Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи
Aims. Maize (Zea mays L.) is one of the most economically important crops which were considerably improved by modern biotechnology. For efficient production of transgenic maize, immature embryos and two transformation techniques for transgenes delivery (Agrobacterium-mediated transformation and part...
Saved in:
| Published in: | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Date: | 2014 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2014
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178271 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи / І.О. Нітовська, О.Є. Абраїмова, Т.М. Сатарова, А.М. Шаховський, Б.В. Моргун // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2014. — Т. 15. — С. 112-117. — Бібліогр.: 10 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860074013084090368 |
|---|---|
| author | Нітовська, І.О. Абраїмова, О.Є. Сатарова, Т.М. Шаховський, А.М. Моргун, Б.В. |
| author_facet | Нітовська, І.О. Абраїмова, О.Є. Сатарова, Т.М. Шаховський, А.М. Моргун, Б.В. |
| citation_txt | Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи / І.О. Нітовська, О.Є. Абраїмова, Т.М. Сатарова, А.М. Шаховський, Б.В. Моргун // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2014. — Т. 15. — С. 112-117. — Бібліогр.: 10 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Фактори експериментальної еволюції організмів |
| description | Aims. Maize (Zea mays L.) is one of the most economically important crops which were considerably improved by modern biotechnology. For efficient production of transgenic maize, immature embryos and two transformation techniques for transgenes delivery (Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment) were employed. However, genetic transformation is genotype dependent and is not routine procedure. Thus, the aim of the current studies was to carry out the biolistic transformation of immature maize embryos for commercial genotypes propagated in fields, and to prove their competence for genetic transformation. Methods. Particle bombardment of immature maize embryos for 21 commercial genotypes using pAHC25 vector was carried out. Histochemical analysis of the phosphinothricin resistant plant material for the presence of β-glucuronidase was performed. Plant DNA was analyzed for the presence of bar gene by PCR method. Results. Following particle bombardment, phosphinothricin resistant calli and plant regenerants were obtained. Histochemical analysis showed the presence of β-glucuronidase in the obtained plant material. PCR analysis proved the presence of bar gene in plant DNA of the phosphinothricin resistant calli and 6 regenerant lines. Out of 21 maize genotypes, inbred line PLS61 and hybrids F₁ PLS61♀×ДК744♂, PLS61♀×ДК304♂, and ДК959♀×PLS61♂ were the most competent for biolistic transformation. Conclusions. After biolistic transformation of immature maize embryos with pAHC25 vector, phosphinothricin resistant calli and plant regenerant lines containing β-glucuronidase have been obtained. The presence of bar gene detected by PCR method indicated the transgenic nature of the obtained plant material. Four most responsive for the biolistic transformation genotypes were selected from 21 commercial lines and hybrids grown in Ukraine.

Key words: Zea mays L., particle bombardment, β-glucuronidase, bar gene, GMO.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:12:15Z |
| format | Article |
| fulltext |
112
Література
1. Програма збереження генофонду основних видів сільськогосподарських тварин в Україні на період до 2015
року / заг. наук. ред. І.В. Гузєва, консультація та специфікація Ю.В. Мельника. – К.: Арістей, 2009. – 132 с.
2. Бірта Г.О., Бургу Ю.Г. Влияние генотипа на мясные качества свиней // Вісник Полтавської держ. аграр.
академії. – 2012. – № 1. – С. 212–214.
3. http://dad.fao.org.
4. Герасимов В.І. та ін. Світовий генофонд свиней: монографі. – Харків: Еспада. – 2006. – 520 с.
5. Ернст Л.K. Генетические основы селекции сельскохозяйственных животных. – М.: РАСХН, ВГНИИ
животноводства, 2004. – 736 с.
6. Барановський Д.І. та ін. Генофонд свійських тварин України: навч. посібник. – Харків: Еспада, 2005. – 400 с.
7. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Стратегия сохранения животного и растительного мира земли // Консервация
генетических ресурсов. – Пущино, 1991. – С. 47–62.
8. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Консервация генетических ресурсов // Природа. – М., 1978. – № 11. – С. 10–21.
9. FAO Guidelines for the Cryoconservation of Animal Genetic Resources. – Rome, Italy, 2010. – 170 с.
10. Лебедева Я.В. Измерение и оценка биологического разнообразия. – Ростов Н/Д.УПЛ РГУ, 1999.– Ч. 2. – 94 с.
11. Соколов Б.П., Джемелинский В.В. Выделение высокомолекулярной эукариотической ДНК с
использованием ацетата калия // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 1989. – № 6. –
С. 45–46.
12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. – Москва: Мир, 1984. – 479 с.
13. Медицинские лабораторные технологии. Справочник / [под ред. А.И. Карпищенко]. – Санкт-Петербург:
Интермедика, 2002. – 2. – 600 с.
METLITSKA О.І., SHCHERBAK О.V., KOVTUN S.I., TROSKIY P.А., ZYUZYN А.B.,
OSYPCHUK О.S.
Institute of Animal Breeding and Genetics, National Academy of Agrarian Science of Ukraine,
Ukraine, 08321, Kiev Region, Borispol District, v. Chubinske, Pogrebnyaka str., 1, e-mail:
ov19792006@yandex.ru
OPTIMIZATION BIOTECHNOLOGICAL METHODS IN THE SYSTEM OF MIRGORODSKA
BREED PIGS GENE POOL PRESERVATION
Aims. Gene pool preservation endangered, indigenous pig breeds requires using methods modern
biotechnology and genetic. Create a cryocollection Mirgorodska breed pigs viable oocytes and DNA bank
for the development of scientific methods of maintenance and further improvement. Methods. In carrying
out this work used biotechnology, cryobiological, morphological, molecular genetic methods. Results. As a
result of working for long-term storage in the Bank Animal Genetic Resources of the Institute of Animal
Breeding and Genetics laid full in vitro matured oocytes 25 sows Rysalka № 274/ 05 128, 19 oocytes Sojka
№ 314 and 53 oocytes Smorodina № 674 Mirgorodska breed pigs. For DNA studies the optimal treatment
primary regimes biomaterial: ovarian tissue and immature oocyte cumulus complexes. Conclusion. Used
complex biotechnology and molecular-genetic methods to form oocytebank pigs of Mirgorodska breed in
Bank Animal Genetic Resources of the Institute of Animal Breeding and Genetics
Key words: cryobank, oocyte, cryopreservation, DNA-analysis, gene pool.
УДК 604.6:633.15
НІТОВСЬКА І.О. 1, АБРАЇМОВА О.Є. 2, САТАРОВА Т.М. 2, ШАХОВСЬКИЙ А.М. 1,
МОРГУН Б.В. 1
1 Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України,
Україна, 03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 148, е-mail: molgen@icbge.org.ua
2 Державна установа Інститут сільського господарства степової зони НААН України,
Україна, 49600, м. Дніпропетровськ, вул. Дзержинського, 14
БІОЛІСТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ НЕЗРІЛИХ ЗАРОДКІВ КУКУРУДЗИ
Генетичну трансформацію рослин
сільськогосподарських культур використовують
для надання їм певних ознак з метою
покращення їх характеристик, збільшення
врожаю та здешевлення виробництва. З кожним
роком світова площа, зайнята під вирощування
113
біотехнологічних рослин, невпинно зростає та
становить станом на 2013 рік понад 175 млн га
[1]. Кукурудза (Zea mays L.) є важливою
сільськогосподарською культурою широкого
використання, яку вирощують по всьому світі у
промислових масштабах, у тому числі і
генетично модифіковану. Найбільше поширення
отримала трансгенна кукурудза, стійка до
гербіцидів та комах [2]. Для отримання
трансгенних рослин кукурудзи найчастіше
використовують Agrobacterium-опосередкова-
ний або біолістичний методи та незрілі зародки
як безпосередній об’єкт для проведення
генетичної трансформації [3, 4]. Проте не
зважаючи на певний успіх по створенню та
вирощуванню трансгенної кукурудзи, генетична
трансформація комерційних генотипів не є
рутинною та надійно відтворювальною
процедурою.
