Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах
Показано, что детонационные наноалмазы (ДНА) проявляют антиоксидантную активность in vitro и in vivo. При пероральном введении лабораторным животным ДНА снижают уровень перекисного окисления белков в эритроцитах, ингибируют липопероксидацию и перекисное окисление белков в плазме, в случае введения ж...
Збережено в:
| Дата: | 2017 |
|---|---|
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України
2017
|
| Назва видання: | Сверхтвердые материалы |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/160153 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах / И.В. Шугалей, А.С. Боровикова, А.П. Возняковский, М.А. Илюшин // Сверхтвердые материалы. — 2017. — № 5. — С. 37-48. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-160153 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1601532025-02-09T13:36:03Z Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах Detonation nanodiamonds as antioxidants in various test systems Шугалей, И.В. Боровикова, А.С. Возняковский, А.П. Илюшин, М.А. Получение, структура, свойства Показано, что детонационные наноалмазы (ДНА) проявляют антиоксидантную активность in vitro и in vivo. При пероральном введении лабораторным животным ДНА снижают уровень перекисного окисления белков в эритроцитах, ингибируют липопероксидацию и перекисное окисление белков в плазме, в случае введения животным прооксиданта – NaNO₂-ДНА, эффективно защищают животных от химически индуцированного окислительного стресса. Результаты тестирования позволяют рекомендовать ДНА в качестве потенциальных антиоксидантов для коррекции оксидативных повреждений. Показано, що детонаційні наноалмази (ДНА) виявляють антиоксидантну активність in vitro та in vivo. При пероральному введенні лабораторним тваринам ДНА знижують рівень перекисного окислення білків в еритроцитах, інгібують ліпопероксидацію і перекисне окислення білків в плазмі, у разі введення тваринам прооксіданта – NaNO₂-ДНА, ефективно захищають тварин від хімічно індукованого окислювального стресу. Результати тестування дозволяють рекомендувати ДНА в якості потенційних антиоксидантів для корекції оксидативних пошкоджень. Nanodiamons of detonation synthesis (DND) were shown to exhibit antioxidant activity both in vitro and in vivo. DND being introduced into laboratory animals with oral introduction lower protein peroxidation in red cells, inhibit peroxidation of lipids and proteins in serum. DND also protect laboratory animals from oxidative stress induced with the help of NaNO₂. The results of the testing form the experimental basis to recommend DND as potential antioxidant for correcting oxidative damage of different origin. 2017 Article Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах / И.В. Шугалей, А.С. Боровикова, А.П. Возняковский, М.А. Илюшин // Сверхтвердые материалы. — 2017. — № 5. — С. 37-48. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. 0203-3119 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/160153 577.12-022.53:539.211:615.2 ru Сверхтвердые материалы application/pdf Інститут надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Получение, структура, свойства Получение, структура, свойства |
| spellingShingle |
Получение, структура, свойства Получение, структура, свойства Шугалей, И.В. Боровикова, А.С. Возняковский, А.П. Илюшин, М.А. Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах Сверхтвердые материалы |
| description |
Показано, что детонационные наноалмазы (ДНА) проявляют антиоксидантную активность in vitro и in vivo. При пероральном введении лабораторным животным ДНА снижают уровень перекисного окисления белков в эритроцитах, ингибируют липопероксидацию и перекисное окисление белков в плазме, в случае введения животным прооксиданта – NaNO₂-ДНА, эффективно защищают животных от химически индуцированного окислительного стресса. Результаты тестирования позволяют рекомендовать ДНА в качестве потенциальных антиоксидантов для коррекции оксидативных повреждений. |
| format |
Article |
| author |
Шугалей, И.В. Боровикова, А.С. Возняковский, А.П. Илюшин, М.А. |
| author_facet |
Шугалей, И.В. Боровикова, А.С. Возняковский, А.П. Илюшин, М.А. |
| author_sort |
Шугалей, И.В. |
| title |
Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах |
| title_short |
Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах |
| title_full |
Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах |
| title_fullStr |
Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах |
| title_full_unstemmed |
Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах |
| title_sort |
детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах |
| publisher |
Інститут надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України |
| publishDate |
2017 |
| topic_facet |
Получение, структура, свойства |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/160153 |
| citation_txt |
Детонационные наноалмазы как антиоксиданты в различных тестсистемах / И.В. Шугалей, А.С. Боровикова, А.П. Возняковский, М.А. Илюшин // Сверхтвердые материалы. — 2017. — № 5. — С. 37-48. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
| series |
Сверхтвердые материалы |
| work_keys_str_mv |
AT šugalejiv detonacionnyenanoalmazykakantioksidantyvrazličnyhtestsistemah AT borovikovaas detonacionnyenanoalmazykakantioksidantyvrazličnyhtestsistemah AT voznâkovskijap detonacionnyenanoalmazykakantioksidantyvrazličnyhtestsistemah AT ilûšinma detonacionnyenanoalmazykakantioksidantyvrazličnyhtestsistemah AT šugalejiv detonationnanodiamondsasantioxidantsinvarioustestsystems AT borovikovaas detonationnanodiamondsasantioxidantsinvarioustestsystems AT voznâkovskijap detonationnanodiamondsasantioxidantsinvarioustestsystems AT ilûšinma detonationnanodiamondsasantioxidantsinvarioustestsystems |
| first_indexed |
2025-11-26T06:43:55Z |
| last_indexed |
2025-11-26T06:43:55Z |
| _version_ |
1849834284923224064 |
| fulltext |
ISSN 0203-3119. Сверхтвердые материалы, 2017, № 5 37
УДК 577.12-022.53:539.211:615.2
И. В. Шугалей1, А. С. Боровикова1, А. П. Возняковский2, *,
М. А. Илюшин1
1Санкт-Петербургский государственный технологический
институт (технический университет), г. Санкт-Петербург, Россия
2Научно-исследовательский институт синтетического каучука
им. акад. С. В. Лебедева (ФГУП “НИИСК”),
г. Санкт-Петербург, Россия
*apvozn@gmail.com
Детонационные наноалмазы
как антиоксиданты в различных
тест-системах
Показано, что детонационные наноалмазы (ДНА) проявляют
антиоксидантную активность in vitro и in vivo. При пероральном введении лабо-
раторным животным ДНА снижают уровень перекисного окисления белков в
эритроцитах, ингибируют липопероксидацию и перекисное окисление белков в
плазме, в случае введения животным прооксиданта – NaNO2-ДНА, эффективно
защищают животных от химически индуцированного окислительного стресса.
