Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha
Aim. Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) which is synthesized when cells are grown on non-fermentable carbon sources. When yeast cells are subsequently shifted to a glucose-containing medium, FBPase is rapidly inactivated and degraded. This process is called catabolite degradation. Methods. Standar...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Дата: | 2014 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2014
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178246 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha / О.В. Дмитрук, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2014. — Т. 15. — С. 55-59. — Бібліогр.: 6 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859744415952666624 |
|---|---|
| author | Дмитрук, О.В. Сибірний, А.А. |
| author_facet | Дмитрук, О.В. Сибірний, А.А. |
| citation_txt | Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha / О.В. Дмитрук, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2014. — Т. 15. — С. 55-59. — Бібліогр.: 6 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Фактори експериментальної еволюції організмів |
| description | Aim. Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) which is synthesized when cells are grown on non-fermentable carbon sources. When yeast cells are subsequently shifted to a glucose-containing medium, FBPase is rapidly inactivated and degraded. This process is called catabolite degradation. Methods. Standart molecular biological and biochemical methods were used. Results. The wild type strains of P. pastoris and H. polymorpha were analyzed by Western blot, using the antibodies for FBP protein of S. cerevisiae. It was shown that FBPase is mostly degraded after 5 hours of incubation of cells in glucose-containing medium. After shifting the cells from methanol or ethanol-containing media on glucose medium, FBPase activity of P. pastoris and H. polymorpha wild-type strains decreased 4.5–5 and 2–2.5 times, respectively. Conclusions. The recombinant strains of P. pastoris with the deletion of FBP gene were constructed and analyzed. Δfbp strains did not grow in the medium with non-fermentable carbon sources. To study the mechanisms of catabolite degradation, plasmids for the expression of FBP fused with GFP were constructed. The recombinant strains with the expression of these plasmids were obtained and analyzed.
Key words: yeasts, fructose-1,6-bisphosphatase, catabolite degradation.
|
| first_indexed | 2025-12-01T20:49:33Z |
| format | Article |
| fulltext |
55
of electrophoresis (Brzezinski vs. Poperelya) for the barley hordeins analysis was invesligated. Methods. The
original electrophoretic procedures were created. Hordeins were extracted from individual grain of several
variants of brewing barley. Results. The hordein spectra were obtained after both procedures. There were no
differences between electrophoregrams. Three protein zones were marked on each electrophoregram. But the
brewing electrophoresis is less expensive. Conclusion. Electrophoresis of proteins is an effective method of
laboratory quality control of barely grain.
Key words: hordeins, electrophoresis.
УДК 576.34:576.311.34:582.282.31
ДМИТРУК O.В. 1, СИБІРНИЙ A.A. 1, 2
1 Інститут біології клітини НАН України,
Україна, 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16, e-mail: verbaolena@gmail.com
2 Факультет біотехнології і мікробіології, Жешівський університет,
Польща, 35-601, м. Жешів, вул. Зелверовіца, 4, e-mail: sibirny@cellbiol.lviv.ua
КАТАБОЛІТНА ДЕГРАДАЦІЯ ФРУКТОЗО-1,6-БІСФОСФАТАЗИ У МЕТИЛОТРОФНИХ
ДРІЖДЖІВ PICHIA PASTORIS І HANSENULA POLYMORPHA
Глюконеогенез є високорегульованим
клітинним процесом, шляхом якого дріжджі
можуть продукувати глюкозу з альтернаивних
неферментативних джерел вуглецю, таких як
ацетат, лактат, етанол, метанол, гліцерин. При
перенесенні дріжджів на середовище, що
містить глюкозу, утворення більшості
глюконеогенезних ферментів репресуються на
транскрипційному рівні, а вже наявні у клітині
ферменти піддаються швидкій деградації і
протеолізу, а вуглецевий метаболізм клітини
переходить на гліколітичний шлях [1].
Фруктозо-1,6-бісфосфатаза (FBP) є
ключовим ферментом глюконеогенезу, вона
каталізує перетворення фруктозо-1,6-бісфосфату
до фруктозо-6-фосфату, який згодом
метаболізує до глюкозо-6-фосфату (рис. 1). FBP
синтезується, якщо клітини дріжджів ростуть на
неферментативних джерелах вуглецю, на
середовищі з глюкозою фермент швидко
інактивується і деградує. Цей процес носить
назву катаболітна деградація [2].
Рис. 1. Схема глюконеогенезу і гліколізу у дріжджів
56
У метилотрофних дріжджів, таких як
P. pastoris і H. polymorpha, FBP також залучена
у шляху метаболізму метанолу, тому
дослідження катаболітної деградації FBP у цих
дріжджів має значний науковий інтерес [3].
