Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини

Aims. The use of plants as a recombinant peptides expression system is a valuable alternative for the production of collagen for various medical and scientific purposes. The aim of this work was to obtained transgenic plants of Nicotiana benthamiana with two human genes encoding subunits of prolyl...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2015
Main Authors:	Щербак, Н.Л., Василенко, М.Ю., Кучук, М.В.
Format:	Article
Language:	Ukrainian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2015
Series:	Фактори експериментальної еволюції організмів
Subjects:	Молекулярні та клітинні біотехнології
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177533
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини / Н.Л. Щербак, М.Ю. Василенко, М.В. Кучук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 17. — С. 265-269. — Бібліогр.: 16 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-177533
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1775332025-02-10T00:28:24Z Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини Obteining of transgenic nIcotiana benthamiana plants carrying genes of prolyl-4-hydroxylase subunits Щербак, Н.Л. Василенко, М.Ю. Кучук, М.В. Молекулярні та клітинні біотехнології Aims. The use of plants as a recombinant peptides expression system is a valuable alternative for the production of collagen for various medical and scientific purposes. The aim of this work was to obtained transgenic plants of Nicotiana benthamiana with two human genes encoding subunits of prolyl-4-hydroxylase (P4H), responsible for key posttranslational modifications of collagen. Methods. Transgenic plants were obtained via Agrobacterium mediated transformation method. Presence of the target and selective genes was confirmed by PCR-analysis. Results. We report here the development of transgenic plants of Nicotiana benthamiana carrying genes of prolyl-4-hydroxylase (P4H) subunits. Conclusions. Obtained plants have potential to produce adequately modified exogenous collagen with mammalian-like post-translation modifications via transient expression experiments. Keywords: Nicotiana benthamiana, transgenic plants, prolyl-4-hydroxylase, collagen, transient expression. 2015 Article Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини / Н.Л. Щербак, М.Ю. Василенко, М.В. Кучук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 17. — С. 265-269. — Бібліогр.: 16 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177533 577.21:582.926.2 uk Фактори експериментальної еволюції організмів application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Молекулярні та клітинні біотехнології Молекулярні та клітинні біотехнології
spellingShingle	Молекулярні та клітинні біотехнології Молекулярні та клітинні біотехнології Щербак, Н.Л. Василенко, М.Ю. Кучук, М.В. Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини Фактори експериментальної еволюції організмів
description	Aims. The use of plants as a recombinant peptides expression system is a valuable alternative for the production of collagen for various medical and scientific purposes. The aim of this work was to obtained transgenic plants of Nicotiana benthamiana with two human genes encoding subunits of prolyl-4-hydroxylase (P4H), responsible for key posttranslational modifications of collagen. Methods. Transgenic plants were obtained via Agrobacterium mediated transformation method. Presence of the target and selective genes was confirmed by PCR-analysis. Results. We report here the development of transgenic plants of Nicotiana benthamiana carrying genes of prolyl-4-hydroxylase (P4H) subunits. Conclusions. Obtained plants have potential to produce adequately modified exogenous collagen with mammalian-like post-translation modifications via transient expression experiments. Keywords: Nicotiana benthamiana, transgenic plants, prolyl-4-hydroxylase, collagen, transient expression.
format	Article
author	Щербак, Н.Л. Василенко, М.Ю. Кучук, М.В.
author_facet	Щербак, Н.Л. Василенко, М.Ю. Кучук, М.В.
author_sort	Щербак, Н.Л.
title	Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини
title_short	Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини
title_full	Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини
title_fullStr	Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини
title_full_unstemmed	Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини
title_sort	отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2015
topic_facet	Молекулярні та клітинні біотехнології
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177533
citation_txt	Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини / Н.Л. Щербак, М.Ю. Василенко, М.В. Кучук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 17. — С. 265-269. — Бібліогр.: 16 назв. — укр.
