Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия

Установлено наличие одних и тех же RAPD-ампликонов, дифференциально
 синтезируемых с ДНК вольфрамустойчивой клеточной линии сои (Glycine max L.,
 Merr.) при действии летальных доз оксианионов вольфрама или ванадия, а также её
 исходного штамма. Предположено наличие в геноме с...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Published in:Фактори експериментальної еволюції організмів
Date:2008
Main Authors: Тищенко, Е.Н., Михальская, С.И., Сергеева, Л.Е.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2008
Subjects:
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177689
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия / Е.Н. Тищенко, С.И. Михальская, Л.Е. Сергеева // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 4. — С. 166-170. — Бібліогр.: 7 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
_version_ 1860110722055274496
author Тищенко, Е.Н.
Михальская, С.И.
Сергеева, Л.Е.
author_facet Тищенко, Е.Н.
Михальская, С.И.
Сергеева, Л.Е.
citation_txt Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия / Е.Н. Тищенко, С.И. Михальская, Л.Е. Сергеева // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 4. — С. 166-170. — Бібліогр.: 7 назв. — рос.
collection DSpace DC
container_title Фактори експериментальної еволюції організмів
description Установлено наличие одних и тех же RAPD-ампликонов, дифференциально
 синтезируемых с ДНК вольфрамустойчивой клеточной линии сои (Glycine max L.,
 Merr.) при действии летальных доз оксианионов вольфрама или ванадия, а также её
 исходного штамма. Предположено наличие в геноме сои локусов, повышенная
 нестабильность которых обусловлена действием различных стрессовых факторов. Встановлено наявність одних і тих RAPD-ампліконів, які диференційно
 синтезуються з ДНК вольфрам стійкої клітинної лінії сої (Glycine max L., Merr.) за дії летальних доз оксианіонів вольфрама або ванадія. Припущена наявність у геномі сої
 локусів, підвищена нестабільність яких обумовлена дією різних стресових факторів. Using lethal dose of oxyanions W or V the same RAPD-amplicons that are
 differentially synthesized from DNAs of tungsten-resistant cell line as well as their wild
 culture of soybean (Glycine max L., Merr.) are shown. The presence of instable loci in
 genome of soybean under different stressors are under discuss.
first_indexed 2025-12-07T17:34:08Z
format Article
fulltext 166 DNA to a number of plasmid and chromosomal DNA of microorganisms, representatives of various species and genera. ТИЩЕНКО Е.Н., МИХАЛЬСКАЯ С.И., СЕРГЕЕВА Л.Е. Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Украина, 0302, Киев, ул. Васильковская 31/1, e-mail: oltyko@gmail.com НЕСТАБИЛЬНОСТЬ RAPD-АМПЛИКОНОВ СОИ ПРИ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ОКСИАНИОНАМ ВОЛЬФРАМА И ВАНАДИЯ Генетические аспекты устойчивости/толерантности культурных растений к разнообразным абиотическим факторам имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Основными неблагоприятными факторами окружающей среды, оказывающими негативное влияние на процессы развития сельскохозяйственных культур и их продуктивность, являются засуха и засоление. Вместе с тем увеличивающееся в последнее время антропогенное загрязнение окружающей среды токсичными элементами ставит и эту проблему в число приоритетных. Актуальным является получение растительных форм с комплексной устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды. Один из вопросов комплексной устойчивости связан с генетическим разнообразием в популяциях растений, которое является результатом изменчивости полинуклеотидных последовательностей ДНК и/или плоидности генома. Источником такого разнообразия может быть сомаклональная изменчивость при культивировании растений in vitro [1]. Однако, поиск новых форм с повышенной устойчивостью к комплексу абиотических факторов затруднен при использовании и традиционных, и биотехнологических методов селекции. В связи с чем нами [2] для гарантированного отбора ценных мутаций, возникающих при культивировании in vitro тканей растений, предложено направление клеточной селекции, которое заключается в создании моделированных систем in vitro с использованием токсичных концентраций ионов тяжелых металлов, которые даже в микроколичествах оказывают многовекторные стрессовые воздействия на растительный организм. Такой подход экспериментально обоснован на