Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii
Розроблено систему генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у Р. guilliermondii. Вірогідно, клонований фрагмент гена HEM12 викликає зростання частоти інтеграції рекомбінантних плазмід у певні локуси геному реципієнта, що призводить до появи прототрофних...
Saved in:
| Published in: | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Date: | 2008 |
| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178300 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii / В.І. Куцяба, Ю.В. Пиняга, Ю.Р. Борецький, М.В. Гончар, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 331-335. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-178300 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Куцяба, В.І. Пиняга, Ю.В. Борецький, Ю.Р. Гончар, М.В. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. 2021-02-18T13:55:11Z 2021-02-18T13:55:11Z 2008 Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii / В.І. Куцяба, Ю.В. Пиняга, Ю.Р. Борецький, М.В. Гончар, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 331-335. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178300 Розроблено систему генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у Р. guilliermondii. Вірогідно, клонований фрагмент гена HEM12 викликає зростання частоти інтеграції рекомбінантних плазмід у певні локуси геному реципієнта, що призводить до появи прототрофних за рибофлавіном інсерційних мутантів внаслідок супресії дії мутації rib83-6. Разработана система генетической трансформации для идентификации регуляторных генов биосинтеза рибофлавина у Р. guilliermondii. Вероятно, клонированный фрагмент гена HEM12 повышает частоту интеграции рекомбинантных плазмид в определённые локусы генома реципиента, что вызывает возникновение прототрофных по рибофлавину инсерционных мутантов вследствие супрессии действия мутации rib83-6. Transformation system for cloning of regulatory genes of riboflavin biosynthesis was designed. Probably, the cloned DNA fragment which contains the part of P.guilliermondii gene HEM12 integrates into some loci of the recipient strain genome. It leads to riboflavin prototrophy of the insertional mutants as a result of suppression of the rib 83-6 mutation. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Біотехнології в медицині і сільському господарстві Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii |
| spellingShingle |
Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii Куцяба, В.І. Пиняга, Ю.В. Борецький, Ю.Р. Гончар, М.В. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| title_short |
Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii |
| title_full |
Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii |
| title_fullStr |
Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii |
| title_full_unstemmed |
Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii |
| title_sort |
розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів рichia guilliermondii |
| author |
Куцяба, В.І. Пиняга, Ю.В. Борецький, Ю.Р. Гончар, М.В. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. |
| author_facet |
Куцяба, В.І. Пиняга, Ю.В. Борецький, Ю.Р. Гончар, М.В. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. |
| topic |
Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| topic_facet |
Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| publishDate |
2008 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Фактори експериментальної еволюції організмів |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| description |
Розроблено систему генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних
генів біосинтезу рибофлавіну у Р. guilliermondii. Вірогідно, клонований фрагмент гена
HEM12 викликає зростання частоти інтеграції рекомбінантних плазмід у певні локуси
геному реципієнта, що призводить до появи прототрофних за рибофлавіном
інсерційних мутантів внаслідок супресії дії мутації rib83-6.
Разработана система генетической трансформации для идентификации
регуляторных генов биосинтеза рибофлавина у Р. guilliermondii. Вероятно,
клонированный фрагмент гена HEM12 повышает частоту интеграции рекомбинантных
плазмид в определённые локусы генома реципиента, что вызывает возникновение
прототрофных по рибофлавину инсерционных мутантов вследствие супрессии
действия мутации rib83-6.
Transformation system for cloning of regulatory genes of riboflavin biosynthesis was
designed. Probably, the cloned DNA fragment which contains the part of P.guilliermondii
gene HEM12 integrates into some loci of the recipient strain genome. It leads to riboflavin
prototrophy of the insertional mutants as a result of suppression of the rib 83-6 mutation.
