Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae

Досліджені генетичні особливості і фізіолого-біохімічні властивості Tn5-мутантів бульбочкових бактерій гороху. Із використанням полімеразної ланцюгової реакції встановлено, що досліджувані штами дійсно є Tn5-мутантами ризобій гороху, оскільки вони містять фрагмент структурної послідовності гену стій...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2009
Автори:	Коць, С.Я., Мандровська, Н.М., Кругова, О.Д., Заєць, В.М.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова 2009
Назва видання:	Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів
Теми:	Оригінальні статті
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18880
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae / С.Я. Коць, Н.М. Мандровська, О.Д. Кругова, В.М. Заєць // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2009. — Т. 7, № 1. — С. 38-45. — Бібліогр.: 19 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-18880
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-188802025-02-09T21:05:52Z Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae Физиолого-биохимические и генетические характеристики Tn5-мутантов Rhizobium leguminosarum bv. viceae The physiologo-biochemical and genetical characteristics of Tn5-mutants of Rhizobium leguminosarum bv. viceae Коць, С.Я. Мандровська, Н.М. Кругова, О.Д. Заєць, В.М. Оригінальні статті Досліджені генетичні особливості і фізіолого-біохімічні властивості Tn5-мутантів бульбочкових бактерій гороху. Із використанням полімеразної ланцюгової реакції встановлено, що досліджувані штами дійсно є Tn5-мутантами ризобій гороху, оскільки вони містять фрагмент структурної послідовності гену стійкості до канаміцину транспозона Tn5. Показано, що за фізіолого-біохімічними ознаками Tn5-мутанти бульбочкових бактерій гороху мають як схожі, так і відмінні властивості порівняно до штаму-реципієнту. Исследованы генетические особенности и физиолого-биохимические свойства Tn5-мутантов клубеньковых бактерий гороха. С использованием полимеразной цепной реакции установлено, что исследуемые штаммы действительно относятся к Tn5-мутантам ризобий гороха, поскольку они содержат фрагмент структурной последовательности гена устойчивости к канамицину транспозанта Tn5. Показано, что по физиолого-биохимическим свойствам Tn5-мутанты клубеньковых бактерий гороха имеют как общие, так и отличительные признаки в сравнении со штаммом-реципиентом. The genetical and physiological and biochemical properties of pea nodule bacteria were studied. Using of polymerase chain reaction it was established that studied strain were actually Tn5 mutants of pea rhizobia, since they contained part of structure sequence of Tn5 kanamicin resistance gene. It was shown that Tn5 mutants of pea nodule bacteria had as the same as distinctive signs by physiological and biochemical properties in comparison with strain-recipient. 2009 Article Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae / С.Я. Коць, Н.М. Мандровська, О.Д. Кругова, В.М. Заєць // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2009. — Т. 7, № 1. — С. 38-45. — Бібліогр.: 19 назв. — укр. 1810-7834 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18880 579.22:575.224.4 uk Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів application/pdf Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Оригінальні статті Оригінальні статті
spellingShingle	Оригінальні статті Оригінальні статті Коць, С.Я. Мандровська, Н.М. Кругова, О.Д. Заєць, В.М. Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів
description	Досліджені генетичні особливості і фізіолого-біохімічні властивості Tn5-мутантів бульбочкових бактерій гороху. Із використанням полімеразної ланцюгової реакції встановлено, що досліджувані штами дійсно є Tn5-мутантами ризобій гороху, оскільки вони містять фрагмент структурної послідовності гену стійкості до канаміцину транспозона Tn5. Показано, що за фізіолого-біохімічними ознаками Tn5-мутанти бульбочкових бактерій гороху мають як схожі, так і відмінні властивості порівняно до штаму-реципієнту.
format	Article
author	Коць, С.Я. Мандровська, Н.М. Кругова, О.Д. Заєць, В.М.
author_facet	Коць, С.Я. Мандровська, Н.М. Кругова, О.Д. Заєць, В.М.
author_sort	Коць, С.Я.
title	Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae
title_short	Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae
title_full	Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae
title_fullStr	Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae
title_full_unstemmed	Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae
title_sort	фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики tn5-мутантів rhizobium leguminosarum bv. viceae
publisher	Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова
publishDate	2009
topic_facet	Оригінальні статті
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18880
citation_txt	Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae / С.Я. Коць, Н.М. Мандровська, О.Д. Кругова, В.М. Заєць // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2009. — Т. 7, № 1. — С. 38-45. — Бібліогр.: 19 назв. — укр.