series	Фактори експериментальної еволюції організмів
work_keys_str_mv	AT ŝerbaknl otrimannâtransgennihroslinnicotianabenthamianavâkihprohoditʹekspresíâgenívprolíl4gídroksilazilûdini AT vasilenkomû otrimannâtransgennihroslinnicotianabenthamianavâkihprohoditʹekspresíâgenívprolíl4gídroksilazilûdini AT kučukmv otrimannâtransgennihroslinnicotianabenthamianavâkihprohoditʹekspresíâgenívprolíl4gídroksilazilûdini AT ŝerbaknl obteiningoftransgenicnicotianabenthamianaplantscarryinggenesofprolyl4hydroxylasesubunits AT vasilenkomû obteiningoftransgenicnicotianabenthamianaplantscarryinggenesofprolyl4hydroxylasesubunits AT kučukmv obteiningoftransgenicnicotianabenthamianaplantscarryinggenesofprolyl4hydroxylasesubunits
first_indexed	2025-12-02T04:31:21Z
last_indexed	2025-12-02T04:31:21Z
_version_	1850369514177298432
fulltext	ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 265 Отримання трансгенних рослин Nicotiana Benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини Щ ер ба к Н .Л ., В ас ил ен ко М .Ю ., К уч ук М .В . Колаген I типу є важливим сировинним ма- теріалом для цілого ряду напрямків фармацев- тичного виробництва і використовується як хі- рургічний шовный матеріал, як допоміжна ре- човина в технології мазей, супозиторіїв, розчи- нів для ін’єкцій, очних лікарських плівок та ін. Традиційно колаген, що використовують в фар- мацевтичній та косметологічній промисловості екстрагують з тваринних тканин. Такий продукт містить колагени різних типів, та може містити алергени та збудники інфекційних захворювань. Технологія отримання рекомбінантного колагену дозволила отримувати більш однорідний та без- печний колаген. Рекомбінантний колаген було от- римано в тваринних клітинах [1], культурі клітин комах [2], дріжджах [3] та культурі рослинних клітин [4]. Ці технології мають певні обмеження та високу вартість. Протягом останніх десятиліть активно про- водиться розробка альтернативної економічно вигідної та безпечної системи продукції реком- бінантних білків в рослинних системах. Крім створення трансгенних рослин, в яких проходить експресія цільових білків після переносу чужо- рідного гена в геном рослини, розроблені систе- ми транзієнтної (тимчасової) експресії, при якій експресія клонованого гена відбувається без його обов’язкової інтеграції в геном рослини [5]. Рос- лини, як продуценти рекомбінантних білків, ма- ють ряд переваг у порівнянні з бактеріями, дріж- джами або клітинами ссавців. Рослини не міс- тять патогенні для людини віруси та пріони, не потребують застосування коштовного обладнан- ня та культуральних середовищ для їх вирощу- вання, а також проведення робіт в асептичних умовах. Вперше в рослинних системах колаген було отримано в трансгенних рослинах тютюну [6] і таким чином було показано, що в рослинах мож- ливий синтез про-β-ланцюгів колагену, та фор- мування потрійної спіральної структури. Од- нак отриманий колаген мав низький вміст гід- роксипроліну, що значно знизило його стабіль- ність при фізіологічних температурах. Гідрокси- © ЩЕРБАК Н.Л., ВАСИЛЕНКО М.Ю., КУЧУК М.В. лювання проліну є необхідним для стабілізації потрійної спіралі колагену, оскільки ОН-групи гідроксипроліну беруть участь в утворенні вну- трішньомолекулярних водневих зв’язків. Утво- рення 4-гідроксипроліну каталізує фермент про- ліл-4-гідроксилаза і це необхідний етап у фор- муванні про-β-ланцюгів колагену [7, 8]. Про- ліл-4-гідроксилаза, яка присутня в рослинах, не забезпечує коректне гідроксилювання проліну у повторюваних амінокислотних послідовностях колагену X-Pro-Gly, в яких X – це будь-яка амі- нокислота, крім гліцину [9]. При цьому було по- казано, що сумісна експресія генів ланцюгів ко- лагену та субодиниць проліл-4-гідроксилази в трансгенних рослинах збільшує вміст 4-гід- роксипроліну в синтезованих молекулах і, як