Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro
Наведено результати експериментальних досліджень використання сучасних генетико-біотехнологічних методів оцінки якості гамет. Встановлено, що використання цитогенетичного методу оцінки дозволяє встановити ступінь мейотичної зрілості деконсервованих і прокультивованих гамет корів та закономірності...
Saved in:
| Published in: | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Date: | 2010 |
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2010
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177779 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro / Л.І. Остаповець, П.А. Троцьки // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 187-191. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-177779 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Остаповець, Л.І. Троцький, П.А. 2021-02-16T18:17:39Z 2021-02-16T18:17:39Z 2010 Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro / Л.І. Остаповець, П.А. Троцьки // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 187-191. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177779 Наведено результати експериментальних досліджень використання сучасних генетико-біотехнологічних методів оцінки якості гамет. Встановлено, що використання цитогенетичного методу оцінки дозволяє встановити ступінь мейотичної зрілості деконсервованих і прокультивованих гамет корів та закономірності перебігу мейозу в ооцитах свиней при дозріванні in vitro. Приведены результаты экспериментальных исследований использования современных генетико-биотехнологических методов оценки качества гамет. Установлено, что использование цитогенетического метода оценки позволяет установить степень мейотического созревания деконсервированых и прокультивированых гамет коров и закономерности прохождения мейоза в ооцитах свиней при созревании in vitro The results of experimental researches the use of modern genetic-biotechnological methods estimation of quality gamets are resulted. It is set that the use of cytogenetics method estimation allows to set the degree of meiotic maturing of frozen-thawed and maturation gamets cows and mechanism passing of meiosis of porcine oocytes during maturation in vitro. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Технології in vitro: проблеми та перспективи Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro |
| spellingShingle |
Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro Остаповець, Л.І. Троцький, П.А. Технології in vitro: проблеми та перспективи |
| title_short |
Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro |
| title_full |
Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro |
| title_fullStr |
Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro |
| title_full_unstemmed |
Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro |
| title_sort |
використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro |
| author |
Остаповець, Л.І. Троцький, П.А. |
| author_facet |
Остаповець, Л.І. Троцький, П.А. |
| topic |
Технології in vitro: проблеми та перспективи |
| topic_facet |
Технології in vitro: проблеми та перспективи |
| publishDate |
2010 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Фактори експериментальної еволюції організмів |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| description |
Наведено результати експериментальних досліджень використання сучасних
генетико-біотехнологічних методів оцінки якості гамет. Встановлено, що
використання цитогенетичного методу оцінки дозволяє встановити ступінь
мейотичної зрілості деконсервованих і прокультивованих гамет корів та закономірності перебігу мейозу в ооцитах свиней при дозріванні in vitro.
Приведены результаты экспериментальных исследований использования
современных генетико-биотехнологических методов оценки качества гамет.
Установлено, что использование цитогенетического метода оценки позволяет
установить степень мейотического созревания деконсервированых и прокультивированых гамет коров и закономерности прохождения мейоза в ооцитах свиней при
созревании in vitro
The results of experimental researches the use of modern genetic-biotechnological
methods estimation of quality gamets are resulted. It is set that the use of cytogenetics
method estimation allows to set the degree of meiotic maturing of frozen-thawed and
maturation gamets cows and mechanism passing of meiosis of porcine oocytes during
maturation in vitro.
|
| issn |
2219-3782 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177779 |
| citation_txt |
Використання генетико-біотехнологічних методів оцінки функціонального стану ооцитів корів і свиней in vitro / Л.І. Остаповець, П.А. Троцьки // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 187-191. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT ostapovecʹlí vikoristannâgenetikobíotehnologíčnihmetodívocínkifunkcíonalʹnogostanuoocitívkorívísvineiinvitro AT trocʹkiipa vikoristannâgenetikobíotehnologíčnihmetodívocínkifunkcíonalʹnogostanuoocitívkorívísvineiinvitro |
| first_indexed |
2025-11-24T06:47:21Z |
| last_indexed |
2025-11-24T06:47:21Z |
| _version_ |
1850843254583459840 |
| fulltext |
187
ОСТАПОВЕЦЬ Л.І., ТРОЦЬКИЙ П.А.
