Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон
З використанням модифiкованого золем полiкремнiєвої кислоти полi-N-вiнiлпiролiдону було розроблено нерозчинне в фiзiологiчних умовах потенцiальне ранове гiдрогелеве покриття з iммобiлiзованим трипсином з високим виходом за активнiстю (75,6%), стабiльнiстю при зберiганнi та γ-стерилiзацiї, пролонгова...
Gespeichert in:
| Datum: | 2009 |
|---|---|
| 1. Verfasser: | |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2009
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18694 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон / И.И. Романовская // Доп. НАН України. — 2009. — № 9. — С. 182-187. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860037719463297024 |
|---|---|
| author | Романовская, И.И. |
| author_facet | Романовская, И.И. |
| citation_txt | Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон / И.И. Романовская // Доп. НАН України. — 2009. — № 9. — С. 182-187. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| description | З використанням модифiкованого золем полiкремнiєвої кислоти полi-N-вiнiлпiролiдону було розроблено нерозчинне в фiзiологiчних умовах потенцiальне ранове гiдрогелеве покриття з iммобiлiзованим трипсином з високим виходом за активнiстю (75,6%), стабiльнiстю при зберiганнi та γ-стерилiзацiї, пролонгованої дiї. Розширення профiлю протеолiтичної активностi в область кислих значень pH, визначення кiнетичних параметрiв iммобiлiзованого ферменту дозволяють оптимiзувати дозу й активнiсть iммобiлiзованого препарату.
Basing on poly-N-vinylpyrrolidone modified by polysilicic acid sol, the wound water-insoluble hydrogel coating with immobilized trypsin, with high yield of activity (75.6%), stable at the storage and γ-sterilization, and with prolonged action is developed. The widening of catalytic activity in the acidic region of pH and the determination of kinetic parameters of the immobilized enzyme provides a possibility of the dose optimization and preparation activity, respectively.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:54:45Z |
| format | Article |
| fulltext |
оповiдi
НАЦIОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМIЇ НАУК
УКРАЇНИ
9 • 2009
БIОХIМIЯ
УДК 615.355:577.152.34
© 2009
И.И. Романовская
Потенциальное раневое покрытие с трипсином,
иммобилизованным в модифицированный
поли-N-винилпирролидон
(Представлено академиком НАН Украины С.А. Андронати)
З використанням модифiкованого золем полiкремнiєвої кислоти полi-N-вiнiлпiролiдону
було розроблено нерозчинне в фiзiологiчних умовах потенцiальне ранове гiдрогелеве по-
криття з iммобiлiзованим трипсином з високим виходом за активнiстю (75,6%), ста-
бiльнiстю при зберiганнi та γ-стерилiзацiї, пролонгованої дiї. Розширення профiлю про-
теолiтичної активностi в область кислих значень pH, визначення кiнетичних параме-
трiв iммобiлiзованого ферменту дозволяють оптимiзувати дозу й активнiсть iммобi-
лiзованого препарату.
Современные полимерные раневые покрытия с биологически активными веществами (БАВ)
отличаются от традиционных текстильных материалов и представлены гелями, гидрокол-
лоидами, пленками, пленкообразующими композициями и др. [1, 2]. Поскольку в настоящее
время установлено, что процесс репарации раны является ферментативным с необходи-
мым присутствием влажной среды, актуальна разработка нерастворимых в физиологичес-
ких условиях неадгезивных полимерных гидрогелевых покрытий с иммобилизованными
протеолитическими ферментами. Последние способны размягчать и лизировать некроти-
ческие образования, обладают антимикробной активностью и охлаждающим действием,
хорошо моделируются и не травмируют рану, позволяют визуально контролировать ее
состояние [3].
Перспективным носителем для создания подобных материалов является широко исполь-
зуемый в медицине поли-N-винилпирролидон, который характеризуется собственной физи-
ологической активностью, отсутствием токсичности, возможностью модификации [4].
Трипсин — протеолитический фермент с широкой субстратной специфичностью — изби-
рательно деградирует некротизированные ткани, разжижает сгустки крови, снижает рези-
стентность гнойной микрофлоры к антибиотикам, тем самым ускоряя процесс заживле-
ния гнойных ран, что позволяет использовать его в раневых покрытиях преимущественно
сорбционного типа (текстильные повязки Дальцекс-трипсин, ПАКС-трипсин) [5, 6]. Однако
182 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №9
иммобилизация трипсина в нерастворимую полимерную матрицу в ряде случаев приводит
к существенной потере исходной активности (на 33% в пленках из фторопласта [7], на 58%
в гидрогелевых пленках хитозана, модифицированного додецилсульфатом натрия [8]).
В связи с этим представляет интерес разработка нового гидрогелевого раневого
покрытия с трипсином на основе модифицированного золем поликремниевой кислоты
поли-N-винилпирролидона и подробное исследование физико-химических характеристик
препарата.
