Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Дата: | 2008 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2008
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178308 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana / Г.В. Погорелко, О.В. Фурсова, О.А. Огаркова, В.А. Тарасов // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 350-354. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859656291056615424 |
|---|---|
| author | Погорелко, Г.В. Фурсова, О.В. Огаркова, О.А. Тарасов, В.А. |
| author_facet | Погорелко, Г.В. Фурсова, О.В. Огаркова, О.А. Тарасов, В.А. |
| citation_txt | Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana / Г.В. Погорелко, О.В. Фурсова, О.А. Огаркова, В.А. Тарасов // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 350-354. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Фактори експериментальної еволюції організмів |
| first_indexed | 2025-12-07T13:39:31Z |
| format | Article |
| fulltext |
350
5. Schweinsburg BC, Alhassoon OM, Taylor MJ, et al. Effects of alcoholism and gender on brain
metabolism /Am J Psychiatry. 2003 Jun;160(6):1180-3.
Резюме
Действие препарата Метовитан в организме направлено на активацию процессов
транссульфирования и трансметилирования, что ведет к усилению биохимической
системы антиоксидантной защиты и реакций детоксикации ксенобиотиков.
Позитивный эффект препарата показан на крысах с моделями гипоксии и
алкогольной интоксикации и подтвержден в производственных условиях на телятах в
период эпидемии парагриппа.
Дія препарату Метовітан в організмі спрямована на активацію процесів
транссульфурування та трансметилювання, що веде до посилення біохімічної системи
антиоксидантного захисту та реакцій детоксикації ксенобіотиків. Позитивний ефект
препарату продемонстровано на моделях гіпоксії та алкогольної інтоксикації на щурах і
підтверджено в промислових умовах на телятах під час епідемії парагрипу.
The action of drug Metovitan is directed on activation of processes of
transsulfurizing and transmethylation in cells that promotes increase of a biochemical
system of antioxidation protection and reactions of xenobiotics detoxication. The positive
effect of Metovitan on living organism had been shown on models of a hypoxia and alcoholic
intoxication. The effect is confirmed on calfs during epidemic of a paraflu under production
conditions.
ПОГОРЕЛКО Г.В., ФУРСОВА О.В., ОГАРКОВА О.А., ТАРАСОВ В.А.
Институт Общей Генетики РАН
ул. Губкина д.3, 119991, Москва, Россия, e-mail: gpogorelko@yandex.ru
НОВЫЙ ПОДХОД В ИЗУЧЕНИИ СУПЕРЭКСПРЕССИРУЮЩИХ МУТАНТОВ
A.thaliana
Расшифровка полной нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis
thaliana в конце 2000г. позволила реально перейти к решению центральной проблемы
молекулярной генетики высших растений – идентификации функции генов.
В последние 10-15 лет были разработаны методы для эффективного массового
получения инсерционных мутантов A. thaliana (Feldmann et. al., 1987, Bechtold et. al.,
1993). В результате были созданы представительные коллекции мутантных линий A.
thaliana, семена которых собраны в коллекционных центрах ABRC, NASC, SALK и
GABI.
Однако большинство созданных коллекций инсерционных мутантов содержат
линии, несущие loss-of-function мутации – связанные с потерей функции генов, которые
позволяют изучать функции только стабильно экспрессирующихся в ходе развития
растений генов. Этим обусловлен интерес к индукции мутаций другого типа, например,
мутаций, вызывающих суперэкспрессию генов. Индукция мутаций такого рода
достигается с помощью векторов, Т-ДНК которых содержит около одного из бордеров
сильный промотор (или энхансер) (Weigel et al., 2000).
Однако когда структура инсерции содержит энхансер, могут возникать мутации
двух типов: loss-of-function мутации, связанные с инактивацией гена при встраивании в
него инсерции, и мутации, обусловленные наличием энхансера в структуре инсерции.
При массовом получении и анализе инсерционных мутаций, полученных с помощью
такого рода векторов, необходимо иметь относительно простую и эффективную
систему идентификации loss-of-function мутаций и мутаций, связанных с
351
суперэкспрессией генов – так называемых gain-of-function мутаций. Вектора для
трансформации растений, несущие в составе Т-ДНК энхансеры, используются для
получения суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana уже более 10 лет (Koncz et al.
1994; Weigel et al., 2000). Однако, при использовании таких векторов, возникают
технические и принципиальные сложности. Основная проблема, связанная с
использованием этих векторов, заключается в необходимости решения вопроса –
обусловлены ли наблюдаемые фенотипические изменения инактивацией гена за счет
интеграции в него инсерции или суперэкспрессией близлежащих генов.
