Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу
Досліджено протиапоптотичну дію нейропептиду кіоторфін на моделі холодового стресу фібробластів лінії L929. Вплив дипептиду на клітини аналізували за морфологічними показниками, за допомогою цитофлуориметрії з одночасним фарбуванням annexin V/7-AAD та дослідженням виходу цитохрому с до цитоплазми...
Збережено в:
| Дата: | 2021 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2021
|
| Назва видання: | Доповіді НАН України |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/180576 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу / О.К. Гулевський, Н.М. Моісєєва, О.Л. Горіна // Доповіді Національної академії наук України. — 2021. — № 4. — С. 103-109. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-180576 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1805762025-02-09T20:13:21Z Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу Neuropeptide kyotorphin prevents the development of apoptosis of fibroblasts L929 under cold stress Гулевський, О.К. Моісєєва, Н.М. Горіна, О.Л. Біохімія Досліджено протиапоптотичну дію нейропептиду кіоторфін на моделі холодового стресу фібробластів лінії L929. Вплив дипептиду на клітини аналізували за морфологічними показниками, за допомогою цитофлуориметрії з одночасним фарбуванням annexin V/7-AAD та дослідженням виходу цитохрому с до цитоплазми клітин. У вибраних умовах холодового стресу відмічено вірогідне збільшення кількості клітин з морфологічними ознаками апоптозу за даними світлової мікроскопії, порушення асиметрії мембрани та зареєстровано появу в цитоплазмі клітин цитохрому с. Доведено, що додавання кіоторфіну в концентрації 100 мкг/л до середовища культивування за 15 хв до моделювання холодового стресу сприяло вірогідному зменшенню кількості клітин з ознаками апоптозу. Кількість annexin V⁺/7-AAD⁻-клітин після попередньої інкубації фібробластів з дипептидом знижувалась до 19,1 ± 0,5 % порівняно зі зразками після холодового стресу (55,3 ± 2,1 %), а кількість клітин, в цитоплазмі яких зареєстровано цитохром с, зменшувалася в 3,65 раза. На підставі результатів досліджень висловлено припущення, що попередня інкубація з регуляторним нейропептидом кіоторфін у концентрації 100 мкг/л ефективно запобігає апоптозу у фібробластах L929 в умовах холодового стресу. We were study the antiapoptotic effect of the neuropeptide kyotorphin in a model of cold stress fibroblasts L929. The effect of dipeptide on cells was analyzed by morphological parameters, using cytofluorimetry with simultaneous staining of annexin V/7-AAD and study of the release of cytochrome c to the cytoplasm of cells. Under selected conditions of cold stress, there was a significantly increase in the number of cells with morphological features of apoptosis according to light microscopy, violation of membrane asymmetry, and the appearance of cytochrome c cells in the cytoplasm was registered. It has been proved that the addition of kyotorphin at a concentration of 100 μg/l to the culture medium 15 min before the modeling of cold stress significantly reduces the number of cells features of apoptosis. The number of annexin V/7-AAD⁻-cells after pre-incubation of fibroblasts with dipeptide decreased to 19.1 ± 0.5 % compared to samples after cold stress (55.3 ± 2.1 %), and the number of cells in the cytoplasm of which was registered cytochrome c, decreased by 3.65 times. Studies have suggested that pre-incubation with the regulatory neuropeptide kyotorphin at a concentration of 100 μg/l effectively prevents apoptosis in fibroblasts L929 under cold stress. 2021 Article Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу / О.К. Гулевський, Н.М. Моісєєва, О.Л. Горіна // Доповіді Національної академії наук України. — 2021. — № 4. — С. 103-109. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. 1025-6415 DOI: doi.org/10.15407/dopovidi2021.04.103 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/180576 577.112.6:576.36.017.6:611.018.22:57.086.13 uk Доповіді НАН України application/pdf Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біохімія Біохімія |
| spellingShingle |