Матеріали і методи
Нуклеотидні послідовності досліджуваних
дріжджових генів P. pastoris і H. polymorpha
були знайдені в геномних базах даних:
www.yeastgenome.org,
http://ergo.integratedgenomics.com/ERGO і
(http://genomeportal.jgi-psf.org/Hanpo2/
Hanpo2.home.html). Делеція гену FBP1
P. pastoris була отримана з допомогою
використання ауксотрофного маркерного гена
ZeoR. Підтвердження наявності делецій генів
буде здійснено шляхом полімеразної ланцюгової
реакції згідно стандартних протоколів
дослідження [4]. Процедури клонування генів і
підтвердження їхньої експресії будли проведені
з використанням типових молекулярно-
біологічних підходів: електрофорез нативних
хромосомних ДНК (молекулярне
каріотипування), рестрикційний аналіз,
лігування ДНК, трансформація бактерій та
дріжджів [4].
Приготування зразків для Вестерн-блот
аналізу для дослідження деградації фруктозо-
1,6-бісфосфатази було здійснено
використовуючи попередньо описані протоколи
досліджень [5]. Вестерн-блот аналіз було
проведено згідно стандартних методик [4].
Визначення активності фруктозо-1,6-
бісфосфатази було здійснено в безклітинних
екстрактах дріжджів за умов індукції деградації
згідно [6].
Результати та обговорення
На першому етапі роботи було визначено
активність FBP у диких штамів дріжджів
P. pastoris і H. polymorpha. Було показано, що
після перенесення клітин із середовища, що
містить метанол або етанол на середовище з
глюкозою, FBP активність P. pastoris і
H. рolymorpha зменшувалася у 4,5 і 2 рази
відповідно (рис. 2). Оскільки FBP
метилотрофних дріжджів також задіяна у
процесі утилізації метанолу, активність цього
фермента на метанолі була у 3 і у 2 рази вищою,
ніж на етанолі для P. pastoris і H. polymorpha
відповідно. Активність FBP на глюкозі була у
10–13 разів нижчою, ніж на етанолі (рис. 3).
Дикі штами P. pastoris і H. polymorpha
були проаналізовані шляхом Вестерн-блот
гібридизації, використовуючи антитіла для FBP
S. cerevisiae (рис. 4). Клітини дріжджів
вирощували на середовищі з етанолом або
метанолом у якості єдиного джерала вуглецю
протягом 48 год, а потім переносили на
середовище з глюкозою для індукції деградації
FBP. Було показано, що FBP повністю деградує
на середовищі з глюкозою після 5 годин
інкубації клітин, попередньо-підрощених на
глюконеогенезних субстратах (метанолі і
етанолі) (рис. 2).
А Б
Рис. 2. Активність FBP у диких штамів дріжджів P. pastoris і H. polymorpha на середовищах, що
містять метанол (А) або етанол (Б) у якості основного джерела вуглецю
57
Рис. 3. Активність FBP у диких штамів дріжджів P. pastoris і H. polymorpha на середовищі, що
містить етанол у якості основного джерела вуглецю
Рис. 4. Результати Вестерн-блот гібридизації диких штамів дріжджів P. pastoris і H. polymorpha
Наступним етапом роботи було
конструювання плазміди для делеції гена FBP1
(рис. 5). Для цього ліву і праву фланкуючі
ділянки гена FBP1 було ампліфіковано за
допомогою ПЛР і клоновано у плазміду pUC57.
Ген резистентності до норзеотрецину було
клоновано між фланкуючими ділянками. Цією
плазмідою було трансформовано у дикий штам
P. pastoris GS200 і отримано норзеотрецин-
резистентні колонії дріжджів. Коректність
делеції гена було підтверджено за допомогою
ПЛР (рис. 6). Штами Δfbp1 не росли на
середовищі з неферментативними джерелами
вуглецю. Активність FBP у штамів Δfbp1 на
гліцеролі і етанолі зменшилася у 2 рази,
порівняно з диким штамом.
58
Для вивчення механізмів катаболічної
деградації FBP було сконструйовано плазміду
для експресії гібридного гена FBP з геном GFP
(ген, що кодує зелений флуорисцентний білок)
під контролем власного FBP-промотора (рис. 7).
Цією плазмідою, було трансформовано штам
Δfbp1 і отримано колонії, здатні рости на
середовищі без додавання гістидину. Отримані
трансформанти були проаналізовані шляхом
ПЛР, активність FBP у даних трансформантів
становила 20 % від активності фермента у
дикого штаму дріжджів P. pastoris (рис. 8).