примере табака, а именно, получены клеточные линии и растения- регенеранты, обладающие уникальным свойством – комплексной толерантностью к разным типам засоления (хлоридному и хлоридно-сульфатному), водному стрессу и селективному агенту. В качестве последнего представляют интерес оксианионы вольфрама и ванадия, которые оказывают негативное воздействие на процессы дыхания и фосфорилирования в растениях [3]. К тому же, оксианион вольфрама является токсичным аналогом иона молибдена, входящего в состав кофактора нитратредуктазы – ключевого фермента ассимиляции нитрата, чувствительного к различным абиотическим стрессам [4]. Нами получены клеточные линии сои (Glycine max L., Merr), устойчивые к токсичным концентрациям вольфрамат-оксианионов. Такие линии показывают устойчивость к ионным и осмотическим стрессорам. Целью данной работы был анализ изменчивости ДНК вольфрамустойчивой клеточной линии (WR-линия) при действии летальных доз ванадатоксианионов. Материалы и методы ДНК исходного каллуса, индуцированного из листьев стерильных растений сои (Glyсine max L., Merr.) сорта Киевская 27 (селекции Института физиологии растений и генетики НАН Украины), и полученной от него WR-линии, культивируемой в 167 присутствии летальной дозы оксианионов вольфрама или ванадия (по 1мМ), выделяли по модифицированному нами методу Деллапорта [5]. Уровень полиморфизма ДНК анализировали методом RAPD-анализа (Random Amplified Polymorphic DNA), используя 9 декамерных праймеров (табл.). Амплификацию ДНК осуществляли в программируемом приборе «Терцик» (Россия) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 25-30 пг ДНК, 2,5 мкл 10-кратного реакционного буфера (Promega, без MgCl2), по 0,2 мМ каждого дАТФ, дГТФ, дТТФ, дСТФ, 0,3 мкМ праймера, 1 ед Tag-полимеразы ((Promega), 1,5 мМ MgCl2. На реакционную смесь наслаивали по 20 - 30 мкл минерального масла. Условия амплифиуации: преденатурация 94 оС, 3 мин; затем 42 цикла - денатурация 94 оС, 1 мин; отжиг – 36 оС, 1 мин; синтез – 72 оС, 2 мин; конечная элонгация 72 оС, 7 мин. Продукты реакции амплификации разделяли по размеру фрагментов путем электрофореза в 2,0 %- ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия в 1хТВЕ при напряжённости 3-4 в/см в течение 4-6 часов. Для количественной оценки продукты амплификации разной интенсивности представляли в виде бинарной матрицы, где наличие или отсутствие одинаковых по размеру фрагментов соответствовало значениям 1 и 0. Уровень гомологии и дивергенции ДНК, представленной в спектрах сравниваемых ампликонов, определяли по коэффициентам Жаккарда, учитывая воспроизводимые минорные и мажорные продукты синтеза 2-х биологических повторностей опыта. Результаты и обсуждения Исследование клеточных линий, устойчивых к летальным дозам стрессора, значительно расширяет представление об уровне структурно-функциональных изменений генома и позволяет получить информацию о молекулярно-генетических аспектах устойчивости как конечного результата реализации защитных механизмов растительных клеток, индуцируемых в ответ на неблагоприятные факторы окружающей среды. Методом «плейтинга» получены WR-линии сои. При этом принципиальное значение имел выбор селектирующей (токсичной) концентрации стрессора. Ею считали такую минимальную концентрацию оксианионов вольфрама (1мМ), при которой полностью останавливался рост исходного каллуса и при последующем возврате в нормальные условия жизнедеятельность клеток не восстанавливалась. Если при переносе в нормальные условия пролиферация и рост клеток возобновлялся, то концентрацию этого стрессора постепенно повышали. Полученные клеточные линии в отличие от исходных каллусов выдерживали селективное давление 0,8 М маннита, а также по 1 % солей морской воды либо сульфата натрия, которые при культивировании in vitro моделируют условия ионных и осмотических стрессов. При исследовании WR-линий сои на устойчивость к оксианионам ванадия показано, что они способны выдерживать летальные дозы этого стрессора, равные 1мМ. Помимо интегрального критерия устойчивости клеточных культур - относительного прироста биомассы каллуса для дифференциации неустойчивых и устойчивых клеточных линий использовали один из основных показателей необратимого перехода клеток на путь гибели – фрагментацию ДНК [5]. Показано, что под влиянием выбранной селективной концентрации ионов ванадия в отличие от устойчивых линий суммарная ДНК дикого штамма сои подвергается