на- слідок, дає можливість отримувати молекули ко- лагену з максимально близькою до нативної про- сторовою структурою [10]. за останні роки було показано, що транзі- єнтна (тимчасова) система експресії дає можли- вість значно збільшити кількість рекомбінантно- го білка у порівнянні з стабільно трансформо- ваними рослинами. При використанні системи транзієнтної експресії MagnICON [11] кількість отриманого рекомбінантного білка у порівнян- ні з трансгенними рослинами збільшилась май- же у 100 разів [12]. У цій же системі повідомля- лось, що Nicotiana benthamiana, у порівнянні зі звичайним тютюном, при транзієнтній експресії накопичує у 7 разів більше білка. Метою нашої роботи було створення транс- генних рослин N. benthamiana – адаптованих продуцентів для транзієнтної експресії колагену людини, в яких відбувається пост-трансляційна модифікація цього рекомбінантного білка. завдя- ки перенесенню в геном цих рослин послідовно- стей, що кодують фермент проліл-4-гідроксилазу та експресії цього ферменту, стає можливим гід- роксилювання залишків проліну в молекулі кола- гену, що в свою чергу забезпечує утворення ко- ректної просторової структури полімерного ко- лагену. УДК 577.21:582.926.2 ЩЕРБАК Н.Л., ВАСИЛЕНКО М.Ю., КУЧУК М.В. Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 148, e-mail: natasha@icbge.org.ua ОТРИМАННЯ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН nicoTiAnA BEnTHAmiAnA, В ЯКИХ ПРОХОДИТь ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ ПРОЛІЛ-4-ГІДРОКСИЛАЗИ ЛЮДИНИ 266 ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 Щербак Н.Л., Василенко М.Ю., Кучук М.В. Трансформація рослин n. benthamiana за допомогою Agrobacterium tumefaciens. Для агробактеріальної трансформації N.benthamiana використовували сегменти листків 5–6-тижне- вих рослин, що вирощувались в асептичних умо- вах. Експланти інкубували у бактеріальній су- спензії (нічна культура агробактерії розведена у 4–5 разів) протягом 10–15 хвилин. Інокульовані бактеріальною суспензією експланти викладали на стерильний фільтрувальний папір і культиву- вали протягом 12–16 годин. Після цього експлан- ти переносили середовище MS [14], яке додатко- во містило 5 мг/л фосфінотрицину, 600 мг/л це- фотаксиму, а також фітогормони 1 мг/л БАП та 0,1 мг/л НОК для ініціації регенерації рослин. Через 5–6 тижнів сформовані пагони пересад- жували на безгормональне середовище MS, до- повнене 5 мг/л фосфінотрицину. Надалі вкоріне- ні рослини переносили в ґрунт в умовах теплиці. Аналіз трансформованих рослин N. bentha miana. Для доведення наявності трансге- нів в отриманих рослинах аналізували сумарну рослинну ДНК за допомогою ПЛР з використан- ням праймерів до гена bar та генів α- та β- су- бодиниць ферменту проліл-4-гідроксилази. Ре- акційна суміш містила ~ 100 нг сумарної рос- линної ДНК, сольовий буфер (10 мМ Tris-HCl, рН 9,0, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 0,01 % Три- тон Х-100), по 200 мкМ кожного з дезоксінукле- отидтрифосфатів, по 0,2 мкМ кожного з прай- мерів та 1 одиницю Taq-полімерази. загальний об’єм суміші становив 20 мкл. В таблиці пред- ставлена інформація про нуклеотидні послідов- ності праймерів, які використовували в роботі, та їх специфічність. Сумарну рослинну ДНК, ви- діляли ЦТАБ-методом [15]. Як позитивний кон- троль для реакції ампліфікації використовували плазмідну ДНК векторів, яку виділяли з нічної Матеріали і методи Векторні конструкції та бактеріаль- ні штами. Створення векторних конструкцій рСВ210 та рСВ226 проводили на основі вектора з колекції Інституту, Т-ДНК якого включає селек- тивний (bar) та репортерний (gfp) гени. При кон- струюванні векторів ділянка із селективним ге- ном фосфінотрицину-N-ацетилтрансферази, що надає трансгенним рослинам стійкість до гер- біциду фосфінотрицину, не