Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale

Проведено исследование фракции ДНК–связывающих белков ржи сорта “Верасень”, методом 2–D электрофореза с последующим гидролизом трипсином дифференциально экспрессируемых белковых пятен и MS MALDI TOF TOF детекцией. Получены данные, подтверждающие влияние микроволновой обработки семян на экспрессию ДН...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Published in:	Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів
Date:	2008
Main Authors:	Спиридович, Е.В., Власова, Н.Б., Решетников, В.Н.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова 2008
Subjects:	Оригінальні статті
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18831
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale / Е.В. Спиридович, Н.Б. Власова, В.Н. Решетников // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2008. — Т. 6, № 2. — С. 310-318. — Бібліогр.: 10 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-18831
record_format	dspace
spelling	Спиридович, Е.В. Власова, Н.Б. Решетников, В.Н. 2011-04-10T18:32:01Z 2011-04-10T18:32:01Z 2008 Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale / Е.В. Спиридович, Н.Б. Власова, В.Н. Решетников // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2008. — Т. 6, № 2. — С. 310-318. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 1810-7834 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18831 575.117.2; 581.48:577.217.5 Проведено исследование фракции ДНК–связывающих белков ржи сорта “Верасень”, методом 2–D электрофореза с последующим гидролизом трипсином дифференциально экспрессируемых белковых пятен и MS MALDI TOF TOF детекцией. Получены данные, подтверждающие влияние микроволновой обработки семян на экспрессию ДНК–связывающих белков, включая БТШ–70. Проведено дослідження фракції ДНК-зв’язувальних білків жита сорту "Верасень", методом 2-D електрофорезу з наступним гідролізом трипсином дифференціально експресованих білкових плям і MS MALDІ TOF TOF детекцією. Отримано дані, що підтверджують вплив мікрохвильової обробки насіння на експресію ДНК-зв’язувальних білків, включаючи БТШ-70. A study of DNA-binding protein fraction of rye cultivar “Verasen'” by means of 2-D electrophoresis with subsequent trypsin hydrolysis of differentially expressed protein spots and MALDI TOF detection was undertaken. Data, showing the influence of microwave-irradiation treatment of seeds on the DNA-binding protein expression, including HSP-70, were obtained. ru Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів Оригінальні статті Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale Протеомний підхід для ідентифікації дифференціально експресованих ДНК-зв’язувальних білків проростків Secale cereale Proteomic approach for identificatoin of differentially expressing DNA-binding proteins of Secale cereale seedlinds Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale
spellingShingle	Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale Спиридович, Е.В. Власова, Н.Б. Решетников, В.Н. Оригінальні статті
title_short	Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale
title_full	Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale
title_fullStr	Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale
title_full_unstemmed	Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale
title_sort	протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных днк-связанных белков проростков secale cereale
author	Спиридович, Е.В. Власова, Н.Б. Решетников, В.Н.
author_facet	Спиридович, Е.В. Власова, Н.Б. Решетников, В.Н.
topic	Оригінальні статті
topic_facet	Оригінальні статті
publishDate	2008
language	Russian
container_title	Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів
publisher	Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова
format	Article
title_alt	Протеомний підхід для ідентифікації дифференціально експресованих ДНК-зв’язувальних білків проростків Secale cereale Proteomic approach for identificatoin of differentially expressing DNA-binding proteins of Secale cereale seedlinds
description	Проведено исследование фракции ДНК–связывающих белков ржи сорта “Верасень”, методом 2–D электрофореза с последующим гидролизом трипсином дифференциально экспрессируемых белковых пятен и MS MALDI TOF TOF детекцией. Получены данные, подтверждающие влияние микроволновой обработки семян на экспрессию ДНК–связывающих белков, включая БТШ–70. Проведено дослідження фракції ДНК-зв’язувальних білків жита сорту "Верасень", методом 2-D електрофорезу з наступним гідролізом трипсином дифференціально експресованих білкових плям і MS MALDІ TOF TOF детекцією. Отримано дані, що підтверджують вплив мікрохвильової обробки насіння на експресію ДНК-зв’язувальних білків, включаючи БТШ-70. A study of DNA-binding protein fraction of rye cultivar “Verasen'” by means of 2-D electrophoresis with subsequent trypsin hydrolysis of differentially expressed protein spots and MALDI TOF detection was undertaken. Data, showing the influence of microwave-irradiation treatment of seeds on the DNA-binding protein expression, including HSP-70, were obtained.
