Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози

За допомогою методів метаболічної інженерії було сконструйовано рекомбінантні штами дріжджів H. polymorpha та P. stipitis з покращеною алкогольною ферментацією ксилози.

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2010
1. Verfasser:	Дмитрук, К.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2010
Schriftenreihe:	Фактори експериментальної еволюції організмів
Schlagworte:	Біотехнології у медицині та сільському господарстві
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177995
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози / К.В. Дмитрук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 243-247. — Бібліогр.: 14 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-177995
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1779952025-02-09T14:08:51Z Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози Дмитрук, К.В. Біотехнології у медицині та сільському господарстві За допомогою методів метаболічної інженерії було сконструйовано рекомбінантні штами дріжджів H. polymorpha та P. stipitis з покращеною алкогольною ферментацією ксилози. С помощью методов метаболической инженерии сконструированы рекомбинантные штаммы дрожжей H. polymorpha и P. stipitis с улучшенными параметрами алкогольной ферментации ксилозы Recombinant yeast strains of H. polymorpha and P. stipitis with increased alcoholic fermentation of xylose were constructed using metabolic engineering approaches. 2010 Article Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози / К.В. Дмитрук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 243-247. — Бібліогр.: 14 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177995 uk Фактори експериментальної еволюції організмів application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Біотехнології у медицині та сільському господарстві Біотехнології у медицині та сільському господарстві
spellingShingle	Біотехнології у медицині та сільському господарстві Біотехнології у медицині та сільському господарстві Дмитрук, К.В. Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози Фактори експериментальної еволюції організмів
description	За допомогою методів метаболічної інженерії було сконструйовано рекомбінантні штами дріжджів H. polymorpha та P. stipitis з покращеною алкогольною ферментацією ксилози.
format	Article
author	Дмитрук, К.В.
author_facet	Дмитрук, К.В.
author_sort	Дмитрук, К.В.
title	Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози
title_short	Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози
title_full	Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози
title_fullStr	Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози
title_full_unstemmed	Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози
title_sort	метаболічна інженерія дріжджів hansenula polymorpha та pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2010
topic_facet	Біотехнології у медицині та сільському господарстві
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177995
citation_txt	Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози / К.В. Дмитрук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 243-247. — Бібліогр.: 14 назв. — укр.
series	Фактори експериментальної еволюції організмів
work_keys_str_mv	AT dmitrukkv metabolíčnaínženeríâdríždžívhansenulapolymorphatapichiastipitisdlâkonstruûvannâštamívzpokraŝenoûalkogolʹnoûfermentacíêûksilozi
first_indexed	2025-11-26T15:47:07Z
last_indexed	2025-11-26T15:47:07Z
_version_	1849868452446076928
fulltext	243 ДМИТРУК К.В. Інститут біології клітини НАН України, 79005, Львів, вул. Драгоманова 14/16, e-mail: dmytruk@cellbiol.lviv.ua МЕТАБОЛІЧНА ІНЖЕНЕРІЯ ДРІЖДЖІВ HANSENULA POLYMORPHA ТА PICHIA STIPITIS ДЛЯ КОНСТРУЮВАННЯ ШТАМІВ З ПОКРАЩЕНОЮ АЛКОГОЛЬНОЮ ФЕРМЕНТАЦІЄЮ КСИЛОЗИ Потреби людства в енергії невпинно зростають і якщо в 20 сторіччі викопні джерела цілком забезпечували енергетичні потреби, то у 21 сторіччі ситуація кардинально змінюється. Стрімке вичерпання викопного палива приводить до нестабільності у ціновій політиці на енергоносії, особливо на нафту. Спалювання викопних енергоносіїв призводить до погіршення еколо- гічної