|
| issn |
2219-3782 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178300 |
| citation_txt |
Розробка системи генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Рichia guilliermondii / В.І. Куцяба, Ю.В. Пиняга, Ю.Р. Борецький, М.В. Гончар, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 331-335. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT kucâbaví rozrobkasistemigenetičnoítransformacíídlâídentifíkacííregulâtornihgenívbíosintezuriboflavínuudríždžívrichiaguilliermondii AT pinâgaûv rozrobkasistemigenetičnoítransformacíídlâídentifíkacííregulâtornihgenívbíosintezuriboflavínuudríždžívrichiaguilliermondii AT borecʹkiiûr rozrobkasistemigenetičnoítransformacíídlâídentifíkacííregulâtornihgenívbíosintezuriboflavínuudríždžívrichiaguilliermondii AT gončarmv rozrobkasistemigenetičnoítransformacíídlâídentifíkacííregulâtornihgenívbíosintezuriboflavínuudríždžívrichiaguilliermondii AT fedorovičdv rozrobkasistemigenetičnoítransformacíídlâídentifíkacííregulâtornihgenívbíosintezuriboflavínuudríždžívrichiaguilliermondii AT sibírniiaa rozrobkasistemigenetičnoítransformacíídlâídentifíkacííregulâtornihgenívbíosintezuriboflavínuudríždžívrichiaguilliermondii |
| first_indexed |
2025-11-25T21:29:35Z |
| last_indexed |
2025-11-25T21:29:35Z |
| _version_ |
1850558094458748928 |
| fulltext |
331
6. Androgenesis and haploid plants. – Berlin, Heidelberg, New York. – 1998. – 297p.
7. Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б. Методические рекомендации по использованию
морфогенетического потенциала пыльника в биотехнологических исследованиях
яровой мягкой пшеницы. – Уфа – 2002. – 22с.
8. Круглова Н.Н., Егорова О.В., Сельдимирова О.А. Световой микроскоп как
инструмент в биотехнологии растений – Уфа. – 2008. – 122с.
9. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. Иммуноферментное определение
содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием
меченых антител // Физиол. раст. – 1986. – Т. 33, № 6. – С.1221-1227.
10. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н. Иммуноферментная тест-система для
определения цитокининов // Физиол. Раст. – 1989. – Т. 37, № 1. – С. 80-89.
11. Веселов С.Ю., Вальке Р.С., Ван Онкелен Х., Кудоярова Г.Р. Содержание и
локализация цитокининов в листьях исходных и трансгенных растений табака //
Физиол. Раст. – 1999. – Т. 46, № 1. – С.34-40.
12. Камелина О.П., Проскурина О.Б., Жинкина Н.А. К методике окраски
эмбриологических препаратов // Ботан. журн. – 1992. – Т. 77, № 4. – С.93-96.
13. Круглова Н.Н. Периодизация развития пыльника злаков как методологический
аспект изучения андрогенеза in vitro // Известия РАН. Серия биол. – 1999. – № 3. –
С.275-281.
14. Куперман Ф.М. Морфофизиология растений. – М. – 1977. – 256 с.
15. Chuang Ch.-Ch., Ouyang T.-W. A set of potato media for wheat anther culture // Proc.
Sympos. Plant Tissue Culture. – Peking – 1978. – P.51-56.
16. Blaydes D.F. Interaction of kinetin and varioris inhibitors in the growth of soybean //
Physiol. Plant. – 1966. – V. 19, № 13. – P.748-753.
Резюме
Приводятся и анализируются основные этапы биотехнологии андроклинной
гаплоидии у яровой мягкой пшеницы. Биотехнология оптимизирована на основе
использования комплексных цитоэмбриологических и физиологических исследований.
The main stages of biotechnology of androclinic haploidy of spring soft wheat are
resulted and analyzed. The biotechnology is optimized on the basis of employment of
complex cytoembryological and physiological investigations.
КУЦЯБА В.І., ПИНЯГА Ю.В., БОРЕЦЬКИЙ Ю.Р., ГОНЧАР М.В., ФЕДОРОВИЧ
Д.В., СИБІРНИЙ А.А.