Материалы и методы исследований. В работе использовали трипсин (К.Ф. 3.4.21.4)
(фирмы “Merck”, ФРГ) с исходной протеолитической активностью (216±11) ПЕ/г фермента;
поли-N-винилпирролидон (ПВП) (ММ 2 · 106), золь поликремниевой кислоты.
Протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона [9], со-
держание белка — методом Лоури-Хартри [10]. ПВП модифицировали, согласно [3]. Вяз-
кость растворов определяли, согласно данным работы [11]. Иммобилизацию трипсина про-
водили в ходе модификации матрицы, смесь перемешивали до однородной консистенции,
выливали в формы, высушивали при комнатной температуре до 45%-го содержания во-
ды, герметично упаковывали и стерилизовали γ-облучением (15 кГр, ООО “Гемопласт”).
ИК-спектры ПВП снимали в пленках и таблетках KBr на спектрофотометре Specord IR-75.
Зависимости протеолитической активности свободного и иммобилизованного трипсина
от pH и температуры изучали в одинаковых по активностям пробах после инкубации в бу-
ферных растворах (pH 3,0–12,0) и в диапазоне температур от 10 до 80 ◦С (pH 7,4). рК
ионогенных групп активного центра фермента определяли графически [12].
Для исследования термостабильности равные по активности пробы термостатировали
при 60 ◦С и определяли остаточную активность с интервалом 10–20 мин. Константы ско-
рости термоинактивации (Kин) вычисляли по тангенсу угла наклона прямой графика за-
висимости натурального логарифма величины остаточной активности от времени методом
линейной регрессии. Кинетику гидролиза свободным и иммобилизованным трипсином ис-
следовали по начальным скоростям гидролиза казеина, представляли в графической форме
в координатах Хейнса. Константу субстратного ингибирования фермента ki, оптимальную
концентрацию субстрата Sопт и оптимальную скорость реакции Vопт определяли методом
Диксона [13].
Результаты и их обсуждение. Матрица для иммобилизации разработана совместно
со с. н. с. И.И. Пашкиным (Московская государственная академия тонкой химической те-
хнологии им. М.В. Ломоносова). Модифицированный ПВП представляет собой органо-не-
органический гибрид — продукт объединения кремнийсодержащего соединения и высоко-
молекулярного ПВП в целостную структуру, при этом носитель теряет способность ра-
створяться в воде, что позволяет получать нерастворимые в физиологических условиях
покрытия. Получению такой матрицы способствуют множественные водородные связи ме-
жду атомами кислорода карбонильных групп молекул органического полимера и водорода
силанольных груп золя поликремниевой кислоты, образующиеся в результате процессов
структурообразования в мягких условиях.
В ИК-спектрах модифицированного ПВП наблюдается снижение интенсивности полосы
поглощения при 3750 см−1, которая характеризует свободные силанольные группы и появ-
ление широкой полосы с максимумом около 3350 см−1, отвечающей силанольным группам,
участвующим в образовании водородной связи.
Установлено оптимальное массовое соотношение фермент : ПВП 1 : 10, способствующее
сохранению высокого уровня включения фермента и удовлетворительных органолептиче-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №9 183
Рис. 1. Зависимость приведенной вязкости растворов от концентрации ПВП: 1 — ПВП; 2 — ПВП + золь
поликремниевой кислоты; 3 — ПВП + фермент; 4 — ПВП + фермент + золь поликремниевой кислоты
ских характеристик материала. В результате иммобилизации получены прозрачные эласти-
чные пленки с количественным включением белка, 75,6%-м сохранением протеолитической
активности после иммобилизации и 100%-м в течение 8 мес. хранения при 0–4 ◦С.
Характеристики трипсина, иммобилизованного в модифицированный ПВП:
протеолитическая активность, ПЕ/г препарата: 163,4 ± 3,6;
содержание фермента, мг/г препарата: 8,11 ± 0,32;
содержание воды, %: 45,0;
органолептические характеристики: однородные, эластичные пленки,
без запаха;
площадь, см2: 64,1 ± 1,9;
толщина, мм: 3,5 ± 0,3;
масса, г: 5,5 ± 0,2;
растворимость в воде, физ. растворе: нерастворимы.
О наличии взаимодействия фермент — матрица свидетельствуют изменения реологиче-
ских характеристик растворов ПВП, трипсина и модификатора. Нами показано, что вяз-
кость растворов в присутствии в нем трех компонентов: ПВП, фермента и золя поликрем-
ниевой кислоты резко увеличивается при возрастании концентрации ПВП (рис. 1), что
указывает на образование комплексов белка с компонентами матрицы [4]. Взаимодействие
носит достаточно сложный характер и может быть обусловлено также механическим вклю-
чением в сшитый золем поликремниевой кислотой полимер.
