Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці
Aims. Cereals, such as wheat (Triticum aestivum L.), display significant increase in freezing tolerance during a period of cold acclimation (CA). Unravel functions and regulations of CA-associated genes can help in receiving cold-resistant cultivars using biotechnology methods. It have identified po...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Datum: | 2015 |
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2015
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177440 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці / Д.Д. Буй, Я.В. Пірко, Я.Б. Блюм // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 17. — С. 27-30. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-177440 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Буй, Д.Д. Пірко, Я.В. Блюм, Я.Б. 2021-02-15T17:58:37Z 2021-02-15T17:58:37Z 2015 Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці / Д.Д. Буй, Я.В. Пірко, Я.Б. Блюм // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 17. — С. 27-30. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177440 576.311.348.7 Aims. Cereals, such as wheat (Triticum aestivum L.), display significant increase in freezing tolerance during a period of cold acclimation (CA). Unravel functions and regulations of CA-associated genes can help in receiving cold-resistant cultivars using biotechnology methods. It have identified potentially important for CA tubulin gene, such as TUBA-2- 3, which is assumed to be essential in forming cold-tolerant microtubules. Methods. Cold acclimation during 72 h was conducted. The level of TUBA-2-3 mRNA was measured using RT Real-time PCR with specific primers. Results. Similar patterns of expression alterations were observed on both winter and spring cultivar. The level of expression TUBA-2-3 decreased at day 1 and was strongly increased at day 2–3 for winter cultivar. Gene expression gradually increased at day 1–3 for spring cultivar. Conclusion. Differences in expression patterns between winter and spring cultivar were found, which leads to different level of winter and spring wheat cold tolerance. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Молекулярна генетика та геноміка рослин Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці Expression of winter and spring wheat alpha-tubulin genes during cold acclimation Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці |
| spellingShingle |
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці Буй, Д.Д. Пірко, Я.В. Блюм, Я.Б. Молекулярна генетика та геноміка рослин |
| title_short |
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці |
| title_full |
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці |
| title_fullStr |
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці |
| title_full_unstemmed |
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці |
| title_sort |
аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці |
| author |
Буй, Д.Д. Пірко, Я.В. Блюм, Я.Б. |
| author_facet |
Буй, Д.Д. Пірко, Я.В. Блюм, Я.Б. |
| topic |
Молекулярна генетика та геноміка рослин |
| topic_facet |
Молекулярна генетика та геноміка рослин |
| publishDate |
2015 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Фактори експериментальної еволюції організмів |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Expression of winter and spring wheat alpha-tubulin genes during cold acclimation |
| description |
Aims. Cereals, such as wheat (Triticum aestivum L.), display significant increase in freezing tolerance during a period of cold acclimation (CA). Unravel functions and regulations of CA-associated genes can help in receiving cold-resistant cultivars using biotechnology methods. It have identified potentially important for CA tubulin gene, such as TUBA-2- 3, which is assumed to be essential in forming cold-tolerant microtubules. Methods. Cold acclimation during 72 h was conducted. The level of TUBA-2-3 mRNA was measured using RT Real-time PCR with specific primers. Results. Similar patterns of expression alterations were observed on both winter and spring cultivar. The level of expression TUBA-2-3 decreased at day 1 and was strongly increased at day 2–3 for winter cultivar. Gene expression gradually increased at day 1–3 for spring cultivar. Conclusion. Differences in expression patterns between winter and spring cultivar were found, which leads to different level of winter and spring wheat cold tolerance.
|
| issn |
2219-3782 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177440 |
| citation_txt |
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці / Д.Д. Буй, Я.В. Пірко, Я.Б. Блюм // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 17. — С. 27-30. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT buidd analízrívnívekspresíígenívalʹfatubulínupídčasholodovoíaklímacííuâroítaozimoípšenicí AT pírkoâv analízrívnívekspresíígenívalʹfatubulínupídčasholodovoíaklímacííuâroítaozimoípšenicí AT blûmâb analízrívnívekspresíígenívalʹfatubulínupídčasholodovoíaklímacííuâroítaozimoípšenicí AT buidd expressionofwinterandspringwheatalphatubulingenesduringcoldacclimation AT pírkoâv expressionofwinterandspringwheatalphatubulingenesduringcoldacclimation AT blûmâb expressionofwinterandspringwheatalphatubulingenesduringcoldacclimation |
| first_indexed |
2025-11-24T16:49:16Z |
| last_indexed |
2025-11-24T16:49:16Z |
| _version_ |
1850487625608069120 |
| fulltext |
© БУЙ Д.Д., ПІРКО Я.В., БЛЮМ Я.Б.
ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 27
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці
Б
уй
Д
.Д
.,
П
ір
ко
Я
.В
.,
Б
лю
м
Я
.Б
.
Детальний аналіз рівня експресії представ-
ників родини генів α-тубуліну в озимих та ярих
сортах (з різним рівнем холодостійкості) може
допомогти в з’ясуванні ролі тубулінів в холодо-
вій акліматизації та передачі сигналів холодово-
го стресу. Оскільки найбільші зміни рівня екс-
пресії спостерігаються у випадку гена TUBA-2-3
(зростання на кілька порядків) [7], можна припу-
стити, що високий рівень його експресії є важли-
вим фактором у формуванні холодостійкості під
час холодової аклімації. Вірогідно, що такі зміни
експресії у різних сортів позитивно корелюють
зі ступенем холодостійкості та швидкістю про-
ходження холодової аклімації [8, 9]. Якщо такий
зв’язок буде знайдено та підтверджено в резуль-
таті порівняння рівня експресії у сортів з різним
рівнем холодостійкості, то можна буде стверджу-
вати ключову роль гена TUBA-2-3 у формуван-
ні холодостійкості м’якої пшениці. Саме на ви-
рішення цього питання і було спрямоване наше
дослідження.
Матеріали і методи
Об’єктами для експериментів були два віт-
чизняні сорти м’якої пшениці: озимий сорт Ми-
ронівська 808 та ярий сорт Харківська 26. Насін-
ня обох сортів пшениці поверхнево стерилізува-
ли шляхом експозиції у 3 %-ному розчині гіпо-
хлориту натрію впродовж 15 хв. У подальшому
насіння пророщували 7 днів на вологому філь-
трувальному папері при температурі 20 °C, далі
2 тижні проростки вирощували при 20 °C та дов-
жині світлового дня 16 год, після чого полови-
ну проростків продовжували утримувати за вка-
заних умов (контроль), а іншу половину (експе-
римент) за умов 4 °C та довжині світлового дня
8 год. Для освітлення використовували люмінес-
центні лампи потужністю 16 Вт.
Перед початком експерименту і через 24, 48
та 72 год відбирали зразки тканин (надземна ча-
стина рослин), заморожували їх у рідкому азоті
та зберігали для подальшого аналізу при –80°C.
Виділення РНК проводили з використанням гу-
анідинтіоцанат фенол-хлороформного мето-
ду (TrIzol реагент) [10, 11]. Чистоту та концен-
з’ясування механізмів морозостійкості рос-
лин було і залишається актуальним питанням для
створення нових сортів культурних рослин. Осо-
бливого значення це питання набуває в регіонах
помірних широт. Незважаючи на велику кіль-
кість досліджень, клітинні та молекулярні ме-
ханізми холодостійкості розкриті далеко не пов-
ністю. Встановлено, що ціла низка сигнальних
шляхів у клітині та ферментів залучена до про-
цесу формування морозостійкості, крім того від-
мічають і певну роль структурних білків, залуче-
них до регуляції поділу клітин, зокрема, тубулі-
нів [1].
У процесі холодової акліматизації в організ-
мі рослин у результаті зміни експресії генів від-
бувається ряд морфологічних, фізіологічних та
біохімічних перетворень, що залучені до меха-
нізмів холодо- та морозостійкості [2–4]. Раніше
вже було показано, що під час холодової акліма-
тизації у пшениці (Triticum aestivum L.) зміню-
ється рівень експресії генів α-тубуліну. Деталь-
ний аналіз рівня експресії представників родини
генів α-тубуліну в озимих та ярих сортах пшени-
ці (з різним рівнем холодостійкості) може допо-
могти в розкритті ролі тубулінів в холодовій аклі-
матизації.
