Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1
Досліджено флавіногенну активність рекомбінантних штамів дріжджів Candida
 famata, що містять ген РФ-кінази FMN1 під контролем сильного конститутивного
 промотора TEF1. Оптимізовано умови нагромадження ФМН у культуральній рідині. Изучена флавиногенная активность рекомбинантных штаммо...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Фактори експериментальної еволюції організмів |
|---|---|
| Дата: | 2008 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2008
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178357 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 / В.Ю. Яцишин, О.П. Іщук, А.Я. Вороновський, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 393-397. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860257311066423296 |
|---|---|
| author | Яцишин, В.Ю. Іщук, О.П. Вороновський, А.Я. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. |
| author_facet | Яцишин, В.Ю. Іщук, О.П. Вороновський, А.Я. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. |
| citation_txt | Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 / В.Ю. Яцишин, О.П. Іщук, А.Я. Вороновський, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 393-397. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Фактори експериментальної еволюції організмів |
| description | Досліджено флавіногенну активність рекомбінантних штамів дріжджів Candida
famata, що містять ген РФ-кінази FMN1 під контролем сильного конститутивного
промотора TEF1. Оптимізовано умови нагромадження ФМН у культуральній рідині.
Изучена флавиногенная активность рекомбинантных штаммов дрожжей Candida
famata, содержащих ген РФ-киназы FMN1 под контролем сильного конститутивного
промотора TEF1. Оптимизированы условия накопления ФМН в культуральной
жидкости.
The flavinogenic activity of recombinant strains of the yeast Candida famata that
express the FMN1 gene encoding riboflavin kinase under control of the strong constitutive
TEF1 promoter was studied. Conditions for flavinmononucleotide production were optimized.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:50:38Z |
| format | Article |
| fulltext |
393
4. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на
основе ранее неизвестных биорегуляторов-гликопротеинов клеточного
микроокружения // Рос. хим. ж. (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). -1998. -Т.42. N3. -c.85-
90.
5. Ямскова В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени
крыс // Биофизика. -1978. -т.23. -c.428-432.
6. Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Вечеркин В.В., Ямсков И.А.
Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови
млекопитающих.// Прикладная биохимия и микробиология. -2004. -т.40, №4, -с.407-413.
7. Krasnov M.S., Gurmizov E.P., Yamskova V.P., Yamskov I.A. “Analysis of a
Regulatory Peptide from the Bovine Eye Lens: Physicochemical Properties and Effect on
Cataract Development in vitro and in vivo” pp. 21-33 // In the book “Biochemical Physics
Frontal Research”, Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov,
Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. -2007. -p. 126.
8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4// Nature. -1970. -V. 227. -P. 680-685.
9. Margasyuk D.V., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V., Grigoryan E.N., Yamskova V.P.,
Yamskov I.A. “Regulatory Protein from Bovine Cornea: Localization and Biological
Activity”, pp. 47-59 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by S.D.
Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science
Publishers Inc. -2007. -p. 126.
10. Yamskova V.P., Rybakova E.Yu., Vecherkin V.V., Berezin B.B., Filatova A.G.
Blagodatskikh I.V. and Yamskov I.A. “Analysis of regulatory proteins from bovine blood
serum that display biological activity at ultra low doses: 1. Isolation, purification and
physicochemical properties.”, pp. 57-67 // In the book “Biochemical Physics Frontal
Research”, Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A. and Zaikov G.E.,
Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. -2007. -p. 126.
Резюме.
Из тканей витреоретинальной области глаза были выделены РБ, которые
образуют комплекс с белками-модуляторами, относящимися к альбуминам. Данный
комплекс обладал выраженным биологическим действием в микродозах.
From vitreoretinal tissue of eye have been allocated regulatory proteins which form a
complex with the protein-modulators concerning to albumin. The given complex possessed
the expressed biological action in microdozes.
