неад
гезивних умовах протягом 7 діб оцінювали життєздатність клітин за трипановим синім
(рис. 1). З рис. 1 видно, що життєздатність фіб робластів після моношарового і об’ємного
куль тивування не відрізнялася на 3тю добу, але після культивування фібробластів у фор
маті 2D протягом 7 діб кількість життєздатних клітин ста новила 68 ± 2,3 %, що було значу
ще (р < 0,05) менше значень даного показника після 3D культивування (88 ± 3,0 %).
Результати нашого дослідження узгоджуються з літературними даними щодо життєздат
ності клітин після культивування в 2D і 3D форматі [8—11].
Для вивчення функціонального (проліферативного) потенціалу клітин після культи
вування в 2D і 3D форматі відтворювали модель пошкодження моношару у вигляді под
ряпини. Відомо, що моделювання рани in vitro на моношарових культурах дає можливість
вивчати такі параметри поведінки клітин, як швидкість міграції і проліферації. Беручи до
уваги особливості міжклітинних взаємодій у 3D форматі, ми зосередились на питанні впли
ву об’ємного культивування на проліферативний потенціал фібробластів після міграції з
МС і формування моношару. Для цього сфероїди після культивування протягом 7 діб пе
реміщували на адгезивну поверхню. Початок прикріплення сфероїдів (80 % МС) до адге
зивної поверхні було зареєстровано вже через годину культивування, при цьому 100 % при
кріплення МС до культуральної поверхні було визначено через 5 год. Міграцію клітин з
МС і формування моношару виявлено через 24 год після перенесення сфероїдів в адгезивні
умови.
Після 100 % конфлюентності клітин двох форматів (2D і 3D) на наступному етапі робо
ти відтворювали експериментальну “подряпину” і оцінювали проліферативний потенціал
клітин за площею ушкодження через 24 і 48 год культивування. З рис. 2, а, б видно, що через
Рис. 1. Життєздатність фібробластів лінії L 929 за
умов моношарового та об’ємного культивування; * —
відмінності вірогідні порівняно з моношаровою куль
турою фібробластів відповідної доби культивування
(р < 0,05)
96 ISSN 10256415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2019. № 8
А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна
24 год площа ушкодження моношару в культурі, отриманій в умовах 2D і 3D, зменшувала
ся на 33 і 72 % відповідно порівняно з початковою площею ушкодження (див. рис. 2, в, г).
Після 48годинного культивування повноцінне загоєння ушкодженого моношару спосте
рігалося тільки у випадку фібробластів, які отримували після 3D культивування (рис. 3, б).
При цьому площа ушкодження моношару фібробластів, отриманих в умовах 2D культиву
вання, становила 20 % порівняно з початковою площею ушкодження. Таким чином, про
ліферативний потенціал клітин після розпластування сфероїдів вірогідно (р < 0,05) збіль
шувався порівняно з аналогічним показником після моношарового культивування, що свід
чить про істотний вплив об’ємного культивування на функціональні показники клітин.
Для оцінки метаболічної активності фібробластів залежно від умов отримання клітин
на наступному етапі роботи методом гельпроникної хроматографії було досліджено спектр
речовин білковопептидної природи в середовищах культивування через 7 діб. Результати
досліджень наведені в таблиці і на рис. 3.
Рис. 2. Моношар фібробластів після відтворення “подряпини” і через 24 і 48 год культивування: а — по
чаткова площа ушкодження моношару фібробластів, отриманих за стандартних умов культивування;
б — площа ушкодження моношару фібробластів, отриманих за стандартних умов культивування через
24 год після “подряпини”; в — площа ушкодження моношару фібробластів, отриманих за стандартних
умов культивування через 48 год після “подряпини”; г — початкова площа ушкодження моношару фібро
бластів, отриманих за умов 3D культивування; д — площа ушкодження моношару фібробластів, отрима
них за умов 3D культивування через 24 год після “подряпини”; е — моношар фібробластів, отриманих за
умов 3D культивування, через 48 год після відтворення “подряпини”. Збільшення: об. ×20, ок. ×10
97ISSN 10256415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2019. № 8
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії...