Результаты тестирования позволяют рекомендовать ДНА в качестве потенци-
альных антиоксидантов для коррекции оксидативных повреждений.
Ключевые слова: детонационные наноалмазы, оксидативное
повреждение, антиоксидант, прооксидант, перекисное окисление липидов, пере-
кисное окисление белков.
В последнее время мировой тенденцией является применение
детонационных наноалмазов (ДНА) в медицине и биологии.
Порошки детонационных наноалмазов по типу организации частиц отно-
сятся к наноструктурированным веществам. Технология выделения ДНА из
продуктов детонационного синтеза предусматривает обработку последних
сильными окислительными агентами. Следствием этого является наличие на
поверхности ДНА функциональных групп с лабильным протоном и, соответ-
ственно, ее гидрофильность.
Высокая дисперсность и наличие функциональных групп на поверхности
ДНА – два основных параметра, на которых базируются практически все
попытки использования ДНА в биологии. Так, для целенаправленной достав-
ки лекарств к пораженному органу формируют сложные комплексы ДНА и
физиологически активных молекул. При этом собственно ДНА, как основа
биологически активных композитов, не являются биологически инертными.
Важной задачей современной биологии является поиск антиоксидантов,
предназначенных для коррекции оксидативных повреждений in vivo. Антиок-
сидантное действие ДНА является следствием наличия на их поверхности
групп с лабильным протоном, таких как аминные, тиольные. Следует отме-
тить, что окислительно-восстановительный потенциал ДНА может быть су-
щественно изменен ковалентной фиксацией на их поверхности дополнитель-
© И. В. ШУГАЛЕЙ, А. С. БОРОВИКОВА, А. П. ВОЗНЯКОВСКИЙ, М. А. ИЛЮШИН, 2017
www.ism.kiev.ua/stm 38
ных функциональных групп. Однако, несмотря на важность проблемы, рабо-
ты по изучению антиоксидантных свойств ДНА весьма малочисленны.
Целью настоящего исследования было изучение антиоксидантной актив-
ности ДНА на различных уровнях, таких как молекулярный, клеточный и
организменный.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Детонационные наноалмазы
Коллоидно-химические свойства ДНА в значительной мере зависят от
технологии их синтеза и очистки. Для исследования использовали ДНА, син-
тезированные СКТБ “Технолог” (г. Санкт-Петербург, Россия). Выбор обу-
словлен тем, что по технологии этого производителя подрыв заряда произво-
дится в присутствии комплексообразователей, что обеспечивает отсутствие в
составе синтезированных частицах ионов тяжелых металлов.
Метод динамического светорассеяния
Измерения по определению размерности частиц и характера их полидис-
персности проводили на приборе Zetasizer ZS 3600 (Malvern Instruments Ltd.).
Подготовка поверхности ДНА
Следует отметить, что критическим для многих случаев практического
применения является этап получения высокодисперсных (10–100 нм) суспен-
зий ДНА в жидких средах (как полярных, так и неполярных). Предельная
дисперсность нативных частиц ДНА составляет 4–6 нм. На практике, особен-
но в случае сухих порошков, дисперсность ДНА находится в субмикронном
интервале, что связано с характерной для высокодисперсных частиц склон-
ностью к агрегации. Таким образом, получение их устойчивых высокодис-
персных суспензий оказывается невозможным без дополнительной обработ-
ки. Как правило, для получения устойчивых суспензий ДНА используют
наложение поля ультразвука в присутствии поверхностно-активных веществ
[1, 2]. В биологических экспериментах присутствие в системе поверхностно-
активных веществ нежелательно, так как не исключена возможность их не-
контролируемой десорбции с поверхности частиц ДНА и, соответственно,
возможностью негативного воздействия на биологические объекты.
Для получения высокодисперсных суспензий ДНА применили ранее ус-
пешно использованный прием функционализации поверхности ДНА фторра-
дикалом [3].
Суспензию функционализированных ДНА после озвучивания (5 мин) вы-
держивали в течение 15 мин. Выпавшие после выдержки в осадок наиболее
крупные агрегаты частиц ДНА декантировали. Оставшуюся часть суспензии
выдерживали в течение суток. При этом формировались два четко выделен-
ных слоя: верхний, слабо опалесцирующий слой (ДНА-1), и нижний слой
серого цвета (ДНА-2). Слои суспензии декантировали и в дальнейшем ис-
пользовали раздельно.
Методом динамического светорассеяния было установлено, что “верхняя”
фракция суспензии (ДНА-1) содержит частицы размерами 10–40 нм. В свою
очередь, “нижняя” фракция (ДНА-2) включает частицы размерами 40–100 нм.