series	Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів
work_keys_str_mv	AT kocʹsâ fízíologobíohímíčnítagenetičníharakteristikitn5mutantívrhizobiumleguminosarumbvviceae AT mandrovsʹkanm fízíologobíohímíčnítagenetičníharakteristikitn5mutantívrhizobiumleguminosarumbvviceae AT krugovaod fízíologobíohímíčnítagenetičníharakteristikitn5mutantívrhizobiumleguminosarumbvviceae AT zaêcʹvm fízíologobíohímíčnítagenetičníharakteristikitn5mutantívrhizobiumleguminosarumbvviceae AT kocʹsâ fiziologobiohimičeskieigenetičeskieharakteristikitn5mutantovrhizobiumleguminosarumbvviceae AT mandrovsʹkanm fiziologobiohimičeskieigenetičeskieharakteristikitn5mutantovrhizobiumleguminosarumbvviceae AT krugovaod fiziologobiohimičeskieigenetičeskieharakteristikitn5mutantovrhizobiumleguminosarumbvviceae AT zaêcʹvm fiziologobiohimičeskieigenetičeskieharakteristikitn5mutantovrhizobiumleguminosarumbvviceae AT kocʹsâ thephysiologobiochemicalandgeneticalcharacteristicsoftn5mutantsofrhizobiumleguminosarumbvviceae AT mandrovsʹkanm thephysiologobiochemicalandgeneticalcharacteristicsoftn5mutantsofrhizobiumleguminosarumbvviceae AT krugovaod thephysiologobiochemicalandgeneticalcharacteristicsoftn5mutantsofrhizobiumleguminosarumbvviceae AT zaêcʹvm thephysiologobiochemicalandgeneticalcharacteristicsoftn5mutantsofrhizobiumleguminosarumbvviceae
first_indexed	2025-11-30T19:45:50Z
last_indexed	2025-11-30T19:45:50Z
_version_	1850245856399196160
fulltext	38 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2009, том 7, № 1 УДК 579.22:575.224.4 ФІЗІОЛОГО�БІОХІМІЧНІ ТА ГЕНЕТИЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ TN5–МУТАНТІВ RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. VICEAE С.Я. КОЦЬ, Н.М. МАНДРОВСЬКА, О.Д. КРУГОВА, В.М. ЗАЄЦЬ Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Україна, 03022, Київ, вул. Васильківська, 31/17 e&mail: azot@ifrg.kiev.ua Досліджені генетичні особливості і фізіолого�біохімічні властивості Tn5–му� тантів бульбочкових бактерій гороху. Із використанням полімеразної ланцю� гової реакції встановлено, що досліджувані штами дійсно є Tn5–мутантами ризобій гороху, оскільки вони містять фрагмент структурної послідовності гену стійкості до канаміцину транспозона Tn5. Показано, що за фізіолого�біохіміч� ними ознаками Tn5�мутанти бульбочкових бактерій гороху мають як схожі, так і відмінні властивості порівняно до штаму�реципієнту. Ключові слова: Транспозоновий мутагенез, Tn5–мутанти ризобій гороху, полі� меразна ланцюгова реакція. Вступ. Вивчення мутаційного процесу у бульбочкових бактерій і за& стосування різних фізичних і хімічних мутагенів дало можливість от& римати у ризобій практично всі відомі для мікроорганізмів типи мутантів — морфологічні, ауксотрофні, симбіотичні& і фагостійкі [1]. У багатьох мутантів ризобій змінилась азотфіксувальна активність, ефективність, конкурентоздатність [2]. Одержання різного роду мутантів дозволило встановити роль ряду компонентів бактеріальної клітини у процесі вста& новлення симбіозу, що дало змогу вивчити механізм експресії симбіо& тичних генів і створити нові ефективні штами бульбочкових бактерій [3]. Однак застосування мутагенів у роботі з ризобіями втратило акту& альність із появою нового генетичного методу — транспозонового му& тагенезу. Цей метод зіграв значну роль в експериментальних дослід& женнях механізмів симбіозу та вивчення генів бульбочкових бактерій, що відповідають за ці процеси. За його допомогою були виявлені ос& новні гени, що обумовлюють симбіотичну азотфіксацію, вірулентність бульбочкових бактерій та гени, пов’язані