змінювалась. Проте структурна частина репортерного гена була делі- тована за допомогою гідролізу вихідного вектора рестриктазами NcoI та KasI, сайти впізнавання яких саме фланкують структурну частину гена. Лінійний фрагмент вектора очищали із гелю піс- ля електрофоретичного розділення продуктів ре- стрикції. Очистку проводили за допомогою набо- ру для виділення ДНК фрагментів (Gel extraction kit, ThermoScientific). Водночас тим самим спо- собом проводили очистку структурних частин генів α-та в-субодиниць проліл-4-гідроксилази, синтезованих за допомогою ПЛР та оброблених після ПЛР рестриктазами NcoI та XbaI. з препа- ратами очищеного лінійного вектора та генів α- та β-субодиниць проліл-4-гідроксилази проводи- ли реакції лігування за допомогою Т4-ДНК ліга- зи за відповідних умов (ThermoScientific). Про- дуктами лігування трансформували Esherihia coli штаму XL1-Blue, відбирали стійки до антибіоти- ка колонії, плазмідну ДНК яких перевіряли рес- триктним картуванням. Коректно зібрані бінарні векторні конструкції переносили в Agrobacterium tumefaciens штаму GV3101 методом електропо- рації з використанням MicroPulser Electroporator (Biorad). Для трансформації рослин використо- вували нічну культуру агробактерії, що вирощу- валась на рідкому середовищі LB [13] при 28 °С. Таблиця Праймери, які використані в роботі, для проведення молекулярного аналізу за допомогою ПЛР Ген Послідовність праймерів Температура реа- соціації Продукт ампліфі- кації bar 5’-CCGTaCCGaGCCGCaGGaaC-3’ 5’-CaGaTCTCGGTGaCGGGCaGGaC-3’ 650С 463 п.н. P4H-α 5’-CaCCaTGGTCTGGTaTaTaTTaaTTaTaGGa-3’ 5’-CaCGGCGCCTTCCaaTTCTGaCaaCGTaCaaGG-3’ 600С 1758 п.н. P4H-β 5’-TTCCaTGGaCGCCCCGGaaGaaGaaGaCCaCG-3’ 5’-aGaGGCGCCCaGTTGaTCTTTCaCaGCTTTCTG-3’ 640С 1477 п.н. P4H-α 5’-GTTGCTGTGGaTTaCCTGCCaGaG-3’ 5’-GGCTCaTCTTTCCGTGCaaaGTC-3’ 600С 491 п.н. P4H-β 5’-TCCTTGGTGGaGTCCaGCGaG-3’ 5’-GaCaGGCTGCTTGTCCCaGTC-3’ 610С 666 п.н. P4H-β 5’-TCCaGCGaGGTGGCTGTCaTCG-3’ 5’-CCaaCaaGCaCCTTGaCaGGCTGC-3’ 640С 663 п.н. ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 267 Отримання трансгенних рослин Nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини рії A. tumefaciens штаму GV3101 та проведено ге- нетичну трансформацію N. benthamiana. Для проведення генетичної трансформа- ції ми використовували суміш суспензій двох агробактеріальних культур, кожна з якої мі- стила відповідний вектор. Регенерація рослин N. benthamiana на селективному середовищі, що містило 5 мг/л фосфінотрицину, відбувалась 6–10 тижнів, протягом яких на експлантах фор- мувались численні пагони (рис. 2-а). Вкорінен- ня регенерантів проводили на безгормональному культури E. coli, використовуючи лужний метод [16]. Електрофорез ПЛР фрагментів ДНК прово- дили у 1 % агарозному гелі. Результати та обговорення Рослини N. benthamiana є модельним об’єк- том для синтезу рекомбінантних білків, тому для проведення досліджень, щодо експресії генів ко- лагену людини І-го типу, був вибраний саме цей вид. Гідроксилювання залишків проліну в моле- кулі колагену є необхідною складовою процесу дозрівання молекули колагену в людському ор- ганізмі, отже наявність ферменту проліл-4-гід- роксилази людини в клітинах N. benthamiana є вкрай важливим фактором для коректного фор- мування молекули колагену. Створення транс- генних рослин N. benthamiana, які мають у своїх клітинах проліл-4-гідроксилазну активність, дає можливість отримати адаптовані продуценти для синтезу колагену в рослинній системі. Для створення рослин N. benthamiana із гідроксилазною активністю за людським типом було проведено клонування генів α- та β-субоди- ниці ферменту (P4H- α та P4H- β) за допомогою ПЛР та створення генетичних конструкцій для трансформації рослин. Далі, на основі створених векторів рСВ210 та рСВ226, що представлені на рис.1, було отримано відповідні лінії