Подготовка липосом
Липосомы, использованные в экспериментах, готовили из сухого яичного
лецитина по модифицированной методике [4]. Для этого 1 г лецитина дис-
ISSN 0203-3119. Сверхтвердые материалы, 2017, № 5 39
пергировали в 250 мл дистиллированной воды и озвучивали в стеклянной
ячейке на воздухе. Перед озвучиванием и через каждую минуту озвучивания
суспензию охлаждали до 5–8 °С. Суммарное время озвучивания составляло
15 мин.
Тестирование in vivo
Тестирование проводили с использованием беспородных белых мышей.
Все эксперименты проводили в соответствии с правилами гуманного обра-
щения с животными в биологических экспериментах, утвержденными комис-
сией по биоэтике.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка антиоксидантной активности ДНА на молекулярном уровне
Для оценки антиоксидантной активности на молекулярном уровне в каче-
стве объекта исследования использовали фосфолипиды яичного желтка, ко-
торые представлены в основном лецитином и структурно организованы в
форме липосом.
Хорошо известно, что липиды активно окисляются под действием актив-
ных форм кислорода (АФК) [5–7]. Для оценки антиоксидантной активности
наноалмазов в суспензии липосом реактивом Фентона (смесь перекиси водо-
рода с сульфатом железа-II) инициировали перекисное окисление липидов
(ПОЛ).
Признаком проявления активности антиоксиданта в системе является
снижение скорости ПОЛ. Для того, чтобы оценить изменение скорости, не-
обходимо визуализировать процесс. Для этого использовали регистрацию
свечения в присутствии фотосенсибилизатора – люминола LH2 (рис. 1–3).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
50
100
150
200
250
300
0,0013 0,0026 0,0065 0,0091 0,013 0,0156 0,0195
Г
аш
ен
и
е
хе
м
и
лю
м
и
н
ес
ц
ен
ц
и
и
, %
П
и
ко
ва
я
и
н
те
н
си
вн
ос
ть
х
ем
и
лю
м
и
н
ес
ц
ен
ц
и
и
, у
сл
. е
д.
Концентрация ДНА, масс. %
2
3
1
Рис. 1. Влияние концентрации ДНА на интенсивность хемилюминесценции в суспензии
липосом, инициируемой реактивом Фентона (фосфатный буфер; рН = 7,0; [FeSO4] =
5,7⋅10–6 моль/л; [Н2О2] = 2,1⋅10–5 моль/л, [LH2] = 1,0⋅10–7 моль/л): в отсутствие ДНА (1), в
присутствие ДНА (2), гашение хемилюминесценции, в процентах относительно контроль-
ной группы (3).
www.ism.kiev.ua/stm 40
Анализ рис. 2–3 показывает, что для получения антиоксидантного эффек-
та концентрация ДНА в реакционной среде, содержащей фосфолипиды при
значениях рН, близких к физиологическим, должна быть более 0,01 % (по
массе). Таким образом, за счет торможения перекисного окисления липидов
ДНА должны проявлять эффект, стабилизирующий клеточную мембрану.
Эффект стабилизации обусловлен тем, что процессы ПОЛ являются ведущи-
ми в процессе разрушения клеточной мембраны.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
50
100
150
200
250
300
55 27 14 11 5,5 2,7
Г
аш
ен
и
е
хе
м
и
лю
м
и
н
ес
ц
ен
ц
и
и
, %
П
и
ко
ва
я
и
н
те
н
си
вн
ос
ть
х
ем
и
лю
м
и
н
ес
ц
ен
ц
и
и
, у
сл
. е
д.
[Fe+2]⋅10
5
, моль/л
1
2
3
Рис. 2. Влияние концентрации сульфата железа (II) на интенсивность хемилюминесценции,
инициируемой реактивом Фентона (фосфатный буфер; рН = 7,0; [Н2О2] = 7,3⋅10–5 моль/л,
[ДНА] = 0,0159 % (по массе); [LH2] = 1,0⋅10–7 моль/л): в отсутствие ДНА (1), в присутствие
ДНА (2), гашение хемилюминесценции, в процентах относительно контрольной группы (3).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
50
100
150
200
250
300
5,9 6,4 6,9 7,0 7,5 8,0
Г
аш
ен
и
е
хе
м
и
лю
м
и
н
ес
ц
ен
ц
и
и
, %
П
и
ко
ва
я
и
н
те
н
си
вн
ос
ть
х
ем
и
лю
м
и
н
ес
ц
ен
ц
и
и
, у
сл
. е
д.
pH
1
2
3
Рис. 3. Влияние рН на интенсивность хемилюминесценции, инициируемой реактивом
Фентона ([FeSO4] = 5,7⋅10–6; [Н2О2] = 2,3⋅10–5 моль/л; [ДНА] = 0,0127 % (по массе); [LH2] =
1,0⋅10–7 моль/л): в отсутствие ДНА (1), в присутствие ДНА (2), гашение хемилюминесцен-
ции, в процентах относительно контрольной группы (3).
ISSN 0203-3119. Сверхтвердые материалы, 2017, № 5 41
0
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 0,1 1 10 50 100 1000
О
п
ти
че
ск
ая
п
ло
тн
ос
ть
р
ас
тв
ор
а
D
(
λ
=
5
60
н
м
)
Концентрация ДНА, мкг/мл
Рис. 4. Влияние фракции ДНА-1 (10–40 нм) на гемолиз эритроцитов.
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0 0,1 1 10 50 100 1000
Концентрация ДНА, мкг/мл
О
п
ти
че
ск
ая
п
ло
тн
ос
ть
р
ас
тв
ор
а
D
(
λ
=
5
60
н
м
)
Рис. 5. Влияние фракции ДНА-2 (40–100 нм) на гемолиз эритроцитов.