issn	1810-7834
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18831
citation_txt	Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale / Е.В. Спиридович, Н.Б. Власова, В.Н. Решетников // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2008. — Т. 6, № 2. — С. 310-318. — Бібліогр.: 10 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT spiridovičev proteomnyipodhoddlâidentifikaciidifferencicialʹnoékspressirovannyhdnksvâzannyhbelkovprorostkovsecalecereale AT vlasovanb proteomnyipodhoddlâidentifikaciidifferencicialʹnoékspressirovannyhdnksvâzannyhbelkovprorostkovsecalecereale AT rešetnikovvn proteomnyipodhoddlâidentifikaciidifferencicialʹnoékspressirovannyhdnksvâzannyhbelkovprorostkovsecalecereale AT spiridovičev proteomniipídhíddlâídentifíkacíídifferencíalʹnoekspresovanihdnkzvâzuvalʹnihbílkívprorostkívsecalecereale AT vlasovanb proteomniipídhíddlâídentifíkacíídifferencíalʹnoekspresovanihdnkzvâzuvalʹnihbílkívprorostkívsecalecereale AT rešetnikovvn proteomniipídhíddlâídentifíkacíídifferencíalʹnoekspresovanihdnkzvâzuvalʹnihbílkívprorostkívsecalecereale AT spiridovičev proteomicapproachforidentificatoinofdifferentiallyexpressingdnabindingproteinsofsecalecerealeseedlinds AT vlasovanb proteomicapproachforidentificatoinofdifferentiallyexpressingdnabindingproteinsofsecalecerealeseedlinds AT rešetnikovvn proteomicapproachforidentificatoinofdifferentiallyexpressingdnabindingproteinsofsecalecerealeseedlinds
first_indexed	2025-11-26T19:26:58Z
last_indexed	2025-11-26T19:26:58Z
_version_	1850771332573167616
fulltext	310 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 УДК 575.117.2; 581.48:577.217.5 ПРОТЕОМНЫЙ ПОДХОД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРОВАННЫХ ДНК'СВЯЗАННЫХ БЕЛКОВ ПРОРОСТКОВ SECALE CEREALE Е.В. СПИРИДОВИЧ, Н.Б. ВЛАСОВА, В.Н. РЕШЕТНИКОВ ГНУ “Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси” Минск 220012, ул. Сурганова, 2В e�mail: nastasia_vlasova@nm.ru Проведено исследование фракции ДНК–связывающих белков ржи сорта “Ве� расень”, методом 2�D электрофореза с последующим гидролизом трипсином дифференциально экспрессируемых белковых пятен и MS MALDI TOF TOF детекцией. Получены данные, подтверждающие влияние микроволновой об� работки семян на экспрессию ДНК�связывающих белков, включая БТШ�70. Ключевые слова: микроволновое излучение, фракция ДНК�связанных белков, 2�D электрофорез, MALDI�TOF�TOF масс�спектрометрия, БТШ�70. Введение. Геномика провела инвентаризацию информационного материала клетки [1, 2]. Итогом молекулярно�генетического на� правления работ следует считать полную расшифровку геномов четы� рех видов высших растений (арабидопсис, рис, люцерна и тополь) и выдвижение на первый план задачи завершения секвенирования ге� номов ряда других важнейших видов сельскохозяйственных растений (кукуруза, виноград, томаты, пшеница, ячмень) [3�5]. Если геном оди� наков для всех клеток организма, то каждый орган, ткань и клетка име� ют собственную протеомную карту, которая изменяется под различ� ными воздействиями. Это направление протеомного анализа – функ� циональная (клеточно�картируемая) протеомика – изучает полимор� физм между различными белковыми популяциями. С помощью двумер� ного электрофореза (2D ЭФ) и масс�спектрометрии (МС) возможно проведение сравнительного анализа изменений в качественном бел� ковом составе растений под влиянием различных факторов. Методи� ческий подход в этой области довольно универсален, однако существу� ют особенности в связи со специфичностью растительных объектов. Осложняет исследования в этой области тот факт, что на сегодняшний © Е.В. СПИРИДОВИЧ, Н.Б. ВЛАСОВА, В.