агробакте- Рис. 1. Схематичне зображення Т-ДНК бінарних век- торів pCB210 та рСВ226: 35Spro – промотор вірусу мозаїки цвітної капусти; nospro – промотор нопалін синтази; nost – термінатор нопалін синтази; oсst – термінатор октопін синтази; bar – ген фосфінотри- цин – N – ацетилтрансферази, Р4Н-α та Р4Н-β гени α- та β-субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилаза Рис. 2. Результати генетичної трансформації N. benthamiana векторами рСВ210 та рСВ226: а – регенерація рослин N. benthamiana на селективному середовищі; б–в – електрофореграмма результатів ПЛР аналізу тоталь- ної ДНК рослин N. benthamiana, відібраних на селективному середовищі з використанням праймерів до bar (в), P4H-α (α) та P4H-β (г) генів: М – маркер 1 kb Plus DNa Ladder (Gibco BrL); К – негативний контроль, ДНК нетрансформованої рослини; К+ – позитивний контроль ДНК плазміди рСВ210 або рСВ226; 1–5 – ДНК рослин-регенерантів, стійких до фосфінотрицину 268 ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 Щербак Н.Л., Василенко М.Ю., Кучук М.В. з умов in vitro рослини швидко адаптувались та росли, формуючи великі листкові пластини, що, на наш погляд, можна вважати ще однією пере- вагою для використання цих рослин для транзі- єнтної експресії. Висновки Були створені генетичні конструкції для агробактеріальної трансформаціі, які містять ге- нетичні послідовності α- та β-субодиниць фер- менту проліл-4-гідроксилази, проведено гене- тичну трансформацію рослин N.benthamiana. В результаті були отримані трансгенні рослини N. benthamiana, що містять гени α- та β-субоди- ниць ферменту проліл-4-гідроксилази, наявність яких в геномі підтверджена за допомогою ПЛР. Ми вважаємо, що такі рослини можуть бути ви- користані, як адаптовані продуценти, в яких за- безпечується пост-трансляційна модифікація ланцюгів колагену, а саме гідроксилювання за- лишків проліну, що синтезуються транзієнтно. середо вищі MS, що також містило 5 мг/л фосфі- нотрицину. Для підтвердження наявності пере- несених генів субодиниць проліл-4-гідроксилази в геномі рослин, відібраних у результаті селекції на фосфінотрицині, проводили молекулярно-біо- логічний аналіз за допомогою ПЛР (рис. 2 бг). В обох векторах, рСВ210 та рСВ226, для се- лекції рослин був використаний ген bar, що на- дає трансгенним рослинам стійкість до гербі- циду фосфінотрицину. В умовах такої селек- ції, приблизно 30 % трансгенних рослин мали в своєму геномі послідовності обох субодиниць проліл-4-гідроксилази. На рисунку 2-г видно від- сутність відповідного сигналу після проведен- ня ПЛР (доріжки 4, 5), що свідчить про відсут- ність гена P4H-β в геномі цих рослин, тоді як на- явність гена P4H-α в них підтверджується (рис. 2-б). Вкорінені рослини, в геномі яких за допо- могою ПЛР було підтверджено наявність обох субодиниць проліл-4-гідроксилази, переноси- ли в ґрунт в умовах теплиці. Перенесені в ґрунт ЛІТЕРАТУРА 1. Geddis a., Prockop D. Expression of human COL1a1 gene in stably transfected HT1080 cells: the production of a thermostable homotrimer of type I collagen in a recombinant system // Matrix. 1993. 13, N 5. Р. 399405. 2. Myllyharju J., Lamberg a., Notbohm H., Fietzek P., Pihlajaniemi T., Kivirikko K.I. Expression of wild-type and modified pro alpha chains of human type I procollagen in insect cells leads to the formation of stable [alpha 1(I)](2)alpha 2(I) collagen heterotrimers and [alpha 1(I)](3) homotrimers but not [alpha 2(I)](3) homotrimers // J. Biol. Chem. – 1997. 272, N 35. Р. 2182421830. 3. Vuorela a., Myllyharju J., Nissi r., Pihlajaniemi T., Kivirikko K.I. assembly of human prolyl 4-hydroxylase and type III collagen in the yeast Pichia pastoris: formation of a stable enzyme tetramer requires coexpression with collagen and assembly of a stable collagen requires coexpression with prolyl 4-hydroxylase // EMBO J. – 1997. 