Припускають, що зміна рівня експресії генів
тубулінів під впливом низьких температур пов’я-
зана зі змінами складу мікротрубочок [5], що
може бути передумовою специфічних білок-біл-
кових взаємодій на їх поверхні [6]. Також вважа-
ється, що тубуліни можуть бути залучені до про-
цесів передачі сигналу за рахунок взаємодій з ре-
цепторними протеїкіназами [4]. У попередніх
дослідженнях було показано, що під час холодо-
вої акліматизації рівень експресії генів, зокрема
α-тубуліну, у пшениці може змінюватись. Вста-
новлено, що різні представники генів родини
б-тубулінів (TUBA) експресуються в різній мірі,
до того ж характер експресії змінюється з часом.
зокрема, на прикладі озимої пшениці (T. aestivum
cv. Chihoku) показано, що за умов впливу низь-
кої температури змінюється рівень експресії гена
TUBA-2-3 [7].
УДК 576.311.348.7
БУй Д.Д., ПІРКО Я.В., БЛЮМ Я.Б.
Державна установа «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України»,
Україна, 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а, e-mail: denisbuy90@gmail.com
АНАЛІЗ РІВНІВ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ АЛьФА-ТУБУЛІНУ ПІД ЧАС
ХОЛОДОВОЇ АКЛІМАЦІЇ У ЯРОЇ ТА ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ
28 ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17
Буй Д.Д., Пірко Я.В., Блюм Я.Б.
Результати та обговорення
Система праймерів I. У випадку обох сортів
(Миронівська 808 та Харківська 26) спостеріга-
ються дещо схожі зразки експресії TUBA-2-3. На
початковому етапі відбувається пригнічення рів-
ня експресії цього гена з подальшим зростанням
його у кілька разів від початкового рівня. зокре-
ма після 24 год. холодової аклімації рівень екс-
пресії гена TUBA-2-3 у сорту Миронівська 808
знижується у 5 разів від початкового рівня, після
48 год. – зберігається зниженим у 4,5 разів, піс-
ля 72 год. – зростає у 8,5 разів у порівнянні з по-
чатковим рівнем (до початку холодової аклама-
ції). У сорту Харківська 26 після 24 год. аклама-
ції спостерігається зниження рівня експресії у
38 разів, а після 48 год. рівень експресії зростає,
збільшуючись у 1,4 разу від початкового рівня.
Після 72 год. експерименту спостерігається під-
вищений у 8,9 разу рівень експресії гена TUBA-
2-3 (рис. 1).
Система праймерів II. Після 24 год. аклама-
ції рівень експресії гена TUBA-2-3 у сорту Миро-
нівська 808 знижується у 5 разів, після 48 год. –
знижується у 13,5 разу від початкового рівня, піс-
ля 72 год. рівень експресії збільшується у 20 ра-
зів від початкового. У сорту Харківська 26 спо-
стерігається поступове підвищення рівня екс-
пресії гена TUBA-2-3: після 24 год. реєструється
підвищення цього показника у 5,6 разу, після 48
та 72 год. рівень експресії зростає більше, ніж у
80 разів від початкового рівня. Таким чином, для
сорту Миронівська 808 пригнічення експресії
гена TUBA-2-3 спостерігається у перші 48 год.,
а у сорту Харківська 26 відбувається поступове
трацію виділеної РНК визначали за допомогою
електрофоретичного аналізу та спектрофотомет-
рії (Eppendorf Biophotometer, США). Концентра-
ції РНК у різних зразках були вирівняні шляхом
подальшого розведення.
Для отримання кДНК використовували на-
бір rEVErTa-L (ИнтерЛабСервис, Росія). Реак-
ційну суміш загальним об’ємом 20 мкл, яка мі-
стила близько 1 мкг РНК та 0,2 мкг випадкових
гексануклеотидів (random hexamers), денатуру-
вали нагріванням при 95 °C протягом 5 хв з на-
ступним охолодженням на льоду, після чого дода-
вали реакційний буфер, 1 мМ dNTPs та 200 оди-
ниць зворотньої траскриптази (MMlv). Реакцій-
ну суміш інкубували 40 хв при 37 °C, у подаль-
шому фермент інактивували прогріванням до
65 °C протягом 10 хв. Температурний режим під-
тримували за допомогою ампліфікатора Thermal
Cycler 2720 (applied Biosystems, США).