ЯЦИШИН В. Ю.1,2, ІЩУК О. П.2, ВОРОНОВСЬКИЙ А. Я.2, ФЕДОРОВИЧ Д. В.1,2,
СИБІРНИЙ А. А.2
1 Львівський національний університет імені Івана Франка,
2 Інститут біології клітини НАН України,
Україна, 75005, Львів, вул. Грушевського, 4
e-mail: yatsyshyn.v@gmail.com
УТВОРЕННЯ ФЛАВІНМОНОНУКЛЕОТИДУ РЕКОМБІНАНТНИМИ
ШТАМАМИ ДРІЖДЖІВ CANDIDA FAMATA , ЩО МІСТЯТЬ ГЕН FMN1 ПІД
ПРОМОТОРОМ TEF1
Перетворення рибофлавіну (РФ) до його біологічно активної форми –
флавінмононуклеотиду (ФМН) – це АТФ-залежний процес, який здійснує РФ-кіназа
(синоніми: флавокіназа, ФМН-синтетаза, АТФ:РФ-5′-фосфотрансфераза) (Е.С. 2.7.1.26).
На відміну від ферментів біосинтезу РФ, її синтез не регулюється іонами заліза. Не
394
зважаючи на те, що існує досить багато природних надсинтетиків РФ, досі не виявлено
здатності мікроорганізмів до синтезу значних кількостей ФМН. В той же час,
препарати ФМН, отримані ферментативним способом, можуть знайти застосування як
лікарські препарати, як реактиви високого ступеня чистоти, а також як компоненти
системи біолюмінесцентного аналізу.
Попри високу активність РФ-кінази, порівняно з іншими ферментами синтезу
флавінів, у клітинах та культуральній рідині флавіногенних дріжджів Candida famata
нагромаджуються лише слідові кількості вільного ФМН. Причини такого явища
невідомі і пов’язуються з дією фосфатаз [4]. Раніше ми показали, що заміна нативного
промотора гену FMN1 (кодує РФ-кіназу) дріжджів Debaryomyces hansenii на сильний,
конститутивний промотор TEF1 C. famata дає можливість отримати рекомбінантні
штами дріжджів із підвищеною активністю РФ-кінази, які здатні виділяти ФМН у
середовище [1]. Однак, попри високу активність РФ-кінази, крім ФМН, в культуральній
рідині виявлено значні кількості РФ. Дана робота присвячена пошуку причин
нагромадження РФ та умов, які б забезпечили максимальну продукцію ФМН такими
штамами.
Матеріали та методи
У роботі використовували отримані нами раніше рекомбінантні штами дріжджів
Candida famata, що містять ген FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1 C.
famata. Схема конструювання плазмід з геном FMN1 під контролем промотора TEF1 та
отримання трансформантів описані в [1].
Дріжджі вирощували при 300С у багатому середовищі YPD (дріжджовий
екстракт, 0,5%; пептон, 1%; глюкоза, 2%), та мінімальному середовищі Беркгольдера
[5].
Вміст флавінів у культуральній рідині визначали флуориметрично на
флуорометрі ЕФ-3М після хроматографічного розділення, з використанням
синтетичного РФ як стандарту [6]. Безклітинні екстракти отримували шляхом
руйнування суспензії клітин в гомогенізаторі для клітин і бактерій Л-17 скляними
кульками. Діаліз проводили проти фосфатного буферу при 40С протягом 12 год., вміст
білка у зразках визначали за Лоурі [7]. Визначення активності РФ-кінази проводили за
[1], лужної фосфатази за [4], кислої фосфатази за [3]. За одиницю активності фермента
[U] приймали його кількість, яка забезпечує синтез 1 мкмоля продукту реакції за 1 хв.
Дані представлено як середнє ± похибка середнього (М ± m). Статистичну
обробку здійснювали з використанням коефіцієнта Ст’юдента. Математичне
опрацювання результатів виконували за допомогою програмного пакета Microsoft
Office Excel 2003.