Материалы и методы
Растения A.thaliana Col-0 экотипа выращивались при 21-23°C с нормальным
освещением (16 часов день, 8 часов ночь) лампами Phillips BioLux при 60% влажности.
Трансформация A. tumefaciens производилась методом «замораживания-
оттаивания» (Höfgen R and Willmitzer L, 1988). Трансформация Arabidopsis thaliana
производилась методом вакуумной инфильтрации (Bechtold and Pelletier, 1998).
Точную локализацию инсерций в геноме проводили при помощи
модифицированного метода inverse PCR.
Результаты и обсуждения
Система векторов pEnLox/pCre.
Система двух векторов pEnLox (Рис.1) и pCre (Погорелко и др., 2007)
используется следующим образом. Энхансер в составе Т-ДНК плазмидного вектора
pEnLox окружен loxP–сайтами. Следующее поколение от скрещивания исследуемого
инсерционного мутанта, полученного путем трансформации вектором pEnLox, с другой
трансгенной линией A. thaliana, несущей ген cre, высевается in vitro на селективную
среду с антибиотиком гигромицином и после отбора устойчивых растений
обрабатывается экзогенно дексаметазоном, в результате чего происходит удаление
энхансерной последовательности. После вырезания энхансера, в последовательности Т-
ДНК, по-прежнему встроенной в геномную ДНК, остается ген гербицид устойчивости с
промотором и один из loxP-сайтов. Таким образом этот оставшийся интегрированным в
геном фрагмент Т-ДНК преобразуется в обычный тип инсерций, которые используются
для получения loss-of-function мутантов, а сам мутант, после вырезания энхансера,
преобразуется в обычного loss-of-function мутанта.
Рисунок 1. Физическая
карта вектора pEnLox.
На последовательности,
ограниченной
бордерами, показан ген
устойчивости к
селективному
гербициду Баста, под
контролем промотора и
терминатора и
энхансер окаймленный
lox-сайтами.
Получение коллекции инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana при
помощи вектора pEnLox.
Используя данную систему векторов, была получена начальная коллекция новых
линий мутантов, несущих в геноме инсерцию Т-ДНК плазмиды pEnLox.
На первом этапе анализа семян Т2 поколения было отобрано 156 устойчивых к
гербициду Баста растений (Е-линий), и 8 устойчивых к антибиотику гигромицину
растений (С-линии).
352
Для подтверждения наличия инсерции/инсерций Т-ДНК в геноме мутантов
анализируемых линий растений, а также для определения их количества, было
осуществлено два последовательных эксперимента.
Анализ Т3 поколения
Три четверти анализируемых линий показали в Т3-поколении наследование
маркера устойчивости к гербициду по моногенному типу, что соответствовало
расщеплению 3:1, и одна четверть мутантов содержала в геноме 2 независимо
интегрированных инсерции.
Данные, полученные путем анализа расщеплений по признаку устойчивости к
селективному маркеру в Т3-поколении отобранных линий, были проверены более
точно с помощью блот-гибридизации по Саузерну рестрицированной геномной ДНК с
фрагментом Т-ДНК плазмиды pEnLox.
Установление точной локализации инсерций в геноме.
На следующем этапе анализа геномную ДНК мутантов линий: Е1, Е4, Е7, Е10,
Е12, E13, E14, Е15, Е17, Е18, Е20, Е21, E23, Е30, E31, Е35, Е37 и Е40 использовали для
RC-PCR. В результате были амплифицированы 38 независимых «гибридных»
фрагментов ДНК, состоящих из околобордерной последовательности Т-ДНК и
примыкающей к ней неизвестной геномной.
Полученные FSFs были отсеквенированы и результаты были проанализированы
с помощью программы BLAST сервера NCBI, что позволило конкретно локализовать
нахождение инсерций Т-ДНК в геномах исследуемых Е-мутантов, а также определить
возможные гены, на экспрессию которых возможно повлияла инсерция..
Проверка работоспособности системы векторов pEnLox/pCre.
Для доказательства работоспособности системы векторов pCre/pEnlox мы
использовали 6 Е-линий (E1, E4, E7, E9, E10, E12) и 8 гомозиготных С-линий (C1, C2,
C3, C4, C5, C6, С7, С8), не отличающихся от фенотипа растений дикого типа. В связи с
тем, что для скрещивания необходимы зрелые растения, в работе использовались
растения 4-х недельного возраста.