Оценка антиоксидантной активности ДНА на клеточном уровне
Для оценки антиоксидантных свойств ДНА в качестве тест-объекта ис-
пользовали эритроциты. Использование данного объекта связано с протека-
нием процессов перекисного окисления фосфолипидов, формирующих ли-
пидную составляющую мембраны эритроцита. Оценку антиоксидантного
действия проводили по интенсивности гемолиза эритроцитов. Снижение
интенсивности гемолиза при введении антиоксиданта в суспензию эритроци-
тов, в том числе и суспензии ДНА, свидетельствует о стабилизации эритро-
цитарной мембраны и снижении интенсивности ПОЛ, т. е. подтверждает
антиоксидантные свойства введенного в суспензию клеток препарата. Интен-
сивность гемолиза оценивали по количеству гемоглобина, вышедшего из
www.ism.kiev.ua/stm 42
эритроцитов при разрушении клеточной мембраны. На первом этапе оцени-
вали влияние ДНА на эритроциты в отсутствие окисляющих агентов.
Влияние частиц ДНА на гемолиз эритроцитов проводили с использовани-
ем двух фракций потенциального антиоксиданта, различающихся размером
используемых частиц (ДНА-1 и ДНА-2).
Результаты испытаний с использованием фракции ДНА-1 и крупнораз-
мерной фракции ДНА-2 представлены на рис. 4 и 5 соответственно.
Видно, что в зависимости от концентрации наноалмазы могут проявлять
как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства в суспензии нативных
эритроцитов. В данной серии экспериментов (см. рис. 4, 5) наблюдается тор-
можение спонтанного гемолиза эритроцитов при концентрации ДНА-1 не
более 10 мг/мл. Фракция ДНА-2 эффективна в более широком диапазоне
концентраций.
Представляло интерес проанализировать возможность снижения интен-
сивности гемолиза эритроцитов, вызванного воздействием агента, целена-
правленно генерирующего АФК и инициирующего ПОЛ в эритроцитарной
мембране. В качестве такого агента использовали реактив Фентона, традици-
онно применяемый для инициирования процессов ПОЛ.
В случае антиоксидантного эффекта, проявляемого ДНА при их введении
в систему, содержащую реактив Фентона и эритроциты, интенсивность гемо-
лиза эритроцитов должна снижаться. В данной серии экспериментов исполь-
зовали “мелкоразмерную” фракцию ДНА-1, так как наблюдаемый эффект
снижения интенсивности гемолиза при очень высоких концентрациях ДНА
(см. рис. 3) трудно трактовать однозначно.
Возможно, при высоких концентрациях наноалмазов “крупноразмерной”
фракции ДНА-2 эффект разрушения эритроцитарной мембраны снижается не
за счет прямой антиоксидантной активности, а за счет сорбции вторичных
АФК на частицах ДНА, что приводит к дополнительному обрыву в цепной
реакции ПОЛ.
Было исследовано влияние ДНА на интенсивность гемолиза эртроцитов
под действием реактива Фентона в условиях переменной концентрации одно-
го из его компонентов – сульфата железа (II) – и постоянной концентрации
перекиси водорода, составляющей 1,1⋅10–5 моль/л. ДНА вводили в систему в
концентрации, которая обеспечивала максимальное (1 мкг/мл) подавление
гемолиза в отсутствие прооксидантов. Полученные результаты по подавле-
нию гемолиза эритроцитов в присутствии реактива Фентона под действием
ДНА представлены на рис. 6.
Анализ данных рис. 6 показывает, что действительно ДНА снижают интен-
сивность гемолиза эритроцитов, вызванного воздействием реактива Фентона,
т. е. проявляют защитное антиоксидантное действие. Однако достоверный эф-
фект наблюдается при малых концентрациях феррокатиона (< 1,4⋅10–4 моль/л).
Оценка антиоксидантной активности ДНА на организменном уровне
Для подтверждения перспектив использования ДНА в качестве антиокси-
данта необходимо подтвердить их антиоксидантное действие в опытах in
vivo. Это позволит оценить антиоксидантную активность на организменном
уровне.
Аэробное существование предполагает активную генерацию АФК в ходе
процессов жизнедеятельности. В здоровом организме поддерживается срав-
нительно невысокий стационарный уровень АФК. Различные виды стресса
нарушают равновесие между продукцией и утилизацией АФК [8–10]. Меха-
ISSN 0203-3119. Сверхтвердые материалы, 2017, № 5 43
низмы таких нарушений достаточно сложны, однако выход генерации АФК
из-под контроля (резкое повышение концентрации) требует коррекции спе-
циальными препаратами – антиоксидантами [11, 12]. Успешность такой кор-
рекции под действием препарата свидетельствует об антиоксидантной актив-
ности тестируемого вещества. Такое тестирование и было проведено для
суспензии ДНА. Предпосылками для проведения тестирования in vivo послу-
жили результаты первичного тестирования с использованием суспензии ли-
посом и эритроцитов, которые показали перспективность использования
ДНА в качестве антиоксидантных препаратов.
0
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
35 27 14 11 5,5 2,7
П
и
ко
ва
я
и
н
те
н
си
вн
ос
ть
х
ем
и
лю
м
и
н
ес
ц
ен
ц
и
и
, у
сл
. е
д.
В отсутствие ДНА
В присутствии ДНА
([FeSO
4
]⋅10
5
, моль/л
Рис. 6. Влияние концентрации сульфата железа (II) при постоянной концентрации перок-
сида водорода в системе Фентона на процесс гемолиза эритроцитов (физиологический
раствор; [Н2О2] = 1,1⋅105 моль/л; [ДНА] = 1 мкг/мл).