Результати та обговорення
Введення гену FMN1 D. hansenii під контролем сильного конститутивного
промотора TEF1 C. famata в геном флавіногенних дріжджів C. famata призводило до 6-
7-кратного підвищення активності РФ-кінази [1]. У таких штамів вміст ФМН у
культуральній рідині за умов вирощування протягом 3 діб у рідкому синтетичному
середовищі (СБ) був вищим, ніж у контрольних в 5-6 разів, при цьому частка ФМН від
0
1
2
3
4
5
6
7
8 № 18
Ф
М
Н
, м
г/
л
2 3 5 2 3 5
Засів, мг/мл
К9
395
загального вмісту флавінів становила біля 30%. Для оптимізації умов нагромадження
ФМН було використано інкубацію клітин. Продукція ФМН суттєво залежала від
кількості інкубованих клітин. Виявилося, що найкращий вихід ФМН спостерігається
при засіві 3мг/мл клітин (рис.1), а подальше підвищення їх кількості знижує
ефективність синтезу ФМН, можливо внаслідок дефіциту поживних речовин. На
відміну від штаму дикого типу L20105 та контрольного штаму K9 (трансформованого
плазмідою, що не містила гена FMN1), у яких нагромадження ФМН було однаково
низьким, незалежно від кількості інкубованих клітин та часу їх інкубації, усі
рекомбінантні штами, що містили ген FMN1 під контролем промотора TEF1,
характеризувалися суттєвим підвищенням синтезу ФМН на 17-20 год. інкубації.
Подальша інкубація клітин не приводила до зростання кількості ФМН в культурі.
Рис.1. Вміст ФМН у культуральній рідині трансформанта №18 та контрольного
штаму К9 у залежності від густини засіву
Використовуючи короткочасну інкубацію 3 мг клітин, досліджено активність
РФ-кінази та флавіногенну активність рекомбінантних штамів C. famata, що містять ген
FMN1 під контролем TEF1 промотора. Виявилось (табл.), що аналізовані рекомбінантні
штами характеризуються вищою в 4-6 разів активністю РФ-кінази, в порівнянні з
контрольними штамами L20105 і K9. За сумарною кількістю флавінів у культуральній
рідині трансформанти практично не відрізнялися від контрольних штамів, проте
нагромаджували до 4,4 мг/л ФМН (в 7 разів більше, ніж вихідний штам). Відсотковий
вміст ФМН становив 24-33% у трансформантів та 7% у контрольного та вихідного
штамів.
Незважаючи на суттєве підвищення активності РФ-кінази та зростання вмісту
ФМН при короткотривалій інкубації клітин рекомбінантних штамів, його кількість
була незначною, а РФ складав понад 60% загального вмісту флавінів. Було висловлено
припущення про можливість гідролізу синтезованого ФМН неспецифічними
клітинними фосфатазами.
Таблиця
Активність РФ-кінази та рівень флавіногенезу в рекомбінантних штамів C.
famata, що містять ген FMN1 під контролем TEF1 промотора
Флавіни культуральної рідини, мг/л
Штам
Активність РФ-
кінази, мкмоль х
10-5 / хв х мг
білка *
ФМН **
Сумарна
кількість
флавінів **
% ФМН
L20105 7,38±0,51 0,6±0,02 8,8±0,90 7
K9 11,07±1,02 0,9±0,07 13,0±1,25 7
трансформант 3 48,38±4,44 2,4±0,11 10,0±0,98 24
трансформант 9 48,79±3,92 4,4±0,39 13,3±1,45 33
трансформант 18 43,05±4,50 4,1±0,37 13,9±1,11 30
трансформант 33 46,74±4,53 2,7±0,30 9,7±1,00 27
Вірогідно відрізняється від відповідних контрольних значень із р < 0,05 (*) та р <
0,025 (**)
Для дріжджів Pichia guilliermondii було показано, що активність фосфатаз,
здатних до гідролізу ФМН, інгібується іонами Be2+, F-, їх сумішшю, а також Ca2+ [2, 3].
Інкубація клітин рекомбінантних штамів C. famata в середовищі з різними
концентраціями BeSO4, NaF та CaCl2 призвела до зростання вмісту ФМН у
396
культуральній рідині на 12-25% (рис.2). Оптимальною для нагромадження ФМН
концентрацією NaF виявилась 0,2 мМ (на 15% більше ФМН), а суміші – 0,2 мМ NaF і
0,5 мМ BeSO4 (на 23% більше ФМН). Цікаво, що лише одночасне додавання іонів
берилію та фториду призводить до зростання продукції ФМН, при цьому додавання
лише іонів берилію пригнічує утворення ФМН інкубованими клітинами на 16%. За
підвищення у середовищі інкубації вмісту CaCl2 продукція ФМН зростала на 12%.