з встановленням симбіотич& них відносин ризобій з рослинами [4]. На цей час розроблено кілька експериментальних систем, в яких ви& користовували транспозони Tn5, Tn10, Tn552, але частіше всього вико& ристовується транспозон Tn5 [5]. Це обумовлено високою частотою його інтеграції у геноми реципієнтних штамів мікроорганізмів, відсут& ністю специфічності до нуклеотидної послідовності ДНК при транспо& зиції Tn5 та низькою частотою утворення його ревертантів. Для введення транспозону Tn5 у реципієнтні штами найбільш розповсюдженим є in vivo підхід із використанням транспозоновмісних плазмід&самовбивць, © С.Я. КОЦЬ, Н.М. МАНДРОВСЬКА, О.Д. КРУГОВА, В.М. ЗАЄЦЬ, 2009 39ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2009, том 7, № 1 Фізіолого6біохімічні та генетичні характеристики Tn56мутантів Rhizobium ... які можуть кон’югативно переноситись від спеціальних штамів E.coli до широ4 кого кругу грам4негативних бактерій [6]. Ці плазміди не здатні до реплікації у реципієнтних штамах, а тому можуть зберігатися при поділі клітин хазяїна. Транспозон же за рахунок ферменту транспозази, яка транскрибується та транслюється хазяйськими фермент4 ними системами, може інтегрувати в його геном і стабільно підтримуватися в наступних поколіннях. Для модифіко4 ваних мікроорганізмів характерні як генетичні, так і фізіолого4біохімічні зміни. Тому для отримання характери4 стики Tn5–мутантів необхідно пара4 лельно досліджувати ці властивості. Метою даної роботи стало вивчен4 ня генетичних властивостей та фізіоло4 го4біохімічних ознак у отриманих нами Tn5–мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae. 263б. Матеріали і методи Мутанти бульбочкових бактерій го4 роху були отримані у відділі симбіотич4 ної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за допомогою транспозонового мута4 генезу із використанням вектора pSUP2021:Tn5 [7] і вивчені їх симбіо4 тичні властивості [8]. Для визначення наявності транспо4 зона Tn5 у мутантних ризобій гороху був застосований метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) [9]. Бульбочкові бактерії гороху реципі4 єнтного штаму 263б [10] та одержаних мутантів вирощували на рідкому се4 редовищі № 79 (г/л дист. води; K2HPO4 — 0,5; MgSO4 × 7H2O — 0,2; NaCl — 0,1; CaCO3 — сліди, дріжджовий екстракт — 2, казамінові кислоти або лакталь4 бумін — 0,5; маніт — 10; pH середови4 ща — 7,2–7,4, стерилізація при 0,8– 1атм протягом 30 хв). Через три доби клітини відмивали від полісахаридів та промивали двічі буфером ТЕ (10 mM трис4Cl; pH 8,0; 1mM EDTA). Для лізису клітин відмитий осад культури суспендували в 0,547 мл буфера ТЕ, додавали 30–50 мкл 10% додецилсульфату та протеїнази К до концентрації 50 мкг/мл і витримували при температурі 37 °С, протягом 60 хв. Для додаткового лізису та подальшої очистки нуклеїнових кислот до лізату додавали 100 мкл 5M NaCl та 80 мкл 10 % цетилтриметиламмонійброміду в 0,7М NaCl та інкубували його 15–20 хв при 60 °С. Після цього додавали такий же об’єм розчину хлороформ : ізоамі4 ловий спирт у співвідношенні 24 : 1, суміш перемішували і центрифугували 10 хв при 12000 об/хв на мікроцентри4 фузі “Eppendorf”. Водну фазу з нуклеї4 новими кислотами відбирали і повтор4 но депротеїнізували таким же об’ємом розчину хлороформ : ізоаміловий спирт 24 : 1 як і раніше. У водний роз4 чин нуклеїнових кислот додавали для гідролізу РНК РНК4азу А до концент4 рації 50 мкг/мл та інкубували при кімнатній температурі 20–30 хв. ДНК із водної фази осаджували рівним об’4 ємом 100% ізопропанолу або 2,5 об’4 ємами 96 % етанолу при 12000 об/хв