Інститут біології клітини НАН України
Україна, 79005, м. Львів, вул. Драгоманова 14/16, e-mail: vasylkutsiaba@yahoo.com
РОЗРОБКА СИСТЕМИ ГЕНЕТИЧНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ ДЛЯ
ІДЕНТИФІКАЦІЇ РЕГУЛЯТОРНИХ ГЕНІВ БІОСИНТЕЗУ РИБОФЛАВІНУ У
ДРІЖДЖІВ РICHIA GUILLIERMONDII
Клонування регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну (РФ) флавіногенних
дріжджів Рichia guilliermondii є важливим етапом при дослідженні молекулярних
механізмів регуляції цього процесу, а також є основою для робіт у галузі метаболічної
інженерії – конструюванні надсинтетиків РФ нового покоління. Відома нуклеотидна
послідовність геному цих дріжджів не завжди дозволяє клонувати регуляторні гени
біосинтезу РФ за допомогою методу інcерційного мутагенезу, тому залишається
актуальною розробка ефективних систем для клонування таких генів методом
функціональної комплементації.
332
У 1991 році у дріжджів Р. guilliermondii було описано мутацію rib1-86 (C207Y)
[1], яка майже повністю інактивує перший фермент флавіногенезу – ГТФ-
циклогідролазу II, викликаючи у дріжджів ауксотрофність за РФ у середовищі з
оптимальним для росту вмістом заліза, але не у залізодефіцитному середовищі, коли
відбувається дерепресія синтезу цього фермента. Вірогідно, виділений мутант rib1-86 є
брадітрофним (leaky) мутантом по гену RIB1. Мутація rib81-131 у регуляторному гені
біосинтезу РФ негативного типу дії, подібно до залізодефіцитних умов вирощування
дріжджів, викликає дерепресію синтезу ГТФ-циклогідролази II внаслідок посиленої
експресії гена RIB1, що було показано за допомогою Нозерн блот-гібридизації [2], тому
подвійні мутанти rib1-86 rib81 є прототрофами за РФ.
Мутація rib83-6, яка пошкоджує неідентифікований регуляторний ген
позитивного типу дії, епістатує над мутацією rib81-131 [3], тому сконструйований
потрійний мутант генотипу rib1-86 rib81 rib83 виявився ауксотрофом за РФ [4]. Таким
чином, мутація rib83-6 повністю виключає дію мутації rib81-131, тому введення гена
RIB83 у складі плазмід у клітини такого потрійного мутанта буде приводити до
відновлення дії мутації rib81-131 і, як наслідок, до появи прототрофних за РФ клонів.
Таким чином, потрійний мутант як реципієнт міг би стати основою системи для
клонування регуляторного гена RIB83 з бібліотеки генів Р. guilliermondii шляхом
позитивної селекції прототрофних за РФ трансформантів.
Матеріали і методи
У роботі було використано такі штами дріжджів Р. guilliermondii: АТСС 9058 –
дикий тип, мутанти з пошкодженою регуляцією біосинтезу РФ 18-Д78/2 hisX rib81
MAT-, 3-Д93/8 argX rib81 MAT+, 32-Д93/8 argX rib81 MAT-, 2-Д82/1 lysX rib83 MAT+;
LV160 rib1-86 MAT+ - РФ-залежний мутант. Бактерійний штам E. coli DH5α lacZ∆M15,
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk
-, mk
+), supE44, relA1, deoR, ∆(lacZYA-argF)U169)
використовувався для селекції та ампліфікації плазмід.
Склад середовищ і умови вирощування дріжджів, методи генетичного аналізу
описані у [5,6]. Біомасу дріжджів визначали на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М.
Концентрацію флавінів – флуорометрично на приладі ЕФ-3М. Усі генно-інженерні
маніпуляції проводили відповідно до [7].
Результати та обговореня
Першим етапом цієї роботи було конструювання стабільного штама-реципієнта
генотипу rib1-86 rib81 rib83, який міг би зберігати фенотип Rib- протягом 10 - 12 днів.