Інститут розведення і генетики тварин НААН України,
Україна, 08321, Київська обл., Бориспільський р-н., с.Чубинське, вул. Погребняка, 1,
е-mail:ostlara@online.ua
ВИКОРИСТАННЯ ГЕНЕТИКО-БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ
ОЦІНКИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ООЦИТІВ КОРІВ
І СВИНЕЙ IN VITRO
Інтенсифікація тваринництва привела до підвищеного попиту на більш
продуктивні спеціалізовані породи сільськогосподарських тварин, які стали
поширюватись за рахунок витіснення місцевих, локальних порід. В той же
час створення нових порід, типів і ліній тварин неможливо без успадкованої
різноманітності ознак, які залучаються до селекційного процесу. Переважна
більшість місцевих порід у ході еволюції придбала і в теперішній час має
спадкові ознаки, які потребує сучасне тваринництво. Унікальні гени і комп-
лекси генів популяцій місцевих порід підвищують ефективність селекції при
використанні їх в удосконаленні існуючих і виведенні нових порід, типів і
ліній. Тому гени, що зникають при селекції, можуть бути втрачені назавжди.
Виходом із цього є використання сучасних генетико-біотехнологічних
методів відтворення в тваринництві. В результаті успішного впровадження
біотехнологічних розробок в практику є можливість прискорення добору
бажаних генотипів сільськогосподарських тварин з врахуванням широкого
спектру критеріїв їх племінної цінності [1–3].
Успішність проведення біотехнологічних досліджень обумовлена
синхронізацією великої кількості ооцитів на певних стадіях мейозу. Метод
кріоконсервування і культивування деконсервованих гамет in vitro є основ-
ним джерелом одержання необхідного біологічного матеріалу для розробки
методів зберігання та практичного використання генетичного потенціалу у
тваринництві. Переважно більшістю дослідників при одержанні in vitro
ембріонів, як вихідний біологічний матеріал для дозрівання поза організмом,
використовують ооцит-кумулюсні комплекси, вилученні із антральних
фолікулів яєчників тварин. Проте, розбіжності в результатах досліджень з
культивування ооцит-кумулюсних комплексів свідчать про необхідність
подальшого дослідження морфологічних та цитогенетичних особливостей
дозрівання ооцитів корів і свиней в умовах in vitro та їх компетентність до
ембріонального розвитку після партеногенетичної активації або запліднення
поза організмом. Ці біотехнологічні дослідження будуть сприяти вивченню
кількісних та якісних показників змін стану хромосом на різних стадіях
мейозу і раннього ембріогенезу [4–6].
Метою досліджень була цитогенетична оцінка дозрівання in vitro де-
консервованих ооцитів корів та вивчення закономірності перебігу мейозу в
ооцитах свиней при культивуванні.
Матеріал і методи
Об’єктом експериментальних досліджень були ооцит-кумулюсні комп-
лекси корів чорно-рябої породи та свиней великої білої породи. Ооцити корів
188
отримували шляхом надрізу лезом видимих антральних фолікулів, вимивали
середовищем Дюльбекко, виловлювали пастерівською піпеткою та оціню-
вали за морфологічними ознаками під мікроскопом. Для заморожування
використовували ооцити корів з гомогенною тонкозернистою ооплазмою,
неушкодженою прозорою оболонкою, щільним або частково розпушеним
кумулюсом [7]. Перед заморожуванням гамети обробляли еквілібраційним
розчином (10 хв.) потім переносили у вітрифікаційний розчин (30 с).
Виведення кріопротекторів після розморожування гамет корів і свиноматок
проводили шляхом перенесення їх на 10 хвилин у розчин 1,0 М сахарози.