впродовж 10 хв, потім відмивали 70 % етанолом і розчиняли в 50 мкл ТЕ. ПЛР ампліфікацію проводили на ампліфікаторі “Proteus” в об’ємі 30 мкл у суміші реагентів фірми “Ферментас” — 1 х ПЛР буфер, 2mM MgCl2, 0,2mM кожного dNTP. Умови проведення ре4 акції: початкова денатурація — 2 хв при 94 °С, наступні 25 циклів денатурації, гібридизації та синтезу проводили відповідно при 94 °С — 1 хв, при 56 °С — 1 хв та при 72 °С — 1 хв. Останній син4 тез проводили при 72 °С — 5 хв. На один зразок використовували 50 нг ДНК, 0,25 мікромоль/л кожного прай4 40 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2009, том 7, № 1 С.Я. Коць, Н.М. Мандровська, О.Д. Кругова, В.М. Заєць мера та 1U Taq полімерази. Праймери для ПЛР були сконструйовані за допо� могою програми “Primer�3” на струк� турну послідовність гена неоміцинфос� фотрансферази Tn5 довжиною 517 нуклеотидних пар. Прямий праймер 5′� CTGAATGAACTGCAGGACGAG — 3′ Зворотній праймер 5′� CAATATCACGGGTAGCCAACG — 3′ Продукти ПЛР аналізували за допо� могою електрофорезу в 0,7% агароз� ному гелі[11, 12]. Фізіолого�біохімічні ознаки транс� позонових мутантів і штаму�реципієн� та вивчали за методиками [13, 14]. Катаболізм вуглеводів досліджува� ли на поживному середовищі Норіса: (г/л дист.води) — K2HPO4 — 0,5, MgSO4× ×7H2O — 0,8, NaCl — 0,2, FeCl3 — 0,1, маніт — 10, дріжджовий екстракт — 1,0, pH 7,2–7,4 з додаванням 0,5–1% пев� ного вуглеводу та індикатора фіолето� вий червоний. Пробірки із середови� щем інкубували при 27 °С впродовж 48 год. або довше. Зміну кольору сере� довищ, або утворення газу оцінювали за трибальною системою. Гідроліз полісахаридів, зокрема крохмалю, виз� начали на картопляному агарі. Для цьо� го, зону росту культур заливали розчи� ном Люголя. Якщо крохмаль гідролі� зується амілазою утворюються жовті зони, а у разі відсутності ферменту — середовище синіє. Розщеплення білків оцінювали за гідролізом молока із інди� катором метиленовим синім, а також за посівом на желатині і бульйоні Хот� тінгера. Утворення сірководню визна� чали з індикаторними папірцями, змо� ченими у розчині (г/л) оцтовокислого свинцю Pb(CH3COOH) — 20,0 і карбо� нату натрію Na2CO3 — 1,0. Нітратредук� цію визначали на мінеральному се� редовищі з KNO3 за допомогою реак� тива Грісса. Результати та обговорення Реципієнтом для одержання му� тантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae. слугував шт. 263б [10]. У про� цесі мутагенезу із використанням шта� му E.coli S�17, трансформованого п л а з м і д о ю � с а м о в б и в ц е ю pSUP2021:Tn5, були отримані канамі� цинстійкі мутанти бульбочкових бак� терій гороху. Як показали наші дослід� ження, одержані Tn5�мутанти відрізня� лись від вихідного штаму за симбіотич� ними властивостями [8] та конкурен� тоздатністю [15]. Один із Tn5�мутантів, а саме М1, був запатентований як ви� сокоактивний штам для одержання бактеріальних добрив під горох і депо� нований у Депозитарії Інституту мікро� біології і вірусології ім. Д.К. Заболотно� го НАН України [7]. Постала необхідність молекулярно� го аналізу отриманих мутантних ри� зобій, щоб з’ясувати чи знаходиться транспозон у їхньому геномі. Для ана� лізу Tn5�мутантів ризобій гороху вико� ристали метод полімеразної ланцюго� вої реакції. Як маркер відбору транспозантів при транспозоновому мутагенезі буль� бочкових бактерій гороху використали ген стійкості до канаміцину. Контроля� ми були взяті штами 263б та штам E.coli S�17, який містив плазмідцу pSUP2021:Tn5. Із результатів полімеразної ланцю� гової реакції видно (рис.), що дослід� жуваний контрольний штам�реципієнт