З рис. 3 і таблиці видно, що хроматографічні профілі усіх досліджених середовищ ма
ли по 10—11 основних піків та різнилися за загальною площею під піками. Так, у середови
щі після культивування клітин у 3D форматі загальна площа під піками, що прямо пропо
рційна загальній кількості речовин у середовищі, істотно не відрізнялася від контролю (се
редовище до культивування), але цей показник був нижче порівняно з моношаровою куль
турою в 1,3 раза (2304,70 ± 4,06 та 3043,06 ± 2,92 мм2 відповідно). При цьому кількісний і
якісний склад пептидів у середовищах після моношарового і об’ємного культивування мали
значні відмінності.
Серед основних піків у середовищах до та після культивування культур домінували піки 1
(середня молекулярна маса �12000 Да), 3 (середня молекулярна маса близько 3791—4345 Да),
8 (середня молекулярна маса близько 1302—1328 Да) та 13 (середня молекулярна маса
близько 490—498 Да). Основним за площею для всіх варіантів виявився пік 1: 54,14 ± 8,45 %
загальної площі під піками у контролі, 41,37 ± 2,92 % у середовищі після культивування мо
ношару та 43,16 ± 0,40 % у середовищі після 3Dкультури. Також істотним за кількістю ре
човин пептиднобілкової природи був пік 3, який містив пептиди в діапазоні молекуляр
Рис. 3. Типові хроматограми середовищ після 7до бового культивування фібробластів лінії L 929 у 2D
та 3D форматі. Як контроль використовували живильне середовище на основі DMEM/F12 та 10 %
фетальної телячої сироватки (пластикова колонка 1,6 × 40 см, гель TSK Toyopeas 1HW40 Fine). 1—13 —
виявлені піки
98 ISSN 10256415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2019. № 8
А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна
них мас 4345—3791 Да. При цьому в контролі пік 3 мав найменше значення — 4,75 ± 0,18 %,
що у 7,4 та 6 разів нижче, ніж у середовищах після культивування моношару та 3Dкультури.
Інша картина спостерігалася для піків 5, 9 та 13. Зокрема, пік 5 (2301—2205 Да) складав в
контролі 2,81 ± 0,09 %, що в 1,9 раза було більше даного показника порівняно з 2D і 3D фор
матом культивування. Кількість пептидів у діапазоні молекулярних мас 1067—1045 Да і
498—490 у контрольному середовищі також достовірно (р < 0,05) перевищувала відповідні
показники після 2D та 3D форматів. Інша картина спостерігалася при аналізі піка 11 (мо
лекулярна маса 705—718 Да), який зареєстровано в усіх трьох варіантах середовищ, але в
контролі кількість пептидів даного піка перевищувала показники моношарового культи
вування в 2,53 раза, при цьому була вірогідно меншою в 7,2 раза відносно 3D культиву
ван ня. Піки 2 (5657—5691 Да) і 7 (1600 Да) взагалі не виявлені в контрольному середовищі,
у свою чергу, пептиди з молекулярними масами 3184 і 781 Да не зареєстровані в середови
щах після моношарового та об’ємного культивування.