Біохімія Біохімія Гулевський, О.К. Моісєєва, Н.М. Горіна, О.Л. Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу Доповіді НАН України |
| description |
Досліджено протиапоптотичну дію нейропептиду кіоторфін на моделі холодового стресу фібробластів
лінії L929. Вплив дипептиду на клітини аналізували за морфологічними показниками, за допомогою
цитофлуориметрії з одночасним фарбуванням annexin V/7-AAD та дослідженням виходу цитохрому с до
цитоплазми клітин. У вибраних умовах холодового стресу відмічено вірогідне збільшення кількості клітин
з морфологічними ознаками апоптозу за даними світлової мікроскопії, порушення асиметрії мембрани та
зареєстровано появу в цитоплазмі клітин цитохрому с. Доведено, що додавання кіоторфіну в концентрації 100 мкг/л до середовища культивування за 15 хв до моделювання холодового стресу сприяло вірогідному
зменшенню кількості клітин з ознаками апоптозу. Кількість annexin V⁺/7-AAD⁻-клітин після попередньої
інкубації фібробластів з дипептидом знижувалась до 19,1 ± 0,5 % порівняно зі зразками після холодового
стресу (55,3 ± 2,1 %), а кількість клітин, в цитоплазмі яких зареєстровано цитохром с, зменшувалася
в 3,65 раза. На підставі результатів досліджень висловлено припущення, що попередня інкубація з регуляторним нейропептидом кіоторфін у концентрації 100 мкг/л ефективно запобігає апоптозу у фібробластах L929 в умовах холодового стресу. |
| format |
Article |
| author |
Гулевський, О.К. Моісєєва, Н.М. Горіна, О.Л. |
| author_facet |
Гулевський, О.К. Моісєєва, Н.М. Горіна, О.Л. |
| author_sort |
Гулевський, О.К. |
| title |
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу |
| title_short |
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу |
| title_full |
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу |
| title_fullStr |
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу |
| title_full_unstemmed |
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу |
| title_sort |
нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії l929 в умовах холодового стресу |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2021 |
| topic_facet |
Біохімія |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/180576 |
| citation_txt |
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу / О.К. Гулевський, Н.М. Моісєєва, О.Л. Горіна // Доповіді Національної академії наук України. — 2021. — № 4. — С. 103-109. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT gulevsʹkiiok neiropeptidkíotorfínzapobígaêrozvitkuapoptozufíbroblastívlínííl929vumovahholodovogostresu AT moísêêvanm neiropeptidkíotorfínzapobígaêrozvitkuapoptozufíbroblastívlínííl929vumovahholodovogostresu AT gorínaol neiropeptidkíotorfínzapobígaêrozvitkuapoptozufíbroblastívlínííl929vumovahholodovogostresu AT gulevsʹkiiok neuropeptidekyotorphinpreventsthedevelopmentofapoptosisoffibroblastsl929undercoldstress AT moísêêvanm neuropeptidekyotorphinpreventsthedevelopmentofapoptosisoffibroblastsl929undercoldstress AT gorínaol neuropeptidekyotorphinpreventsthedevelopmentofapoptosisoffibroblastsl929undercoldstress |
| first_indexed |
2025-11-30T09:41:02Z |
| last_indexed |
2025-11-30T09:41:02Z |
| _version_ |
1850207803482832896 |
| fulltext |
103ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2021. № 4: 103—109
Ц и т у в а н н я: Гулевський О.К., Моісєєва Н.М., Горіна О.Л. Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку
апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2021. № 4.
С. 103—109. https://doi.org/10.15407/dopovidi2021.04.103
Раніше нами було показано, що холодовий стрес, який являє собою циклічний процес пе-
ребування біооб’єктів у гіпотермічних умовах з подальшим відігріванням до нормотермії,
призводить до появи апоптозу в клітинах in vivo та in vitro [1]. З літературних джерел відо мо,
що синтетичний аналог ендогенного лей-енкефаліну препарат “Даларгін” у гіпотер мічних
умовах виявляє захисну дію щодо клітин і тканин від патологічних змін [2]. Як механізми
протекторної дії гексапептиду називають антиокиснювальний ефект і його здатність зв’я-
зуватися з опіоїдними рецепторами клітинних мембран, що призводить до їх модифікації
та нормалізації роботи іонтранспортних систем [3].
