Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2)
За допомогою ПЛР ампліфіковано фрагмент хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2), що містить ген синтезу PKS III. Проведено клонування ампліфікованої ДНК в човниковому векторі pWHM4 по сайтам HindIII та EcoRI. Базуючись на даних рестрикційного аналізу плазмідних ДНК трансформантів встановлено, що...
Saved in:
| Published in: | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Date: | 2008 |
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178302 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) / В.В. Луk’янчук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 335-338. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859733038111391744 |
|---|---|
| author | Луk’янчук, В.В. |
| author_facet | Луk’янчук, В.В. |
| citation_txt | Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) / В.В. Луk’янчук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 335-338. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Фактори експериментальної еволюції організмів |
| description | За допомогою ПЛР ампліфіковано фрагмент хромосоми Streptomyces coelicolor
A3(2), що містить ген синтезу PKS III. Проведено клонування ампліфікованої ДНК в
човниковому векторі pWHM4 по сайтам HindIII та EcoRI. Базуючись на даних
рестрикційного аналізу плазмідних ДНК трансформантів встановлено, що
молекулярний розмір проклонованого фрагмента ДНК становить 1129 пн.
С помощью ПЦР амплифицировано фрагмент хромосоми хромосоми
Streptomyces coelicolor A3(2), который содержал ген синтеза PKS III. Проведено
клонирование амплифицированной ДНК в челночном векторе pWHM4 в сайтах HindIII
та EcoRI. Основываясь на данных рестриционного анализа плазмидных ДНК
трансформантов, установлено, что молекулярный размер клонированного фрагмента
составляет 1129 пн.
Copies of chromosome Streptomyces coelicolor A3(2) fragment (gene of PKSIII
synthase) were obtained to use PLR. Amplificated DNA was cloned in shuttle vector pWHM4
on sites for HindIII and EcoRI. Restriction analysis of plasmid DNAs of transformantes
demonstrated that molecular sizes of cloning DNA insertions were 1129 b.
|
| first_indexed | 2025-12-01T14:24:15Z |
| format | Article |
| fulltext |
335
2. Boretsky Y.R., Kapustyak K.E., Fayura L.R., Stasyk O.V., Stenchuk M.M., Bobak Y.P.,
Drobot L.B., Sybirny A.A. Positive selection of mutants defective in transcriptional repression
of riboflavin synthesis by iron in the flavinogenic yeast Pichia guilliermondii. // FEMS Yeast
Research. -2005. – 5. – Р. 829-837.
3. Шавловский Г.М., Колтун Л.В., Кшановская Б.В., Логвиненко Е.М., Стенчук Н.Н.
Регуляция биосинтеза рибофлавина элементами позитивного контроля у дрожжей
Pichia guilliermondii // Генетика. - 1989. - Т.25, №2. - С. 250-258.
4. Стенчук М.М., Кшановська Б.В., Куцяба В.І., Шавловський Г.М. Особливості
біосинтезу рибофлавіну у мутантів Pichia guilliermondii з пошкодженими генами
позитивного і негативного типу регуляції флавіногенезу. // Тези доп. VI Українського
біохімічного з’їзду. - Київ. - 1992. - Ч.1. - С. 52.
5. Шавловский Г.М., Жарова В.П., Щелокова И.Ф., Трач В.М., Сибірний А.А.,
Кшеминская Г.П. Флавиногенная активность природных штаммов дрожжей Pichia
guilliermondii. // Прикл. биохимия и микробиология. -1978. – т. 14., вып.2. – с. 184-189.
6. Сибирный А.А., Шавловский Г.М., Кшановская Б.В., Наумов Г.И. Гибридизация и
мейотическое расщепление у парафинусваивающих дрожжей Pichia guilliermondii
Wickerham // Генетика. – 1977. - Т.13, №2. – С. 314-321.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.
Молекулярное клонирование. - М., Мир. – 1984. - 480 с.
Резюме
Розроблено систему генетичної трансформації для ідентифікації регуляторних
генів біосинтезу рибофлавіну у Р. guilliermondii. Вірогідно, клонований фрагмент гена
HEM12 викликає зростання частоти інтеграції рекомбінантних плазмід у певні локуси
геному реципієнта, що призводить до появи прототрофних за рибофлавіном
інсерційних мутантів внаслідок супресії дії мутації rib83-6.
Разработана система генетической трансформации для идентификации
регуляторных генов биосинтеза рибофлавина у Р. guilliermondii. Вероятно,
клонированный фрагмент гена HEM12 повышает частоту интеграции рекомбинантных
плазмид в определённые локусы генома реципиента, что вызывает возникновение
прототрофных по рибофлавину инсерционных мутантов вследствие супрессии
действия мутации rib83-6.