Такий час є достатнім для відбору трансформантів на селективному середовищі і
виділення з них реплікативних плазмід. Для того, щоб сумістити мутації rib1-86 і rib81-
131 в одному гаплоїдному геномі, схрестили мутант 18-Д78/2 hisX rib81 MAT- з
штамом LV160 rib1-86 MAT+. У отриманого диплоїда Д93/13 індукували мейоз,
виділили мейотичні сегреганти і у проторофних за РФ і нездатних до його надсинтезу
представників перевіряли наявність мутації rib81-131. Для цього їх схрестили з
мутантами 3-Д93/8 argX rib81-131 MAT+ і 32-Д93/8 argX rib81-131 MAT- і у отриманих
диплоїдів досліджували флавіногенез. Надсинтез РФ у диплоїдів свідчив про наявність
у сегрегантів мутації rib81-131, а також генотипу rib1-86 rib81. Було виділено колекцію
таких сегрегантів. Сегрегант 29-Д93/13, який нагромаджував велику біомасу і не
втратив здатності до схрещування, був використаний для конструювання потрійного
мутанта. Після схрещування його з штамом 2-Д82/1 lysX rib83-6 MAT+ з отриманого
диплоїда Д93/73 виділили ауксотрофні за РФ мейотичні сегреганти і схрестили їх з
мутантами rib81 і rib83. Висока флавіногенна активність першого диплоїда у
середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза і відсутність надсинтезу РФ у
залізодефіцитному середовищі другого диплоїда свідчила про наявність у
досліджуваного сегреганта генотипу rib1-86 rib81 rib83.
Сегреганти генотипу rib1-86 rib81 rib83 були нестабільними і легко ревертували
до фенотипу Rib+. На поверхні штрихів сегрегантів на агаризованому YPD через 10 –
333
14 днів зберігання виростала велика кількість „бородавок” - прототрофних за РФ
клонів, але деякі з сегрегантів були значно стабільнішими. На поверхні їх штрихів
виростало лише 2 – 3 „бородавки”. Один з таких сегрегантів (12-Д93/73), який також
ріс на середовищі YPD з РФ краще, ніж інші сегреганти, було відібрано як реципієнт
для клонування гена RIB83. Висівання на чашки з YPD 2 · 107 клітин (як при
стандартній методиці клонування) не приводило до появи підросту і спонтанних
ревертантів через 10 днів інкубації при 30 0С.
Ефективність трансформації реципієнта досліджували за допомогою плазміди
p19R1, яка містить ген RIB1 Р. guilliermondii. Трансформацію реципієнта проводили
методом електропорації. Ефективність цього методу була вищою, ніж у випадку
використання хлористого літію. Підібрано такі оптимальні параметри
електротрансформації: кювета 1 мм, 40 мкл суспензії клітин реципієнта 100 од. опт.
густ. з 0,5 – 2 мкг плазмідної ДНК, опір – 200 Ом, ємність – 25 мкФ, напруга – 1,8 кВ.
Після трансформації клітини висівали на агаризоване середовище YPD без РФ, яке
містило 0,3 М сахарозу. При дотриманні цих параметрів частота трансформації
реципієнта становила до 104 трансф./мкг плазмідної ДНК. Ефективність трансформації
зростала майже у 2 рази після обробки клітин Li-ацетатом на початкових етапах
приготування компетентних клітин. Після трансформації реципієнта ревертанти на
контрольних чашках з’являлися лише через 10 днів.
Наступним етапом роботи стало створення геномної бібліотеки штама Р.
guilliermondii АТСС 9058 на основі бірепліконного (Р. guilliermondii/E. coli) вектора
рUC-ARS, який є похідним від pUC19. Бактерійна частина вектора рUC-ARS містить
ген резистентності до ампіциліну, що кодує фермент β-лактамазу, реплікатор E. сoli
(ori), а дріжджова частина представлена ARS-елементом Р. guilliermondii у складі
HincII фрагмента розміром 0,82 т.п.н., який забезпечує реплікацію вектора у дріжджах.
Хромосомну ДНК Р. guilliermondii АТСС 9058 гідролізували за допомогою рестриктази
ЕсоRI. Отримані фрагменти ДНК лігували в ЕсоRI сайт вектора.
В результаті електротрансформації штама E. coli DH5α таким лігатом було
отримано понад 104 колоній ампіцилін-резистентних трансформантів. Ці колонії були
змиті стерильним середовищем LB, що містило ампіцилін. Отриману суспензію
підрощували і виділяли плазмідну ДНК. Таким чином було отримано геномну
бібліотеку штама Р. guilliermondii АТСС 9058.