ситуації внаслідок вивільнення в атмосферу додаткового вуглекислого газу, посилюючи парниковий ефект. Вирішити посталу проблему можна шля- хом обмеження спалювання викопних джерел, застосовуючи енергозаощад- жуючі технології та/або заміною викопних джерел енергії поновлювальними, наприклад рослинною біомасою (лігноцелюлозою). Одним з найбільш роз- повсюджених типів біопалива отриманих з рослинної біомаси є етанол. На сьогодні етанол отримають з цукру (Бразилія) або крохмалю (США). Вихідна сировина також використовується в їжу людини і в корм тваринам, що обмежує її широке застосування для отримання біоетанолу. До того ж зменшення кількості парникових газів в результаті використання етанолу з цукру чи крохмалю є недостатнім [1]. Встановлено, що етанол із зернових культур суттєво не знижує викиди парникових газів, тоді як використання біомаси замість традиційної сировини для отримання біопалива має суттєві переваги у зниженні викидів парникових газів, адже потребує менше викопного палива для його отримання [2]. Основною причиною збереження енергії та обмеження посилення парникового ефекту при отриманні біопа- лива з целюлози є наявність побічного продукту переробки біомаси до етанолу — лігніну, що використовується як джерело енергії замість природ- ного газу, що спалюється на більшості спиртзаводах. Іншою підставою для позитивної оцінки отримання етанолу з лігноцелюлози є той факт, що з біо- маси можна отримати більше етанолу з одиниці площі. В середньому з одно- го гектару зернових культур отримають до 4000 літрів спирту. Для підви- щення рентабельності, залишкова солома могла би бути перетворена на додаткові 1400 літрів спирту. Використання зернових, що дають більшу біомасу, наприклад просо, також потребують менші затрати викопного палива, підвищуючи сумарний вихід енергії [3]. Лігноцелюлоза доступна у великих кількостях у складі залишків сільського господарства та дерево- обробної промисловості (солома, тирса, кукурудзяний качан, стебла кукуруд- зи, лузга соняшникового насіння, кора дерев тощо). Це комплексна сполука з декількох полімерів, що містить окрім глюкози і інші цукри, серед яких п’ятивуглецевий цукор, ксилоза — другий найбільш поширений цукор. 244 Основною проблемою, на шляху до розробки економічно вигідної технології конверсії цукрів лігноцелюлози до етанолу є відсутність мікроорганізмів, здатних ефективно ферментувати не лише глюкозу, а й ксилозу. Винні дріжджі Saccharomyces cerevisiae, які традиційно використовуються для отримання етанолу, нездатні ферментувати пентози. Відомо декілька мікроорганізмів здатних до алкогольної ферментації ксилози, зокрема дріжджі Hansenula polymorpha та Pichia stipitis. Проте вихід етанолу під час мікробної фермен- тації ксилози є недостатньо високий, що робить цей процес економічно неви- гідним. Використання методів метаболічної інженерії дозволяє покращити параметри алкогольної ферментації. Метаболічна інженерія це сукупність методів та технологій для створен- ня та вдосконалення організмів із заданими характеристиками. Основний принцип метаболічної інженерії полягає у максимально ефективному пере- творенні одних сполук в інші. Ефективність перетворення досягається поси- ленням ланок бажаного шляху метаболізму та обмеженням відтоку метабо- літів у суміжні біохімічні шляхи. Такі маніпуляцію здійснюють за допомогою методів генної інженерії, посилюючи експресію одних генів та знижуючи або зупиняючи експресію інших, або шляхом введення чужорідних генів. У дріжджів посилення експресії цільового гену досягається шляхом заміни власного промотора на сильний конститутивний або регульований. Тоді як обмеження експресії досягається пошкодженням (делецією) відповідного гена. Дріжджі Hansenula polymorpha Метилотрофні термотолерантні дріжджі Hansenula polymorpha — унікальний організм, здатний до алкогольної ферментації ксилози та глюкози при високій температурі (45–50 °C). Здатність до ферментації лігноцелюлоз- них цукрів при високій температурі перетворює H. polymorpha у перспек- тивний організм для розробки ефективного процесу одночасної сахарифі- кації та ферментації, при якому ензиматичний гідроліз лігноцелюлози целю- лазами та