Н. РЕШЕТНИКОВ, 2008 311ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 Протеомный подход для идентификации дифференциально экспрессированных... день не велики данные об отсеквени� рованных и аннотированных геномах растений [6]. Обсуждается изменение в одной из групп белков (ДНК�связанных) проро� стков ржи, выявленное комплексом методов: двумерным электрофорезом с последующим триптическим гидро� лизом некоторых дифференциально экспрессированных белковых пятен и идентификацией их MALDI�TOF�TOF масс�спектрометрией. Получены дан� ные о влиянии микроволновой обра� ботки семян на изменение протеома и экспрессию ДНК�связанных белков, в том числе БТШ�70. Результаты могут стать полезными при создании теоре� тических основ индукции прорастания семян микроволновым излучением, а также повышения адаптации растений к неблагоприятным факторам внеш� ней среды. Использованный подход может применяться для изучения раз� личных воздействий на протеом рас� тений. Материалы и методы В работе использовали семена ржи сорта Верасень, обработанные на ус� тановке ВЧЭР (высокочастотное элек� тромагнитное поле), по методике [7]. Ступенчатое фракционирование бел� ков проводили методом ультрацентри� фугирования по схеме, предложенной Giavalisco [8, 9]. Определение содер� жания белка в образце вели с исполь� зованием набора реагентов “2�D Quant Kit” (поизводство GE Healthcare, США). Фракции ДНК�связанных белков кон� трольных и опытных образцов разде� ляли 2D ЭФ по [9]. Электронные изоб� ражения двумерных электрофорети� ческих спектров получали с использо� ванием сканера Epson и далее анали� зировали с помощью специализиро� ванного программного обеспечения PDQuest 2�D Analysis Software, Version 8.0.1, Bio�Rad Laboratories. Триптический гидролиз белка в по� лиакриламидном геле проводили сле� дующим образом: вырезали кусочек геля размером 1 мм3, который дваж� ды промывали путем инкубации в 100 мкл 40 % раствора ацетонитрила в 0,1 М NH4HCO3 в течение 40 мин при 37 °С. После удаления раствора для дегид� ратации геля добавляли по 100 мкл ацетонитрила. Удалив ацетонитрил и высушив кусочек геля, прибавляли к нему 3 мкл раствора модифицирован� ного трипсина (Promega) в 0.05 М NH4HCO3 с концентрацией 10 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 12 ч при 37 °С, затем к раствору добавляли 7 мкл 0,5 % трифторуксусной кислоты (ТФУ) в воде и тщательно перемеши� вали. Надгелевый раствор использо� вали для получения MALDI�масс�спек� тров. Подготовка образцов для масс� спектрометрии: на мишени смешива� ли по 0,5 мкл раствора образца и ра� створа 2,5�дигидроксибензойной кис� лоты (Aldrich,10 мг·мл�1 в 20 % ацето� нитриле в воде с 0.5 % ТФУ) и получен� ную смесь высушивали на воздухе. Масс�спектры были получены на тандемном MALDI�времяпролетно� времяпролетном масс�спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), осна� щенном УФ лазером (Nd). Масс�спек� тры получены в режиме положитель� ных ионов с использованием рефлект� рона; точность измеренных масс пос� ле докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0,007 %. Идентификацию белков осуществ� ляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск по “пептидному фингерпринту” прово� дился в базе данных NCBI (подбаза – растения) с указанной точностью с 312 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 Е.В. Спиридович, Н.Б. Власова, В.Н. Решетников учетом возможного окисления метио� нинов кислородом воздуха и возмож� ной модификации цистеинов акрила� мидом. Анализ изображений двумерных гелей с помощью специализированно� го программного обеспечения PDQuest 2�D Analysis Software, трипти� ческий гидролиз белка, получение MALDI�масс�спектров и идентифика� цию белков проводили на базе лабо� ратории протеомного анализа ФГУ НИИ физико�химической медицины (г. Москва, Россия). Результаты и обсуждение В связи с высокой гетерогенностью белков проростков ржи по составу, физико�химическим свойствам и функциям, исследование протеома