Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів
Методом rep-ПЛР з використанням BOX-праймерів, виявлено кількісні і якісні відмінності патернів ДНК Alu-інтегранта B. subtilis, як від стандартних штамів, так і субклонів з ознаками суттєвого порушення росту колоній. Посредством метода rep-ПЦР с и спользованием BOX-праймеров выявлены количественны...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Datum: | 2010 |
| Hauptverfasser: | , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2010
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177461 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів / І.С. Карпова В.В. Негруцька О.Л. Кузьменко Г.Г. Пальчиковська В.К. Позур Л.Л. Лукаш // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 8. — С. 43-47. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859670775447945216 |
|---|---|
| author | Карпова, І.С. Негруцька, В.В. Кузьменко, О.Л. Пальчиковська, Г.Г. Позур, В.К. Лукаш, Л.Л. |
| author_facet | Карпова, І.С. Негруцька, В.В. Кузьменко, О.Л. Пальчиковська, Г.Г. Позур, В.К. Лукаш, Л.Л. |
| citation_txt | Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів / І.С. Карпова В.В. Негруцька О.Л. Кузьменко Г.Г. Пальчиковська В.К. Позур Л.Л. Лукаш // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 8. — С. 43-47. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Фактори експериментальної еволюції організмів |
| description | Методом rep-ПЛР з використанням BOX-праймерів, виявлено кількісні і якісні відмінності патернів ДНК Alu-інтегранта B. subtilis, як від стандартних штамів, так і субклонів з ознаками суттєвого порушення росту колоній.
Посредством метода rep-ПЦР с и спользованием BOX-праймеров выявлены количественные и качественные отличия паттернов ДНК Alu-интегранта B. subtilis как от стандартных штаммов, так и субклонов с признаками существенного изменения роста колоний.
Quantitative and qualitative deviations in DNA patterns from control and derivativesof the B. subtilis strain which contain Alu-insertion were shown using rep-PCR methodwith primers to BOX elements.
|
| first_indexed | 2025-11-30T13:46:07Z |
| format | Article |
| fulltext |
43
КАРПОВА І.С., НЕГРУЦЬКА В.В., *КУЗЬМЕНКО О.Л.,
ПАЛЬЧИКОВСЬКА Л.Г., *ПОЗУР В.К., ЛУКАШ Л.Л.
*Київський Національний університет ім. Тараса Шевченка,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,
Україна, 0314. Київ, вул. Заболотного, 150, e-mail:lukash@imbg.org.ua
ДОСЛІДЖЕННЯ МІНЛИВОСТІ ГЕНОМУ
НЕСТАБІЛЬНИХ НАЩАДКІВ ALU-ІНТЕГРАНТІВ BACILLUS
SUBTILIS МЕТОДОМ REP-ПЛР
З ВИКОРИСТАННЯМ ПРАЙМЕРІВ
ДО ПОВТОРЮВАНИХ BOX-ЕЛЕМЕНТІВ
Відомо, що значну частину геному еукаріот становлять мобільні гене-
тичні елементи — МГЕ, які можуть впливати на експресію генів, а також
призводити до генетичної нестабільності і канцерогенезу [1, 2]. Геноми
бактерій також містять повторювані некодуючі послідовності, серед яких
найпоширенішими є представники трьох родин — позагенні паліндроми
REP (repetitive extragenic palindromic), внутрішньогенні консенсусні послі-
довності ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus), та елементи
BOX [3, 4]. Останні мають міжгенну локалізацію, подвійну симетрію і здатні
до формування петлеподібних структур. Метод геномного фінгерпринтингу
(rep-ПЛР) базується на використанні праймерів, комплементарних до
зазначених повторюваних послідовностей ДНК.
Об’єктом дослідження є одержані нами генетично нестабільні мутанти
Bacillus subtilis, які містять послідовність Alu-повтору геному людини
(Alu-інтегранти) [2, 5]. У попередній публікації показано можливість детек-
ції генетичних перебудов геному Alu-інтегрантів B. subtilis методом rep-ПЛР
з використанням REP-праймерів. Такий вибір ґрунтувався на відомостях,
що REP послідовності, які беруть участь у хромосомних перебудовах бакте-
рій, за консервативністю, сталою паліндромною структурою, локалізацією
в некодуючих областях, поширенням геномом нагадують представників
Alu-родини геному приматів[1].