За допомогою методу електропорації даною бібліотекою генів трансформували
реципієнтний штам Р. guilliermondii генотипу rib1-86 rib81 rib83. Було отримано 28
колоній прототрофних за РФ дріжджових трансформантів. З однієї з них виділили
плазміду (pN1), яка з невисокою ефективністю (10 трансф./мкг ДНК) трансформувала
реципієнт до прототрофності за РФ. Плазміда містила фрагмент ДНК Р. guilliermondii,
про що свідчила менша електрофоретична рухливість її порівняно з вихідним вектором
рUC-ARS (рис.1А). Було проведено рестрикційний аналіз плазмід рUC-ARS і pN1 за
допомогою ендонуклеаз рестрикції ЕсоRI і HincII (рис.1А). Рестрикційний аналіз
плазміди pN1 за допомогою рестриктази ЕсоRI показав, що вона розщеплюється на два
фрагменти: вихідний вектор рUC-ARS (3,5 т.п.н.) і фрагмент хромосомної ДНК Р.
guilliermondii, що несе, вірогідно, ген RIB83 або його супресор (1,7 т.п.н.).
Рестрикційний аналіз плазміди pN1 за допомогою рестриктази HincII підтвердив, що
вона, як і вихідний вектор, містить ARS елемент Р. guilliermondii (фрагмент ДНК 0,82
т.п.н.) і два додаткові HincII сайти, що знаходяться в клонованому фрагменті ДНК. На
основі цих результатів запропоновано схему плазміди pN1 (рис. 1Б).
334
Рис. 1. А - Електрофореграма плазмід pUC-ARS (3,5 т.п.н.) і pN1 (5,2 т.п.н.) та їх
рестрикційних фрагментів.
1 – нативна форма плазміди pUC-ARS; 2 – плазміда pUC-ARS, лінеаризована
ендонуклеазою рестрикції EcoRI; 3 – плазміда pUC-ARS, лінеаризована ендонуклеазою
рестрикції HincII; 4 і 8 – маркери молекулярної маси (GeneRulerTM 1 kb Ladder); 5 –
плазміда pN1, лінеаризована ендонуклеазою рестрикції HincII; 6 – плазміда pN1,
лінеаризована ендонуклеазою рестрикції EcoRI ; 7 - нативна форма плазміди pN1.)
Б - схема плазмід рUC-ARS і pN1 (фрагмент ДНК Р. guilliermondii, що несе
РgARS, позначено товстою чорною лінією; послідовність pUC19 – товстою білою
лінією; клонований фрагмент ДНК Р. guilliermondii– товстою сірою лінією.)
Аналіз нуклеотидної послідовності клонованого фрагмента ДНК показав, що він
містить дві неповні відкриті рамки трансляції генів HEM12 і амінопептидази Х з
невідомою функцією. Повні гени HEM12 та амінопептидази Х були клоновані у складі
реплікативних векторів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції,
використовуючи відповідні праймери. Була проведена трансформація реципієнта
даними плазмідами. Трансформанти були отримані лише у випадку плазмід із геном
HEM12 з такою ж частотою, як у випадку трансформації реципієнта плазмідою pN1.
Вірогідно, клонований фрагмент гена HEM12 і повний ген HEM12 викликають
зростання частоти інтеграції рекомбінантних плазмід у певні локуси геному реципієнта,
що призводить до появи прототрофних за РФ інсерційних мутантів внаслідок супресії
дії мутації rib83-6.
Висновки
1. Сконструйовано стабільний штам-реципієнт генотипу rib83 rib1-86 rib81,
придатний для клонування регуляторного гена біосинтезу РФ RIB83.
2. Підібрано оптимальні умови для трансформації реципієнта банком генів
дріжджів Р. guilliermondii методом електропорації.
3. З банку генів дріжджів Р. guilliermondii виділено плазміду, яка з частотою 10
трансф./мкг ДНК трансформує штам-реципієнт до прототрофності за РФ.
4. Аналіз нуклеотидної послідовності клонованого фрагмента виявив неповну
рамку трансляції гена HEM12. Трансформація реципієнта плазмідою із клонованим
нативним геном HEM12 не привела до зростання частоти появи прототрофних
трансформантів.