проводили по фракциям – легкора� створимая (цитозольная), мембран� носвязанная фракция НК�связанных белков. Они были получены в резуль� тате комплексного использования по� этапного ультрацентрифугирования и экстракции белков определенными буферными растворами с добавлени� ем детергентов и хаотропов. Интерес представляла III фракция –ДНК�свя� занных белков, представленная белка� ми хроматина. Использование стрипов с широким диапозоном pI 3�11 для 1– го направления 2�D электрофореза позволило максимально исключить потерю полиморфных компонентов на начальных этапах исследования. Полу� ченные результаты двумерного разде� ления компонентов фракции III (ДНК� связанные белки) контрольных и опыт� ных растений ржи сорта “Верасень” представлены на рис. 1. Гели дают “картинку” высокого разрешения, с четкими дискретными пятнами. Каждый белок был откалиброван соответственно молекулярной массы и pI. Сочетая автоматическое сканиро� вание и компьютерно�целевой анализ а б Рис. 1. Двумерный электрофорез белковой фракции III контрольных (а) и опытных (б) проростков ржи сорта “Верасень”. Белки разделены на стрипах pI 3�11. Второе направление осуществлено в ПААГ пластинах 12%. Гели окрашены серебром. Скобками обозначены полиморфные зоны, фигурами– кон� ститутивные 313ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 Протеомный подход для идентификации дифференциально экспрессированных... имиджей гелей в программе PDQest выявлено 315 белковых пятен в конт� рольных образцах, и 278 – в опытных (номерованные белковые карты не приводятся), таким образом, демонст� рируя изменение экспрессии некото� рых белковых компонентов в опытных растениях после микроволновой обра� ботки семян. Наряду с качественным полимор� физмом были обнаружены количе� ственные изменения (на основе дан� ных денситометрии), которые для ряда белковых компонентов являлись весьма существенными. В основном наблюдалась тенденция “исчезнове� ния” белковых пятен у опытных расте� ний по сравнению с контрольными. При сравнении данных денситометрии белковых пятен и “присутствия�отсут� ствия” белковых пятен в 2�D спектрах было получено значение r=0,32, что свидетельствует о довольно значи� тельных отклонениях (качественных) между спектрами контрольных и опыт� ных растений. Фиксируя ряд суще� ственных качественных отличий меж� ду 2�D спектрами контрольных и опыт� ных растений, необходимо отметить, что “исчезали” белковые пятна не только у опытной группы, по сравне� нию с контрольной, но и наоборот. Для последующей идентификации были выбраны 3 дифференциально экспрессированных у контрольных и опытных растений ржи в связи обра� боткой семян полипептида со следу� ющими характеристиками (по данным проведенного 2�D ЭФ, и компьютер� ной обработки), которые приведены на рис. 2: •Белковое пятно №1 – контрольные растения; ~ 14.4 kDa, ~3,2 pI. •Белковое пятно №2 – опытные ра� стения; ~ 17,8 kDa, ~3,1 pI. Рис. 2. Полиморфные зоны 2D–гелей контрольных и опытных растений ржи сорта “Верасень”. Пятна №1, №2 и №3 (обозначены стрелками) подвергнуты триптическому анализу и MALDI�TOF�TOF масс� спектрометрии 314 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 Е.В. Спиридович, Н.Б. Власова, В.Н. Решетников •Белковое пятно №3 – опытные ра� стения; ~ 70 kDa, ~4,6 pI. В настоящее время масс–спектро� метрия (MALDI�TOF/TOF или нано� жидкостная хроматография [LC]�ESI� MS/MS) является одним из возможных способов идентификации неотсекве� нированных и на основе гомологии [6]. Обозначенные пятна №1, 2 и 3 были подвергнуты триптическому анализу и MALDI�TOF�TOF масс�спектрометрии, как указано выше. В результате были получены MALDI�TOF�TOF масс�спект� ры для пятен №1, 2 и 3, которые пред� ставлены на рис. 3 и 4, соответственно. Полученные MALDI�TOF�TOF масс� спектры пятен №1 и №2 содержали