Достоверная оценка антиоксидантных свойства препарата in vivo может
быть получена по изменению уровня ПОЛ и перекисного окисления белков
(ПОБ) при введении препарата лабораторным мышам [13, 14]. При этом,
антиоксидантную активность препарата оценивают по его влиянию на про-
цессы ПОЛ и ПОБ при сравнении показателей животных, получавших сти-
мулирующую пероксидацию (прооксидант), с показателями животных, не
подвергавшихся действию прооксиданта.
На начальном этапе проводили исследование влияние ДНА на процессы
ПОЛ и ПОБ на животных, не получающих прооксиданты. Для оценки эффек-
та лабораторные животные подвергались воздействию ДНА, которые живот-
ные получали перорально в течение семи дней в виде водной суспензии
(0,05 %) вместо питьевой воды. По окончанию данного срока животные (бе-
лые мыши) подвергались декапитации. У животных забирали кровь и опре-
деляли уровень ПОЛ и ПОБ в плазме крови и эритроцитах (табл. 1). Затем
провели сравнение результатов с животными, не получающими препарат
(интактными).
Уровень ПОЛ оценивали по конечному продукту пероксидации – малоно-
вому диальдегиду (МДА), образование которого происходит в результате
липопероксидации в соответствии со схемой (рис. 7) [15, 16].
www.ism.kiev.ua/stm 44
Таблица 1. Влияние ДНА на процессы ПОЛ и ПОБ в эритроцитах
лабораторных животных (опыт in vivo)
ПОЛ ПОБ Группа
животных МДА*,
наномоль
% к контрольной
группе
ДНФгидразон*,
мкмоль
% к контрольной
группе
Интактные
животные
5,2±0,3 – 0,07±0,01 –
Животные,
получавшие ДНА
14,8±0,5 285 0,39±0,007 56
*Расчеты проводили на 1 г гемоглобина.
гидроперекись
эндопероксид
малонодиальдегид
Рис. 7. Схема образования малонового диальдегида в результате липопероксидации.
Концентрацию МДА определяли спектрофотометрическим методом.
Уровень ПОБ оценивали по накоплению карбонильных фрагментов, обра-
зующихся в результате деструкции полипептидной цепи.
Количество образовавшихся карбонильных фрагментов определяли в виде
соответствующих 2,4-динитрофенилгидразонов. Концентрацию МДА также
определяли спектрофотометрическим методом (табл. 2).
Наиболее приближенным к условиям перспективного применения ДНА
как терапевтического антиоксиданта является исследование его ингибирую-
щего действия на ПОЛ и ПОБ in vivo в случае воздействия на лабораторных
животных вещества, стимулирующего пероксидацию. В качестве токсическо-
го препарата, вызывающего оксидативный стресс, был выбран нитрит натрия,
так как хорошо известно, что данный препарат окисляет гемоглобин по цеп-
ному механизму через промежуточное образование АФК [17].
Как видно из табл. 1, 2, действие ДНА как антиоксиданта неоднозначно.
ДНА проявляет выраженный ингибирующий эффект по отношению к ПОБ в
эритроцитах, а также по отношению к ПОЛ и ПОБ в плазме крови. Однако
ПОЛ в эритроцитах существенно активизируется под действием ДНА. Воз-
ISSN 0203-3119. Сверхтвердые материалы, 2017, № 5 45
можно, стимулирующий эффект связан с гемолизом эритроцитов под дейст-
вием ДНА, имеющем место в определенном концентрационном диапазоне в
случае использования мелкоразмерной фракции, которую и применяли в
качестве добавки в питьевую воду, потреблявшуюся опытной группой лабо-
раторных животных.
Таблица 2. Влияние ДНА на процессы ПОЛ и ПОБ в плазме крови
лабораторных животных (опыт in vivo)
ПОЛ ПОБ Группа
животных МДА*, на-
номоль
% к контрольной
группе
ДНФгидразон*,
мкмоль
% к контрольной
группе
Интактные живот-
ные
3,28±0,07 – 0,21±0,04 –
Животные,
получающие ДНА
2,03±0,05 62 0,055±0,007 26
*Расчеты проводили на 1 мл плазмы.
In vivo нитрит натрия изменяет уровень АФК и активность антиоксидант-
ных ферментов [18]. Таким образом, в данной серии опытов сравнивался
уровень ПОЛ и ПОБ в группах интактных животных и животных, получав-
ших только ДНА либо только нитрит натрия, с группой животных, одновре-
менно получавших прооксидантный препарат (нитрит натрия) и тестируемый
антиоксидант ДНА. Опытные животные получали внутрибрюшинно нитрит
натрия в дозе 20 мг/кг в течение семи дней и 0,05 %-ную суспензию ДНА
перорально с питьевой водой в течение того же времени (табл. 3).
Таблица 3. Влияние нитрита натрия и ДНА на уровень ПОЛ и ПОБ
в эритроцитах лабораторных животных (опыт in vivo)
ПОЛ ПОБ
Группа
животных МДА*,
наномоль
% к контрольной
группе
ДНФгидразон*,
мкмоль
% к контрольной
группе
Животные, получавшие
NaNO2 (в/бр)
10,6±0,7 204 0,13±0,04 186
Животные, получавшие
ДНА (перорально)
14,8±0,7 285 0,059±0,05 84
Животные, параллельно
получавщие NaNO2
(в/бр) и ДНА
(перорально)
7,3±0,4 140 0,09±0,03 129
Интактные животные 5,2±0,3 – 0,07±0,02 –
*Расчеты проводили на 1 г гемоглобина.