Transformation system for cloning of regulatory genes of riboflavin biosynthesis was
designed. Probably, the cloned DNA fragment which contains the part of P.guilliermondii
gene HEM12 integrates into some loci of the recipient strain genome. It leads to riboflavin
prototrophy of the insertional mutants as a result of suppression of the rib 83-6 mutation.
ЛУK’ЯНЧУК В.В.
Інститут мікробіології і вірусології НАН України,
Україна, Д03680, Київ, вул. акад. Заболотного, 154, e-mail: vitaly@serv.imv.kiev.ua
КЛОНУВАННЯ ПЛР-АМПЛІКОНА ХРОМОСОМИ Streptomyces coelicolor A3(2)
Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - це один з найсучасніших
методів прямого аналізу нуклеотидної послідовності ДНК. Цей метод дозволяє
накопичувати в значній кількості копії виключно бажаних фрагментів досліджуваної
ДНК. Метод ПЛР дозволяє визначати первинну будову ДНК незалежно від її джерела,
розміру молекули чи галузі призначення досліджень. Метод також є абсолютно
специфічним: має місце ампліфікації тільки чітко визначеної послідовності ДНК
336
Метод ПЛР суттєво доповнює існуючі морфологічні, біохімічні та генетичні
методи, а не заміняє чи витісняє їх з наукових досліджень. Крім простого збільшення
числа копій фрагмента ДНК, ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з
генетичним матеріалом і широко використовується в науковій діяльності, наприклад
для клонування генів, введення мутацій, сіквенування, виділення генів та інше [1, 2].
Матеріали і методи
В роботі використовувалися культури Streptomyces coelicolor A3(2) [2, 3] та
Escherichia coli XL tetR [5]. Вектором слугувала плазміда pWHM4 (6,6 тпн) [6]. В роботі
використовували середовища: соєве, S-середовище (рідкий варіанти), МПА та МПБ [3,
7]. Для селекції трансформантів та нарощуванні їх біомаси в середовища додавали
антибіотики ампіцилін (100 мкг/мл) та тетрациклін (25 мкг/мл).
Плазмідну ДНК виділяли за методом Кайзера [8]. Хромосому Streptomyces
coelicolor A3(2) виділяли, використовуючи рекомендації керівництва Маніатіса і
співавторів [9]. Гідроліз та лігування фрагментів ДНК проводили згідно з
рекомендаціями керівництва Маніатіса [9]. В експериментах по гідролізу та лігуванню
ДНК використовували ферменти та буфери фірми MBI “Fermentas” (Литва) [5].
Компетентні клітини Escherichia coli XL tetR отримували і трансформували
відповідно рекомендаціям Маніатіса [9].
Полімеразну ланцюгову реакцію проводили на ампліфікаторі Мastercycler
personal (“Еppendorf”, Німеччина). Застосований режим ПЛР: початкова денатурація -
950C - 120’’; 35 циклів: 960C - 20’’; 500C - 20’’; 700C - 240’’; заключна елонгація: 600C -
240’’. Реакційна суміш містила: 10mM TrisHCl (pH 8,0), 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 0.2
mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 ед Taq-полімерази, 30 рМ праймера, 10мкл
ДНК. Суміш нуклеотидів і Taq-полімеразу використовували фірми MBI “Fermentas”
(Литва) [5]. Послідовності праймерів наведені в таблиці 1.
Таблиця 1
Послідовності праймерів, що були використані в роботі:
Нуклеотидна будова праймерів Напрямок Ендонуклеаза
5'- CGCAAGCTTATGGCGACTTTGTGCAGAC -3' прямий HindIII
5'-CCGAATTCATGCCTGCCTCACCCTCCGC -3' зворотній EcoRI
Примітка: підкреслено послідовності сайтів рестрикції
Електрофоретичне розподілення ПЛР продуктів проводили в 1,5 % агарозному
гелі. Для визначення молекулярної маси отриманих продуктів ампліфікації
використовували маркер молекулярної ваги 100 bp DNA Ladder фірми “Promega”
(США).
Результати та обговорення
Мікроорганізми відомі своєю здатністю синтезувати багато полікетидних сполук, які
застосовуються в медицині і ветеринарії як антибіотичні, імуносупресорні та
антигельмінтні препарати. Вони синтезуються полікетидсинтазами і завершальними
ферментами (циклази, оксидази, кеторедуктази, глікозил-трансферази тощо)[10, 11].