https://doi.org/10.15407/dopovidi2021.04.103
УДК 577.112.6:576.36.017.6:611.018.22:57.086.13
О.К. Гулевський, https://orcid.org/0000-0002-4676-3375
Н.М. Моісєєва, https://orcid.org/0000-0002-9845-2317
О.Л. Горіна, https://orcid.org/0000-0003-4075-650X
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків
E-mail: ogorina2603@gmail.com
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу
фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу
Представлено академіком НАН України А.М. Гольцевим
Досліджено протиапоптотичну дію нейропептиду кіоторфін на моделі холодового стресу фібробластів
лінії L929. Вплив дипептиду на клітини аналізували за морфологічними показниками, за допомогою
цитофлуориметрії з одночасним фарбуванням annexin V/7-AAD та дослідженням виходу цитохрому с до
цитоплазми клітин. У вибраних умовах холодового стресу відмічено вірогідне збільшення кількості клітин
з морфологічними ознаками апоптозу за даними світлової мікроскопії, порушення асиметрії мембрани та
зареєстровано появу в цитоплазмі клітин цитохрому с. Доведено, що додавання кіоторфіну в концентра-
ції 100 мкг/л до середовища культивування за 15 хв до моделювання холодового стресу сприяло вірогідному
зменшенню кількості клітин з ознаками апоптозу. Кількість annexin V+/7-AAD–-клітин після попередньої
інкубації фібробластів з дипептидом знижувалась до 19,1 ± 0,5 % порівняно зі зразками після холодового
стресу (55,3 ± 2,1 %), а кількість клітин, в цитоплазмі яких зареєстровано цитохром с, зменшувалася
в 3,65 раза. На підставі результатів досліджень висловлено припущення, що попередня інкубація з регуля-
торним нейропептидом кіоторфін у концентрації 100 мкг/л ефективно запобігає апоптозу у фіброблас-
тах L929 в умовах холодового стресу.
Ключові слова: холодовий стрес, апоптоз, кіоторфін, фібробласти L929.
БІОХІМІЯ
BIOCHEMISTRY
104 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2021. № 4
О.К. Гулевський, Н.М. Моісєєва, О.Л. Горіна
Гіпотетично таку властивість можуть мати природні нейропептиди з мозку тварин-гі-
бернаторів, зокрема кіоторфін (Tyr—Arg), який має опіатоподібну активність. Найпершим
фізіологічним ефектом цього дипептиду описано рилізинг мет-енкефаліну з нервових за-
кінчень, що може обумовлювати прояв анальгезії після його введення [4]. Пізніше була
показана роль кіоторфіну в механізмах природних гіпометаболічних станів на тваринах-гі-
бернаторах, а також на незимосплячих залежно від температури та стану тварин [5]. Водно-
час на сьогодні нічого не відомо про протекторний вплив цього нейропептиду стосовно збе-
реження клітин за умов холодового стресу. Зважаючи на вищесказане, ми ставили за мету
дослідження протиапоптотичної дії нейропептиду кіоторфін на моделі холодового стресу
фібробластів лінії L929.
Матеріали та методи. У дослідженні використовували культуру фібробластів L929,
яку підтримували на живильному середовищі DMEM/F12 (“Biowest”, Франція), допов-
неному 10 % фетальної телячої сироватки (“Biowest”, Франція), 200 Од/мл бензилпеніци-
ліну (“Arterium”, Україна) та 200 мкг/мл стрептоміцину (“Arterium”, Україна), у зволожено-
му інкубаторі з 5 % СО2 при 37 С.
Перед моделюванням холодового стресу клітини переносили у 24-лункові планшети
(“SPL Life Sciences”, Корея) у концентрації 0,5 · 106 клітин/мл і культивували протягом 7 діб
у стандартних умовах. Після утворення моношару на 7-му добу планшети переносили в льо-
дову баню і витримували при 0—2 С 20 хв, далі культуру повертали в умови нор мотермії
(5 % СО2, 37 С) на 60 хв. Паралельно вели культуру, яку не піддавали дії холо ду (контроль).
Для дослідження дії нейропептиду кіоторфін (ТОВ “Пептидные Технологии”, РФ) на
фібробласти, піддані холодовому стресу, препарат додавали у концентрації 100 мкг/л до
середовища культивування за 15 хв до моделювання холодового стресу. У контрольні зраз-
ки та зразки без препарату додавали еквівалентний об’єм фізіологічного розчину.
Морфологію клітин досліджували методом світлової мікроскопії (“PZO-Warszava”, Поль-
ща) під імерсією (ок. 8, об. 100) після забарвлення гематоксиліном та еозином. Після холо-
дового стресу моношар трипсинізували розчином трипсину (0,25 % (“Sigmа”, США)) у роз-
чині версену (“PAA”, США), витримували 5 хв і відмивали від ферментного розчину сере-
довищем DMEM/F12. Далі клітини промивали фосфатно-сольовим буферним розчином
(PBS) і фік сували в метанолі, додавали 1 % розчин гематоксиліну (Sigma-Aldrich, США) з
по дальшим промиванням PBS та забарвленням 1 % розчином еозину (Sigma-Aldrich, США).
Наявність апоптотичних змін у клітинах аналізували за такими ознаками клітин: пікноз клі-
тин, фрагментація ядра та блебінг. Усього підраховували по 200 клітин у зразку. Кількість клі-
тин з ознаками апоптозу виражали у відсотках до загальної кількості підрахова них клітин.