Збереженість гамет корів після деконсервування оцінювали за морфоло-
гічними і цитогенетичними показниками та культивування. Дозрівання
ооцит-кумулюсних комплексів поза організмом проводили в присутності
клітин гранульози, концентрація якої складала 3–6x106 клітин у 1 мл куль-
турального середовища, в чотирилункових планшетах (“Costar”) протягом
27 год. при температурі 38,5 °С та 5%-ному вмісті СО2 в повітрі, у краплях
середовища 199 з 10%-ною попередньо інактивованою сироваткою корів,
1,0 мкг/мл естрадіолу (“Serva”), 2,5 МОд/мл лютеїнізуючого гормона
(“Serva”), 2,0 мМ натрію пірувату (“Sigma”), 2,92 мМ кальцію лактату
(“Sigma”), 40 мкг/мл гентаміцину.
З метою оцінки стадії мейотичного дозрівання поза організмом декон-
сервованих і нативних (контрольна група) ооцит-кумулюсних комплексів
корів та виявлення хромосомних порушень у гамет протягом дозрівання,
частина клітин із загальної кількості, поставлених на культивування, підля-
гала цитогенетичному аналізу. Для приготування сухоповітряних препаратів
за методом A.K. Tarkowski [8], ооцит-кумулюсні комплекси спочатку
механічно (піпетуванням) звільняли від клітин кумулюса, потім на 10 хв при
кімнатній температурі переносили у 0,9%-ний гіпотонічний розчин 3-х за-
міщеного цитрату натрію і фіксували на попередньо знежиреному сухому
склі фіксатором Карнуа (метанол : льодяна оцтова кислота = 3:1). Препарати
забарвлювали 2,0%-ним розчином барвника Гімза.
Вилучення ооцит-кумулюсних комплексів свиней проводили шляхом
розрізання антральних фолiкулів у середовищі 199 з 25 мМ Hepes (“Sigma”),
яке мiстило 10% сироватки крові корів. Відібрані за морфологічними
ознаками ооцит-кумулюсні комплекси культивували в середовищі 199 на
розчині Ерла (“Sigma”), яке містило 20% еструсної сироватки кровi корiв та
клітин гранульози в концентрації 3–5х106 клiтин на 1 мл культурального
середовища. Дозрівання ооцитів свиней здійснювали при температурi
+38,8 °С в атмосфері повітря з 4% СО2 та при максимальній вологості. Для
дослідження стану мейотичних хромосом під час дозрівання ооцитів поза
організмом готували сухоповітряні препарати за модифікованим нами
методом A.K. Tarkowski [8]. Ооцити свиней переносили на 10 хвилин у крап-
лю 0,26%-го гіпотонічного розчину цитрату натрію з подальшою фіксацією
сумішшю метанол-оцтової кислоти в співвідношенні 2:1. Фарбування пре-
паратів проводили з використанням 2,0%-го розчину барвника Гімза.
189
Результати та обговорення
Проведено дослідження з вивчення впливу гліцерину, пропандіолу,
етиленгліколю в еквілібраційному розчині на життєздатність і подальший
розвиток in vitro деконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів.
Заморожували ооцит-кумулюсні комплекси корів з використанням трьох
різних еквілібраційних розчинів: гліцерин — група А, пропандіол — група Б,
етиленгліколь — група В. В контрольній групі гамети не заморожували.
Результати наших досліджень показали наявність взаємозв’язку між різними
кріопротекторами у еквілібраційному розчині та рівнем мейотичного
дозрівання деконсервованих ооцитів корів в умовах in vitro. За результатами
експериментальних досліджень встановлено, що рівень дозрівання декон-
сервованих ооцитів, заморожених з використанням гліцерину різниться,
порівняно із етиленгліколем у еквілібраційному розчині за такими показни-
ками як кількість дозрілих до метафази ІІ мейозу (51,7% (гр. А) проти 63,4%
(гр. В), (р<0,05)) та кількість клітин з хромосомними порушеннями (35,6%
проти 23,2%, (р<0,05) відповідно). Позитивні результати отримані нами при
кріоконсервуванні ооцит-кумулюсних комплексів корів при застосуванні
пропандіолу (гр. Б) у еквілібраційному розчині. Рівень дозрівання поза орга-
нізмом гамет корів становить 57,1% та порушень хромосомного матеріалу
30,4%.