Полікетидсинтази (PKS) відносяться до 3-х класів. Гени полікетидсинтаз і
завершальних ферментів зібрані на хромосомі у великі кластери. У геномі S. coelicolor
A3(2) виявлено послідовності для трьох типів PKS, одна із яких SCO 1206 кодує RppA-
подібну THN-синтазу (PKS третього типу) [4, 10, 11].
На базі інформації про нуклеотидну будову PKS ІІІ S. coelicolor A3(2) було
підібрано нуклеотидну будову пари праймерів (прямий та зворотній) для ПЛР [4].
Кожен олігонуклеотид містив по 19 чи 20 пн відповідної послідовності гена синтезу
PKS ІІІ S. coelicolor A3(2) та нуклеотидну послідовність сайту пізнавання для
відповідної ендонуклеази рестрикції. Клонування отриманих ПЛР-продуктів в складі
човникового вектора pWHM4 було вирішено провести по унікальним сайтам рестрикції
для EcoRI та HindIII, що знаходяться в полілінкерному фрагменті вектора pWHM4. В
337
склад прямого (F) праймера входить послідовність для HindIII, а до складу зворотнього
праймера (R) - сайт для EcoRI (таблиця 1).
ПЛР-продукти, отримані за допомогою ПЛР на цільовому фрагменті
досліджували електрофоретичним розподіленням в агарозному гелі. Було отримано
ПЛР-амплікони молекулярним розміром 1,145 тпн. Довжина була вирахована по даним
електрофоретичного розподілу ПЛР-продуктів та інформації про первинну будову
відповідного фрагменту хромосоми S. coelicolor A3(2) [4].
ПЛР-продукти і ДНК вектора pWHM4 обробляли ендонуклеазами ІІ типу EcoRI
і HindIII та проводили спільне лігування отриманих рестриктів. Лігованою сумішшю
трансформували компетентні клітини кишкової палички. Відбирали трансформанти
стійкі до ампіциліну та тетрацикліну. Стійкість до тетрацикліну детермінується
хромосомою реципієнта. Стійкість до 100 мкг/мл ампіциліна забезпечується генjм
вектора pWHM4.
Виділені з ряду АpR TetR трансформантів позахромосомні ДНК мали однаковий
молекулярний розмір. Електрофоретичне розділення продуктів гідролізу
ендонуклеазами EcoRI та HindIII плазмідних ДНК декількох АpR TetR трансформантів
продемонструвало наявність 2 фрагментів: 6,6 тпн та 1,1 тпн (рис ).
1 2 3 4 5
Рис. Електрофоретичне розподілення фрагментів плазмідних ДНК трансформантів №6
та №8: 1.-pWHM4 + EcoRІ + HindIII, 2.-100 bp DNA Ladder, 3.-pN6 + EcoRІ + HindIII,
4.-pN8 + EcoRІ + HindIII, 5.- pN6 + Bgl1.
Таким чином, плазмідні ДНК АpR TetR трансформантів містять однакові вставки,
які є бажаними нуклеотидними послідовностями хромосоми S. coelicolor A3(2).
Висновки
1. На базі інформації про нуклеотидну будову гену синтезу PKS ІІІ
S. coelicolor A3(2) було підібрано оптимальні нуклеотидні послідовності для пари
праймерів (прямий та зворотній) для проведення ПЛР. Було отримано ПЛР-амплікони
молекулярним розміром 1,145 тпн
2. Було успішно підібрано систему для клонування амліфікованої ДНК (що
складалася з вектора pWHM4 та реципієнтного штама Escherichia coli XL tetR). Гібридні
плазміди АpR TetR трансформантів містили клонований фрагмент стрептосміцетної
хромосоми молекулярним розміром 1,129 тпн.
Література
1. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. (Pед. Салганник Р.И.) –
Новосибирск: Наука.- 1990.-256 с.
338
2. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот(ред.
Проковьев М.А.)//Москва, Издательство МГУ.-1985.-279 с.
3. Валагурова В.Е., Козырицкая В.Е., Иутинская Г.А. Актиномицеты рода
Streptomyces. Описание видов и компьютерная программа их идентификации//
Киев: Наукова думка.-2003.-645 с.
4. Bentley S.D., Chater K.F., Cerdeno-Tarraga A.M. et al. Complete genome sequence
of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2) // Nature.-2002.- vol. 417,
№6885.- P. 141-147.
5. Каталог фірми MBI. Fermentas.- 2006-2007.
6. Vara j., Lewandowska-Skarbek M., Wang Y.-G. Cloning of genes governing the
deoxysugar portion of the erythromycin biosynthesis pathway in
Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus) // J. Bacteriology.- 1989.-
vol. 171, №3.-P.5872-5881.