Подвійне забарвлення annexin V та 7-AAD. Після холодового стресу моношар трипси-
нізували як описано вище. Далі відмивали 1х розчином PBS та після центрифугування
інкубували в 100 мкл буфера для зв’язування annexin V (0,1 М Hepes/NaOH (pH 7,4),
1,4 М NaCl, 25 мМ CaCl2), що містить 5 мкл FITS-кон’югованого annexin V (BD Biosciences,
США) та 5 мкл (2,5 мкг/мл) 7-AAD (BD Biosciences, США), протягом 10 хв при кімнатній
тем пературі в темряві. Клітини аналізували з використанням протокового цитометра
FACS Calibur та програмного забезпечення Cell Quest (BD Biosciences, США). За 100 %
приймали 10000 клітин. Одночасне забарвлення вітальним ДНК-специфічним барвни-
ком 7-AAD та annexin V, який має високу афінність до фосфатидилсерину, дає змогу ди-
105ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2021. № 4
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу
ференціювати клітини на стадії апоптозу (annexin V+/7-AAD–) від вже загиблих (annexin
V+/7-AAD+, некроз) [6].
Дослідження виходу цитохрому с до цитоплазми. Клітинну культуру переводили в
96-лун ковий планшет у концентрації 0,5 · 106 клітин/мл і культивували протягом 48 год.
Після утворення моношару відтворювали холодовий стрес як описано вище. Після 60 хв
інкубації в умовах нормотермії видаляли культуральне середовище з лунок, промивали 1х
PBS і фіксували клітини в буфері BD Cytofix (BD Biosciences, США) протягом 10 хв. Пер-
меабілізацію клітин та подальші етапи промивання проводили за допомогою буфера 1х
Perm/Wash (BD Biosciences, США) за інструкцією виробника. Після цього в кожну лунку
додавали по 50 мкл моноклональних антитіл 6H2.B4 до цитохрому с, кон’югованих з Alexa
Fluor® 488 (BD Biosciences, США), та інкубували в темряві. Антитіла видаляли триразовим
промиванням буфером 1х Perm/Wash. Після заключного промивання забарвлювали ядра
клітин додаванням 2 мкг/мл розчину Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, США) за рекомен до-
ваною виробником процедурою аналізу. Інтенсивність флуоресценції реєстрували за до-
помогою конфокального лазерного сканувального мікроскопа (“Carl Zeiss”, Німеччина).
Для візуалізації, підрахунку кількості забарвлених клітин використовували програми LSM
510 та LSM Image Examiner. За 100 % приймали 200 клітин.
Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням програми
Statgraphics plus for Windows 2.1 (“Manugistics Inc.”, США) за непараметричним критерієм
Манна—Уітні. Експериментальні дані наведені як середнє арифметичне ± середнє квад-
ратичне відхилення. Статистично значущими вважали відмінності при р < 0,05.
Результати досліджень. Для виявлення та дослідження клітин, що знаходяться у стані
апоптозу, розроблено безліч різноманітних методів та їх модифікацій. Ці методи базуються
на реєстрації подій, пов’язаних зі зменшенням розмірів та збільшенням щільності клітин,
змінами складу зовнішньої мембрани, фрагментацією ядерної ДНК, змінами вмісту молеку-
лярних маркерів апоптозу [7, 8].
Морфологічна картина апоптозу включає зменшення об’єму клітини, конденсацію й
фрагментацію ядра та блебінг плазматичної мембрани, що виявляється методом світлової
мікроскопії препаратів, забарвлених гематоксиліном та еозином [8]. Тому на першому етапі
досліджень антиапоптотичну дію синтетичного нейропептиду кіоторфін оцінювали на мо-
делі холодового стресу фібробластів лінії L929 за морфологічними показниками апоптозу.
Як видно з рис. 1, після холодового стресу кількість клітин з апоптотичними ознаками ві-
рогідно збільшувалася в 5,3 раза щодо контролю. У досліді з попередньою інкубацією фі-
бробластів з нейропептидом перед холодовим стресом кількість апоптотичних клітин змен-
шувалася (19,3 ± 1,4 %, р < 0,05) відносно значень для зразків, підданих холодовому стресу,
але вірогідно (р < 0,05) перевищувала контрольні показники.