интенсивной деградации с образованием непрерывного спектра фрагментов широкого диапазона молекулярных масс, где олигонуклеосомной фрагментации, характерной для программированной клеточной гибели, не наблюдается. Это свидетельствует о том, что токсичные концентрации оксианионов ванадия вызывают гибель клеток сои путем некроза. Для изучения уровня генетической изменчивости ДНК исходного каллуса и WR- линий, культивируемой на питательных средах с 1мМ оксианионов вольфрама (WRW) 168 или ванадия (WRV), использовали RAPD-метод, позволяющий оценить вариабельность значительного числа локусов, распределенных на протяжении всего генома. Все используемые нами 9 произвольных декамерных праймеров с разной эффективностью обеспечивали синтез определенного набора фрагментов размером ~ 200 ÷ 3 500 п.н., количество которых составляло от 4 до 18. Сравнение спектров амплификации ДНК исходного каллуса и полученной от нее WR-линий показало, что среди 111 синтезированных фрагментов наблюдается разница только для 4-х ампликонов (табл.). В частности, с использованием праймера 5´-GCG CAT TAG A-3´ выявлено исчезновение фрагментов размером ~ 1550 и 1350 п.н. у WRW-линии, тогда как при применении праймера 5´- GGC TAG GGC A-3´ у этой линии появлялся новый ампликон размером 1700 п.н. и отсутствовал фрагмент размером ~500 п.н. Установленные различия могут быть результатом замены пар оснований в одном и/или обоих сайтах связывания праймеров ДНК, делециями или вставками последовательностей внутри амплифицируемых локусов ДНК. Индекс подобия и дивергенции составил 0,964 и 0,036, соответственно. Таблица Сравнительная характеристика продуктов амплификации ДНК исходного каллуса и WR-линий, культивируемой на питательных средах с 1мМ оксианионов вольфрама (WRW) или ванадия (WRV) Количество ампликонов WR-линия Праймеры Исходный каллус WRW WRV 5´-СTC AGC CCA G-3´ 16 16 16 5´-GCG CAT TAG A-3´ 14 [1, 1] 12 [0, 0] 14 [1, 1] 5´-GGC TAG GGC A-3´ 14[0, 1] 14[1, 0] 12[0, 0] 5´-ATC AAG CTG C-3´ 8 8 8 5´-GGT TCC AGC T-3´ 16 16 16 5´-CTG AGG CAA A-3´ 4 4 4 5´-GAG CCA ACC G-3´ 18 18 18 5´-CAC GGC GGG T-3´ 13 13 13 5´-GCC ATC AAG A-3´ 7 7 7 Всего 110 108 108 Примечание: в квадратных скобках представлены вариабельные ампликоны, где 1 и 0 означают присутствие и отсутствие фрагмента, соответственно; При чередовании стрессовых факторов, предполагая, что каждый их них может приводить к нестабильности генома, теоретически можно ожидать следующие варьирования в паттернах ампликонов ДНК исходного каллуса, WRW и WRV: 1-0-0, 1-1- 0, 1-0-1, 0-1-1, 0-0-1, 0-1-0. Часть фрагментов присутствуют во всех спектрах амплификации (1-1-1). Только полиморфные фрагменты, идентифицированные в ДНК исходного каллуса и длительно культивируемой WRW-линий, показывали вариабельность в ДНК WRV. При этом под влиянием токсичных концентраций оксианионов ванадия новых ампликонов не синтезировалось, однако происходило их варьирование. Так, фрагменты размером ~ 1550 и 1350 п.н., которые отсутствовали у WRW-линии, появлялись у WRV, а ампликон размером ~1700 п.н., который не наблюдался в ДНК исходного каллуса, исчезал в спектре WRV. Фрагмент размером ~500 п.н. был присущ только ДНК исходного каллуса. То есть, при использовании указанных праймеров наблюдали следующие типы изменений в ампликонах: 1-0-0, 1-0-1, 0-1-0. Тот факт, что для 3-х из 4-х полиморфных ампликонов имеет место их появление/ исчезновение (1-0-1, 0-1-0) в спектре WRV, свидетельствует об 169 изменчивости полинуклеотидных последовательностей ДНК сои при чередовании летальных доз оксианионов вольфрама и ванадия. Такая реверсия ампликонов позволяет сделать предположение о наличие в геноме сои локусов, повышенная нестабильность которых обусловлена действием различных стрессовых факторов. Не исключено, что помимо ионов W и V определенный вклад вносят и условия культивирования in vitro. Следует отметить, что данные о дифференциальной нестабильности одних и тех же последовательностей в ДНК растений немногочисленны. В частности, генетический полиморфизм установлен при изменении уровня плоидности (тетраплоид →диплоид→тетраплоид) в культуре in vitro с использованием колхицина у Eragrostis curvula, где ревертантные ампликоны включают в большинстве случаев некодирующие последовательности, хотя среди них встречаются и гомологи генам [6]. Элвис и соавт. [7] предполагают существование в геноме ржи «горячих зон мутагенеза». Преимущественные точки локализации FB-транспозона позволяют частично объяснить этот феномен. Тем не менее механизмы, связанные с нестабильностью конкретных локусов генома растений, не ясны. Таким образом, идентифицированы RAPD-ампликоны, дифференциально синтезируемые с ДНК WR-линии при чередовании стрессоров – оксианионов W и V. Предположено наличие в геноме сои локусов, повышенная нестабильность которых обусловлена действием различных стрессовых факторов. Литература 1. Larkin P.J., Scowcroft W.R. Somaclonal variation – a novel source of variability from cell cultures for plant improvement // Theor. Appl Genet.