Метою нашого дослідження було
проведення біолістичної трансформації незрілих
зародків кукурудзи певних генотипів, які
створені та вирощуються на території України,
та оцінка їх компетентність для генетичної
трансформації.
Матеріали та методи
Для трансформації використовували
незрілі зародки кукурудзи 21 генотипу: 8
інбредних ліній, 10 гібридів F1 та сомаклональні
варіанти на основі гібридів F1 (табл. 1). Донорні
рослини кукурудзи вирощували у польових
умовах. Незрілі зародки у віці 10–12 діб після
запилення ізолювали з донорних рослин,
стерилізували та експлантували на живильне
середовище для калусогенезу in vitro, як описано
раніше [5]. Через 2–16 діб культивування на
середовищі для калюсогенезу незрілі зародки, на
щитках яких почали розвиватися калуси, підда-
вали біолістичній трансформації.
В експериментах використовували вектор
pAHC25 [6], який містить ген β-глюкуронідази
uidA та ген фосфінотрицин-ацетил-трансферази
bar, обидва під контролем промотору убіквітину
кукурудзи.
Експерименти з біолістичної транс-
формації кукурудзи проводили, використовуючи
гармату PDF-1000/He.unit, Bio-Rad. Носіями
ДНК були частинки золота (Bio-Rad) діаметром
1 мкм. ДНК плазміди адсорбували на частинках
золота, використовуючи розчин Mg2+-PEG [7].
Процедуру біолістичної трансформації
проводили за загально прийнятим протоколом,
застосовуючи тиск 900 psi та відстань від
макроносія до рослинного матеріалу 6 см.
Підготовку рослинного матеріалу до
трансформації та подальше культивування
робили як описано раніше [5]. Кількість
зародків, яку обробляли одним пострілом, була
від 25 до 50. Через тиждень після біолістичної
обробки рослинний матеріал переносили на
селективне середовище для калюсогенезу [5] з
додаванням 5 мг/л фосфінотрицину та
вирощували у темряві при 27 °С. Калюси
переносили на свіже середовище що два тижні.
Через 2–4 тижні після початку селекції калюси
переносили на селективне регенераційне
середовище, яке містило сольовий компонент та
вітаміни середовища MС [8], 700 мг/л проліну,
0,25 мг/л 6-бензил-амінопурину, 20 г/л сахарози,
7 г/л агару та 5 мг/л фосфінотрицину, і
вирощували в умовах освітлення при 26 °С та
16-годинному фотоперіоді. Рослини-
регенеранти висаджували в банки на
безгормональне середовище MС з додаванням
5 мг/л фосфінотрицину та вирощували в тому ж
режимі освітлення.
Гістохімічний аналіз наявності β-глю-
куронідази у рослинному матеріалі проводили за
методикою [9] через 4 доби після обстрілу з
метою виявлення транзієнтної експресії гена
uidA, і через 2–3 місяця для визначення події
стабільної трансформації.
З отриманого стійкого до фосфінотрицину
рослинного матеріалу виділяли ДНК,
використовуючи ЦТАБ-метод [10].
Концентрацію та чистоту ДНК визначали
спектрофотометрично. Наявність гену bar в
рослинній ДНК визначали методом ПЛР,
використовуючи праймери: форвардний 5’-ACA
TCG AGA CAA GCA CGG TC-3’ та реверсний
5’-GCC AGA AAC CCA CGT CAT GC-3’.
Довжина очікуваного фрагменту була 411 п.н.
Умови ампліфікації були: денатурація 94°С/4 хв;
32 циклі ампліфікації (денатурація 94°С/30 с,
відпал 59°С/30 с, синтез 72°С/30 с); заключний
синтез 72°С/5 хв. В якості позитивного
контролю використовувалась загальна ДНК вже
трансформованої рослини. Продукти реакції
фракціонували в 1 % агарозному гелі з
бромистим етидієм (0,5 мкг/мл) у трис-боратній
буферній системі при 8 В/см протягом 90 хв.