геміцелюлазами, температурний оптимум яких біля 55 °C, відбу- вається одночасно з ферментацією вивільнених моносахаридів до етанолу. Це обмежує ретроінгібування ензиматичного гідролізу кінцевими продук- тами [4]. Метилотрофні дріжджі H. polymorpha є одним з найдокладніше вивче- них видів неконвенційних дріжджів. Дріжджі H. polymorpha є привабливим об’єктом як з наукової так і з практичної точки зору. Ці дріжджі є об’єктом дослідження механізмів термотолерантності, гомеостазу пероксисом, про- дукції гетерологічних білків та високотемпературної алкогольної фермен- тації [5]. Промислове використання H. polymorpha обумовлене декількома цікавими особливостями цього виду дріжджів. Дріжджі H. polymorpha здатні нагромаджувати значну біомасу у ферментерах, що забезпечує високі виходи цільових продуктів. Як і S. cerevisiae, дріжджі H. polymorpha ростуть на дешевих та простих поживних середовищах, для них розроблені генетичні методи, є досвід у промисловому використання та масштабуванні. H. poly- 245 morpha розглядаються як генетично безпечні організми, що не містять патогенів або вірусних інфекцій. До того ж завершено визначення нуклеотид- ної послідовності геному цих дріжджів, що перетворює H. polymorpha у зручний організм для метаболічної інженерії, модифікації та покращення певних біохімічних шляхів. Як зазначалось вище, дріжджі H. polymorpha здатні до високотемпературної алкогольної ферментації глюкози, ксилози та целобіози, основних цукрів лігноцелюлозних гідролізатів [6]. Однак ефективність алкогольної ферментації ксилози штамами дикого типу є недо- статньо високою. Для покращення виходу етанолу з ксилози, ген бактерійної ксилозоізомерази разом з гомологічним геном ксилулокінази були успішно експресовані в H. polymorpha [7; 8]. Експресія модифікованої форми ксилозоредуктази разом з експресією ксилітолдегідрогенази, ксилулокінази та піруватдекарбоксилази призводила до покращення параметрів алкогольної ферментації ксилози при високій температурі (45–48 °C) [9; 10]. Термото- лерантність цих дріжджів може бути надалі покращеною шляхом делеції гену, що кодує кислу трегалазу або шляхом посилення експресії генів теп- лового шоку [11]. Гетерологічні гени, що кодують амілолітичні (α-амілаза та глюкоамілаза) та ксиланолітичні (ендоксиланаза та β-ксилозидаза) фер- менти були успішно експресовані в H. polymorpha, що забезпечило отри- мання рекомбінантних штамів здатних до високотемпературної алкогольної ферментації крохмалю та ксилану [12]. Покращення параметрів алкогольної ферментації було також досягнуте шляхом застосування методу позитивної селекції із додаванням у середовище токсичних аналогів глюкози та пі- рувату — 2-дезоксиглюкози та 3-бромпірувату, відповідно. Мутанти, на се- редовищі з ксилозою з додаванням токсичних концентрацій 2-дезокси- глюкози, можуть виникати внаслідок різних причин, в тому числі внаслідок активації ферментів метаболізму цієї пентози. Тоді як 3-бромпіруват спе- цифічно інгібує ключові ферменти гліколізу-гексокіназу, піруваткіназу та піруватдекарбоксилазу. Такий підхід було застосовано для селекції дріжджо- вих мутантів з підвищеною ефективністю утворення етанолу. Встановлено, що спонтанні мутанти, резистентні до токсичних концентрацій 2-дезокси- глюкози та 3-бромпірувату характеризуються підвищеним рівнем алкоголь- ної ферментації ксилози в півтора-два рази. В загальному, синтез етанолу з ксилози було підвищено в 10–15 разів. Однак сконструйовані штами у синтезі та продуктивності етанолу з ксилози поступаються дріжджам P. stipitis та найкращим з рекомбінантних штамів S. cerevisiae. Максимальна кількість етанолу при ферментації ксилози скон- струйованими штамами сягала 10 г/л при 45–48 °C, тоді як для рентабель- ного застосування технології одночасної сахарифікації та ферментації необхідно досягнути концентрації етанолу 30 г/л. Дріжджі Pichia stipitis Дріжджі P. stipitis є найкращими ферментатором ксилози з усіх відомих мікроорганізмів. Дріжджі P. stipitis володіють широким спектром целюло- літичних ферментів. Такі особливості цього організму обумовлені його 246 природною екологічною нішою. Ці дріжджі були виявлені в кишківнику жуків-пассалідів, що використовують у їжу