- 60. – P.167-214. 2. Сергеева Л.Е. Изучение комплексной устойчивости ванадий- и вольфрамустойчивых клеточных линий табака // Физиология и биохимия культ. растений. - 2000.- т.32, №6.- С.490-493. 3. Ridge I., Omer J., Osborne D.J. Different effects of vanadate on net proton secreretion in the fern Regnellidium diphyllum and the dicotyledon Nymphoides peltata: relevance to cell growth// J. Plant Physiol.–1998.–153.–№ 3/4.–P.430-436. 4. Deng M., Moureaux T., Caboche M. Tungstate, a molybdate analog inactivating nitrate reductase, deregulates the expression of the nitrate reductase structural gene //Plant Physiol. - 1989. – 91.- P.304-309. 5. Тищенко Е.Н., Даскалюк Т.М., Михальская С.И. Марьюшкин. Денатурация ДНК при старении створок бобов сои // Біополімери і клітина. – 2004. – 20, №5. – С.410-415. 6. Mecchia M.A., Ochogavia A., Selva J.P., Laspina N., Felitti S., Martelotto L.G., Spangenberg G., Echenique V., Pessino S.C. Genome polymorphisms and gene differential expression in ‘back-and-forth’ ploidy-altered series of weeping lovegrass (Eragrostis curvula) // Journal of Plant Physiology. – 2007. – 164, №8. – С.1051-1061. 7. Alves E., Ballesteros I., Linacero R., Vazques A.M. RYS1, a foldback transposon, is activated by tissues culture and `shows preferential insertion points into the rye genome // Theor. Appl. Genet. – 2005. – 111. - P.431-436. Резюме Установлено наличие одних и тех же RAPD-ампликонов, дифференциально синтезируемых с ДНК вольфрамустойчивой клеточной линии сои (Glycine max L., Merr.) при действии летальных доз оксианионов вольфрама или ванадия, а также её исходного штамма. Предположено наличие в геноме сои локусов, повышенная нестабильность которых обусловлена действием различных стрессовых факторов. Встановлено наявність одних і тих RAPD-ампліконів, які диференційно синтезуються з ДНК вольфрам стійкої клітинної лінії сої (Glycine max L., Merr.) за дії 170 летальних доз оксианіонів вольфрама або ванадія. Припущена наявність у геномі сої локусів, підвищена нестабільність яких обумовлена дією різних стресових факторів. Using lethal dose of oxyanions W or V the same RAPD-amplicons that are differentially synthesized from DNAs of tungsten-resistant cell line as well as their wild culture of soybean (Glycine max L., Merr.) are shown. The presence of instable loci in genome of soybean under different stressors are under discuss. ФЕДОРОВА Н.Б., ЧАДОВА Е.В. Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия, 630090, г. Новосибирск, ул. акад. Лаврентьева, 10, тел.(383)333 2976, e-mail:bonife@bionet.nsc.ru МУТАЦИЯ В ОНТОГЕНЕ ДРОЗОФИЛЫ ВЫЗЫВАЕТ ПЕРЕМЕЩЕНИЕ РЕТРОТРАНСПОЗОНА 412 Генетическая нестабильность (ГН) – картина, характерная для ряда явлений: канцерогенеза, гибридного дисгенеза, отдаленных последствий облучения. Несмотря на очевидную общность характера ГН и связь явлений между собой, до сих пор ГН рассматривается в каждой из этих трех областей изолированно. В общем случае под ГН понимают «длительное сохранение отклонений в строении и функционировании генетического аппарата, ДНК - белкового комплекса» [1]. ГН выражается в длительном образовании с высокой частотой точковых мутаций, хромосомных перестроек, канцерогенезе, анеуплоидии, хронической гибели части клеток в культурах in vitro. Механизмы индукции и поддержания ГН дискутируются. В случае облучения причины возникновения ГН связывают с прямым повреждением ДНК и продуктов цитоплазмы. Одной из причин ГН при канцерогенезе предполагается анеуплоидия [2]. Феноменология ГН связана с увеличением транспозиционной активности мобильных генетических элементов (МЭ). Для канцерогенеза это - мобилизация ретровирусных элементов, для гибридного дисгенеза - систем МГЭ типа P-M и I-R [3]. Облучение тоже является индуктором транспозиционной активности МГЭ. Под действием облучения скорости инсерций увеличиваются более чем на порядок величин [4]. Ранее нами был обнаружен новый класс мутаций – мутации генов, управляющих онтогенезом (онтогены) [5, 6].