Экспериментальные исследования свойств полученного препарата показали расширение
pH-оптимума на 4 ед. в область кислых значений (pH 4,0–9,0) (рис. 2, а), обусловленное вли-
янием высокого значения pH матрицы в процессе иммобилизации на рК ионогенных групп
активного центра трипсина (табл. 1). Иммобилизованный трипсин стабилен при pH 5,5, ха-
рактерном для содержимого раны, и после 3 ч инкубации полностью сохраняет активность,
тогда как свободный за это же время утрачивает ее на 65%.
Установлено, что иммобилизация приводит к деформации термопрофиля активности
и расширению температурного оптимума (37–50 ◦С) препарата (см. рис. 2, б ), что предпо-
лагает его меньшую склонность к инактивации в условиях повышенных температур и под-
184 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №9
Рис. 2. Зависимость протеолитической активности свободного и иммобилизованного трипсина от pH (а)
и температуры (б ) инкубационной среды.
Трипсин: 1, 1
′ — иммобилизованный; 2, 2
′ — свободный
тверждается найденными Kин, составившими для свободного и иммобилизованного трип-
сина 0,75 и 0,41 мин−1 соответственно.
Кинетические параметры реакции гидролиза казеина двумя формами трипсина приве-
дены в табл. 2. Следует отметить, что иммобилизация фермента приводит к изменению KМ
вследствие увеличения в условиях гетерогенного катализа сродства фермента к субстрату,
образования более прочного фермент-субстратного комплекса с уменьшением скорости его
распада и, поскольку эта стадия является лимитирующей, то соответственно снижается
скорость всего процесса. Уменьшение Vмакс обусловлено также диффузионными ограни-
чениями матрицы. В диапазоне концентраций, превышающих 3,1 г/дм3 для свободного
трипсина и 1,0 г/дм3 для иммобилизованного, наблюдается ингибирование фермента суб-
стратом: ki для свободного и иммобилизованного фермента составили 12,5 и 1,44 г/дм3 со-
ответственно. Вычисленные Soпт и Voпт характеризуют концентрацию субстрата и скорость
реакции в условиях минимального проявления ингибирования субстратом. Проведенные
кинетические исследования позволяют в определенной степени прогнозировать скорость
лизиса некротических образований и необходимую дозу препарата.
О десорбции иммобилизованного трипсина из матрицы судили по активности фермента,
обнаруженного в инкубационной среде (рис. 3). Установлено, что после 1 ч инкубации по-
Таблица 1
Трипсин pH-оптимум pK1 pK2
Свободный 8,0–9,0 6,5 11,5
Иммобилизованный 4,0–9,0 3,2 11,4
Таблица 2
Трипсин Kм, г/дм3
Vмакс,
мкмоль/(г · мин) ki, г/дм3
Sопт, г/дм3
Voпт,
мкмоль/(г · мин)
Свободный 0,67 608,6 12,5 3,1 458,25
Иммобилизованный 0,24 72,68 1,44 1,0 72,68
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №9 185
Рис. 3. Изменения протеолитической активности иммобилизованного трипсина при десорбции
лученного препарата уровень обнаруженной протеолитической активности составил 38,1%,
достигая максимального через 4 ч и оставаясь неизменным в последующие 24 ч, т. е. иммо-
билизованный в структуру модифицированного полимера трипсин обеспечивает пролонги-
рованное действие препарата, обусловленное стабилизирующим влиянием матрицы. Выяв-
ленное свойство отвечает современным требованиям оптимального времени нахождения
повязки на ране (1–3 сут) [14], в течение которого должно проявляться биологическое дей-
ствие лечебного покрытия.
После стерилизации протеолитическая активность иммобилизованного препарата со-
ставила 54,1% от исходной.
Таким образом, в результате иммобилизации трипсина в поли-N-винилпирролидон, мо-
дифицированный золем поликремниевой кислоты, получено потенциальное раневое гидро-
гелевое полимерное покрытие с высоким уровнем сохранения исходной активности, ста-
бильностью в условиях значений pH раневого содержимого, при хранении и к стерилиза-
ции γ-облучением, пролонгированного протеолитического действия.
1. Юданова Т.Н., Решетов И.В. Современные раневые покрытия: получение и свойства: Обзор //
Хим.-фарм. журн. – 2006. – 40, № 2. – С. 24–31.
2. Валуев Л.И., Валуева Т.А., Валуев И.Л. и др. Полимерные системы для контролируемого выделения
биологически активных соединений // Успехи химии. – 2003. – 43, № 2. – С. 307–328.
3. Пат. РФ 2198685 С1. Медицинский полимерный гелевый материал и лечебные средства на его осно-
ве / И.И. Пашкин, В. Ю. Богачев, В.П. Зубов. – No 2001134048/14; Заявл. 18.12.01; Опубл. 20.02.03.