Одними з ранніх показників запуску апоптозу в еукаріотичних клітинах є біохімічні
зміни у фосфоліпідному бішарі плазматичної мембрани, що виявляється в переміщенні
фос фатидилсерину на її зовнішню сторону. Це призводить до втрати асиметрії плазматич-
ної мембрани [7]. Для ідентифікації цього процесу загальноприйнятим є використання ре-
комбінантного білка annexin V, який має високу афінність до фосфатидилсерину, разом з
катіонним барвником 7-AAD, здатним проникати всередину клітини тільки у разі пору-
шення цілісності цитоплазматичної мембрани [6]. У таблиці наведені дані щодо кількості
106 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2021. № 4
О.К. Гулевський, Н.М. Моісєєва, О.Л. Горіна
annexin V+/7-AAD– та annexin V+/7-AAD+-клітин у суспензії фібробластів після холодово-
го стресу. Результати досліджень свідчать про те, що після холодового стресу (20 хв при 0 С
з подальшим поверненням в умови нормотермії на 60 хв при 37 С) зареєстровано підви-
щення кількості клітин з порушенням асиметрії мембрани порівняно з контролем (інтак-
тними клітинами). Встановлено, що в контрольній групі відносна кількість annexin V+/7-
AAD–-клітин (клітини в стадії апоптозу) становила 15,1 ± 1,1 % всієї популяції, а після хо-
лодового стресу — 55,3 ± 2,1 %. Завдяки інкубації клітин із синтетичним нейропептидом
кіоторфін у концентрації 100 мкг/л перед холодовим стресом цей показник вірогідно зни-
зився до 19,1 ± 0,5 % відносно значень зразків, які піддавалися тільки дії холодового стресу.
За результатами аналізу кількості клітин з ознаками некрозу (annexin V+/7-AAD+-
клітини) встановлено, що в нормі їх кількість не перевищувала 7,2 ± 0,6 %, проте за умов
холодового стресу збільшувалася до 18,1 ± 1,4 %. Після додавання кіоторфіну кількість
annexin V+/7-AAD+-клітин достовірно зменшувалася і становила 10,3 ± 0,2 %.
Як відомо, апоптоз, спричинений зниженням температури нижче фізіологічної норми
(не екстремальні низькі температури), розвивається за мітохондріальним шляхом запуску
цього процесу. Гіпотермія призводить до змін біологічної функції мітохондрій, при цьому
спостерігається зниження трансмембранного потенціалу, порушення проникності мітохон-
дріальних мембран та вихід цитохрому с і ряду інших білків у цитозоль [9]. Отже, поява в
цитоплазмі клітин цитохрому с є маркером апоптотичного процесу. У вибраних нами умо-
вах експерименту холодовий стрес призводить до збільшення кількості клітин, у цитоплаз-
Вплив нейропептиду кіоторфін на кількість апоптотичних
(annexin V+/7-ААD–) та некротичних (annexin V+/7-ААD+)
фібробластів L929 у контролі і після холодового стресу, %, n = 5
Показник Контроль Холодовий стрес Холодовий стрес +
+ кіоторфін
Annexin V+/7-AAD– 15,1 ± 1,1 55,3 ± 2,1a 19,1 ± 0,5c
Annexin V+/7-AAD+ 7,2 ± 0,6 18,1 ± 1,4b 10,3 ± 0,2d
a Відмінності вірогідні (р < 0,05) порівняно з кількістю annexin V+/7-AAD–-клітин у контролі.
b Відмінності вірогідні (р < 0,05) порівняно з кількістю annexin V+/7-AAD+-клітин у контролі.
c Відмінності вірогідні (р < 0,05) порівняно з кількістю annexin V+/7-AAD–-клітин у зразках після холодо-
вого стресу.
dВідмінності вірогідні (р < 0,05) порівняно з кількістю annexin V+7/AAD+-клітин у зразках після холодо-
вого стресу.
Рис. 1. Кількість апоптотичних фібробластів L929,
підданих холодовому стресу та попередній інку-
бації з кіоторфіном (100 мкг/л). За 100 % прийма-
ли 200 клітин. a — відмінності вірогідні (р < 0,05)
порівняно з контролем; b — відмінності вірогідні
(р < 0,05) порівняно зі значеннями для зразків
після холодового стресу; n 5
107ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2021. № 4
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу
мі яких виявлено цитохром с, до рівня 26,3 ± 2,1 % (рис. 2). Попередня інкубація з кіоторфі-
ном у концентрації 100 мкг/л сприяла вірогідному (р < 0,05) зменшенню цього показника
після холодового стресу до 7,2 ± 1,2 %, рівня контрольних значень.