Таким чином, нашими дослідженнями встановлена різна чутливість
ооцит-кумулюсних комплексів корів до кріопротекторів та різна властивість
дозрівання поза організмом деконсервованих ооцитів до метафази ІІ мейозу
in vitro. Ця нерівномірність корегує з морфологічним та цитогенетичними
властивостями і в загальному характерна для всіх досліджених ооцит-куму-
люсних комплексів корів. Виходячи із одержаних нами даних цитогенетичної
оцінки кріоконсервованих ооцит-кумулюсних комплексів корів з різними
кріопротекторами у еквілібраційному розчині, вважаємо, що застосування
етиленгліколю забезпечить при високих кріопротекторних властивостях
меншу токсичність еквілібраційного розчину, що в свою чергу, сприяє більш
повноцінному дозріванню деконсервованих ооцитів і цим зумовлює пе-
ревагу.
Застосування морфологічного та цитогенетичного методу, тобто про-
ведення візуальної оцінки ооцитів за станом кумулюсу та ооплазми і по-
дальшого цитогенетичного аналізу хроматину таких гамет дозволило вста-
новити, що ооцити оточені клітинами кумулюсу без ознак дегенерації та із
гомогенною ооплазмою є найбільш придатними для дозрівання in vitro [9].
Відомо, що перебування ооцитів на певних стадіях мейотичного дозрівання
in vitro залежить від часу культивування. Проведені дослідження з вивчення
мейотичного стану хромосом ооцитів свиней на 18, 32 та 46 годину
дозрівання in vitro. За результатами цитогенетичного аналізу ооцитів свиней
встановлено, що на 18, 32 та 46 годину культивування незначна кількість
гамет не відновила мейотичного дозрівання і перебувала на стадії диплотени
(відповідно 2,9; 7,1 та 5,7%). В ооцитах свиней, які культивували 32 години,
190
спостерігали найбільшу та однакову кількість гамет на стадії метафази І та
анафази І, що становило 28,6%. Проте, зі збільшенням часу дозрівання до
46 годин спостерігали поступове зменшення кількості гамет на стадії
метафази І, що достовірно менше, порівняно із 18 та 32 годинами (9,4%
проти 28,6% (р<0,01) та 44,2% (р<0,001), відповідно). Зниження кількості
ооцитів на стадії метафази І відбувалося внаслідок переходу частини клітин
на більш просунуті стадії мейозу. Так для стадії метафази ІІ цей показник
становив 60,4% клітин, що достовірно більше, порівняно з 18 та 32 годинами
культивування (8,8% (р<0,01) та 10,7% (р<0,001), відповідно). Рівень
дегенерації хромосом між часовими параметрами суттєво не відрізнявся і
знаходився в межах 2,9–15,9%. Таким чином, на 46 годину більше половини
гамет завершили мейотичне дозрівання in vitro, що узгоджуються з даними
інших авторів, про більш тривалий термін культивування ооцит-кумулюсних
комплексів свиней, порівняно з іншими видами сільськогосподарських
тварин [10, 11].
Висновки
1. Проведені дослідження морфологічного і цитогенетичного аналізу
гамет корів і свиней спрямовані на комплексну оцінку кількісних та якісних
показників стану хромосом та рівня хромосомних аберацій в мейозі при
культивуванні.
2. Використання при оцінці якості деконсервованих і прокультивованих
in vitro ооцитів корів цитогенетичного аналізу дозволяє встановити, що
63,4% з них після розморожування і культивування поза організмом досягали
метафази-2 мейозу, а 23,2% мали хромосомні порушення.
3. Проведений порівняльний цитогенетичний аналіз ооцитів свиней за
різних термінів культивування виявив, що подовження терміну культивування
до 46 годин дозволило одержати більшу кількість ооцитів на стадії мета-
фази ІІ, порівняно з 18 та 32 годинами (60,4% проти 8,8% та 10,7%, від-
повідно).
Література
1.Руденко Є.В. Роль і перспективи сучасних методів біотехнології в умовах
інтенсифікації тваринництва / Є.В. Руденко, О.Є. Гузеватий // Науково-технічний
бюлетень.— Харків, 2008.— №96.— С. 44–49.