Оцінку відносного рівня експресії α-тубулі-
ну 2–3 (TUBA-2-3) було проведено за допомогою
кількісної ПЛР (ДДCt метод). Ампліфікацію спе-
цифічного фрагменту гена, що кодує α-тубулін
2–3, проводили з використанням набору SYBr®
Green JumpStart™Taq readyMix™ (Sigma-
aldrich, США). Реакційна суміш загальним об’є-
мом 25 мкл містила 2 мкл кДНК, 1 мкл прямо-
го та зворотнього праймерів. ПЛР проводили з
інтеркалюючим барвником SybrGreen (490 нм)
з використанням ампліфікатора iQ5 (Bio-rad,
США) за наступним температурним протоколом:
початкова денатурація – 94°C, 2 хв; 40 циклів:
денатурація – 94°C, 30 с; відпал праймерів при
58°C – 30 с, синтез ДНК при 72°C – 1 хв, заключ-
ний етап елонгації – 72°C, 2 хв. Рівень флюорес-
ценції вимірювали на стадії синтезу ампліконів.
Було використано 2 пари специфічних до
кДНК TUBA-2-3 праймерів:
I. Прямий 5` GaGTaTTaaGCCTGCCTCCT 3`
зворотній 5` CaaGGTTCTTaCaaCaCaaCaG 3`
II.Прямий 5` GCCTTTGaGCCTTCGTCCaT 3`
зворотній 5` CCTGGTGGCTGGTaGTTGaT 3`
Після ампліфікації якість продукту пере-
віряли, досліджуючи криву плавлення продук-
тів ПЛР та візуально за допомогою електрофо-
резу в 1,5%-ному агарозному гелі з додаванням
бромистого етидію в ультрафіолетовому світлі.
Рівень експресії оцінювали окремо для кожної
пари праймерів. Для оцінки якості та відтворю-
ваності результатів реакції експеримент прово-
дили у трьох повтореннях. Як референсний ген
використовували ген убіхітину.
Рис. 1. Відносні рівні експресії гена TUBA-2-3 (ре-
ференсний ген – убіквітин) впродовж перших 72 год.
холодової аклімації з використанням системи прай-
мерів I (М808 – Миронівська 808, Х26 – Харківська
26; вісь ординат – відносний рівень експресії)
ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 29
Аналіз рівнів експресії генів альфа-тубуліну під час холодової аклімації у ярої та озимої пшениці
лися наступними: в перші 24 год. спостерігалось
зниження рівня його експресії, а потім цей по-
казник поступово зростав, досягаючи початко-
вого рівня після 6-го дня холодової аклімації, та
10-кратно збільшувався після 14 днів [7]. Таким
чином поступове відновлення експресії TUBA-2-
3 спостерігається для обох сортів, але у озимих
сортів таке відновлення відбувається пізніше.
Висновки
Досліджено закономірності у змінах рівнів
експресії гена TUBA-2-3 під час перших 72 год.
холодової аклімації у озимого (Миронівська 808)
та ярого (Харківська 26) сортів м’якої пшениці.
Для обох сортів спостерігається пригнічення рів-
нів експресії гена TUBA-2-3 з подальшим посту-
повим його зростанням. У випадку озимого сор-
ту Миронівська 808 у перші 48 год реєструється
знижений у порівнянні з контролем рівень екс-
пресії гена TUBA-2-3 з подальшим відновленням
та зростанням експресії після 72 год. У випадку
ярого сорту Харківська 26 відбувається поступо-
ве підвищення рівня експресії TUBA-2-3 у перші
24 год., після чого рівень експресії гена TUBA-
2-3 зростає, досягаючи значних рівнів після 72
год. холодової аклімації. В цілому у озимого сор-
ту пшениці відновлення експресії відбувається
дещо пізніше в порівнянні з ярим сортом.
підвищення рівня експресії цього гена під час хо-
лодової аклімації (рис. 2).
Раніше під час досліджень ярого сорту пше-
ниці Quantum було виявлено, що рівень експре-
сії одного з генів α-тубуліну (досліджувався візу-
ально в агарозному гелі) у порівнянні з контро-
лем виявився різко знижений після 24 год. холо-
дової аклімації, а потім відновлювався до почат-
кового рівня (після 72 год.) і надалі зростав [8].