деревину. P. stipitis розглядається як надзвичайно перспективний організм для ферментації гідролізатів залишків сільського господарства та деревообробної промисловості. Не- щодавно було визначено послідовність нуклеотидів геному дріжджів P. stipitis та проведена його анотація [13]. Разом з тим з’явилась стаття, де описано загальній рівень експресії генів залучених у катаболізмі гексоз і пентоз [14]. Встановлено, що рівень експресії генів, що кодують перші два ферменти катаболізму ксилози — ксилозоредуктаза та ксилітолдегідрогеназа суттєво підвищуються. Беручи до уваги дисбаланс нуклеотидних кофакторів було посилено експресію модифікованої форми ксилозоредуктази із зни- женою спорідненістю до NADPH, а також ксилітолдегідрогенази. Відповідні гени було поєднано із сильним конститутивним промотором гліколітичного гену, що кодує гліцеральдегідфосфатдегідрогеназу та введено в реципієнтний штам. В результаті було отримано суттєве покращення алкогольної фермен- тації ксилози, на 39% при посилені експресії модифікованої форми ксило- зоредуктази та на 40% при посилені експресії ксилітолдегідрогенази. Окрім того проводилось посилення експресії генів, що кодують пі- руватдекарбоксилазу та алкогольдегідрогеназу. Ці ферменти беруть участь в останніх реакціях синтезу етанолу. А також гени неокислювальної ланки пентозофосфатного шляху — трансальдолазу та транскетолазу, за участі яких метаболізм ксилози сполучається з гліколізом. Одночасне посилення експресії усіх чотирьох генів стимулювало алкогольну ферментацію ксилози на 34%. Майбутні перспективи Незважаючи на значні успіхи у конструюванні рекомбінантних мікро- організмів — продуцентів паливного етанолу, отримати промисловий проду- цент етанолу другого поколінні поки що не вдається. Ведеться активна пошу- кова робота у напрямках покращення ефективності транспорту фермен- туючого субстрату у клітину, гліколізу, блокування реутилізації утвореного етанолу, зниження чутливості мікроорганізмів до синтезованого етанолу та інших інгібіторів ферментації, обмеження зростання біомаси, регуляція синтезу етанолу, розробка ефективних методів селекції продуцентів етанолу тощо. Враховуючи першочерговість та гостроту світових проблем енерго- забезпечення та екологічного балансу, ефективні продуценти етанолу з по- новлюваної сировини будуть створені в близькому майбутньому. Література 1. Farrell A., Plevin R., Turner B., Jones A.D., O’Hare M., Kammen D. Ethanol can contribute to energy and environmental goals // Science.— 2006.— Vol.311.— P. 506– 508. 2. Hill J., Polasky S., Nelson E., Tilman D., Huo H., Ludwig L., Neumann J., Zheng H., Bonta D. Climate change and health costs of air emissions from biofuels and gasoline // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 2009.— Vol.106.— P. 2077–2082. 247 3. Schubert C. Can biofuels finally take center stage? // Nat. Biotechnol.— 2006.— Vol.24.— P. 777–784. 4. Olofsson K., Bertilsson M., Lidén G. A short review on SSF — an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks // Biotechnol. Biofuels.— 2008.— Vol.1(1): 7. 5. Gellissen G. (Ed.) (2002) Hansenula polymorpha — Biology and Applications. Wiley-VCH, Weinheim. 6. Ryabova O., Chmil O., Sibirny A. Xylose and cellobiose fermentation to ethanol by the thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res.— 2003.— Vol.4.— P. 157–164. 7. Voronovsky A., Ryabova O., Verba O., Ishchuk O., Dmytruk K., Sibirny A. Expres- sion of xylA genes encoding xylose isomerases from Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res.— 2005.— Vol.5.— P. 1055–1062. 8. Dmytruk O., Voronovsky A., Abbas C., Dmytruk K., Ishchuk O., Sibirny A. Overexpression of bacterial xylose isomerase and yeast host xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res.— 2008.— Vol.8.— P. 165–173. 9. Dmytruk O., Dmytruk K., Abbas C., Voronovsky A., Sibirny A. Engineering of xylose reductase and overexpression of xylitol dehydrogenase and xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha // Microbial Cell Factories.— 2008.— 7: 21. 10. Ishchuk O., Voronovsky A., Stasyk O., Gayda G., Gonchar M., Abbas C., Sibir- ny A. Overexpression of pyruvate decarboxylase in the yeast Hansenula polymorpha results in increased ethanol yield in high-temperature fermentation of xylose // FEMS Yeast Res.