Елементи BOX, що за своєю структурою нагадують інвертрони, потен-
ційно можуть бути мішенями для взаємодії з іншими МГЕ [7].
Мета даної роботи — дослідження можливості використання BOX-прай-
мерів, комплементарних до міжгенних елементів BOX, для виявлення
перебудов геному серед нащадків Alu-інтегрантів B. subtilis, відібраних за
ознакою суттєвого порушення росту колоній.
Матеріали і методи
Бактеріальні штами. В роботі використано стандартні штами B. sub-
tilis — SHgw, дикий тип, прототроф (“Bacillus Genetic Stock Center”, USA);
Lys-42 з колекції ЛІЯФ ім. Константинова РАН, які слугували контролем.
Об’єктами дослідження були: похідний від Lys-42 штам ІМБГ187 (ауксотроф
за орнітином Lys-Orn–, містить Alu-повтор геному людини) [5] та його нащад-
ки. Останні умовно розподілено на дві групи за морфологічними (розмір
44
колоній) та біохімічними (ауксотрофність) ознаками. Першу групу складали
мутанти, однакові за ауксотрофністю, але відмінні за розміром колоній:
штами 4, 7, 11 (діаметр до 2 мм), штами 18, 22 (до 4 мм, що відповідало роз-
міру колоній батьківського штаму), штами 25, 26 (до 10 мм) та штам 31 —
мозаїк з темним центром, розмір якого досягав 25 мм. Другу групу складали
субклони мозаїка 31, які формували великі за розміром колонії, але
відрізнялись за ауксотрофністю: штами 3/31 і 6/31 — ревертанти Lys-Orn+;
субклон 32 Lys-Orn-, що виник як сегмент мозаїка 31 та його ревертанти шта-
ми 1/32, 6/32, 12/32 і 14/32 — Lys-Orn+, субклон 33, що виник як світлий
прозорий сегмент мозаїка 31, який мав додаткову ауксотрофну мутацію
(фенотип Lys-Orn-X-) та його ревертант за цією мутацією — штам 3/33.
Мутанти розсівали до окремих колоній та вирощували на повноцінному
та мінімальному агаризованому середовищі з відповідними добавками при
37 °С протягом 20–24 год.
Виділення бактеріальної ДНК. Геномну ДНК виділяли з бактеріальної
нічної культури клітин (5 мл) за стандартним методом [6]. Концентрацію
ДНК, вільну від РНК, визначали на спектрофотометрі Biomate 5 (Thermo
electron corporation, США).
Rep-ПЛР проводили з використанням праймерів BOX A1R (5'-
CTACGGCAAGGCGACGCTGACG -3'). Реакційна суміш, кінцевий об’єм
якої становив 50 мкл, містила 50 ng бактеріальної ДНК, 200 nM кожного
праймера, 200 мM кожного з нуклеозидтрифосфатів, стандартний буфер для
ПРЛ (Fermentas, Литва), 2 мМ MgCl2, 0,05% DMSO та 1 од. Taq ДНК-полі-
мерази (Fermentas, Литва). ПЛР було проведено в ампліфікаторі “Терцик”
(Росія) з початковою денатурацією 95 °С/6 хв., після чого в реакційну суміш
вносили Taq ДНК-полімеразу. Умови реакції 94 °С/1 хв — 55 °С/1 хв —
65 °С/8 хв (30 циклів) з кінцевим синтезом — 64 °С/16 хв [4]. Наявність
ампліконів визначали за допомогою електрофорезу у 1,2% агарозному гелі.
Як маркер молекулярної ваги використовували O’Gene Ruler Express DNA
Ladder (Fermentas, Литва) згідно рекомендаціям фірми-виробника. Для ана-
лізу агарозних гелів застосовували програму TotalLab v 2.01.