Обговорюючи механізм протекторної дії кіоторфіну на підставі наявних експеримен-
тальних результатів, можна допустити, що, найімовірніше, він носить рецепторний харак-
тер, хоча конкретні дані за цим питанням нам невідомі. Водночас за результатами деяких
робіт, дипептид регулює транспорт Ca2+ як через плазматичну, так і через мітохондріальну
мембрани. Зокрема, кіоторфін, який був виділений з мозку ховраха, що гібернує, в ізольо-
ваних препаратах серця (волокна передсердя та окремі клітини шлуночка) жаби блокував
транспорт Ca2+ через канали, а в ізольованих кардіоміоцитах щурів та ховрахів — збіль-
шував його. Це вказує на видоспецифічність дії кіоторфіну відносно іонного транспорту в
серцевих клітинах [10]. В експериментах з використанням клітинних культур показано, що
кіоторфін окрім стимуляції Ca2+-сигналізації впливає на проліферацію залежно від кон-
центрації пептиду в середовищі та умов культивування [11]. Негативна дія кіоторфіну на
індуковані норадреналіном ріст преадипоцитів і синтез ДНК у клітинах, що культивуються,
а також пригнічення Ca2+-відповіді свіжовиділених клітин на норадреналін відмічалися
тільки у вузькому діапазоні концентрацій дипептиду. Крім того, дані зазначених робіт під-
тверджують наявність рецепторів до кіоторфіну й у периферичних тканинах, де пептид
може виконувати функцію регулювання мітогенної активності. Ряд дослідників встанови-
ли, що рівень кіоторфіну в спинномозковій рідині знижується у пацієнтів із захворюван-
ням Альцгеймера в стані хронічного болю, а це може служити біомаркером для оцінки болю
незалежно від рівня когнітивних порушень хворого [12]. Проте досі не встановлено точ-
ний механізм дії дипептиду, а ймовірний рецептор ще не ідентифікований [13].
Не виключено, що як і даларгін (синтетичний аналог ендогенного лей-енкефаліну) [3],
кіоторфін може впливати на утворення активних форм кисню в клітинах фібробластів. По-
рівнюючи ефективність антиапоптотичної дії даларгіну [1] та кіоторфіну, можна побачити,
що вона дуже близька і це опосередковано вказує на подібний механізм дії, який, імовірно,
пов’язаний з регуляцією транспорту іонів кальцію та його вивільненням з клітинних депо.
Узагальнюючи вищесказане, можна зробити висновок, що попередня інкубація з кіо-
торфіном у концентрації 100 мкг/л ефективно пригнічує апоптоз у фібробластах L929 в
умовах холодового стресу. З’ясування питань характеру рецепції та механізмів захисної дії
нейропептидів в умовах холодового стресу залишається відкритим.
Рис. 2. Вплив попередньої інкубації фіброблас-
тів L929 з нейропептидом кіоторфін (100 мкг/л)
на кількість фібробластів, у цитоплазмі яких ви-
явлено цитохром с, після холодового стресу. За
100 % приймали 200 клітин. a — відмінності ві-
рогідні (р < 0,05) порівняно з контролем; b — від-
мінності вірогідні (р < 0,05) порівняно зі значен-
нями для зразків після холодового стресу; n 5
108 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2021. № 4
О.К. Гулевський, Н.М. Моісєєва, О.Л. Горіна
ЦИТОВАНА ЛІТЕРАТУРА
1. Гулевський О.К., Моісєєва Н.М., Горіна О.Л. Антиапоптотична дія нейропептиду лей-енкефаліну
що до лейкоцитів донорської крові, підданих холодовому стресу. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2019. № 4.
С. 94—100. https://doi.org/10.15407/dopovidi2019.04.094
2. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., Нарыжная Н.В., Пей Ж., Колар Ф., Жанг И., Портниченко А.Г., Ванг Х.
Эндогенная опиоидная система как звено срочной и долговременной адаптации организма к экстре-
мальным воздействиям. Перспективы клинического применения опиоидных пептидов. Вестн. Рос.
академии мед. наук. 2012. 67, № 6. C. 73—82. https://doi.org/10.15690/vramn.v67i6.287
3. Таджибова Л.Т., Астаева М.Д., Исмаилова Ж.Г., Даудова Т.Н., Кличханов Н.К. Влияние даларгина на
свободнорадикальные процессы в крови крыс при умеренной гипотермии. Бюлл. эксп. биологии и ме-
ди цины. 2010. 150, № 9. С. 271—274. https://doi.org/10.1007/s10517-011-1128-z
4. Shiomi H., Kuraishi Y., Ueda H., Harada Y., Amano H., Takagi H. Mechanism of kyotorphin-induced re lease
of Met-enkephalin from guinea pig striatum and spinal cord. Brain. Res. 1981. 221, № 1. P. 161—169. https://
doi.org/10.1016/0006-8993(81)91070-2
5. Игнатьев Д.А., Сухова Г.С., Ляшков А.Е. Температурные и кардиотропные эффекты пептидов киотор-
фина и неокиоторфина в опытах на зимоспящих и незимоспящих животных. Успехи физиол. наук. 2009.