Rhizobium leguminosarum bv. viceae 263б не містить у своєму геномі фраг� мента ДНК гена стійкості до канаміци� ну транспозону Tn5. У той час ПЛР аналіз показав наявність даного фраг� мента транспозону довжиною 517 нук� леотидних пар у Tn5–мутантів бульбоч� кових бактерій гороху М1 і М2. Це свідчить про наявність в їх геномі гена 41ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2009, том 7, № 1 Фізіолого6біохімічні та генетичні характеристики Tn56мутантів Rhizobium ... неоміцинфосфотрансферази, тобто вони є Tn54мутантами. У геномі мутанта М3 не виявлено транспозону Tn5, тому його не можна вважати справжнім транспозоновим мутантом. Причиною відсутності по4 слідовності транспозону Tn5 у геномі М3 може бути те, що він є або спонтан4 ним мутантом, або з часом втратив транспозон [16]. Таким чином, використаний нами метод ПЛР аналізу геномної ДНК ри4 зобій гороху на наявність послідовності гена неоміцинфосфотрансферази транспозону Tn5 підтвердив, що набу4 та стійкість до антибіотика є результа4 том інтеграції в їхній геном Tn5. Поряд із встановленням генетичних змін у Tn54мутантів ризобій гороху не4 обхідно було дослідити їхні основні фізіолого4біохімічні ознаки порівняно із штамом4реципієнтом, що важливо для їх подальшого вивчення і викори4 стання. Нами було встановлено, що досліджені мутанти як і вихідний штам були грам4негативні, рухливі, клітини мали паличковидну форму, добре рос4 ли на поживному середовищі Мазе і середовищі № 79. Бульбочкові бактерії засвоюють широкий спектр вуглеводів, викорис4 товуючи їх як джерело енергії для син4 тезу різних метаболітів [14]. Так, гексо4 зи у клітинах ризобій катаболізуються до пірувата в основному шляхом Ент4 нера4Дудорова, але у деяких штамів виявлені ферменти шляху Ембдена4 Мейергофа4Парнаса. У швидкорослих ризобій присутні ферменти пентозо4 500 нп М 1 2 3 4 5 Рисунок. ПЛР4аналіз ДНК мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae на на4 явність в їхньому геномі транспозону Tn5. Ампліфікацію було проведено з прайме4 рами, комплементарними до структурної послідовності гена неоміцинфосфотран4 сферази транспозону Tn5 довжиною 517 н.п.: М — маркер молекулярної маси ДНК (GeneRulerTM 100bp DNA Ladder, “Fermentas”); 1 — вихідний штам 263б (негативний контроль); 2 — мутант М1; 3 — мутант М2; 4 — мутант М3; 5 — E. coli S417, який містить плазміду pSUP2021:Tn5 (позитивний контроль) 42 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2009, том 7, № 1 С.Я. Коць, Н.М. Мандровська, О.Д. Кругова, В.М. Заєць фосфатного шляху: глюкозо464фос4 фат4дегідрогенази, 64фосфоглюконат4 дегідрогенази [17]. Засвоєння пентоз, зокрема арабінози, швидкорослими бульбочковими бактеріями здійсню4 ється завдяки утворенню 1 β4кетоглю4 таратсімальдегіду і кетоглютарату [17, 19]. Досліджувані мутантні штами, як видно з даних табл.1, активно катабо4 лізують моносахариди — арабінозу, глюкозу, але на відміну від вихідного штаму не засвоюють сорбозу. Завдя4 ки наявності у них індуцибельної інвер4 тази, спроможні катаболізувати диса4 хариди — лактозу, мальтозу, сахарозу. Вони добре засвоюють трисахарид рафінозу, а також сахароспирти — маніт і сорбіт, але на відміну від вихід4 ного штаму не катаболізують інозитол, декстрин і полісахарид — крохмаль. Метаболізм азоту у швидкорослих ризобій пов’язаний із здатністю бак4 терій під дією ферментів нітратредук4 тази та уреази використовувати як джерело азоту солі амонію, нітрати, сечовину. Джерелом азоту для ризобій можуть бути деякі амінокислоти, зок4 рема, глутамат, а також аргінін, гісти4 дин, пролін, які