Формально генетически это - факультативные доминантные летальные мутации (ФДЛ). Их факультативность (условность) заключается в том, что у особей одного генотипа они проявляют летальное действие, у особей другого генотипа – не проявляют. Перестройки способны снимать летальное действие ФДЛ [7], сохраняя тем самым мутации в популяции. Мутация в онтогене может сохраниться и в том случае, если она возникнет в уже перестроенном геноме. Последующая дестабилизация генома связана с массовыми перемещениями МЭ и феноменологически схожа с картиной дисгенеза. Материалы и методы Линии Drosophila melanogaster. Для получения мутаций была использованы линии дикого типа - Berlin wild и Barnaul и изогенная линия 51 c мутацией radius incompletus, ri (III; 47cM). Для ведения в культурах и выявления свойств мутаций использовали линии: 1) yellow (y); 2) C(1)DX, y w f /Y; 3) Muller-5 и 5) net dp b pr cn/In(2LR)Cy, Cy dplv1 pr Bl cn2 L4. Получение мутаций (ФДЛ). Для получения мутаций в Х-хромосоме самцов дрозофилы Berlin wild и изогенной линии 51 облучали γ-лучами в дозе 30 Gr. Через три часа их скрещивали с самками C(1)DX, y w f /Y, несущими сцепленные Х-хромосомы,
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-177689
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn 2219-3782
language Russian
last_indexed 2025-12-07T17:34:08Z
publishDate 2008
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
record_format dspace
spelling Тищенко, Е.Н.
Михальская, С.И.
Сергеева, Л.Е.
2021-02-16T14:32:53Z
2021-02-16T14:32:53Z
2008
Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия / Е.Н. Тищенко, С.И. Михальская, Л.Е. Сергеева // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 4. — С. 166-170. — Бібліогр.: 7 назв. — рос.
2219-3782
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177689
Установлено наличие одних и тех же RAPD-ампликонов, дифференциально
 синтезируемых с ДНК вольфрамустойчивой клеточной линии сои (Glycine max L.,
 Merr.) при действии летальных доз оксианионов вольфрама или ванадия, а также её
 исходного штамма. Предположено наличие в геноме сои локусов, повышенная
 нестабильность которых обусловлена действием различных стрессовых факторов.
Встановлено наявність одних і тих RAPD-ампліконів, які диференційно
 синтезуються з ДНК вольфрам стійкої клітинної лінії сої (Glycine max L., Merr.) за дії летальних доз оксианіонів вольфрама або ванадія. Припущена наявність у геномі сої
 локусів, підвищена нестабільність яких обумовлена дією різних стресових факторів.
Using lethal dose of oxyanions W or V the same RAPD-amplicons that are
 differentially synthesized from DNAs of tungsten-resistant cell line as well as their wild
 culture of soybean (Glycine max L., Merr.) are shown. The presence of instable loci in
 genome of soybean under different stressors are under discuss.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Фактори експериментальної еволюції організмів
Молекулярна структура та организація геномів
Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия
Article
published earlier
spellingShingle Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия
Тищенко, Е.Н.
Михальская, С.И.
Сергеева, Л.Е.
Молекулярна структура та организація геномів
title Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия
title_full Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия
title_fullStr Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия
title_full_unstemmed Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия
title_short Нестабильность RAPD-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия
title_sort нестабильность rapd-ампликонов сои при клеточной селекции на устойчивость к оксианионам вольфрама и ванадия
topic Молекулярна структура та организація геномів
topic_facet Молекулярна структура та организація геномів
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177689
work_keys_str_mv AT tiŝenkoen nestabilʹnostʹrapdamplikonovsoiprikletočnoiselekciinaustoičivostʹkoksianionamvolʹframaivanadiâ
AT mihalʹskaâsi nestabilʹnostʹrapdamplikonovsoiprikletočnoiselekciinaustoičivostʹkoksianionamvolʹframaivanadiâ
AT sergeevale nestabilʹnostʹrapdamplikonovsoiprikletočnoiselekciinaustoičivostʹkoksianionamvolʹframaivanadiâ