аналогичные мажорные и минорные пики для этих пятен, что, с большой долей вероятности, позволяет пред� положить, что проанализированные полипептиды являются субъединица� ми одного и того же белка. Интерес� ным и, тем не менее, не выясненным остается вопрос, почему одна субъе� диница данного белка экспрессирова� на у контрольных растений, а другая – только у растений, семена которых подверглись микроволновой обра� ботке. К сожалению, до настоящего вре� мени геном Secale сereale не отсекве� нирован полностью и не аннотирован в мировой базе данных. Таким обра� Рис. 3. MALDI–TOF–TOF масс�спектры для пятен № 1 (а) и № 2 (б); интенсивность измеряется в абсо� лютных единицах (а.е.), а соотношение масса/заряд характеризует массу белковых фрагментов в атом� ных единицах массы (а.е.м.) 315ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 Протеомный подход для идентификации дифференциально экспрессированных... зом, поиск по пептидному фингер� принту пятен №1 и №2 не позволили нам идентифицировать данные поли� пептиды по базе данных Mascot (Plant) (данные не приводяться). Полученные данные, тем не менее, представляют собой интерес с точки зрения очерчи� вания круга белков, что может облег� чить дальнейшую целевую идентифи� кацию данных полипептидов другими методами молекулярной биологии и биохимии, такими как RT–PCR или Ве� стерн – блот анализа. С другой стороны, поиск по пептид� ному фингерпринту на основе MALDI– TOF�TOF спектров пятна №3 в базе ncbi позволил получить более обнаде� живающие результаты, несмотря на то, что среди аннотированных поли� пептидов также не обнаружены те, ко� торые принадлежат непосредственно Secale cereale. Девятнадцать из трид� цати, обнаруживших гомологию с по� данными спектрами полипептидов яв� ляются белками теплового шока 70 (Heat shock cognate 70 kDa protein, БТШ 70) различных видов растений, включая Medicago truncatula, Medicago sativa, Oryza sativa (japonica cultivar� group), Lilium longiflorum, Arabidopsis thaliana, Vigna radiate, Cucumis sativus, Triticum aestivum, Spinacia oleracea, Lycopersicon esculentum и др. Был вы� явлен довольно высокий процент го� мологии, который достигает 62–89% (см. табл. 1). Рис. 4. MALDI–TOF–TOF масс�спектр для пятна №3: а — полный спектр; б — развернутая область спек� тра 316 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 Е.В. Спиридович, Н.Б. Власова, В.Н. Решетников Таблица 1. Результаты идентификации MALDI �TOF�TOF масс�спектров для пятна №3 по базе данных ncbi № П.п. № доступа Масса Сходство, % Описание 1. gi\|92868673 22803 88 Orn/DAP/Arg decarboxylase 2; Heat shock protein Hsp70 [Medicago truncatula] 2. gi\|108711797 71267 80 Heat shock cognate 70 kDa protein 2, putative, expressed [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 3. gi\|15232682 71103 80 ATP binding [Arabidopsis thaliana] 4. gi\|762844 71470 78 Hsc70 [Lycopersicon esculentum] 5. gi\|92891109 70951 68 DnaK family protein [Medicago truncatula] 6. gi\|56554972 70952 68 heat shock protein 70 [Medicago sativa] 7. gi\|431144 71610 68 HSP70 [Lilium longiflorum] 8. gi\|108707472 71589 67 Heat shock cognate 70 kDa protein, putative, expressed [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 9. gi\|15230534 71057 67 HSP70; ATP binding [Arabidopsis thaliana] 10. gi\|45331281 70972 65 70 kDa heat shock cognate protein 1 [Vigna radiata] 11. gi\|6911551 71444 65 heat shock protein 70 [Cucumis sativus] 12. gi\|2827002 70986 65 HSP70 [Triticum aestivum] 13. gi\|87241037 71046 65 Heat shock protein Hsp70 [Medicago truncatula] 14. gi\|45331283 71184 65 70 kDa heat shock cognate protein 2 [Vigna radiata] 15. gi\|41584275 71202 64 heat shock cognate protein 70 [Thellungiella halophila] 16. gi\|34908140 70907 64 putative HSP70 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 