Література
1. Шавловский Г.М., Стенчук Н.Н., Кшановская Б.В. Влияние регуляторной мутации в
локусе RIB1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii. // Биополимеры и клетка.
– 1991. – 7. – С. 96-99.
1 2 3 4 5 6 7 8 А Б
335
2. Boretsky Y.R., Kapustyak K.E., Fayura L.R., Stasyk O.V., Stenchuk M.M., Bobak Y.P.,
Drobot L.B., Sybirny A.A. Positive selection of mutants defective in transcriptional repression
of riboflavin synthesis by iron in the flavinogenic yeast Pichia guilliermondii. // FEMS Yeast
Research. -2005. – 5. – Р. 829-837.
3. Шавловский Г.М., Колтун Л.В., Кшановская Б.В., Логвиненко Е.М., Стенчук Н.Н.
Регуляция биосинтеза рибофлавина элементами позитивного контроля у дрожжей
Pichia guilliermondii // Генетика. - 1989. - Т.25, №2. - С. 250-258.
4. Стенчук М.М., Кшановська Б.В., Куцяба В.І., Шавловський Г.М. Особливості
біосинтезу рибофлавіну у мутантів Pichia guilliermondii з пошкодженими генами
позитивного і негативного типу регуляції флавіногенезу. // Тези доп. VI Українського
біохімічного з’їзду. - Київ. - 1992. - Ч.1. - С. 52.
5. Шавловский Г.М., Жарова В.П., Щелокова И.Ф., Трач В.М., Сибірний А.А.,
Кшеминская Г.П. Флавиногенная активность природных штаммов дрожжей Pichia
guilliermondii. // Прикл. биохимия и микробиология. -1978. – т. 14., вып.2. – с. 184-189.
6. Сибирный А.А., Шавловский Г.М., Кшановская Б.В., Наумов Г.И. Гибридизация и
мейотическое расщепление у парафинусваивающих дрожжей Pichia guilliermondii
Wickerham // Генетика. – 1977. - Т.13, №2. – С. 314-321.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.
Молекулярное клонирование. - М., Мир. – 1984. - 480 с.
Резюме
Розроблено систему генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних
генів біосинтезу рибофлавіну у Р. guilliermondii. Вірогідно, клонований фрагмент гена
HEM12 викликає зростання частоти інтеграції рекомбінантних плазмід у певні локуси
геному реципієнта, що призводить до появи прототрофних за рибофлавіном
інсерційних мутантів внаслідок супресії дії мутації rib83-6.
Разработана система генетической трансформации для идентификации
регуляторных генов биосинтеза рибофлавина у Р. guilliermondii. Вероятно,
клонированный фрагмент гена HEM12 повышает частоту интеграции рекомбинантных
плазмид в определённые локусы генома реципиента, что вызывает возникновение
прототрофных по рибофлавину инсерционных мутантов вследствие супрессии
действия мутации rib83-6.
Transformation system for cloning of regulatory genes of riboflavin biosynthesis was
designed. Probably, the cloned DNA fragment which contains the part of P.guilliermondii
gene HEM12 integrates into some loci of the recipient strain genome. It leads to riboflavin
prototrophy of the insertional mutants as a result of suppression of the rib 83-6 mutation.
ЛУK’ЯНЧУК В.В.
Інститут мікробіології і вірусології НАН України,
Україна, Д03680, Київ, вул. акад. Заболотного, 154, e-mail: vitaly@serv.imv.kiev.ua
КЛОНУВАННЯ ПЛР-АМПЛІКОНА ХРОМОСОМИ Streptomyces coelicolor A3(2)
Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - це один з найсучасніших
методів прямого аналізу нуклеотидної послідовності ДНК. Цей метод дозволяє
накопичувати в значній кількості копії виключно бажаних фрагментів досліджуваної
ДНК. Метод ПЛР дозволяє визначати первинну будову ДНК незалежно від її джерела,
розміру молекули чи галузі призначення досліджень. Метод також є абсолютно
специфічним: має місце ампліфікації тільки чітко визначеної послідовності ДНК
|