Необхідно відзначити той факт, що в результаті порівняння спектра і кількості пептидів
у середовищах безпосередньо після 2D та 3D культивування протягом 7 діб виявлені віро
гідні відмінності (див. таблицю). Особливу увагу привертають піки 7 (1600 Да), 9 (1067—
1045 Да) та 11 (705—718 Да). Зокрема, після культивування клітин в умовах 3D встановле
на поява піка 7 з відсотковим вмістом від загальної площі 1,41 ± 0,09 %. У результаті аналізу
піка 9 (1067—1045 Да) встановлено збільшення пептидів у даному молекулярному діапазо
ні в 4 рази саме після об’ємного культивування. Також значні відмінності залежно від умов
Аналіз пептидного складу (%) середовищ після 7добового культивування
фібробластів лінії L 929, вирощених у моношарі та 3Dкультурі
Пік
Молекулярна
маса, Да
Живильне середовище
на основі DMEM/
F12 та 10 % фетальної
телячої сироватки
Середовище після
культивування
моношару
Середовище після
культивування
3Dкультури
1 �12 000 54,14 ± 0,38 41,37 ± 0,80 43,16 ± 0,40
2 5691—5657 — 2,70 ± 0,11 2,23 ± 0,24
3 4345—3791 4,75 ± 0,18 35,20 ± 0,26# 28,37 ± 0,16#
4 3184 3,47 ± 0,10 — —
5 2301—2205 2,81 ± 0,09 1,45 ± 0,18# 1,48 ± 0,21#
6 1867—1821 3,55 ± 0,07 2,24 ± 0,12# 1,75 ± 0,30#
7 1600 — — 1,41 ± 0,09
8 1328—1302 13,13 ± 0,34 9,24 ± 0,19# 7,25 ± 0,27#
9 1067—1045 2,01 ± 0,09 0,21 ± 0,08# 0,84 ± 0,10*#
10 781 1,04 ± 0,11 — —
11 718—705 2,63 ± 0,41 0,92 ± 0,11# 6,66 ± 0,39*#
12 621—616 2,41 ± 0,12 1,90 ± 0,09# 1,98 ± 0,11#
13 498—490 10,07 ± 0,23 4,78 ± 0,18# 4,88 ± 0,15#
Загальна площа піків, мм2 2125,99 ± 8,45 3043,06 ± 2,92# 2304,70 ± 4,06*
* Відмінності вірогідні порівняно з культурою після 2D культивування (р < 0,05).
# Відмінності вірогідні порівняно з середовищем культивування DMEM/F12 та 10 % фетальної телячої
сироватки, р < 0,05
99ISSN 10256415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2019. № 8
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії...
культивування за кількістю речовин пептиднобілкової природи зареєстровані в молеку
лярному діапазоні 705—718 Да. Зокрема, пік 11 складав у середовищі після культивування
моношару 0,92 ± 0,11 % загальної площі під піками, а після об’ємного культивування —
6,66 ± 0,39 %.
Для решти піків після порівняльного аналізу встановлено характерне зменшення вміс
ту речовин після 7добового культивування фібробластів як у 2D, так і в 3D форматі від
носно показників контрольного середовища (див. таблицю).
Встановлені в наших дослідженнях розбіжності щодо складу середовищ МС порівняно
з моношаровою культурою узгоджуються з результатами досліджень [1, 12, 13]. Зокрема,
у роботах [1, 12] показано, що після дво та тривимірного культивування синтез фібро блас
тами білків позаклітинного матриксу значно відрізняється.
Таким чином, аналіз спектра речовин за молекулярною масою може частково пояснити
істотні відмінності функціонального потенціалу клітин після об’ємного і моношарового
культивування. Особливу увагу привертають результати щодо розбіжності за кількістю
сполук у діапазоні низькомолекулярних мас (705—1607 Да) залежно від умов культивуван
ня, що може бути наслідком активного синтезу ростових факторів, молекул міжклітинного
матриксу та інших біологічних речовин, а також пояснити переваги функціональної актив
ності МС порівняно з моношаровою культурою. Підтвердженням цього факту є результати
досліджень щодо прискорення відновлення ушкодженого після “подряпини” моношару в
умовах 3D культивування порівняно з 2D.
Отже, на підставі результатів досліджень доходимо висновку, що культивування в 3D
умовах сприяє підвищенню функціональних показників фібробластів клітинної лінії L 929.