4. Кирш Ю.Э. Поли-N-винилпирролидон и другие поли-N-виниламиды: Синтез и физико-химические
свойства. – Москва: Наука, 1998. – 252 с.
5. Эфендиев А.И., Толстых П.И., Дадашев А.И., Маршава О.М. Местная пролонгированная энзимо-
терапия гнойных ран // Хирургия. – 1991. – № 7. – С. 48–50.
6. Назаренко Г.И., Сугурова И.Ю., Глянцев С.П. Рана. Повязка. Больной. – Москва: Медицина, 2002. –
472 с.
7. Вирник А.Д., Гостищев В.К., Кильдеева Н.Р. и др. Получение пленок и волокон, содержащих про-
теолитические ферменты // Прикл. биохимия и микробиология. – 1987. – 23, № 2. – С. 78–83.
8. Кильдеева Н. Р., Бабак В. Г., Меркович Е.А. и др. Включение ферментов в оболочки из ПАВ-полиэле-
ктролитных комплексов на основе хитозана // Материалы VI Междунар. конф. “Новые достижения
в исследовании хитина и хитозана”. – Москва: ВНИРО, 2001. – С. 350–352.
9. Полыгалина Г. В., Чередниченко В. С., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. – Москва:
ДеЛи принт, 2003. – С. 230–231.
10. Hartree E. F. Determination of protein: а modification of the Lowry method, that gives a linear photometric
response // Anal. Biochem. – 1972. – 48, No 1. – P. 422–427.
11. Бартеньев Г.М., Френкель С.Я. Физика полимеров. – Ленинград: Химия, 1990. – 332 с.
186 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №9
12. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. – Москва:
Изд-во Моск. ун-та, 1976. – 320 с.
13. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. – Москва: Мир, 1979. – 280 с.
14. Биологически активные перевязочные средства в комплексном лечении гнойно-некротических ран /
Под ред. В. Д. Федорова, И.М. Чижа. – Москва: МЗ РФ, 2000. – 36 с.
Поступило в редакцию 16.03.2009Физико-химический институт
им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса
I. I. Romanovskaya
The potential wound coating with trypsin immobilized in modified
poly-N-vinylpyrrolidone
Basing on poly-N-vinylpyrrolidone modified by polysilicic acid sol, the wound water-insoluble hydro-
gel coating with immobilized trypsin, with high yield of activity (75.6%), stable at the storage and
γ-sterilization, and with prolonged action is developed. The widening of catalytic activity in the
acidic region of pH and the determination of kinetic parameters of the immobilized enzyme provides
a possibility of the dose optimization and preparation activity, respectively.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №9 187
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-18694 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:54:45Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Романовская, И.И. 2011-04-07T20:01:47Z 2011-04-07T20:01:47Z 2009 Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон / И.И. Романовская // Доп. НАН України. — 2009. — № 9. — С. 182-187. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18694 615.355:577.152.34 З використанням модифiкованого золем полiкремнiєвої кислоти полi-N-вiнiлпiролiдону було розроблено нерозчинне в фiзiологiчних умовах потенцiальне ранове гiдрогелеве покриття з iммобiлiзованим трипсином з високим виходом за активнiстю (75,6%), стабiльнiстю при зберiганнi та γ-стерилiзацiї, пролонгованої дiї. Розширення профiлю протеолiтичної активностi в область кислих значень pH, визначення кiнетичних параметрiв iммобiлiзованого ферменту дозволяють оптимiзувати дозу й активнiсть iммобiлiзованого препарату. Basing on poly-N-vinylpyrrolidone modified by polysilicic acid sol, the wound water-insoluble hydrogel coating with immobilized trypsin, with high yield of activity (75.6%), stable at the storage and γ-sterilization, and with prolonged action is developed. The widening of catalytic activity in the acidic region of pH and the determination of kinetic parameters of the immobilized enzyme provides a possibility of the dose optimization and preparation activity, respectively. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Біохімія Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон The potential wound coating with trypsin immobilized in modified poly-N-vinylpyrrolidone Article published earlier |
| spellingShingle | Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон Романовская, И.И. Біохімія |
| title | Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон |
| title_alt | The potential wound coating with trypsin immobilized in modified poly-N-vinylpyrrolidone |
| title_full | Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон |
| title_fullStr | Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон |
| title_full_unstemmed | Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон |
| title_short | Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон |
| title_sort | потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-n-винилпирролидон |
| topic | Біохімія |
| topic_facet | Біохімія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18694 |
| work_keys_str_mv | AT romanovskaâii potencialʹnoeranevoepokrytiestripsinomimmobilizovannymvmodificirovannyipolinvinilpirrolidon AT romanovskaâii thepotentialwoundcoatingwithtrypsinimmobilizedinmodifiedpolynvinylpyrrolidone |