17. gi\|15241847 71342 63 ATP binding [Arabidopsis thaliana] 18. gi\|108707463 71056 63 Heat shock cognate 70 kDa protein, putative, expressed [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 19. gi\|15219109 70870 62 HSP70B; ATP binding [Arabidopsis thaliana] 20. gi\|21338 71686 62 70 kDa heat shock protein [Spinacia oleracea] 21. gi\|162665432 71043 100 predicted protein [Physcomitrella patens subsp. patens] 22. gi\|125546233 46875 97 hypothetical protein OsI_013605 [Oryza sativa (indica cultivar-group)] 23. gi\|15232682 71103 89 heat shock cognate 70 kDa protein 3 (HSC70-3) (HSP70- 3) [Arabidopsis thaliana] 24. gi\|115456247 71267 86 Os03g0821100 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 25. gi\|762844 71470 86 Hsc70 [Lycopersicon esculentum] 26. gi\|125543311 47415 80 hypothetical protein OsI_010683 [Oryza sativa (indica cultivar-group)] 27. gi\|56554972 70952 74 heat shock protein 70 [Medicago sativa] 28. gi\|162662524 70817 74 predicted protein [Physcomitrella patens subsp. patens] 29. gi\|162680921 70931 74 predicted protein [Physcomitrella patens subsp. patens] 30. gi\|162697021 70903 74 predicted protein [Physcomitrella patens subsp. patens] 317ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 Протеомный подход для идентификации дифференциально экспрессированных... БТШ 70 является довольно изучен� ным белком для разных групп расте� ний, который индуцируется в организ� ме растения в ответ на воздействие ряда стрессовых факторов, является важным компонентом клетки в регуля� ции укладки белков. По литературным данным показана высокая гомология БТШ 70 у разных групп растений. На основе данных 2�D электрофореза была рассчитана молекулярная масса полипептида (пятно №3) – 70 kDa. Та� ким образом, полученные данные трипсинолиза и идентификации MALDI�TOF�TOF масс�спектра для пят� на №3 с высокой долей вероятности позволяют предположить, что диффе� ренциально экспрессированный поли� пептид у опытных растений ржи сорта “Верасень” с Mr 70kDa и pI~4,6, дей� ствительно является белком теплово� го шока 70 ржи. Предпринятая схема исследований на сегодняшний день является широ� ко принятой для протеомных исследо� ваний и идентификации дифференци� ально экспрессированных белков. Проведенные исследования ДНК–свя� занной группы белков контрольных и подвергшихся микроволновой обра� ботке растений (семян) ржи сорта “Ве� расень” методом двумерного электро� фореза, последующего триптического гидролиза дифференциально эксп� рессированых белковых пятен и иден� тификации MALDI�TOF�TOF масс�спек� тров, подтвердили влияние микровол� новой обработки семян на экспрессию ДНК�связанных белков, в том числе БТШ 70, который обладает N�терми� нальным АТР�азным доменом. Требу� ется проведение дополнительных ис� следований на уровне кДНК методом RT–PCR со специфическими прайме� рами и Western–блоттингом со специ� фическими антителами, которые по� зволят достоверно подтвердить дан� ное предположение. Выводы Микроволновая обработка семян ржи приводит к изменению характера экспрессии фракции ДНК–связываю� щих белков, что может быть определе� но методом 2–D электрофореза. С по� мощью последующего протеолиза дифференциально экспрессируемых белковых пятен трипсином и MALDI TOF TOF масс�спектрометрии было показано, что микроволновая обра� ботка индуцирует, в частности, эксп� рессию БТШ–70. Список литературы 1. Fridman E., Pichersky E. Metabolomics, genomics, proteomics, and the identification of enzymes and their substrates and products // Current Opinion in Plant Biology. – 2005. – Vol. 8 (3) – P. 242–248. 2. Tohge T., Nishiyama Y., Yokota Hirai M., et al. Functional genomics by integrated analysis of metabolome and transcriptome of Arabidopsis plants over� expressing an MYB transcription factor// The Plant Journal. – 2005. – Vol. 42 (2). – P. 218–235. 