Результати досліджень
Методом Rep-ПЛР були отримані фінгерпринти ДНК штаму SHgw
дикого типу B. subtilis, батьківського штаму Lys-42, Alu-інтегранта ІМБГ187,
а також похідних від нього мутантів (рис. 1) та проведено їхній порівняльний
аналіз. У контрольних штамів виявлено 9 фрагментів ДНК, що фланковані
BOX-послідовностями, і мають такі розміри: 3288–3259; 2804–2777; 2268–
2251; 1802–1794; 1209–1174; 898; 515–511; 304; 90–76 нп. Найбільші від-
мінності від контролю мали високомолекулярні продукти ампліфікації ДНК
Alu-інтегранта (рис. 1, доріжки А3 і Б2), розмір яких знаходиться в діапазоні
2831–1585 нп. Відмінності стосувались як збільшення інтенсивності
забарвлення відповідних смужок так і зменшення іх розмірів на 400–200 нп.
Особливої уваги заслуговує мажорний амплікон розміром 1585 нп (четверта
45
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
А Б
Рис. 1. Електрофореграма результатів BOX-аналізу ДНК похідних Alu-інте-
гранта B. subtilis ІМБГ187, щo відрізняються за розмірами колоній (гель А):
M — маркер (5000, 3000, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 300, 100 нп); штами: 1 — SHgw
(прототроф); 2 — Lys-42 (контроль); 3 — ІМБГ187; 4 — клон 4; 5 — клон 7; 6 —
клон 11; 7 — клон 18; 8 — клон 22; 9 — клон 25; 10 — клон 26 та ДНК субклонів
Alu-інтегранта ІМБГ187, щo відрізняються великими розмірами колоній та змінами
ауксотрофності (гель Б): 1 — Lys-42; 2 — ІМБГ187; 3 — 31 (сегмент 1); 4 — ревертант
3/31; 5 — ревертант 6/31; 6 — 32 (сегмент 2); 7 — ревертант 1/32; 8 — ревертант
6/32 клон; 9 — ревертант 12/32; 10 — ревертант 14/32; 11 — 33 (сегмент 3); 12 —
ревертант 3/33
1 2 3
1
2
3
Рис.2. Денситограма геномного фінгерпринту Alu-інтегранта B. subtilis ІМБГ187
(3) порівняно з контрольними штамами SHgw (1) та Lys-42 (2)
46
смужка від старту, рис. 2), який є характерним для досліджуваного Alu-ін-
тегранта і деяких його похідних.
Зокрема, визначення асоціації фрагмента №4 з мутантними фенотипами
показало, що похідні Alu-інтегранта, які мають розміри колоній від 2
до 10 мм (за винятком клону 18) втрачають зазначені особливості нестабіль-
ного мутанта і за фінгерпринтом не відрізняються від контрольних штамів
(рис. 1, гель А). Поряд з цим, у мозаїка 31, колонії якого за розміром в 5 разів
перевищували норму, на молекулярному рівні зафіксовано кількісні і якісні
відмінності в високомолекулярній частині отриманого патерну (від 1600 нп),
як від батьківського штаму, так і від контрольних варіантів (рис. 1, гель Б).
Також звертає на себе увагу більш інтенсивна ампліфікація трьох нижніх
фрагментів у субклонів 31 і 32, що не спостерігалось у ревертантів з феноти-
пом Lys-Orn+ і у субклона 33. За стандартизації кількості ДНК-матриці в
реакції, виявлені відмінності виходу продукту можна віднести за рахунок
активності еукаріотного МГЕ в межах ділянки ДНК, що фланкована послі-
довностями сімейства BOX.
Відомо, що присутність Alu-повтору (розмір 300 нп) у регуляторній зоні
може впливати на експресію генів, а інтеграція у кодуючу послідовність
ДНК підвищує темпи виникнення мутацій та спричиняє генетичну неста-
більність [1, 2]. Одержані результати дозволяють висловити припущення,
що мутаційні події, які призводять до суттєвого порушення росту колоній в
поколіннях нестабільного мутанта за наявності в геномі Alu-повтору людини,
пов’язані з перебудовами в певних ділянках, що франковані BOX-послідов-
ностями. Секвенування найбільш характерних ампліконів мутантів, зокрема
фрагменту №4, дозволить з’ясувати точну природу мутаційних змін і їхню
локалізацію.