Данными, представленными в табл. 3, подтверждается выраженное проок-
сидантное действие нитрита натрия, которое, однако, существенно отличает-
ся по отношению к липидам и белкам – прооксидантный эффект по отноше-
нию к липидам существенно выше, чем по отношению к белкам.
www.ism.kiev.ua/stm 46
Данные табл. 3 демонстрируют, что ДНА способны гасить прооксидант-
ное действие нитрита натрия. Снижение прооксидантного действия по отно-
шению к липидам составляет 64 %, а по отношению к белкам – 57 %.
Хотя введение ДНА снижает прооксидантный эффект токсиканта – нитри-
та натрия, однако при этом уровень ПОЛ остается повышенным (на 40 %) по
сравнению с интактными животными. Полученные значения уровня ПОБ
близки к значениям, определенным для интактной группы.
Антиоксидантный эффект ДНА проявляют не только по отношению к ли-
пидам и белкам эритроцитов, но и к липидам и белкам плазмы крови.
Данные табл. 4 демонстрируют, что прооксидантный эффект нитрита на-
трия ярко выражен и по отношению к компонентам плазмы крови. Введение
ДНА лабораторным животным снижает уровень ПОЛ и ПОБ в плазме крови.
Однако торможение пероксидации липидов в плазме является весьма уме-
ренным в отличие от эритроцитов – всего на 30 %.
Таблица 4. Влияние нитрита натрия и ДНА на уровень ПОЛ и ПОБ
в плазме крови лабораторных животных (опыт in vivo)
ПОЛ ПОБ Группа
животных МДА*,
наномоль
% к контрольной
группе
ДНФгидразон*,
мкмоль
% к контрольной
группе
Животные,
получавшие
NaNO2 (в/бр)
5,15±0,08 157 0,56±0,05 267
Животные,
получавшие ДНА
(перорально)
2,03±0,06 57 0,055±0,03 26
Животные,
получавшие
параллельно
NaNO2 (в/бр)
и ДНА (перорально)
4,13±0,09 126 0,31±0,05 148
Интактные
животные
3,28±0,07 – 0,21±0,03 –
*Расчеты проводили на 1 мл плазмы.
Антиоксидантный эффект по отношению к белкам является ярко выра-
женным. При пероральном введении прооксиданта (нитрита натрия) и ДНА
наблюдается двукратное снижение уровня ПОБ в плазме крови по сравнению
с группой животных, получавших только прооксидант – нитрит натрия.
Вероятно, это определяется тем, что для нитрита натрия в качестве основ-
ной мишени выступают эритроциты [18–21]. Однако, как показывает послед-
няя серия экспериментов, антиоксидантный эффект ДНА in vivo является
неоспоримым, что подтверждает перспективность использования данного
препарата для коррекции последствий оксидативного стресса.
ВЫВОДЫ
ДНА проявляют антиоксидантные свойства in vitro (подтверждено с ис-
пользованием суспензии липосом и суспензии эритроцитов).
В зависимости от концентрации детонационные наноалмазы могут прояв-
лять как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства.
ISSN 0203-3119. Сверхтвердые материалы, 2017, № 5 47
Действие ДНА in vivo неоднозначно, данный препарат тормозит ПОБ
эритроцитов, но стимулирует ПОЛ.
Установлено, что ДНА тормозит стимулируемые прооксидантом (нитри-
том натрия) процессы ПОЛ и ПОБ, что подтверждает его антиоксидантные
свойства и в перспективе позволит рассматривать возможность его клиниче-
ского применения.
Показано, що детонаційні наноалмази (ДНА) виявляють антиоксидан-
тну активність in vitro та in vivo. При пероральному введенні лабораторним тваринам
ДНА знижують рівень перекисного окислення білків в еритроцитах, інгібують ліпоперок-
сидацію і перекисне окислення білків в плазмі, у разі введення тваринам прооксіданта –
NaNO2-ДНА, ефективно захищають тварин від хімічно індукованого окислювального
стресу. Результати тестування дозволяють рекомендувати ДНА в якості потенційних
антиоксидантів для корекції оксидативних пошкоджень.
Ключові слова: детонаційні наноалмази, оксидативного ушкодження,
антиоксидант, прооксидант, перекисне окислення ліпідів, перекисне окислення білків.
Nanodiamons of detonation synthesis (DND) were shown to exhibit
antioxidant activity both in vitro and in vivo. DND being introduced into laboratory animals with
oral introduction lower protein peroxidation in red cells, inhibit peroxidation of lipids and
proteins in serum. DND also protect laboratory animals from oxidative stress induced with the
help of NaNO2. The results of the testing form the experimental basis to recommend DND as
potential antioxidant for correcting oxidative damage of different origin.
Keywords: nanodiamonds of detonation synthesis, oxidative damage,
antioxidant, prooxidant, peroxy damage of lipids, peroxy damage of proteins.
1. Львов С. Н., Хорунжий В. В., Александрович Ю. С., Шугалей И. В. Характеристика
процессов свободно-радикального окисления у детей с отравлениями различными хи-
мическими веществами // Сохранение репродуктивного потенциала подростков: Матер.
науч.-практ. конф. – СПб.: СПбГПМА, 2001. – С. 108–109.
2. Шугалей И. В., Львов С. Н., Баев В. И. и др. Характеристика процессов свободно ради-
кального окисления при экстремальных воздействиях // Чернобыль – 15 лет спустя:
Матер. науч.-практ. конф. – СПб, 2001. – С. 62–63.
3. Илюшина Т. М., Хмельницкая Е. М., Шугалей И. В. и др. Некоторые особенности
течения пероксидных процессов при различных патологиях у детей // XI Вишняковские
чтения. Вузовская наука – образованию и промышленности: Матер. науч. конф. – СПб.-
Бокситогорск, 2008. – С. 297–302.