Якщо розглядати озимі сорти, то рівні експресії
гена TUBA-2-3 у озимого сорту Chihoku вияви-
ЛІТЕРАТУРА
1. abdrakhamanova a., Wang Q.Y., Khokhlova L., Nick P. Is microtubule disassembly a trigger for cold acclimation? // Plant Cell
Physiol. – 2003. – 44. – P. 676–686.
2. Xiong L, Schumaker K.S., Zhu J-K Cell signaling during cold, drought, and salt stress // Plant Cell. – 2002. – 14. – P. 165–183.
3. Maibam P., Nawkar G.M., Park J.H., Sahi V.P., Lee S.Y., Kang C.H. The influence of light quality, circadian rhythm, and photoperiod
on the CBF-mediated freezing tolerance // Int. J. Mol. Sci. – 2013. – 14. – P. 11527–11543.
4. Gray G.r., Chauvin L., Sarhan F., Huner P.a. Cold acclimation and freezing tolerance: a complex interaction of light and
temperature // Plant Physiol. – 1997. – 114. – P. 467–474.
5. Kerr G.P., Carter J.V. Tubulin isotypes in rye roots are altered during cold acclimation // Plant Physiol. – 1990. – 93. – P. 83–88.
6. Tardif G., Kane N.a., adam H., Labrie L., Major G., Gulick P., Sarhan F., Lalibertй J.F. Interaction network of proteins associated
with abiotic stress response and development in wheat // Plant Mol. Biol. – 2007. – 63. – P. 703–718.
7. Christov N.K., Imai r., Blume Y.B. Differential expression of two winter wheat alpha-tubulin genes during cold acclimation // Cell
Biol. Int. – 2008. – 32. – P. 574–578.
8. ridha Farajalla M., Gulick P.J. The alpha-tubulin gene family in wheat (Triticum aestivum L.) and differential gene expression
during cold acclimation // Genome. – 2007. – 50. – P. 502–519.
9. Jian L.C., Sun L.H., Liu Z.P. Studies on microtubule cold stability in relation to plant cold hardiness // acta Bot. Sinica. – 1989. –
31. – P. 737–741.
10. Chomczynski P. a reagent for the single-step simultaneous isolation of rNa, DNa and proteins from cell and tissue samples //
BioTechniques. – 1993. – 15. – P. 532–537.
11. Chomczynski P., Sacchi N. Single step method of rNa isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction //
anal. Biochem. – 1987. – 162. – P. 156–159.
Рис. 2. Відносні рівні експресії гена TUBA-2-3 (ре-
ференсний ген – убіквітин) впродовж перших 72 год.
холодової аклімації з використанням системи прай-
мерів II (М808 – Миронівська 808, Х26 – Харківська
26; вісь ординат – відносний рівень експресії)
30 ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17
Буй Д.Д., Пірко Я.В., Блюм Я.Б.
BUY D.D., PIRKO YA.V., BLUME Ya.B.
Institute of Food Biotechnology and Genomics,
Ukraine, 04123, Kyiv, Osypovskogo str., 2A, e-mail: denisbuy90@gmail.com
EXPRESSION OF WINTER AND SPRING WHEAT ALPHA-TUBULIN GENES DURING COLD
ACCLIMATION
Aims. Cereals, such as wheat (Triticum aestivum L.), display significant increase in freezing tolerance during a period
of cold acclimation (Ca). Unravel functions and regulations of Ca-associated genes can help in receiving cold-resistant
cultivars using biotechnology methods. It have identified potentially important for Ca tubulin gene, such as TUBA-2-
3, which is assumed to be essential in forming cold-tolerant microtubules. Methods. Cold acclimation during 72 h was
conducted. The level of TUBA-2-3 mrNa was measured using rT real-time PCr with specific primers. Results. Similar
patterns of expression alterations were observed on both winter and spring cultivar. The level of expression TUBA-2-3
decreased at day 1 and was strongly increased at day 2–3 for winter cultivar. Gene expression gradually increased at day
1–3 for spring cultivar. Conclusion. Differences in expression patterns between winter and spring cultivar were found,
which leads to different level of winter and spring wheat cold tolerance.
Keywords: Triticum aestivum, cold acclimation, tubulin, gene TUBA-2-3 expression.
|