40, № 3. С. 68—88.
6. van Engeland M., Nieland L.J., Ramaekers F.C., Schutte B., Reutelingsperger C.P. Annexin V-affinity assay:
a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry. 1998. 31, № 1.
P. 1—9. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0320(19980101)31:1<1::aid-cyto1>3.0.co;2-r
7. Neves A.A., Brindle K.M. Imaging cell death. J. Nucl. Med. 2014. 55, № 1. Р. 1—4. https://doi.org/10.2967/
jnumed.112.114264
8. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol. Pathol. 2007. 35, № 4. P. 495—516. https://
doi.org/10.1080/01926230701320337
9. Kong X., Liu H., He X., Sun Y., Ge W. Unraveling the mystery of cold stress-induced myocardial injury.
Front. Physiol. 2020. № 11. 580811. https://doi.org/10.3389/fphys.2020.580811
10. Kokoz Y.M., Zenchenko K.I., Alekseev A.E., Korystova A.F., Lankina D.A., Ziganshin R.H., Mikhaleva I.I.,
Ivanov V.T. The effect of some peptides from the hibernating brain on Ca2+ current in cardiac cells and on
the activity of septal neurons. FEBS Lett. 1997. 411, № 1. P. 71—76. https://doi.org/10.1016/s0014-
5793(97)00607-8
11. Бронников Г.Е., Колаев С.Г., Долгачева Л.П., Крамарова Л.И. Киоторфин подавляет пролиферацию и
Ca2+-сигнализацию бурых преадипоцитов. Бюлл. эксп. биологии и медицины. 2006. 141, № 2. С. 184—186.
12. Santos S.M., Garcia-Nimo L., Sá Santos S., Tavares I., Cocho J.A., Castanho M.A. Neuropeptide kyotorphin
(Tyrosyl-Arginine) has decreased levels in the cerebro-spinal fluid of Alzheimer’s disease patients: potential
diagnostic and pharmacological implications. Front. Aging. Neurosci. 2013. 5. Art. 68. https://doi.org/10.3389/
fnagi.2013.00068
13. Perazzo J., Castanho M.A., Sá Santos S. Pharmacological potential of the endogenous dipeptide kyotorphin
and selected derivatives. Front. Pharmacol. 2017. 7. Art. 530. https://doi.org/10.3389/fphar.2016.00530
Надійшло до редакції 27.04.2021
REFERENCES
1. Gulevsky, A. K., Moiseyevа, N. N. & Gorina, O. L. (2019). Antiapoptotic effect of leu-enkephalin neurope-
ptide on donor blood leukocytes under cold stress. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr., No. 4, pp. 94-100 (in
Ukrainian). https://doi.org/10.15407/dopovidi2019.04.094
2. Lishmanov, Y. B., Maslov, L. N., Naryzhnaya, N. Y., Pej, Z. H., Kolar, F., Zhang, I., Portnichenko, A. G. & Vang,
H. (2012). Endogenous opioid system as a mediator of acute and long-term adaptation to stress. Vestnik
Rossijskoj akademii medicinskih nauk, 67, No. 6, pp. 73-82 (in Russian). https://doi.org/10.15690/vramn.
v67i6.287
3. Tadzhibova, L. T., Astaeva, M. D., Ismailova, J. G., Daudova, T. N. & Klichkhanov, N. K. (2011). Effects of
dalargin on free radical processes in the blood of rats exposed to moderate hypothermia. Bull. Exp. Biol.
Med., 150, No. 3, pp. 304-306. https://doi.org/10.1007/s10517-011-1128-z
109ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2021. № 4
Нейропептид кіоторфін запобігає розвитку апоптозу фібробластів лінії L929 в умовах холодового стресу
4. Shiomi, H., Kuraishi, Y., Ueda, H., Harada, Y., Amano, H. & Takagi, H. (1981). Mechanism of kyotorphin-
induced release of Met-enkephalin from guinea pig striatum and spinal cord. Brain. Res., 221, No. 1, pp. 161-
169. https://doi.org/10.1016/0006-8993(81)91070-2
5. Ignatiev, D. A., Sukhova, G. S. & Liashkov, A. E. (2009). Temperature and cardiotropic effects of kioto-
rphyn and neokiotorphyn in hibernating and nonhibernating animals. Uspekhi Fiziologicheskih Nauk, 40,
No. 3, pp. 68-88 (in Russian).