Приведені дані свідчать, що гідроліз ФМН є однією із причин нагромадження в
культуральній рідині, крім ФМН, РФ. Однак токсичність цих інгібіторів виключає
застосування їх у процесі ферментації з метою отримання препаратів ФМН.
Рис. 2. Вміст ФМН у культуральній рідині штамів C. famata, що містять ген FMN1
під контролем промотора TEF1, при інкубації в середовищі з інгібіторами фосфатаз
Цікавою виявилася спроба пригнічення активності фосфатаз шляхом внесення в
середовище інкубації підвищених кількостей фосфату калію. Активність кислої
фосфатази інгібувалась фосфатом на 18-20%, проте активність лужної фосфатази під
впливом КН2РО4 зростала на 25%, однак вона є малоактивною в середовищі інкубації
дріжджів, рН якого є нижчим 5. За таких умов вміст ФМН у культуральній рідині
зростав у 2,5 рази. Таким чином, продукцію ФМН можна регулювати шляхом зміни
компонентів середовища.
Наведені результати свідчать про те, що генно-інженерне конструювання штамів
із високим рівнем експресії гену FMN1 є перспективним для створення дріжджових
надсинтетиків цього нуклеотиду. Подальші зусилля повинні бути спрямовані на
забезпечення РФ-кінази субстратом – РФ, а також делеції генів, які відповідають за
гідроліз ФМН.
Література
1. Іщук О.П., Яцишин В.Ю., Дмитрук К.В., Вороновський А.Я., Федорович Д.В.,
Сибірний А.А. Генно-інженерне конструювання штамів флавіногенних дріжджів
Candida famata з високою активністю рибофлавінкінази // Укр. біохім. журнал. – 2006.
– Т. 78, № 5. – С.53-59.
2. Сибирный А.А., Шавловский Г.М. Об ингибировании щелочной фосфатазы I
дрожжей Pichia guilliermondi in vitro и in vivo // Укр. биохим. журн. – 1978. – Т. 50, № 2.
– С. 212-218.
3. Струговщикова Л.П., Федорович І.П., Сенюта Е.З., Шавловський Г.М.
Дослідження кислої фосфатази ІІ дріжджів Pichia guilliermondi // Укр. біохім. журн. –
1976. – Т. 48, № 3. – С. 320-324.
0
20
40
60
80
100
120
140
Середовище
Контроль +Be +F +Be+F +CaCl2
Ф
М
Н
, %
397
4. Струговщикова Л.П., Шавловський Г.М., Федорович І.П., Кучерас Р.В.
Очищення та деякі властивості лужної фосфатази І дріжджів Pichia guilliermondi //
Укр. біохім. журн. – 1973. – Т. 45, № 3. – С. 312-317.
5. Шавловский Г.М., Жарова В.П., Щелокова И.Ф., Трач В.М., Сибирный А.А.,
Кшеминская Г.П. Флавиногенная активность природных штаммов дрожжей Pichia
guilliermondii // Прикл. биохимия и микробиология. – 1978. – Т.14. – С. 184-189.
6. Bessey O.A., Lowry J.Y., Love R.H.J. The fluorometric measurement of the
nucleotides of riboflavin and their concentration in tissues // J. Biol. Chem. – 1949. – Vol.
180, N 2. – P. 378-381.
7. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein measurement
with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – Vol. 193. – P. 265-275.
Резюме
Досліджено флавіногенну активність рекомбінантних штамів дріжджів Candida
famata, що містять ген РФ-кінази FMN1 під контролем сильного конститутивного
промотора TEF1. Оптимізовано умови нагромадження ФМН у культуральній рідині.
Изучена флавиногенная активность рекомбинантных штаммов дрожжей Candida
famata, содержащих ген РФ-киназы FMN1 под контролем сильного конститутивного
промотора TEF1. Оптимизированы условия накопления ФМН в культуральной
жидкости.
The flavinogenic activity of recombinant strains of the yeast Candida famata that
express the FMN1 gene encoding riboflavin kinase under control of the strong constitutive
TEF1 promoter was studied. Conditions for flavinmononucleotide production were optimized.
LYPOVA N.M., SINDAROVSKA Y.R, GERASYMENKO I.M., SHELUDKO Y.V.,
BANNIKOVA M.A., KUCHUK N.V.