Висновки
1. Було показано, що FBP P. pastoris і H.
polymorpha повністю деградує на середовищі з
глюкозою після 5 годин інкубації клітин,
попередньо підрощених на глюконеогенезних
субстратах (метанолі і етанолі). Після
перенесення клітин із середовища, що містить
метанол або етанол на середовище з глюкозою,
FBP активність P. pastoris і H. рolymorpha
зменшувалася у 4,5 і 2 рази відповідно.
2. Було сконструйовано та проаналізовано
штами дріжджів P. pastoris з делецією гена, що
кодує FBP1. Активність FBP у штамів Δfbp1 на
гліцеролі і етанолі зменшилася у 2 рази
порівняно із диким штамом.
3. Для вивчення механізмів катаболітної
деградації FBP було сконструйовано плазміду
для експресії гібридного гена FBP1 з геном GFP
(ген, що кодує зелений флуорисцентний білок)
під контролем власного FBP-промотора.
Активність FBP у цих трансформантів
становила 20% від активності фермента у дикого
штаму дріжджів P. pastoris.
Рис. 5. Схема плазміди для делеції гена FBP1 P. pastoris
Рис. 6. Підтвердження коректності дегецї гена FBP1 у трансформантів штаму P. pastoris GS200
за допомогою ПЛР-аналізу
Рис. 7. Схема плазміди для експресії гібридного гена FBP1 з геном GFP під контролем
власного FBP-промотора
Рис. 8. Активність FBP у трансформантів штаму Δfbp1 плазмідою, для експресії гібридного
гена FBP1 з геном GFP під контролем власного FBP-промотора
59
Література
1. Regelmann J., Schüle T., Josupeit F.S., Horak J., Rose M., Entian K.D., Thumm M., Wolf D.H. Catabolite
degradation of fructose-1,6-bisphosphatase in the yeast Saccharomyces cerevisiae: a genome-wide screen identifies
eight novel GID genes and indicates the existence of two degradation pathways // Mol Biol Cell. – 2003. – 14 (4). –
P. 1652–1663.
2. Shieh H.L., Chen Y., Brown C.R., Chiang H.L. Biochemical analysis of fructose-1,6-bisphosphatase import into
vacuole import and degradation vesicles reveals a role for UBC1 in vesicle biogenesis // J Biol Chem. – 2001. –
276 (13). – P. 10398–10406.
3. Hung G.C., Brown C.R., Wolfe A.B., Liu J., Chiang H.L. Degradation of the gluconeogenic enzymes fructose-1,6-
bisphosphatase and malate dehydrogenase is mediated by distinct proteolytic pathways and signaling events //
J. Biol Chem. – 2004. – 279 (47). – P. 49138–49150.
4. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual [2nd ed.]. – Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989. – 510 p.
5. Nazarko V.Y., Futej K.O., Thevelein J.M., Sibirny A.A. Differences in glucose sensing and signaling for
pexophagy between the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae and the methylotrophic yeast Pichia pastoris //
Autophagy. – 2008. – 4 (3). – P. 381–384.
6. Gancedo C. Inactivation of 1,6-diphosphatase by glucose in yeast //Journal of Bacteriology. – 1971. – 107 (2). –
P. 401–405.
DMYTRUK O.V. 1, SIBIRNY A.A. 1, 2
1 Institute of Cell Biology, National Academy of Sciences of Ukraine,
Ukraine, 79005, Lviv, Drahomanov str., 14/16, e-mail: verbaolena@gmail.com
2 Department of Biotechnology and Microbiology, Rzeszow University,
Poland, 35-601, Rzeszow, Zelwerowicza str., 4, e-mail: sibirny@cellbiol.lviv.ua
CATABOLITE DEGRADATION OF FRUCTOSE-1,6-BISPHOSPHATASE IN
METHYLOTROPHIC YEASTS PICHIA PASTORIS AND HANSENULA POLYMORPHA
Aim. Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) which is synthesized when cells are grown on non-fermentable
carbon sources. When yeast cells are subsequently shifted to a glucose-containing medium, FBPase is
rapidly inactivated and degraded. This process is called catabolite degradation. Methods. Standart molecular
biological and biochemical methods were used. Results. The wild type strains of P. pastoris and
H. polymorpha were analyzed by Western blot, using the antibodies for FBP protein of S. cerevisiae. It was
shown that FBPase is mostly degraded after 5 hours of incubation of cells in glucose-containing medium.