4. Шугалей И. В., Илюшина Т. М., Хмельницкая Е. М., Судариков А. М. Некоторые
патологические состояния, сопровождающиеся нарушениями процессов с участием
активных форм кислорода // XI Вишняковские чтения. Вузовская наука – образованию
и промышленности: Матер. науч. конф. – СПб.-Бокситогорск, 2008. – С. 349–353.
5. Шугалей И. В., Судариков А. М., Илюшин М. А. Некоторые аспекты процесса
липопероксидации и его роль в развитии патологии сердечно-сосудистой системы //
XVI Вишняковские чтения. Проблемы и перспективы развития высшего профессио-
нального образования в регионе на современном этапе: Матер. науч. конф. – СПб.-
Бокситогорск, 2013. – C. 191–195
6. Илюшина Т. М., Хмельницкая Е. М., Шугалей И. В. и др. Клиническое применение
антиоксидантов // XI Вишняковские чтения. Вузовская наука – образованию и промыш-
ленности: Матер. науч. конф. – СПб.-Бокситогорск, 2008. – С. 288–296.
7. Шугалей И. В., Возняковский А. П., Гарабаджиу А. В. и др. Биологическая активность
детонационных наноалмазов и перспективы их медико-биологического использования
// ЖОХ. – 2013. – 83, вып. 5. – С.709–744.
8. Шугалей И. В., Возняковский А. П., Илюин М. А., Гарабаджиу А. В. Изучение влияния
детонационных наноалмазов на процесс пероксидного повреждения ацетилхолинэсте-
разы эритроцитов // Породоразрушающий и металлообрабатывающий инструмент –
техника и технология его изготовления и применения: Сб. науч. тр. – 2013. – Вып. 16. –
С. 351–357.
www.ism.kiev.ua/stm 48
9. Шугалей И. В., Илюшин М. А., Возняковский А. П., и др. Ультрадисперсные алмазы как
антиоксидантные препараты // Там же. – 2009. – Вып. 12. – С. 320–326.
10. Шугалей И. В., Судариков А. М., Возняковский А. П. и др. Химия поверхности детона-
ционных наноалмазов как основа создания продукции биомедицинского назначения:
Моногр. – СПб.: ЛГУ им. А. С. Пушкина, 2012. – 152 с.
11. Верещагин А. Л. Сакович Г. В., Петрова Л. А. и др. Исследование химического состава
поверхности ультрадисперсного алмаза детонационного синтеза // ДАН СССР. – 1990.
– 315, №1. – С. 104–105.
12. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических
мембранах. – М.: Наука, 1972. – 252 с.
13. Владимиров Ю. А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства
липидного слоя биологических мембран // Биофизика. – 1987. – 32, вып. 5. – С. 830–
844.
14. Бурлакова Е. Б., Храпова Н. Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные
антиоксиданты //Успехи химии. – 1985. – 54, № 9. – С. 1540–1558.
15. Владимиров Ю. А., Проскурина Е. В., Гумайлов Д. Ю. Хемилюминесценция как метод
обнаружения и исследования свободных радикалов в биологических системах // Бюл-
летень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Вып. 1. – С. 13–20.
16. Circu M. L., Aw T. Y. Reactive oxygen species, cellular redox systems and apoptosis // Free
Rad. Biol. Med. – 2010. – 48. – P. 749–762.
17. Ланкин В. З., Тихазе А. К., Беляков Ю. Н. Свободнорадикальные процессы в норме и
при патологических состояниях. – М., 2001. – 78 с.
18. Нamilton C. A., Miller W. H., Al-Benno S. и др. Strategies to reduce oxidative stress in car-
diovascular disease // Clinical Sci. – 2004. – 106. – P. 219–234.
19. Шугалей И. В., Львов С. Н., Баев В. И. и др. Влияние генерации и реакционной
способности активных форм кислорода на организм человека // Адаптация организма к
неблагоприятным условиям среды обитания: Сб. науч. ст. – СПб.: СПбГПМА, Аспор,
1999. – С. 6–11.
20. Шугалей И. В., Илюшин М. А., Судариков А. М. Особенности метаболизма ксенобио-
тиков в организме теплокровных // XVI Вишняковские чтения. Проблемы и перспек-
тивы развития высшего профессионального образования в регионе на современном
этапе: Матер. науч. конф. – СПб.-Бокситогорск, 2013. – С. 187–191.
21. Шугалей И. В., Гарабаджиу А. В., Целинский И. В. Химия белка. – СПб., 2011. – 200 с.