Перспективним видається використання даної моделі для попереднього
дослідження цитостатичної дії різноманітних високо- та низькомолекулярних
біологічно активних речовин, зокрема, лектинів, антибіотиків, тощо.
Висновки
Методом rep-ПЛР з використанням BOX-праймерів, виявлено кількісні
і якісні відмінності патернів ДНК Alu-інтегранта B. subtilis, як від стан-
дартних штамів, так і субклонів з ознаками суттєвого порушення росту
колоній.
На найбільш характерні зміни виявлено в ампліконі №4, що може бути
потенційним маркером, асоційованим з даним фенотипом.
Література
1. Batzer M.A., Deininger P.L Alu repeats and human genomic diversity // Nature
reviews.— 2002.— Vol.3, N1.— P. 370–380.
2. Карпова І.С., Корецька Н.В., Лялюцька Т.С. Розвиток ідей С.М. Гершензона
у дослідженні адаптивності мутацій // Физиология и биохимия культурных расте-
ний.— 2006.— Т.38, №2.— С. 124–133.
3. Lupski J.R., Wienstock G.M. Short, interspersed repetitive DNA sequences in
procariotic genomes // Journ. of Bacter.— 1992.— Vol.174, N14.— P. 4525–4529.
47
4. Rademaker J.L.W., Bruijn F.J. Characterization and classification of microbes by
Rep-PCR genomic fingerprinting and computer-assisted pattern analysis // Appl. Envir.
Microbiol.— 1998.— Vol.64.— P. 2096–2104.
5. Карпова И.С., Горовенко Н.Г., Подольская С.В., Россоха З.И.,. Корецкая Н.В,
Дмитренко В.В., Рымарь С.Е. Инсерционный механизм ДНК-мутагенеза // Вісн.
Укр. товариства генетиків і селекціонерів.— 2006.— Т.4, №1.— С. 124–129.
6. Кузьменко О.Л., Негруцька В.В., Пальчиковська Л.Г., Карпова І.С., Лу-
каш Л.Л. Застосування методу геномного фінгерпринтінгу (REP-ПЛР) для
дослідження інсерційних мутантів Bacillus subtilis // Фактори експериментальної
еволюції організмів.— К.: Логос.— 2009.— Т.7.— С. 32–36.
7. Sakaguchi K. Invertrons, a class of structurally and functionally related genetic
elements that includes linear DNA plasmids, transposable elements, and genoms of adeno-
type viruses // Microbiol. Rev.— 1990.— Vol.54, N1.— P. 66–74.
Резюме
Методом rep-ПЛР з використанням BOX-праймерів, виявлено кількісні і якісні
відмінності патернів ДНК Alu-інтегранта B. subtilis, як від стандартних штамів, так
і субклонів з ознаками суттєвого порушення росту колоній.
Посредством метода rep-ПЦР с использованием BOX-праймеров выявлены
количественные и качественные отличия паттернов ДНК Alu-интегранта B. subtilis
как от стандартных штаммов, так и субклонов с признаками существенного изме-
нения роста колоний.
Quantitative and qualitative deviations in DNA patterns from control and derivatives
of the B. subtilis strain which contain Alu-insertion were shown using rep-PCR method
with primers to BOX elements.
КОНОВАЛОВ В.С., КОПІЫЛОВ К.В., СТАРОДУБ Л.Ф.,
АЛЕКСЕЕНКО Т.И., ШЕБУНЬКО М.В.
Институт разведения и генетики животных НААН, Украина.