Результати та обговорення
Було проведено три серії експериментів з
біолістичної трансформації незрілих зародків 21
генотипу кукурудзи при різних термінах
культивування від експлантації на живильне
середовище ізольованих зародків до проведення
біолістичної трансформації (DIC) (табл.). У
дослідах використовували вектор pAHC25.
114
Таблиця. Біолістічна трансформація незрілих зародків кукурудзи
Gus-забарвлення
Генотип Кількість
пострілів DIC* Кількість
регенерантів
Калюс,
кількість
зародків
Листки,
кількість
регенерантів
PLS61 3 7 2 - -
PLS61 2 9 45 - 6
RS15 5 12 1 - -
ПРЖ5 2 8 1 - -
ПРЖ5 2 16 0 1 -
P205 8 12 0 - -
ДК744 3 13 0 - -
ДК959 4 7 0 - -
КС277 4 4 0 - -
KG232 4 9 0 - -
PLS61♀×KG232♂ 2 9 1 - -
PLS61♀×KG232♂ 4 10 0 1 -
PLS61♀×P205♂ 4 8 0 - -
PLS61♀×ДК744♂ 2 7 0 - -
PLS61♀×ДК744♂ 4 9 3 1 -
PLS61♀×ДК959♂ 2 5 0 - -
PLS61♀×КП7♂ 1 14 3 - -
PLS61♀×ПРЖ5♂ 2 15 4 - -
ДК959♀×PLS61♂ 6 9 6 5 1
KG232♀×PLS61♂ 2 11 0 - -
ПРЖ5♀×PLS61♂ 2 2 0 - -
ДК744♀×PLS61♂ 2 3 0 - -
с.в. ДК304♀×PLS61♂ 2 5 1 - -
с.в. ДК304♀×PLS61♂ 2 15 0 - -
с.в.PLS61♀×ДК304♂ 3 7 1 1 1
с.в.PLS61♀×ДК304♂ 3 14 12 1 -
с.в. ДК675♀×Chi31♂ 2 13 3 3 -
Загалом 82 82 13 8
Примітка: *DIC (days in culture) – кількість діб від експлантації незрілих зародків на середовище для
калюсогенезу до проведення біолістичної обробки; с.в. – сомаклональний варіант.
Через 4 доби після обстрілу проводили
гістохімічний аналіз транзієнтної експресії гену
β-глюкуронідази в калюсних тканинах. За
інтенсивністю блакитного забарвлення
найкраще в експериментах з біолістичної
трансформації себе показали наступні генотипи
кукурудзи: інбредні лінії PLS61 і КС277 та
гібриди F1 ДК959♀×PLS61♂, PLS61♀×ДК959♂,
PLS61♀×ПРЖ5♂, PLS61♀×КП7♂.
Через 1,5–2 місяці після трансформації
спостерігали регенерацію пагонів на
селективному середовищі для різних генотипів
кукурудзи (рис. 1, табл.).
Пагони регенерованих рослин
відокремлювали від калюсу та садили в банки з
селективним середовищем. Більшість рослин-
регенерантів були чутливі до гербіциду, тоді як
решта укорінювались та залишались зеленими
на селективному середовищі. Паралельно
проводили гістохімічний аналіз на присутність
експресії гена uidA для частини рослинного
матеріалу (листочки рослин-регенрантів і
калюс) стійкого до фосфінотрицину.
Гістохімічне фарбування на присутність
β-глюкуронідази показало, що синє забарвлення
спостерігалось не по всій тканині, а на окремих
ділянках, що може свідчити, або про
замовчування експресії гену uidA в окремих
ділянках, або про химерність одержаного
рослинного матеріалу.