2.Яблонський В.А. Біотехнологія відтворення тварин: Підручник.— К.: Аріс-
тей, 2005.— 296 с.
3. Bazer F.W. Reproductive biology in the era of genomics biology / F.W. Bazer,
T.E. Spencer // Theriogenology.— 2005.— Vol.64, №3.— P. 442–456.
4.Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при исполь-
зовании в качестве цитопластов ооцитов, дозревавших in vitro / К.В. Кириенко,
А.Г. Логвинов, И.Г. Сметанина [и др.] // Актуальные проблемы биологии в жи-
вотноводстве: четвертая междунар. конф.— Боровск, 2006.— С. 238–239.
5. Keefer C.L. Lessons learned from nuclear transfer (cloning) / C.L. Keefer // The-
riogenology.— 2008.— Vol.69, №1.— P. 48–54.
6. Funahashi H. Advances in in vitro production of pig embryos / H. Funahashi, B.N. Day
// Journal of reproduction and fertility. Supplement.— 1997.— Vol.52.— P. 271–283.
191
7. Гузеватий О.Є. Методики оцінки якості ооцит-кумулюсних комплексів корів
для кріоконсервування / О.Є. Гузеватий, П.А. Троцький, Ю.М. Собко // Методики
наукових досліджень із селекції, генетики та біотехнології у тваринництві.— К.:
Аграрна наука, 2005.— С. 180–187.
8. Tarkowski A.K. An air-drying method for chromosome preparation from mouse
eggs / A.K. Tarkowski // Cytogenetics.— 1966.— Vol.5, №3.— P. 394–400.
9.Остаповець Л.І. Морфологічна та цитогенетична оцінка незрілих ооцитів
свиней / Л.І. Остаповець // Вісник проблем біології і медицини.— 2008.— №1.—
С. 42–47.
10. Cytogenetic evaluation of in vitro matured bovine oocytes collected from ovaries
of individual donors / J. Sosnowski, M. ZwitoDski, D. Lechniak [et al.] // Theriogeno-
logy.— 1996.— Vol.45, №4.— Р. 865–872.
11. Prather R.S. Practical considerations for the in vitro production of pig embryos /
R.S. Prather, B.N. Day // Theriogenology.— 1998.— Vol.49, №1.— P. 23–32.
Резюме
Наведено результати експериментальних досліджень використання сучасних
генетико-біотехнологічних методів оцінки якості гамет. Встановлено, що
використання цитогенетичного методу оцінки дозволяє встановити ступінь
мейотичної зрілості деконсервованих і прокультивованих гамет корів та законо-
мірності перебігу мейозу в ооцитах свиней при дозріванні in vitro.
Приведены результаты экспериментальных исследований использования
современных генетико-биотехнологических методов оценки качества гамет.
Установлено, что использование цитогенетического метода оценки позволяет
установить степень мейотического созревания деконсервированых и прокультиви-
рованых гамет коров и закономерности прохождения мейоза в ооцитах свиней при
созревании in vitro.
The results of experimental researches the use of modern genetic-biotechnological
methods estimation of quality gamets are resulted. It is set that the use of cytogenetics
method estimation allows to set the degree of meiotic maturing of frozen-thawed and
maturation gamets cows and mechanism passing of meiosis of porcine oocytes during
maturation in vitro.
САВЕНКО Е.Г., ГЛАЗЫРИНА В.А., ШУНДРИНА Л.А.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт риса
Россия, г. Краснодар, 350921, п/о Белозерное, E-mail: arrri_kub@mail.ru
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ
ДЛЯ КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ РИСА IN VITRO
При длительном культивировании каллусов (более 50 дней) на искус-
ственных питательных средах в условиях in vitro у них теряется способность
к регенерации растений [16]. В опытах использовали янтарную кислоту (ЯК)
(бутандиовая — двухосновная предельная карбоновая кислота), которая в
настоящее время рассматривается как эффективный, дешевый и экологи-
|