16, N 22. – Р. 67026712. 4. ritala a., Wahlstrom E.H., Holkeri H., Hafren a., Makelainen K., Baez J., Makinen K., Nuutila a.M. Production of a recombinant industrial protein using barley cell cultures // Protein Expr. Purif. – 2008. 59, N 2. Р. 274281. 5. Komarova T., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E. Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals // Expert. rev. Vaccines. – 2010. – 9, N 8. – Р. 859–876. 6. ruggiero F., Exposito J.Y., Bournat P., Gruber V., Perret S., Comte J., Olagnier B., Garrone r., Theisen M. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants // FEBS Lett. – 2000. 469, N 1. Р. 132–136. 7. Gorres K., raines r. Prolyl 4-hydroxylase // Crit. rev. Biochem. Mol. Biol. 2010. 45, N 2. P. 106–124. 8. Myllyharju J. Prolyl 4-hydroxylases, the key enzymes of collagen biosynthesis // Matrix Biol. 2003. – 22, N 1. Р. 15–24. 9. Tanaka M., Sato K., Uchida T. Plant prolyl hydroxylase recognizes poly(L-proline) II helix // J. Biol. Chem. – 1981. 256, M 22. Р. 11397–11400. 10. Xu X., Gan Q., Clough r.C., Pappu K.M., Howard J.a., Baez J.a., Wang K. Hydroxylation of recombinant human collagen type I alpha 1 in transgenic maize co-expressed with a recombinant human prolyl 4-hydroxylase // BMC Biotechnol. – 2011. – 11, N 69. 11. Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia r., Klimyuk V., Gleba Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants // Nat. Biotechnol. 2005. 23, N 6. Р. 718–723. 12. Nausch H., Mikschofsky H., Koslowski r., Meyer U., Broer I., Huckauf J. High-level transient expression of Er-targeted human interleukin 6 in Nicotiana benthamiana // PLoS One. – 2012. – 7, N 11. e48938. 13. Bertani G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli // J. Bacteriol. 1951. – 62, N 3. Р. 293–300. 14. Murashige T., Skoog F. a revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum. – 1962. 15, N 3. Р. 473–497. 15. Армитидж Ф., Уолден Р., Дрейпер Дж. Выделение тотальных препаратов нуклеиновых кислот из A. tumefaciens // Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скота, Ф. Армитидж, Р. Уолден. – М.: Мир, 1991. С. 76–78. 16. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. – М.: Мир, 1984. – 545 с. ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 269 Отримання трансгенних рослин Nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини SHCHERBAK N.L., VASYLENKO M.YU., KUCHUK M.V. Institute of Cell Biology and Genetic Engineering NAS of Ukraine, Ukraine, 03680, Kyiv, Zabolotnogo str., 148, e-mail: natasha@icbge.org.ua OBTEINING OF TRANSGENIC NICOTIANA BENTHAMIANA PLANTS CARRYING GENES OF PROLYL-4-HYDROXYLASE SUBUNITS Aims. The use of plants as a recombinant peptides expression system is a valuable alternative for the production of collagen for various medical and scientific purposes. The aim of this work was to obtained transgenic plants of Nicotiana benthamiana with two human genes encoding subunits of prolyl-4-hydroxylase (P4H), responsible for key posttranslational modifications of collagen. Methods. Transgenic plants were obtained via Agrobacterium mediated transformation method. Presence of the target and selective genes was confirmed by PCr-analysis. Results. We report here the development of transgenic plants of Nicotiana benthamiana carrying genes of prolyl-4-hydroxylase (P4H) subunits. Conclusions. Obtained plants have potential to produce adequately modified exogenous collagen with mammalian-like post-translation modifications via transient expression experiments. Keywords: Nicotiana benthamiana, transgenic plants, prolyl-4-hydroxylase, collagen, transient expression.

Отримання трансгенних рослин nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини

Institution

Similar Items