Стійкий до фосфінотрицину калюс та
листки рослин-регенерантів використовували
115
для виділення загальної ДНК. Рослинну ДНК
аналізували методом ПЛР на наявність
послідовності трансгена bar. Аналіз методом
ПЛР показав присутність гена bar в рослинній
ДНК стійкого до фосфінотрицину калюсу
кукурудзи, який виявляв блакитне забарвлення
при гістохімічному аналізі, а також для 6 ліній
рослин-регенерантів (рис. 2). Результати ПЛР
свідчать про трансгенну природу одержаного
рослинного матеріалу.
Цікаво, що у нашому дослідженні
спостерігаться певна кореляція між рівнями
транзієнтної експресії β-глюкуронідази для
різних генотипів кукурудзи і результатами зі
стабільної трансформації, що може бути
використано для швидкого відбору
компетентних для трансформації генотипів
кукурудзи.
В експериментах з генетичної біолістичної
трансформації ми використовували незрілі
зародки кукурудзи, які до обстрілу перебували
на середовищі для калюсогенезу від 2 до 16 діб
(табл. 1). Найкращим для трансформації
рослинним матеріалом були незрілі зародки з
калусами, які до обстрілу культивувалися 9 діб.
У проведених експериментах по отриманню
стабільних трансформантів кукурудзи методом
біолістичної трансформації серед 21 генотипу
найкраще себе показали інбредна лінія PLS61 та
гібриди F1 PLS61♀×ДК744♂, PLS61♀×ДК304♂ і
ДК959♀×PLS61♂.
Рис. 1. Регенерація на селективному середовищі пагонів кукурудзи лінії PLS61 (ліворуч) та
гібриду F1 PLS61♀×ДК744♂ (праворуч)
Рис. 2. ПЛР-аналіз на наявність гена bar в рослинному матеріалі кукурудзи за допомогою
праймерів bar1f1 та bar1r2. Доріжка 1 – ДК959♀×PLS61♂ (к., л. 3); 2 – PLS61♀×ДК959♂ (к., л. 6);
3 – ДК959♀×PLS61♂ (к., л. 1); 4 – PLS61 (р., л. 17); 5 – PLS61♀×ДК744♂ (р., л. 2);
6 – PLS61♀×ПРЖ5♂ (к., л. 1); 7 – PLS61 (р., л. 2); 8 – PLS61 (к., л. 3); 9 – PLS61 (к., л. 7); 10 – PLS61
(р., л. 1); 11 – PLS61♀ЧДК304♂ (р., л. 7); 12 – PLS61♀ЧДК304♂ (р., л. 6); 13 – позитивний контроль;
14 – без ДНК; 15 – маркер молекулярної маси DNA Ladder Mix; 16 – нетрансформована PLS61,
негативний контроль; 17 – PLS61 (р., л. 8-1); 18 – PLS61♀×ДК744♂ (р., л. 3). Довжина очікуваного
фрагменту – 411 п.н. Скорочення: к – калюс; р – рослина; л. – лінія
116
Висновки
В результаті проведених експериментів з
біолистичної трансформації вектором pAHC25
були отримані стійкі до фосфінотрицину
калюсні лінії і рослини-регенеранти, у яких
виявляли активність фермента β-глюкуронідази.
Аналіз методом ПЛР показав присутність гена
bar у рослинній ДНК стійких до фосфі-
нотрицину калюсних ліній та 6 ліній рослин-
регенерантів. Наявність гена bar у рослинній
ДНК свідчить про трансгенну природу
одержаного рослинного матеріалу. Серед 21
генотипу кукурудзи, які створені та вирощу-
ються на території України, були відібрані
4 генотипи найбільш компетентні для біоліс-
тичної трансформації.
Робота проводилася в рамках науково-
технічного проекту «Отримання та вивчення
молекулярно-біологічних і генетичних
особливостей стійких до гербіцидів
сільськогосподарсько важливих культур»
цільової комплексної міждисциплінарної
програми наукових досліджень НАН України
«Фундаментальні основи молекулярних та
клітинних біотехнологій» номер
держреєстрації 0110U006082.