Скрещивание Е-линий с С-линиями.
Не опыленные бутоны Е-растений (акцепторы) были скрещены со зрелыми
цветами С-линий (доноры) путем непосредственного тесного контакта таким образом,
чтобы донорная пыльца максимально покрыла поверхность бутона. Известно, что для
максимальной эффективности оплодотворения сторонней пыльцой у однодомных
растений самоопылителей с обоеполыми цветками необходимо удалить андроцей до
созревания гинецея и раскрыть бутон для увеличения вероятности попадания пыльцы
на поверхность пестика. Такие кропотливые процедуры, требующие большого опыта,
часто приводят к гибели цветков. Однако, в случае системы pCre/pEnLox, как
упоминалось выше, скрещиваемые растения несут принципиально разные селективные
маркеры и процесс получения мутантов, несущих Т-области обоих векторов,
значительно упрощается.
Удаление энхансера из состава интегрированной в геном Т-ДНК.
Через 2-3 дня после пересадки в открытый грунт, устойчивые к гигромицину
растения опрыскивались 0.1 µM дексометазоном один раз в день в течение 6 дней и
гербицидом Баста (250мг/л) 6 раз через день в течение 12 дней. После обработки
вторым селективным маркером и дексометазоном – стимулятором изменения
третичной структуры GR-домена белка фьюжена CreGR, в течение нескольких часов
происходило проникновение в ядра клеток рекомбиназы Cre и удаление энхансера из
геномной ДНК под ее воздействием.
Проверка эффективности удаления методом ПЦР
Через неделю после обработки, геномную ДНК растений мы проанализировали
при помощи ПЦР, используя фланкирующие энхансер праймеры, и показали 100%
эффективность вырезания внутреннего фрагмента между двумя lox-сайтами. Мы
353
использовали геномную ДНК - пул из 5-ти независимых «двойных» мутантов для
каждой Е-линии.
Идентификация генов, супер-экспрессия которых влияет на морфогенез
Arabidopsis thaliana.
Среди отобранных нами трансформантов нам удалось выявить 3 линии: Е9, Е78
и Е134, отличающихся от растений дикого типа по морфологическим
признакам.Проверка точной локализации инсерций в морфологических мутантах
показала, что во всех трех линиях Т-ДНК встроилась непосредственно перед старт-
кодонами генов таким образом, что энхансер направлен на старт-кодоны и
потенциально может вызывать супер-экспрессию этих генов (Табл. 1).
Таблица 1
Локализация инсерций в линиях с измененной морфологией
№
линии Ген/Длина Описание продукта Стрра
гена
Локализация/Ориентация
инсерции
GenBank
Acc№
E9 AT5G10080
2538п.н.
Белок семейства
аспартил протеаз 9 экз.
Инсерция за 400п.н. до старт-
кодона. Энхансер направлен на
старт-кодон.
DX575044
E78 AT1G33390
4371 п.н.
DEAH-box АТФ-
зависимая хеликаза 8 экз.
Инсерция за 530 п.н. до старт-
кодона. Энхансер направлен на
старт-кодон.
EI183464
E134 AT5G13760
2922 п.н.
Неизвестный белок
содержащий пролин
богатый домен
5 экз.
энхансер за 270 п.н. до старт
кодона и смотрит на него EI232171
Реверсия Е-мутантов к фенотипу дикого типа.
После удаления энхансера из геномной ДНК Е-мутантов экспрессия генов
At5g10080, At1g33390 и At5g13760 была остановлена тогда как остаток Т-ДНК
присутствовал в геноме. Растения мутантной линии с удаленным энхансером обладали
фенотипом растений дикого типа, т.е. являлись полными ревертантами (Рис.2).
Рисунок 2
Сравнение фенотипов растений Е9, Е9/С4 E78, E78/C4, E134, E134/C4 и A.
thaliana Col0. Возраст 7 недель.
(А) Исходный мутант Е9
(В) «Двойной мутант» Е9/С4 после скрещивания обработанный дексометазоном
(С) Исходный мутант Е78
(D) «Двойной мутант» Е78/С4 после скрещивания обработанный дексометазоном
(E) Исходный мутант Е134
(F) «Двойной мутант» Е134/С4 после скрещивания обработанный дексометазоном
(G) Растение дикого типа A. thaliana Col0
354
Основываясь на полученных данных можно утверждать, что супер-экспрессия
гена At5g10080, кодирующего белок класса аспартиловых протеаз А1
локализирующегося в клеточных мембранах приводит к нарушениям нормального
морфогенеза растений – замедляет рост, изменяет окраску и приводит к уменьшенному
габитусу взрослых растений. Cупер-экспрессия гена At1g33390, кодирующего белок
класса АТФ-зависимых хеликаз вызывает нарушения нормального развития стеблей
растений, а именно вызывает развитие фасциированного стебля. Изменение экспрессии
гена At5g13760, кодирующего белок содержащий пролин-богатый домен приводит к
нарушениям нормального развития растений, а именно вызывает замедление роста и
уменьшение фертильности.