Однак для поглиблення розуміння метаболічних особливостей фібробластів після об’ємного
культивування необхідні подальші дослідження цього питання, зокрема з’ясування складу
речовин у молекулярному діапазоні мас 705—1607 Да.
ЦИТОВАНА ЛІТЕРАТУРА
1. Кожина К.В., Сабурина И.Н., Горкун А.А., Зурина И.М., Кошелева Н.В., Волкова Е.Н., Морозов С.Г.
Сравнительный анализ воздействия р199 на 2D и 3D культуру дермальных фибробластов человека.
Патогенез. 2015. № 4. С. 34—40.
2. Кошелева Н.В., Ильина И.В., Кожина К.В., Зурина И.М., Роскова А.Е., Горкун А.А., Овчинников А.В.,
Агранат М.Б., Морозов С.Г., Сабурина И.Н. Разработка клеточной модели на основе лазерной микро
хирургии сфероидов для изучения процессов репарации. Онтогенез. 2017. 48, № 1. С. 63—72. https://
doi.org/10.7868/S0475145017010074
3. Плаксина Е.М., Сидоренко О.С., Легач Е.И., Коваленко І.Ф., Божок Г.А. Экспрессия βIIIтубулина в
культуре клеток неонатальных надпочечников: сравнение монослойного и 3Dкультивирования. Вісн.
Харків. нац. унту ім. В.Н. Каразіна. Сер. Біологія. 2017. Вип. 28. С. 76—86. https://doi.org/10.26565/2075
54572017289
4. Божок Г.А., Моісєєв А.І., Горіна О.Л., Моісєєва Н.М. Вплив посівної концентрації фібробластів L929
на морфофункціональні властивості 3D культури. The development of medical sciences: problems and
solutions: Proceedings of the International research and practical conference (Brno, 27—28 april, 2018). Brno,
2018. P. 135—138.
5. Armitage W.J., Mazur P. Osmotic tolerance of human granulocytes. Am. J. Physiol. 1984. 247, № 5. P. 373—
381. https://doi.org/10.1152/ajpcell.1984.247.5.C373
6. Denker S.P., Barber D.L. Cell migration requires both ion translocation and cytoskeletal anchoring by the
NaH exchanger NHE1. J. Cell Biol. 2002. 159, № 6. P. 1087—1096. https://doi.org/10.1083/jcb.200208050
100 ISSN 10256415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2019. № 8
А.І. Моісєєв, Г.А. Божок, О.Л. Горіна
7. Белоус А.М., Мохамед А.Н., Семенченко А.Ю., Яворская В.А. Исследование уровня пептидов “средних
молекул” в плазме крови больных с различными формами острых нарушений мозгового кровообраще
ния. Допов. Нац. акад. наук Укр. 1997. № 8. C. 177—181.
8. Cheng N.C., Wang N.C., Cheng S., Young T.H. The influence of spheroid formation of human adiposede
rived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 2012. 33, Iss. 6.
P. 1748—1758. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2011.11.049
9. Sato R., Yasukawa T., Kacza J., Eichler W., Nishiwaki A., Iandiev I., Ohbayashi M., Kato A., Yafai Y., Brin
gmann A., Takase A., Ogura Y., Seeger J., Wiedemann P. Threedimensional spheroidal culture visualization
of membranogenesis of Bruch’s membrane and basolateral functions of the retinal pigment epithelium.
Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2013. 54, № 3. P. 1740—1749. https://doi.org/10.1167/iovs.1210068
10. Kubatiev A.A., Zurina I.M., Kosheleva N.V., Gorkun A.A., Saburina I.N., Repin V.S. From 2D cell phenotypes
to 3D live highcontent imaging: new ways to windows. J. Cytol. Histol. 2015. 6, № 6. https://doi.
org/10.4172/21577099.1000378
11. Antoni D., Burckel H., Josset E., Noel G. Threedimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int. J. Mol.
Sci. 2015. 16, № 3. P. 5517—5527. https//doi.org/10.3390/ijms16035517
12. Sangmyung R. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Exp. Mol.
Med. 2009. 41, № 12. P. 858—865. https://doi.org/10.3858/emm.2009.41.12.096
13. Eleanor K., Przyborski S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissuelike structures to be
created in vitro. J. Anat. 2015. 227, № 6. P. 746—756. https://doi.org/10.1111/joa.12257
Надійшло до редакції 10.04.2019
REFERENCES
1. Kozina, K. V., Saburina, I. N., Gorkun, A. A., Zurina, I. N., Kosheleva, N. V., Volkova, E. N. & Morozov, S. G.
(2015). Comparative study of p199 effect on 2D and 3D cultures of human dermal fibroblasts. Pathogenesis,
No. 4, pp. 3440 (in Russian).
2. Kosheleva, N. V., Il’ina, I. V., Kozhina, K. V., Zurina, I. V., Roskova, A. E., Gorkun, A. A., Ovchinnikov, A. V.,
Agranat, M. B., Morozov, S. G. & Saburina, I. N. (2017). Cellular model based on laser microsurgery ofcells
spheroids to study the repair process. Ontogenez, 48, No. 1, pp. 6372 (in Russian). https://doi.org/10.7868/
S0475145017010074
3. Plaksina, K. M., Sidorenko, O. S., Legach, Y. I., Kovalenko, I. F. & Bozhok, G. A. (2017). Expression of βIII
tubulin in the neonatal adrenal cell culture: comparison of monolayer and 3Dculture. The Journal of V.N.
Karazin Kharkiv National University, Ser. Biology, Iss. 28, pp. 7686 (in Ukrainian). https://doi.
org/10.26565/207554572017289
4. Bozhok, G. A., Moisieiev, A. I., Gorina, O. L. & Moisieieva, N. N. (2018, April). The effect of sowing
concentration of fibroblasts on the morphofunctional properties of 3D culture. Proceedings of the Interna
tional Research and Practical Conference The development of medical sciences: problems and solutions.
(pp. 135138), Brno.
5. Armitage, W. J. & Mazur, P. (1984). Osmotic tolerance of human granulocytes. Am. J. Physiol., 247, No. 5,
pp. 373381. https://doi.org/10.1152/ajpcell.1984.247.5.C373
6. Denker, S. P. & Barber, D. L. (2002). Cell migration requires both ion translocation and cytoskeletal anchoring
by the NaH exchanger NHE1. J. Cell Biol., 159, No. 6, pp. 10871096. https://doi.org/10.1083/
jcb.200208050
7. Belous, А. М., Mokhamed, А. N., Semenchenko, A. Yu. & Yavorskaya, V. A. (1997). Research of level of
peptides of “middle molecules” in plasma of blood of patients with the different forms of violations of cerebral
circulation of blood. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr., No. 8, pp. 177181 (in Russian).
8. Cheng, N. C., Wang, N. C., Cheng, S. & Young, T. H. (2012). The influence of spheroid formation of human
adiposederived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials, 33,
Iss. 6, pp. 17481758. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2011.11.049
9. Sato, R., Yasukawa, T., Kacza, J., Eichler, W., Nishiwaki A., Iandiev, I., Ohbayashi, M., Kato, A., Yafai, Y.,
Bringmann, A., Takase, A., Ogura, Y., Seeger, J. & Wiedemann, P. (2013). Threedimensional spheroidal cul tu re
visualization of membranogenesis of Bruch’s membrane and basolateral functions of the retinal pigment epi
thelium. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 54, No. 3, pp. 17401749. https://doi.org/10.1167/iovs.1210068
101ISSN 10256415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2019. № 8
Порівняльна характеристика тривимірного та моношарового культивування перещеплюваної лінії...