Література
1. ISAAA Brief 46-2013: Executive Summary. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2013.
2. EU Register of Authorised GMOs [Електронний ресурс] // Regulation EC 1829/2003 – 2014. – Режим доступу:
http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm
3. Sidorov V.A. Plant tissue culture in biotechnology: recent advances in transformation through somatic
embryogenesis // Biochemistry and Biotechnology for Modern Medicine. Edited by S. Komisarenko. – K.:
Publishing House Moskalenko O.M., NAS of Ukraine, Kyiv – 2013. – 704 p.
4. Shou H., Frame B., Whitham S., Wang K. Assessment of transgenic maize event produced by particle
bombardment or Agrobacterium-mediated transformation // Mol. Breed. – 2004. – 13. – P. 201–208.
5. Нітовська І.О., Дуплій В.П., Рудас В.А., Абраїмова О.Є., Сатарова Т.М., Моргун Б.В. Оптимізація умов
трансформації калюсних ліній кукурудзи за допомогою детекції транзієнтної експресії гена бета-
глюкуронідази // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: збірник наукових праць IX
з’їзду УТГіС. – Київ: Логос. – 2012. – 4. – С. 587–592.
6. Christensen A.H., Quail P.H. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or
screenable marker genes in monocotyledonous plants // Transgenic Research. – 1996. – 5. – P. 213–218.
7. Василенко М.Ю., Кучук М.М., Овчаренко О.О., Кучук М.В. Отримання транспластомних рослин Nicotiana
bethamiana із генами мікобактерії (Mycobacterium tubertulosis) // Фактори експериментальної еволюції
організмів. – 2010. – 9. – C. 224–229.
8. Murashige T., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol.
Plant. – 1962. – 15. – P. 473–497.
9. Jefferson R.A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system // Plant Mol. Biol. Rep. – 1987. – 5.
– P. 387–405.
10. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство / Под ред. Дрейпер Дж. и др. – М.: Мир, 1991. –
408 с.
NITOVSKA І.О. 1, АBRAIMOVA О.YE. 2, SATAROVA Т.М. 2, SHAKHOVSKY А.М. 1,
МОRGUN В.V. 1
1 Institute of Cell Biology and Genetics Engineering of Nat. Acad. Sci. of Ukraine,
Ukraine, 03680, Kyiv, Akademika Zabolotnogo str., 148, е-mail: molgen@icbge.org.ua
2 State Enterprise Institute of Agriculture of Steppe Zone of NAAS of Ukraine,
Ukraine, 49600, Dnipropetrovsk, Dzerzhynskij str., 14
BIOLISTIC TRANSFORMATION OF IMMATURE MAIZE EMBRYOS
Aims. Maize (Zea mays L.) is one of the most economically important crops which were considerably
improved by modern biotechnology. For efficient production of transgenic maize, immature embryos and
two transformation techniques for transgenes delivery (Agrobacterium-mediated transformation and particle
bombardment) were employed. However, genetic transformation is genotype dependent and is not routine
procedure. Thus, the aim of the current studies was to carry out the biolistic transformation of immature
maize embryos for commercial genotypes propagated in fields, and to prove their competence for genetic
transformation. Methods. Particle bombardment of immature maize embryos for 21 commercial genotypes
using pAHC25 vector was carried out. Histochemical analysis of the phosphinothricin resistant plant
material for the presence of β-glucuronidase was performed. Plant DNA was analyzed for the presence of
bar gene by PCR method. Results. Following particle bombardment, phosphinothricin resistant calli and
117
plant regenerants were obtained. Histochemical analysis showed the presence of в-glucuronidase in the
obtained plant material. PCR analysis proved the presence of bar gene in plant DNA of the phosphinothricin
resistant calli and 6 regenerant lines. Out of 21 maize genotypes, inbred line PLS61 and hybrids F1
PLS61♀×ДК744♂, PLS61♀×ДК304♂, and ДК959♀×PLS61♂ were the most competent for biolistic
transformation. Conclusions. After biolistic transformation of immature maize embryos with pAHC25
vector, phosphinothricin resistant calli and plant regenerant lines containing β-glucuronidase have been
obtained. The presence of bar gene detected by PCR method indicated the transgenic nature of the obtained
plant material. Four most responsive for the biolistic transformation genotypes were selected from 21
commercial lines and hybrids grown in Ukraine.