Поступила 22.07.16
<<
/ASCII85EncodePages false
/AllowTransparency false
/AutoPositionEPSFiles true
/AutoRotatePages /None
/Binding /Left
/CalGrayProfile (Dot Gain 20%)
/CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2)
/sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CannotEmbedFontPolicy /Warning
/CompatibilityLevel 1.4
/CompressObjects /Off
/CompressPages true
/ConvertImagesToIndexed true
/PassThroughJPEGImages true
/CreateJobTicket false
/DefaultRenderingIntent /Default
/DetectBlends true
/DetectCurves 0.1000
/ColorConversionStrategy /LeaveColorUnchanged
/DoThumbnails true
/EmbedAllFonts true
/EmbedOpenType false
/ParseICCProfilesInComments true
/EmbedJobOptions true
/DSCReportingLevel 0
/EmitDSCWarnings false
/EndPage -1
/ImageMemory 1048576
/LockDistillerParams true
/MaxSubsetPct 100
/Optimize false
/OPM 1
/ParseDSCComments true
/ParseDSCCommentsForDocInfo true
/PreserveCopyPage true
/PreserveDICMYKValues true
/PreserveEPSInfo true
/PreserveFlatness true
/PreserveHalftoneInfo false
/PreserveOPIComments false
/PreserveOverprintSettings true
/StartPage 1
/SubsetFonts true
/TransferFunctionInfo /Remove
/UCRandBGInfo /Preserve
/UsePrologue false
/ColorSettingsFile ()
/AlwaysEmbed [ true
]
/NeverEmbed [ true
]
/AntiAliasColorImages false
/CropColorImages true
/ColorImageMinResolution 300
/ColorImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleColorImages false
/ColorImageDownsampleType /Bicubic
/ColorImageResolution 300
/ColorImageDepth 8
/ColorImageMinDownsampleDepth 1
/ColorImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeColorImages true
/ColorImageFilter /FlateEncode
/AutoFilterColorImages false
/ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG
/ColorACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/ColorImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000ColorACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000ColorImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasGrayImages false
/CropGrayImages true
/GrayImageMinResolution 300
/GrayImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleGrayImages false
/GrayImageDownsampleType /Bicubic
/GrayImageResolution 300
/GrayImageDepth 8
/GrayImageMinDownsampleDepth 2
/GrayImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeGrayImages true
/GrayImageFilter /FlateEncode
/AutoFilterGrayImages false
/GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG
/GrayACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/GrayImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000GrayACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000GrayImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasMonoImages false
/CropMonoImages true
/MonoImageMinResolution 1200
/MonoImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleMonoImages false
/MonoImageDownsampleType /Bicubic
/MonoImageResolution 1200
/MonoImageDepth -1
/MonoImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeMonoImages true
/MonoImageFilter /CCITTFaxEncode
/MonoImageDict <<
/K -1
>>
/AllowPSXObjects false
/CheckCompliance [
/None
]
/PDFX1aCheck false
/PDFX3Check false
/PDFXCompliantPDFOnly false
/PDFXNoTrimBoxError true
/PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXSetBleedBoxToMediaBox true
/PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXOutputIntentProfile (None)
/PDFXOutputConditionIdentifier ()
/PDFXOutputCondition ()
/PDFXRegistryName ()
/PDFXTrapped /False
/CreateJDFFile false
/Description <<
/CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000500044004600206587686353ef901a8fc7684c976262535370673a548c002000700072006f006f00660065007200208fdb884c9ad88d2891cf62535370300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002>
/CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef653ef5728684c9762537088686a5f548c002000700072006f006f00660065007200204e0a73725f979ad854c18cea7684521753706548679c300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002>
/DAN <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>
/DEU <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>
/ESP <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>
/FRA <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>
/ITA <FEFF005500740069006c0069007a007a006100720065002000710075006500730074006500200069006d0070006f007300740061007a0069006f006e00690020007000650072002000630072006500610072006500200064006f00630075006d0065006e00740069002000410064006f006200650020005000440046002000700065007200200075006e00610020007300740061006d007000610020006400690020007100750061006c0069007400e00020007300750020007300740061006d00700061006e0074006900200065002000700072006f006f0066006500720020006400650073006b0074006f0070002e0020004900200064006f00630075006d0065006e007400690020005000440046002000630072006500610074006900200070006f00730073006f006e006f0020006500730073006500720065002000610070006500720074006900200063006f006e0020004100630072006f00620061007400200065002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000200065002000760065007200730069006f006e006900200073007500630063006500730073006900760065002e>
/JPN <FEFF9ad854c18cea51fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e30593002537052376642306e753b8cea3092670059279650306b4fdd306430533068304c3067304d307e3059300230c730b930af30c830c330d730d730ea30f330bf3067306e53705237307e305f306f30d730eb30fc30d57528306b9069305730663044307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e30593002>
/KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020b370c2a4d06cd0d10020d504b9b0d1300020bc0f0020ad50c815ae30c5d0c11c0020ace0d488c9c8b85c0020c778c1c4d560002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e>
/NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken voor kwaliteitsafdrukken op desktopprinters en proofers. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.)
/NOR <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>
/PTB <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>
/SUO <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>
/SVE <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>
/ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents for quality printing on desktop printers and proofers. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.)
/RUS ()
>>
/Namespace [
(Adobe)
(Common)
(1.0)
]
/OtherNamespaces [
<<
/AsReaderSpreads false
/CropImagesToFrames true
/ErrorControl /WarnAndContinue
/FlattenerIgnoreSpreadOverrides false
/IncludeGuidesGrids false
/IncludeNonPrinting false
/IncludeSlug false
/Namespace [
(Adobe)
(InDesign)
(4.0)
]
/OmitPlacedBitmaps false
/OmitPlacedEPS false
/OmitPlacedPDF false
/SimulateOverprint /Legacy
>>
<<
/AddBleedMarks false
/AddColorBars false
/AddCropMarks false
/AddPageInfo false
/AddRegMarks false
/ConvertColors /NoConversion
/DestinationProfileName ()
/DestinationProfileSelector /NA
/Downsample16BitImages true
/FlattenerPreset <<
/PresetSelector /MediumResolution
>>
/FormElements false
/GenerateStructure true
/IncludeBookmarks false
/IncludeHyperlinks false
/IncludeInteractive false
/IncludeLayers false
/IncludeProfiles true
/MultimediaHandling /UseObjectSettings
/Namespace [
(Adobe)
(CreativeSuite)
(2.0)
]
/PDFXOutputIntentProfileSelector /NA
/PreserveEditing true
/UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged
/UntaggedRGBHandling /LeaveUntagged
/UseDocumentBleed false
>>
]
>> setdistillerparams
<<
/HWResolution [2400 2400]
/PageSize [612.000 792.000]
>> setpagedevice
|