6. van Engeland, M., Nieland, L. J., Ramaekers, F. C., Schutte B. & Reutelingsperger, C. P. (1998). Annexin
V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry,
31, No. 1, pp. 1-9. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0320(19980101)31:1<1::aid-cyto1>3.0.co;2-r
7. Neves, A. A. & Brindle, K. M. (2014). Imaging cell death. J. Nucl. Med., 55, No. 1, pp. 1-4. https://doi.
org/10.2967/jnumed.112.114264
8. Elmore, S. (2007). Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol. Pathol., 35, No. 4, pp. 495-516.
https://doi.org/10.1080/01926230701320337
9. Kong, X., Liu, H., He, X., Sun, Y. & Ge, W. (2020). Unraveling the mystery of cold stress-induced myocardial
injury. Front. Physiol., No. 11, 580811. https://doi.org/10.3389/fphys.2020.580811
10. Kokoz, Y. M., Zenchenko, K. I., Alekseev, A. E., Korystova, A. F., Lankina, D. A., Ziganshin, R. H., Mikhaleva,
I. I. & Ivanov, V. T. (1997). The effect of some peptides from the hibernating brain on Ca2+ current in cardiac
cells and on the activity of septal neurons. FEBS Lett., 411, No. 1, pp. 71-76. https://doi.org/10.1016/s0014-
5793(97)00607-8
11. Bronnikov, G. E., Kolaeva, S. G., Dolgacheva, L. P. & Kramarova, L. I. (2006). Kyotorphin suppresses
proliferation and Ca2+ signaling in brown preadipocytes. Bull. Exp. Biol. Med., 141, pp. 223-225. https://doi.
org/10.1007/s10517-006-0133-0
12. Santos, S. M., Garcia-Nimo, L., Sá Santos, S., Tavares, I., Cocho, J. A. & Castanho, M. A. (2013). Neuropeptide
kyotorphin (Tyrosyl-Arginine) has decreased levels in the cerebro-spinal fluid of Alzheimer’s disease patients:
potential diagnostic and pharmacological implications. Front. Aging. Neurosci., 5, art. 68. https://doi.
org/10.3389/fnagi.2013.00068
13. Perazzo, J., Castanho, M. A. & Sá Santos, S. (2017). Pharmacological potential of the endogenous dipeptide
kyotorphin and selected derivatives. Front. Pharmacol., 7, art. 530. https://doi.org/10.3389/fphar.2016.00530
Received 27.04.2021
О.K. Gulevskyy, https://orcid.org/0000-0002-4676-3375
N.M. Moisieieva, https://orcid.org/0000-0002-9845-2317
O.L. Gorina, https://orcid.org/0000-0003-4075-650X
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the NAS of Ukraine, Kharkiv
E-mail: ogorina2603@gmail.com
NEUROPEPTIDE KYOTORPHIN PREVENTS THE DEVELOPMENT
OF APOPTOSIS OF FIBROBLASTS L929 UNDER COLD STRESS
We were study the antiapoptotic effect of the neuropeptide kyotorphin in a model of cold stress fibroblasts L929.
The effect of dipeptide on cells was analyzed by morphological parameters, using cytofluorimetry with simul-
taneous staining of annexin V/7-AAD and study of the release of cytochrome c to the cytoplasm of cells. Under
selected conditions of cold stress, there was a significantly increase in the number of cells with morphological
features of apoptosis according to light microscopy, violation of membrane asymmetry, and the appearance of
cytochrome c cells in the cytoplasm was registered. It has been proved that the addition of kyotorphin at a con-
centration of 100 μg/l to the culture medium 15 min before the modeling of cold stress significantly reduces
the number of cells features of apoptosis. The number of annexin V+/7-AAD–-cells after pre-incubation of fibro-
blasts with dipeptide decreased to 19.1 ± 0.5 % compared to samples after cold stress (55.3 ± 2.1 %), and the
number of cells in the cytoplasm of which was registered cytochrome c, decreased by 3.65 times. Studies have
suggested that pre-incubation with the regulatory neuropeptide kyotorphin at a concentration of 100 μg/l ef-
fectively prevents apoptosis in fibroblasts L929 under cold stress.
Keywords: cold stress, apoptosis, kyotorphin, fibroblasts L929.
|