Institute of Cell Biology and Genetic Engineering NAS of Ukraine,
Zabolotnogo str. 148, Kiev 03680, Ukraine, e-mail: ysheludko@ukr.net
COMPARISON OF DIFFERENT SYSTEMS FOR PURIFICATION OF
RECOMBINANT PROTEINS PRODUCED BY TRANSIENT EXPRESSION IN
PLANTS
Plants as source of recombinant proteins have important advantages over microbial or
animal cell systems. Plant cells, unlike bacteria, are able to produce proteins with post-
translational modifications, as well as correctly folded and assembled multimeric proteins, e.
g. antibodies [1]. In contrast to animal cells, plants are free from human pathogens like
viruses and prions, so the recombinant proteins of plant origin are considered to be safer [2].
The main obstacle on the way of using transgenic plants for high-scale production of
recombinant proteins is the low level of foreign gene expression in case of stable integration
into plant nuclear genome (usually about 0.1-0.5 % TSP) [3]. Transient gene expression may
allow for rapid accumulation of considerably larger amount of recombinant proteins (in the
range 0.5-10 % TSP or sometimes more) [4], but even in this case an efficient purification
system can substantially improve the yield of pure target product.
Here we describe comparative analysis of different approaches for purification of
transiently expressed recombinant proteins from plants using green fluorescent protein (GFP)
as a reporter. The purification scheme including ammonium sulfate precipitation and anion-
exchange chromatography was compared with two tag-based protocols applying metal
affinity chromatography with a 6xHis tag (Qiagen) and intein mediated purification with a
chitin-binding affinity tag (New England Biolab).
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-178357 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2219-3782 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:50:38Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Яцишин, В.Ю. Іщук, О.П. Вороновський, А.Я. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. 2021-02-18T15:30:10Z 2021-02-18T15:30:10Z 2008 Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 / В.Ю. Яцишин, О.П. Іщук, А.Я. Вороновський, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2008. — Т. 5. — С. 393-397. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178357 Досліджено флавіногенну активність рекомбінантних штамів дріжджів Candida
 famata, що містять ген РФ-кінази FMN1 під контролем сильного конститутивного
 промотора TEF1. Оптимізовано умови нагромадження ФМН у культуральній рідині. Изучена флавиногенная активность рекомбинантных штаммов дрожжей Candida
 famata, содержащих ген РФ-киназы FMN1 под контролем сильного конститутивного
 промотора TEF1. Оптимизированы условия накопления ФМН в культуральной
 жидкости. The flavinogenic activity of recombinant strains of the yeast Candida famata that
 express the FMN1 gene encoding riboflavin kinase under control of the strong constitutive
 TEF1 promoter was studied. Conditions for flavinmononucleotide production were optimized. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Фактори експериментальної еволюції організмів Біотехнології в медицині і сільському господарстві Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 Article published earlier |
| spellingShingle | Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 Яцишин, В.Ю. Іщук, О.П. Вороновський, А.Я. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| title | Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 |
| title_full | Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 |
| title_fullStr | Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 |
| title_full_unstemmed | Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 |
| title_short | Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata , що містять ген FMN1 під промотором TEF1 |
| title_sort | утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів candida famata , що містять ген fmn1 під промотором tef1 |
| topic | Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| topic_facet | Біотехнології в медицині і сільському господарстві |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/178357 |
| work_keys_str_mv | AT âcišinvû utvorennâflavínmononukleotidurekombínantnimištamamidríždžívcandidafamataŝomístâtʹgenfmn1pídpromotoromtef1 AT íŝukop utvorennâflavínmononukleotidurekombínantnimištamamidríždžívcandidafamataŝomístâtʹgenfmn1pídpromotoromtef1 AT voronovsʹkiiaâ utvorennâflavínmononukleotidurekombínantnimištamamidríždžívcandidafamataŝomístâtʹgenfmn1pídpromotoromtef1 AT fedorovičdv utvorennâflavínmononukleotidurekombínantnimištamamidríždžívcandidafamataŝomístâtʹgenfmn1pídpromotoromtef1 AT sibírniiaa utvorennâflavínmononukleotidurekombínantnimištamamidríždžívcandidafamataŝomístâtʹgenfmn1pídpromotoromtef1 |