Key words: Zea mays L., particle bombardment, β-glucuronidase, bar gene, GMO.
УДК 668.52:668.53:61
ПАДАЛКО С.Ф., КАМЕНЧУК О.П., БОБИК Л.В.
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
Україна, 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17, e-mail: kurchii@mail.ru
КОМПОНЕНТНИЙ СКЛАД І БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ ЕКСТРАКТІВ ГРИБА
ACREMONIUM SPP.
Серед нових видів природних субстратів
важливе місце займають препарати
вермикомпости (біогумуси), які містять гумінові
та фульвокислоти, макро- та мікро-елементи і
позитивно впливають на ростові процеси
сільськогосподарських культур [1]. До того ж
макро- і мікро-елементи в біогумусах
знаходяться в невеликих кількостях. Цей факт
зумовлює недостатню ефективність
використання вермикомпосту та перегною на
збіднених грунтах, тому включення до складу
препаратів мікроелементів має суттєво
підвищити їх ефективність. Серед недоліків
зареєстрованих в Україні препаратів, створених
на основі вермикомпомту, можна назвати їх
низькі експлуатаційні властивості, пов’язані із
значними транспортними витратами та
термінами зберігання, обумовленими високими
нормами витрат на одиницю площі (12–15 л на 1
га), або маси насіння (15 л на 1 т), що
обробляється [2].
Матеріал і методи
Проведено аналіз вмісту біологічно
активних речовин в культуральних середовищах
гриба Acremonium spp. Тест на цитокініни
здійснено на сім’ядольних листках 8-денних
проростків огірка сорту Ніжинський. Насіння
огірка пророщували розділенням сім’ядолей.
Сім’ядолі по 10 листків ставили в чашки з
досліджуваним розчином на 24 години. Тест на
ауксини здійснено на колеоптилях пшениці
Альбатрос одеський 1,5 см довжиною, вирізали
середину і ставили в розчини на 24 години. Тест
на гібереліни проведено на проростках огірків
пророщували, відбирали гіпокотилі довжиною
0,5–1,0 см. По 10 рослин ставили в чашки з
досліджуваним розчином в термостат при Т
22 °С на 24 години.
Гриб Acremonium spp. вирощували
протягом 21 доби при кімнатній температурі в
скляних флаконах (матрацах) при 12-ти
годинному світловому режимі (4 люмінесцентні
лампи по 40 вт) в рідкому культуральному
середовищі наступного складу (мг/1 л
середовища): K2HPO4 – 600, KH2PO4 –1800,
MgSO4 – 400, K2SO4 – 200, FeSO4 – 4, MnSO4 – 4,
Asparagin – 0,02, KJ – 0,02, Vitamin B1 – 1,
Vitamin B6 – 2, Vitamin PP – 2, MES 2260 – 4520,
D-inositol – 100, D-glucose – 16, Pectin – 2000,
Gibberellic acid – 0,003, KOH, 5M – 3 краплі.
Екстракцію речовин із міцелію гриба (10 г
сирої речовини) проводили трічі 80 %-ним
етиловим спиртом і зберігали в холодильнику
при 4 °С – (базовий екстракт із міцелію гриба
Acremonium spp., БЕА).
Результати та обговорення
Цитокінінову активність екстрактів
міцелію гриба Acremonium spp., яку визначили
за допомогою тестів на сім’ядольних листках 8-
денних проростків огірка сорту Ніжинський,
представлено в таблиці 1.
Таким чином, найвищу ефективність
проявив нерозведене середовище культивування
міцелію гриба.