утворюються у процесі дезамінування [14]. Як показали ре4 зультати досліджень Tn54мутанти, як і вихідний штам здатні до нітратредукції. Почервоніння середовища із реакти4 вом Грісса, що спостерігається у вихід4 ного штаму, так і Tn54мутантів, вказує на появу нітриту, який утворився в ре4 зультаті відновлення нітрату (табл.2). Таблиця 1. Катаболізм вуглеводів Rhizobium leguminosarum bv. viceae шт. 263б та його Tn54 мутантами Штам Вуглевод 263б М1 М2 Моносахариди Арабіноза + + + + + + + + + Глюкоза + + + + + + + + + Ксилоза + + + + + + + Рамноза + + + + + + + + + Сорбоза + + − − Дисахариди Лактоза + + + + + + + + + Мальтоза + + + + + + + + + Сахароза + + + + + + + + + Трисахарид Рафіноза + + + + + + Сахароспирти і полісахариди Маніт + + + + + + + + + Сорбіт + + + − − Інозитол + + − − Декстрин + + − − Крохмаль + + − − П р и м і т к и: + + + — нормальний ріст; + + — слабкіший ріст; — відсутність росту. 43ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2009, том 7, № 1 Фізіолого6біохімічні та генетичні характеристики Tn56мутантів Rhizobium ... Для дослідження здатності транспо4 зонових мутантів бульбочкових бак4 терій гороху розщеплювати білки вико4 ристали різні середовища: знежирене молоко з індикатором метиленовим синім, бульйон Хоттінгера, желатину, індикаторні папірці на наявність сірко4 водню. Із результатів, наведених у табл. 2, видно, що вихідний штам 263б слабо пептонізує молоко, а мутанти М1 і М2, отримані на його основі, активно проводять цю реакцію — молоко з інди4 катором після гідролізу (пептонізації) ставало прозорим за рахунок розщеп4 лення казеїну до розчинних амінокис4 лот та пептидних фрагментів. Мутанти, як і вихідний штам, не ростуть на бульйоні Хоттінгера, не виділяють сірководню, не розріджують желатину. Таким чином, як видно із наведених даних, Tn54мутанти ризобій гороху за фізіолого4біохімічними ознаками ма4 ють як спільні, так і відмінні властивості у порівнянні з штамом4реципієнтом. Висновки Вивчені генетичні та фізіолого4 біохімічні ознаки (катаболізм вугле4 водів, нітратредукція, стійкість до ан4 тибіотиків, ПЛР аналіз) у отриманих нами Tn54мутантів бульбочкових бак4 терій гороху у порівнянні зі штамом4 реципієнтом Rhizobium leguminosarum bv. viceae 263б. За результатами полімеразної лан4 цюгової реакції встановлено, що дос4 ліджувані мутанти М1 і М2 є дійсно Tn54 мутантами ризобій гороху, тому що вони містять фрагмент структурної по4 слідовністі гена стійкості до канаміци4 ну транспозону Tn5. Показано, що за фізіолого4біохіміч4 ними ознаками Tn54мутанти ризобій гороху мають як спільні, так і відмінні властивості із вихідним штамом Rhizobium leguminosarum bv. viceae 263б. Перелік літератури 1. Генетика симбиотической азотфикса4 ции с основами селекции / Под ред. И.А. Тихоновича, Н.А. Проворова. — СПб.: Наука, 1998. — 193с. 2. Проворов Н.А., Симаров Б.В., Федоров С.Н. Симбиотические свойства разных типов мутантов клубеньковых бакте4 рый // Изв. АН СССР. — 1985. — № 6. — С. 870–884. 3. Генетические основы селекции клу4 беньковых бактерий / Под ред. Б.В. Симарова. — Л.: Агропромиздат, 1990. — 192 с. 4. Проворов Н.А., Симаров Б.В. Направ4 ления конструирования штаммов клу4 бенькових бактерий с повышенной симбиотической эффективностью // Молекулярные механизмы генетичес4 ких процессов. — М. — 1991. — С. 190– 194. Таблиця 2. Фізіолого4біохімічні властивості Tn54мутантів бульбочкових бактерій гороху Розщеплення білків Редукція нітратів Варіант ріст на бульйоні желатина виділення H2S пептонізація молока Колір середовища ріст колір середовища 263б − − − + + Слабо блакитний + + + рожевий М1 − − − + + + Прозорий + + + рожевий М2 − − − + + + Прозорий + + + рожевий П р и м і т к и: + + + — нормальний ріст; + + — слабкіший ріст; — відсутність росту. 