7. Okanishi M., Suzuki K., Umezava H. Formation and reversion of Streptomyces
protoplasts: condition and morphological study // J. General Microbiol. –1989.-vol.80,
№1.-P.389-400.
8. Kieser T. Factors affecting the isolation of CCC DNA from Streptomyces lividans and
Escherichia coli // Plasmid.-1984.-vol.12, №1.- P.19-36.
9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбук Дж. Молекулярное клонирование. Методы
генетической инженерии – Москва: Мир.- 1984.-450 с.
10. Cortes J., Velasko J., Foster G., Blackaby A.P., Rudd B.A.M., Wilkinson B.
Identification and cloning of a type III polyketide synthase required for diffusible
pigment biosynthesis in Saccharopolyspora erythrea // Mol. Microbiol. - 2002. – vol.
44, №5. - P. 1213-1224.
11. Funa N., Ohhnishi Y., Ebizuka Y., Horinouchi S. Alteration of reaction and substrate
specificity of a bacterial type III polyketide synthase by site-directed mutagenesis //
Biochem. J. - 2002. – vol, 367, №3. - P. 781-789.0
Резюме
За допомогою ПЛР ампліфіковано фрагмент хромосоми Streptomyces coelicolor
A3(2), що містить ген синтезу PKS III. Проведено клонування ампліфікованої ДНК в
човниковому векторі pWHM4 по сайтам HindIII та EcoRI. Базуючись на даних
рестрикційного аналізу плазмідних ДНК трансформантів встановлено, що
молекулярний розмір проклонованого фрагмента ДНК становить 1129 пн.
С помощью ПЦР амплифицировано фрагмент хромосоми хромосоми
Streptomyces coelicolor A3(2), который содержал ген синтеза PKS III. Проведено
клонирование амплифицированной ДНК в челночном векторе pWHM4 в сайтах HindIII
та EcoRI. Основываясь на данных рестриционного анализа плазмидных ДНК
трансформантов, установлено, что молекулярный размер клонированного фрагмента
составляет 1129 пн.
Copies of chromosome Streptomyces coelicolor A3(2) fragment (gene of PKSIII
synthase) were obtained to use PLR. Amplificated DNA was cloned in shuttle vector pWHM4
on sites for HindIII and EcoRI. Restriction analysis of plasmid DNAs of transformantes
demonstrated that molecular sizes of cloning DNA insertions were 1129 b.
МИТРОФАНОВА О.В.1, ЛЕСНИКОВА-СЕДОШЕНКО Н.П.1, ЧИРКОВ С.Н.2,
СМЫКОВ А.В.1
1Никитский ботанический сад – Национальный научный центр УААН,
Украина, 98648, АР Крым, г. Ялта, e-mail: in_vitro@ukr.net
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-178302 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2219-3782 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-01T14:24:15Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Луk’янчук, В.В. 2021-02-18T14:07:22Z 2021-02-18T14:07:22Z 2008 Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) / В.В. Луk’янчук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 335-338. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178302 За допомогою ПЛР ампліфіковано фрагмент хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2), що містить ген синтезу PKS III. Проведено клонування ампліфікованої ДНК в човниковому векторі pWHM4 по сайтам HindIII та EcoRI. Базуючись на даних рестрикційного аналізу плазмідних ДНК трансформантів встановлено, що молекулярний розмір проклонованого фрагмента ДНК становить 1129 пн. С помощью ПЦР амплифицировано фрагмент хромосоми хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2), который содержал ген синтеза PKS III. Проведено клонирование амплифицированной ДНК в челночном векторе pWHM4 в сайтах HindIII та EcoRI. Основываясь на данных рестриционного анализа плазмидных ДНК трансформантов, установлено, что молекулярный размер клонированного фрагмента составляет 1129 пн. Copies of chromosome Streptomyces coelicolor A3(2) fragment (gene of PKSIII synthase) were obtained to use PLR. Amplificated DNA was cloned in shuttle vector pWHM4 on sites for HindIII and EcoRI. Restriction analysis of plasmid DNAs of transformantes demonstrated that molecular sizes of cloning DNA insertions were 1129 b. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Біотехнології в медицині і сільському господарстві Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) Article published earlier |
| spellingShingle | Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) Луk’янчук, В.В. Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| title | Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) |
| title_full | Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) |
| title_fullStr | Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) |
| title_full_unstemmed | Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) |
| title_short | Клонування плр-амплікона хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) |
| title_sort | клонування плр-амплікона хромосоми streptomyces coelicolor a3(2) |
| topic | Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| topic_facet | Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178302 |
| work_keys_str_mv | AT lukânčukvv klonuvannâplramplíkonahromosomistreptomycescoelicolora32 |