10. Kubatiev, A. A., Zurina, I. M., Kosheleva, N. V., Gorkun, A. A., Saburina, I. N. & Repin, V. S. (2015). From 2D
cell phenotypes to 3D live highcontent imaging: new ways to windows. J. Cytol. Histol., 6, No. 6. https://doi.
org/10.4172/21577099.1000378
11. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E. & Noel, G. (2015). Threedimensional cell culture: a breakthrough in vivo.
Int. J. Mol. Sci., 16, No. 3, pp. 5517–5527. https://doi.org/10.3390/ijms16035517
12. Sangmyung, R. (2009). Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Exp.
Mol., Med, 41, No. 12, pp. 858865. https://doi.org/10.3858/emm.2009.41.12.096
13. Eleanor, K. & Przyborski, S. (2015). Advances in 3D cell culture technologies enabling tissuelike structures
to be created in vitro. J. Anat., 227, No. 6, pp. 746756. https://doi.org/10.1111/joa.12257
Received 10.04.2019
А.И. Моисеев, Г.А. Божок, О.Л. Горина
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков
Email: bozhokgaru@gmail.com
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРЁХМЕРНОГО И МОНОСЛОЙНОГО
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ ФИБРОБЛАСТОВ L 929
Выполнено сравнительное исследование функционального и метаболического потенциала фиброблас
тов клеточной линии L 929 в условиях монослойного (2D) и объемного (3D) культивирования. Показано,
что способ культивирования фибробластов влияет на их жизнеспособность и пролиферативный потен
циал. В частности, после объемного культивирования фибробластов в течение 7 сут установлено, что ко
личество жизнеспособных клеток и их пролиферативный потенциал достоверно (р < 0,05) превышали
аналогичные показатели после монослойного культивирования.
По данным гельпроникающей хроматографии установлены достоверные отличия (р < 0,05) по ко
личественному и качественному составу веществ белковопептидной природы в средах культивирова
ния клеток в 2D и 3D форматах. Особое внимание привлекают результаты по отличию количества пепти
дов в диапазоне молекулярных масс 705—1607 Да в среде объемного культивирования, что может быть
следствием активного синтеза ростовых факторов. Полученные результаты свидетельствуют о значитель
ном влиянии объемного (3D) культивирования на синтетические и морфофункциональне показатели фи
бробластов клеточной линии L 929 по сравнению с 2D форматом.
Ключевые слова: монослойное и объёмное культивирование, фибробласты, соединения белковопептидной
природы, пролиферативный потенциал.
A.I. Moisieiev, G.A. Bozhok, O.L. Gorina
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the NAS of Ukraine, Kharkiv
Email: bozhokgaru@gmail.com
THE COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF MONOLAYER AND THREEDIMENSIONAL
CULTIVATIONS OF THE CONTINUOUS CELL LINE OF FIBROBLASTS L 929
The comparative study of the functional and metabolic potentials of fibroblasts of cell line L 929 under condi
tions of the monolayer (2D) and threedimensional cultivations is performed. It is found that the method of
cultivation of fibroblasts affects their viability and proliferative potential. In particular, it is shown that, after the
volumetric cultivation of fibroblasts during 7 days, the number of viable cells and their proliferative potential
significantly (p < 0.05) exceed similar indicators after the monolayer cultivation.
According to data of the gel permeation chromatography, we established significant differences (p < 0.05) in
the quantitative and qualitative compositions of proteinpeptide substances in cell culture media in 2D and
3D formats. Special attention is attracted by the results on the difference in the amounts of peptides in the range
of molecular masses (705—1607 Da) in the medium of volumetric cultivation, which may be due to the active
synthesis of growth factors. The results obtained indicate that the volumetric cultivation has a significant
impact on the synthetic and morphofunctional indicators of fibroblasts of the cell line L 929 in comparison
with the 2D format.
Keywords: monolayer and volumetric cultivations, fibroblasts, proteinpeptide substances, proliferative potential.
|