Литература.
1. Feldmann, K., Marks, M., Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of
Arabidopsis thaliana: A non-tissue culture approach. Mol. Gen. Genet. 1987. 208, 1-9
2. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G.,. In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by
infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. Paris: C. R. Acad. Sci. Sciences de la vie /
Life sciences. 1993-316, 1194-1199.
3. Bechtold, N., Pelletier G., In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult
Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods Mol Biol. 1998. 82, 259-266
4. Höfgen, R., Willmitzer, L., Storage of competent cells for Agrobacterium transformation.
Nucl. Acids Res. 1988. 16, 9877
5. Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J.,. Specialized
vectors for gene tagging and expression studies. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The
Netherlands. 1994- B1-22
6. Pogorelko, G., Fursova, O., Ogarkova, O., Tarasov, V.,. New vector system for induction
of gene expression in dicotyledonous plants. Genetika (Rus) 2007. 43-2, 194-201
7. Weigel, D. et al., Activation tagging in Arabidopsis. Plant Physiology. 2000. 122-4, 1003-
13
РАХМЕТОВ Д.Б.2, БАЄР Г.Я.1, СТАДНІЧУК Н.О.2, ЄМЕЦЬ А.І.1, БЛЮМ Я.Б.1
1Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України,
Україна, 03680, Київ, вул. акад. Заболотного, 148,
E-mail: galinabayer@univ.kiev.ua
2Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України,
Україна, 01014, Київ, вул. Тимірязєвська, 1
ВИВЧЕННЯ БІОХІМІЧНИХ ХАРАКТЕРИСТИК СОМАКЛОНАЛЬНИХ
ВАРІАНТІВ ПАЛЬЧАСТОГО ПРОСА
Традиційний селекційний процес, що базується на використанні статевої
гібридизації як засобу передачі генетичної інформації, дозволив досягти значних
успіхів у підвищенні урожайності і якості багатьох культур, однак інтенсифікація
сільського господарства ставить перед селекціонерами складні задачі по створенню
нових сортів, що відрізняються високою врожайністю, стійкістю до хвороб, шкідників,
стресових факторів навколишнього середовища, високою пластичністю. Для створення
більш досконалих сортів необхідно розробляти нові прискорені методи підвищення
результативності селекційного процесу. Одним з важливих шляхів у цьому напрямі на
сьогоднішній день є використання біотехнологічних прийомів, одним з яких є
отримання сомаклональних варіантів в культурі in vitro, які набули нових ознак.
Перевагою даного методу є поява нових форм з високим рівнем адаптації і
неспецифічної стійкості до шкідливих факторів навколишнього середовища з
покращеними господарсько цінними характеристиками (Arun et al., 2003; Bulk, 1991;
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-178308 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2219-3782 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T13:39:31Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Погорелко, Г.В. Фурсова, О.В. Огаркова, О.А. Тарасов, В.А. 2021-02-18T14:19:28Z 2021-02-18T14:19:28Z 2008 Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana / Г.В. Погорелко, О.В. Фурсова, О.А. Огаркова, В.А. Тарасов // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 350-354. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178308 ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Біотехнології в медицині і сільському господарстві Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana Article published earlier |
| spellingShingle | Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana Погорелко, Г.В. Фурсова, О.В. Огаркова, О.А. Тарасов, В.А. Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| title | Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana |
| title_full | Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana |
| title_fullStr | Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana |
| title_full_unstemmed | Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana |
| title_short | Новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов A.thaliana |
| title_sort | новый подход в изучении суперэкспрессирующих мутантов a.thaliana |
| topic | Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| topic_facet | Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178308 |
| work_keys_str_mv | AT pogorelkogv novyipodhodvizučeniisuperékspressiruûŝihmutantovathaliana AT fursovaov novyipodhodvizučeniisuperékspressiruûŝihmutantovathaliana AT ogarkovaoa novyipodhodvizučeniisuperékspressiruûŝihmutantovathaliana AT tarasovva novyipodhodvizučeniisuperékspressiruûŝihmutantovathaliana |