Научно-методический центр, Украина. e-mail konovalov_vs@ukr.net
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РИСКИ И УПРАВЛЕНИЕ ИМИ
В СЕЛЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ
Современные методико-технологические достижения молекулярной
генетики позволили не только углубить понимание механизмов мутацион-
ного процесса, но и понять, что существенная часть “нейтральных” мутаций
[1], на самом деле представляют собой рецессивные “молчащие” мутации
проявляющие свои кодоминантные свойства как адаптивный ответ на
меняющийся уровень антропогенного давления [2]. Реализация ранее
скрытой от селекционера изменчивости обязывает нас глубже анализировать
проблемы генетического груза и дифференцировать генетические риски в
зависимости от их влияния на гомеостатические механизмы жизнеспо-
собности и воспроизводительной способности организма. В этой связи в
методологии фено-цито-ДНК мониторинга наследственных патологий раз-
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-177461 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2219-3782 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-11-30T13:46:07Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Карпова, І.С. Негруцька, В.В. Кузьменко, О.Л. Пальчиковська, Г.Г. Позур, В.К. Лукаш, Л.Л. 2021-02-15T18:44:57Z 2021-02-15T18:44:57Z 2010 Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів / І.С. Карпова В.В. Негруцька О.Л. Кузьменко Г.Г. Пальчиковська В.К. Позур Л.Л. Лукаш // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 8. — С. 43-47. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177461 Методом rep-ПЛР з використанням BOX-праймерів, виявлено кількісні і якісні відмінності патернів ДНК Alu-інтегранта B. subtilis, як від стандартних штамів, так і субклонів з ознаками суттєвого порушення росту колоній. Посредством метода rep-ПЦР с и спользованием BOX-праймеров выявлены количественные и качественные отличия паттернов ДНК Alu-интегранта B. subtilis как от стандартных штаммов, так и субклонов с признаками существенного изменения роста колоний. Quantitative and qualitative deviations in DNA patterns from control and derivativesof the B. subtilis strain which contain Alu-insertion were shown using rep-PCR methodwith primers to BOX elements. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Еволюція геномів у природі та експерименті Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів Article published earlier |
| spellingShingle | Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів Карпова, І.С. Негруцька, В.В. Кузьменко, О.Л. Пальчиковська, Г.Г. Позур, В.К. Лукаш, Л.Л. Еволюція геномів у природі та експерименті |
| title | Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів |
| title_full | Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів |
| title_fullStr | Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів |
| title_full_unstemmed | Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів |
| title_short | Дослідження мінливості геному нестабільних нащадків Alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних BOX-елементів |
| title_sort | дослідження мінливості геному нестабільних нащадків alu-інтегрантів bacіllus subtilis методом rep-плр з використанням праймерів до повторюваних box-елементів |
| topic | Еволюція геномів у природі та експерименті |
| topic_facet | Еволюція геномів у природі та експерименті |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177461 |
| work_keys_str_mv | AT karpovaís doslídžennâmínlivostígenomunestabílʹnihnaŝadkívaluíntegrantívbacíllussubtilismetodomrepplrzvikoristannâmpraimerívdopovtorûvanihboxelementív AT negrucʹkavv doslídžennâmínlivostígenomunestabílʹnihnaŝadkívaluíntegrantívbacíllussubtilismetodomrepplrzvikoristannâmpraimerívdopovtorûvanihboxelementív AT kuzʹmenkool doslídžennâmínlivostígenomunestabílʹnihnaŝadkívaluíntegrantívbacíllussubtilismetodomrepplrzvikoristannâmpraimerívdopovtorûvanihboxelementív AT palʹčikovsʹkagg doslídžennâmínlivostígenomunestabílʹnihnaŝadkívaluíntegrantívbacíllussubtilismetodomrepplrzvikoristannâmpraimerívdopovtorûvanihboxelementív AT pozurvk doslídžennâmínlivostígenomunestabílʹnihnaŝadkívaluíntegrantívbacíllussubtilismetodomrepplrzvikoristannâmpraimerívdopovtorûvanihboxelementív AT lukašll doslídžennâmínlivostígenomunestabílʹnihnaŝadkívaluíntegrantívbacíllussubtilismetodomrepplrzvikoristannâmpraimerívdopovtorûvanihboxelementív |