After shifting the cells from methanol or ethanol-containing media on glucose medium, FBPase activity of
P. pastoris and H. polymorpha wild-type strains decreased 4.5–5 and 2–2.5 times, respectively. Conclusions.
The recombinant strains of P. pastoris with the deletion of FBP gene were constructed and analyzed. Δfbp
strains did not grow in the medium with non-fermentable carbon sources. To study the mechanisms of
catabolite degradation, plasmids for the expression of FBP fused with GFP were constructed. The
recombinant strains with the expression of these plasmids were obtained and analyzed.
Key words: yeasts, fructose-1,6-bisphosphatase, catabolite degradation.
УДК 575.222.7:581.1
ДРОБОТ К.О., МАТВЄЄВА Н.А., КВАСКО О.Ю., ШАХОВСЬКИЙ А.М.
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України,
Україна, 03680, м. Київ, вул. Заболотного, 148, e-mail: joyna56@gmail.com
СТВОРЕННЯ КУЛЬТУРИ «БОРОДАТИХ» КОРЕНІВ РОСЛИН АЛТЕЇ ЛІКАРСЬКОЇ
ALTHAEA OFFICINALIS L. З ВИКОРИСТАННЯМ РІЗНИХ ВЕКТОРНИХ КОНСТРУКЦІЙ
З ГЕНОМ ifn-α2b ЛЮДИНИ
Алтея лікарська (Althaea officinalis L.,
Malvaceae), багаторічна трав’яниста рослина,
поширена у Європі, є лікарською та
використовується як у нетрадиційній медицині,
так і у фармакології для створення лікарських
препаратів. Рослини алтеї мають ряд
лікувальних властивостей завдяки наявності
мукополісахаридів та інших сполук. Її листки та
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-178246 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2219-3782 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-01T20:49:33Z |
| publishDate | 2014 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Дмитрук, О.В. Сибірний, А.А. 2021-02-18T12:19:01Z 2021-02-18T12:19:01Z 2014 Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha / О.В. Дмитрук, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2014. — Т. 15. — С. 55-59. — Бібліогр.: 6 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178246 576.34:576.311.34:582.282.31 Aim. Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) which is synthesized when cells are grown on non-fermentable carbon sources. When yeast cells are subsequently shifted to a glucose-containing medium, FBPase is rapidly inactivated and degraded. This process is called catabolite degradation. Methods. Standart molecular biological and biochemical methods were used. Results. The wild type strains of P. pastoris and H. polymorpha were analyzed by Western blot, using the antibodies for FBP protein of S. cerevisiae. It was shown that FBPase is mostly degraded after 5 hours of incubation of cells in glucose-containing medium. After shifting the cells from methanol or ethanol-containing media on glucose medium, FBPase activity of P. pastoris and H. polymorpha wild-type strains decreased 4.5–5 and 2–2.5 times, respectively. Conclusions. The recombinant strains of P. pastoris with the deletion of FBP gene were constructed and analyzed. Δfbp strains did not grow in the medium with non-fermentable carbon sources. To study the mechanisms of catabolite degradation, plasmids for the expression of FBP fused with GFP were constructed. The recombinant strains with the expression of these plasmids were obtained and analyzed. Key words: yeasts, fructose-1,6-bisphosphatase, catabolite degradation. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Клітинні, генні та молекулярні біотехнології Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha Catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase in methylotrophic yeasts Pichia pastoris and Hansenula polymorpha Article published earlier |
| spellingShingle | Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha Дмитрук, О.В. Сибірний, А.А. Клітинні, генні та молекулярні біотехнології |
| title | Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha |
| title_alt | Catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase in methylotrophic yeasts Pichia pastoris and Hansenula polymorpha |
| title_full | Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha |
| title_fullStr | Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha |
| title_full_unstemmed | Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha |
| title_short | Катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris і Hansenula polymorpha |
| title_sort | катаболітна деградація фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів pichia pastoris і hansenula polymorpha |
| topic | Клітинні, генні та молекулярні біотехнології |
| topic_facet | Клітинні, генні та молекулярні біотехнології |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178246 |
| work_keys_str_mv | AT dmitrukov katabolítnadegradacíâfruktozo16bísfosfataziumetilotrofnihdríždžívpichiapastorisíhansenulapolymorpha AT sibírniiaa katabolítnadegradacíâfruktozo16bísfosfataziumetilotrofnihdríždžívpichiapastorisíhansenulapolymorpha AT dmitrukov catabolitedegradationoffructose16bisphosphataseinmethylotrophicyeastspichiapastorisandhansenulapolymorpha AT sibírniiaa catabolitedegradationoffructose16bisphosphataseinmethylotrophicyeastspichiapastorisandhansenulapolymorpha |