Проведено аналіз вмісту ауксинів в
культуральних середовищах гриба
Acremonium spp. (табл. 2).
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-178271 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2219-3782 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:12:15Z |
| publishDate | 2014 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Нітовська, І.О. Абраїмова, О.Є. Сатарова, Т.М. Шаховський, А.М. Моргун, Б.В. 2021-02-18T12:29:08Z 2021-02-18T12:29:08Z 2014 Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи / І.О. Нітовська, О.Є. Абраїмова, Т.М. Сатарова, А.М. Шаховський, Б.В. Моргун // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2014. — Т. 15. — С. 112-117. — Бібліогр.: 10 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178271 604.6:633.15 Aims. Maize (Zea mays L.) is one of the most economically important crops which were considerably improved by modern biotechnology. For efficient production of transgenic maize, immature embryos and two transformation techniques for transgenes delivery (Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment) were employed. However, genetic transformation is genotype dependent and is not routine procedure. Thus, the aim of the current studies was to carry out the biolistic transformation of immature maize embryos for commercial genotypes propagated in fields, and to prove their competence for genetic transformation. Methods. Particle bombardment of immature maize embryos for 21 commercial genotypes using pAHC25 vector was carried out. Histochemical analysis of the phosphinothricin resistant plant material for the presence of β-glucuronidase was performed. Plant DNA was analyzed for the presence of bar gene by PCR method. Results. Following particle bombardment, phosphinothricin resistant calli and plant regenerants were obtained. Histochemical analysis showed the presence of β-glucuronidase in the obtained plant material. PCR analysis proved the presence of bar gene in plant DNA of the phosphinothricin resistant calli and 6 regenerant lines. Out of 21 maize genotypes, inbred line PLS61 and hybrids F₁ PLS61♀×ДК744♂, PLS61♀×ДК304♂, and ДК959♀×PLS61♂ were the most competent for biolistic transformation. Conclusions. After biolistic transformation of immature maize embryos with pAHC25 vector, phosphinothricin resistant calli and plant regenerant lines containing β-glucuronidase have been obtained. The presence of bar gene detected by PCR method indicated the transgenic nature of the obtained plant material. Four most responsive for the biolistic transformation genotypes were selected from 21 commercial lines and hybrids grown in Ukraine.
 
 Key words: Zea mays L., particle bombardment, β-glucuronidase, bar gene, GMO. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Клітинні, генні та молекулярні біотехнології Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи Biolistic transformation of immature maize embryos Article published earlier |
| spellingShingle | Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи Нітовська, І.О. Абраїмова, О.Є. Сатарова, Т.М. Шаховський, А.М. Моргун, Б.В. Клітинні, генні та молекулярні біотехнології |
| title | Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи |
| title_alt | Biolistic transformation of immature maize embryos |
| title_full | Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи |
| title_fullStr | Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи |
| title_full_unstemmed | Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи |
| title_short | Біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи |
| title_sort | біолістична трансформація незрілих зародків кукурудзи |
| topic | Клітинні, генні та молекулярні біотехнології |
| topic_facet | Клітинні, генні та молекулярні біотехнології |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178271 |
| work_keys_str_mv | AT nítovsʹkaío bíolístičnatransformacíânezrílihzarodkívkukurudzi AT abraímovaoê bíolístičnatransformacíânezrílihzarodkívkukurudzi AT satarovatm bíolístičnatransformacíânezrílihzarodkívkukurudzi AT šahovsʹkiiam bíolístičnatransformacíânezrílihzarodkívkukurudzi AT morgunbv bíolístičnatransformacíânezrílihzarodkívkukurudzi AT nítovsʹkaío biolistictransformationofimmaturemaizeembryos AT abraímovaoê biolistictransformationofimmaturemaizeembryos AT satarovatm biolistictransformationofimmaturemaizeembryos AT šahovsʹkiiam biolistictransformationofimmaturemaizeembryos AT morgunbv biolistictransformationofimmaturemaizeembryos |