3. Arabidopsis Genomics Initiative (AGI). Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana // Nature. – 2000. – Vol. 408. – Р. 796–815. 4. Goff S. A., et al A Draft Sequence of the Rice Genome (Oryza sativa L. ssp. japonica) // Science. – 2002. – Vol. 296, №. 5565. – Р. 92–100. 5. Jansson S., Douglas C. J. Populus: A Model System for Plant Biology // Annual Review of Plant Biology. – 2007. – Vol. 58. – P. 435–458. 6. Sommerer N., et al. Peptide Mass Fingerprinting. // Plant Proteomic. Ed. Thiellement H. – Totowa, New Jersey: Humana Press Inc. – 2007. – P. 217–234. 318 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2008, том 6, № 2 Е.В. Спиридович, Н.Б. Власова, В.Н. Решетников 7. Городецкая Е.А. Влияние плазменно�ра� диоволновой обработки на агрономи� ческие качества семян // Теоретичес� кие и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направ� ления развития науки и народного хо� зяйства: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 75�летию со дня обра� зования ЦБС НАН Беларуси, Минск, 12–15 июня 2007 г. / ЦБС НАН Белару� си; под ред. В.Н. Решетникова. – Минск, 2007. – С.143–145 8. Thelen J. J., Peck S. C. Quantitative Proteomics in Plants: Choices in Abundance // The Plant Cell. – 2007. – Vol. 19. – P. 3339–3346. 9. Giavalisco P., Nordhoff E., Lehrach H., Gobom J., Klose J. Extraction of proteins from plant tissues for two�dimensional electrophoresis analysis // Electro� phoresis. – 2003. – Vol. 24. – P. 207–216. 10. Спиридович Е.В., Власова А.Б., Решет� ников В.Н. Протеомный подход для изучения эпигенетического контроля генной экспрессии у растений под вли� янием различных воздействий. 1. Фракционирование общего пула белков методом ультрацентрифугиро� вания для получения целостной карти� ны протеома в связи с обработкой се� мян // Теоретические и прикладные ас� пекты биохимии и биотехнологии рас� тений: Сб. науч. Тр. III Междунар. науч� ной конференции, ЦБС НАН Беларуси, 14– 16 мая 2008 г., Минск. – С. 61�66. Представлена Л.Л. Лукаш Поступила 8.10.2008 ПРОТЕОМНИЙ ПІДХІД ДЛЯ ІДЕНТИФІКАЦІЇ ДИФЕРЕНЦІАЛЬНО ЕКСПРЕСОВАНИХ ДНК�ЗВ’ЯЗУВАЛЬНИХ БІЛКІВ ПРОРОСТКІВ SECALE CEREALE Е.В. Спіридович, Н.Б. Власова, В.Н. Решетніков ДНУ “Центральний ботанічний сад Націо� нальної академії наук Білорусі” Мінськ 220012, вул. Сурганова, 2В e�mail: nastasia_vlasova@nm.ru Проведено дослідження фракції ДНК�зв’я� зувальних білків жита сорту “Верасень”, методом 2�D електрофорезу з наступним гідролізом трипсином диференціально ек� спресованих білкових плям і MS MALDІ TOF TOF детекцією. Отримано дані, що підтвер� джують вплив мікрохвильової обробки на� сіння на експресію ДНК�зв’язувальних білків, включаючи БТШ�70. Ключові слова: мікрохвильове випроміню� вання, фракція ДНК�зв’язувальних білків, 2�D електрофорез, MALDІ�TOF�TOF мас� спектрометрія, БТШ�70. PROTEOMIC APPROACH FOR IDENTIFICATOIN OF DIFFERENTIALLY EXPRESSING DNA�BINDING PROTEINS OF SECALE CEREALE SEEDLINDS E.V. Spiridovich, N.B. Vlasova, V.N. Reshetnikov Central Botanical Garden of the NAS of Belarus Belarus, 220012, Minsk, Surganova str., 2B e�mail: nastasia_vlasova@nm.ru A study of DNA�binding protein fraction of rye cultivar “Verasen’” by means of 2�D electrophoresis with subsequent trypsin hydrolysis of differentially expressed protein spots and MALDI TOF detection was undertaken. Data, showing the influence of microwave�irradiation treatment of seeds on the DNA�binding protein expression, including HSP�70, were obtained. Key words: Microware radiation, fraction of DNA�binding proteins, 2�D electrophoresis, MALDI�TOF�TOF mass spectrometry

Протеомный подход для идентификации дифференцициально экспрессированных ДНК-связанных белков проростков Secale cereale

Institution

Similar Items