— 2008.— Vol.8.— P. 1164–1174. 11. Ishchuk O., Voronovsky A., Abbas C., Sibirny A. Construction of Hansenula polymorpha strains with improved thermotolerance // Biotechnol. Bioeng.— 2009.— Vol.104.— P. 911–919. 12. Voronovsky A., Rohulya O., Abbas C., Sibirny A. Development of strains of the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha capable of alcoholic fermentation of starch and xylan // Metab. Eng.— 2009.— Vol.11.— P. 234–242. 13. Jeffries T., Grigoriev I., Grimwood J., Laplaza J., Aerts A., Salamov A., Schmutz J., Lindquist E., Dehal P., Shapiro H., Jin Y., Passoth V., Richardson P. Genome sequence of the lignocellulose-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis // Nat. Biotechnol.— 2007.— Vol.25.— P. 319–326. 14. Jeffries T., Van Vleet J. Pichia stipitis genomics, transcriptomics, and gene clusters // FEMS Yeast Res.— 2009.— Vol.9.— P. 793–807. Резюме За допомогою методів метаболічної інженерії було сконструйовано рекомбі- нантні штами дріжджів H. polymorpha та P. stipitis з покращеною алкогольною ферментацією ксилози. С помощью методов метаболической инженерии сконструированы рекомби- нантные штаммы дрожжей H. polymorpha и P. stipitis с улучшенными параметрами алкогольной ферментации ксилозы. Recombinant yeast strains of H. polymorpha and P. stipitis with increased alcoholic fermentation of xylose were constructed using metabolic engineering approaches. 248 ЖАРИКОВА Н.В., КОРОБОВ В.В., АНИСИМОВА Л.Г., ЯСАКОВ Т.Р., ЖУРЕНКО Е.Ю., МАРКУШЕВА Т.В. Учреждение РАН Институт биологии УНЦ РАН, Россия, 450054, Уфа, ул. Проспект Октября, 61, e-mail: tvmark@anrb.ru ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КУЛЬТУРЫ GLUCONOBACTER OXYDANS 2Т В ОБЛАСТИ РЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ ОТ ГЕРБИЦИДА 2,4,5-Т 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) — синтетическое соединение, используемое в качестве гербицида для борьбы с древесной и кустарниковой растительностью, обработки газонов, лесных угодий, паст- бищ. Вместе с тем в ряде работ было показано, что 2,4,5-Т способна оказы- вать значительный мутагенный и канцерогенный эффект на живые системы [1]. Отмечено, что 2,4,5-Т является недоступным или малодоступным источ- ником углерода и энергии для большинства микроорганизмов, что ведет к накоплению и постепенному распространению этого ксенобиотика по пище- вым цепям [2]. Анализ работ, касающихся поиска и исследования особен- ностей деструкторов, показал, что интерес к микроорганизмам-деструкторам 2,4,5-Т связан с возможностью использовать их на практике при создании биологических технологий очистки почвы от экологически опасных соеди- нений. Объектом исследований служил бактериальный штамм, выделенный из образца почвенных популяций микроорганизмов. В эксперименте использовали минимальную солевую среду следующего состава в г/л: NH4Cl — 1; K2HPO4 — 5; MgSO4×7H2O — 0,05; FeSO4×7H2O — 0,005; CuSO4×5H2O — 0,001; ZnSO4 — 0,008; pH — 6,8–7,0. В качестве един- ственного источника углерода и энергии добавляли 2,4,5-Т до конечной кон- центрации 100 мг/л. Определение количества 2,4,5-Т в культуральной жидкости проводили согласно методам определения микроколичеств 2,4,5-Т с небольшими моди- фикациями [3]. Для идентификации продуктов катаболизма 2,4,5-Т метилированные экстракты метаболитов подвергали анализу на хроматомасс-спектрометри- ческой системе хроматограф HP 5890 с масс-селективным детектором HP 5972A. В опытах с почвой посевной материал культуры вносили из расчета 105–106 КОЕ на 1 г почвы, содержащей 2,4,5-Т в концентрации 100 мг/кг. Обработку проводили в течение 48 суток в лабораторных условиях при естественном суточном колебании температур летнего периода. Исследуемый штамм был идентифицирован согласно культурально- морфологическим и физиолого-биохимическим признакам как Glucono- bacter oxydans [4]. Клетки штамма представляют собой подвижные коккоба-

Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis для конструювання штамів з покращеною алкогольною ферментацією ксилози

Institution

Ähnliche Einträge