44 ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2009, том 7, № 1 С.Я. Коць, Н.М. Мандровська, О.Д. Кругова, В.М. Заєць 5. Reznikoff W.S. The Tn5 transposon // Annu. Rev. Microbiol. — 1993. — Vol. 47. — P. 945–963. 6. Simon By.R., O’Connell M., Labes M. , Pьhler A. Plasmid vector for the genetic analysis and manipulation of Rhizobia and other gram�negative bacteria // Methods in Enzymology. — 1986. — Vol. 118. — P. 645–659. 7. Патент № 81577 Украиїни МПК CO5F 11/08 C12R 1/41. Штам бактерій Rhizo� bium leguminosarum bv. viceae М1 для одержання бактеріального добрива під горох // Коць С.Я., Мандровська Н.М., Кругова О.Д. — Опубл. 10.01.2008. Бюл № 1. 8. Мандровська Н.М., Кругова О.Д., Коць С.Я. Ефективність симбіозу рос� лин гороху із транспозантами Rhizobium leguminosarum bv. viceae 263б // Вісник ХНАУ. — 2007. — випуск 8 (10) — С. 65–79. 9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбук Дж. Мо� лекулярное клонирование. Методы ге� нетической инженерии. — Москва: Мир, 1984. — С. 182–194. 10. Патент № 21012 А Україна, МКИ6 СОБF 11/08 C12R 1:4. Штам бактерій Rhizo� bium leguminosarum для одержання бактеріального добрива під горох // Ю.П. Старченков, Н.М. Мандровська, М.М. Нічик, О.Д. Кругова та ін. — Опубл. 27.02.98, Бюл. № 1. 11. Reznikoff W.S. Transposon Tn5 // Annu. Rev. Genet. — 2008. — Vol. 42. — P. 151– 158. 12. Chachaty E., Saulnier P. Isolation chromo� somal DNA from bacteria // In the Nucleic Acid Protocols Handbook (Edited by R.Rapley). — Humana Press Inc., Totowa NJ, 2000. — P. 29–32. 13. Лабинская А.С. Микробиология с тех� никой микробиологических исследо� ваний. — М.: Высшая школа, 1972. — 480 с. 14. Готшлак Г. Метаболизм бактерий. — М.: Б.и, 1982. — 310 с. 15. Кругова О.Д., Мандровська Н.М. Ноду� ляційна конкурентна здатність Tn5�му� тантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae // Сільськогосподарська мікро� біологія; міжвідомчий тематичний нау� ковий збірник. — 2007. — випуск 6. — С. 18–28. 16. Maloy R. Use of antibiotic�resistant trans� posons for mutagenesis // Methods in Enzymology. — 2007. — Vol. 421. — P. 11–17. 17. Martinez�Drets E., Arias A. Enzymatic basic for differentiation of Rhizobium into fast and slow growing groups // J. Bacte� riol. — 1972. — Vol. 105, N 1. — P.467– 469. 18. De Vries A., Van brussel L. Mechanism and regulation of glucose transport in Rhizobium leguminosarum // J. Bacteriol. — 1982. — Vol. 149, N 1. — P.872–876. 19. Duncan M., Fraenkec D. Ketoglutu� ratedehydrogenase mutant of Rhizobium meliloti // J. Bacteriol. — 1979. — Vol. 37, N 1. — P.415–419. Представлено М.В. Кучуком Надійшла 25.02.2009 ФИЗИОЛОГО�БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ TN5� МУТАНТОВ RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. VICEAE С.Я. Коць, Н.М. Мандровская, Е.Д. Кругова, В.Н. Заец Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Украина, 03022, Киев, ул. Васильковская, 31/17 e�mail: azot@ifrg.kiev.ua Исследованы генетические особенности и физиолого�биохимические свойства Tn5� мутантов клубеньковых бактерий гороха. С использованием полимеразной цепной реакции установлено, что исследуемые штаммы действительно относятся к Tn5� мутантам ризобий гороха, поскольку они содержат фрагмент структурной последо� вательности гена устойчивости к канами� цину транспозанта Tn5. Показано, что по физиолого�биохимическим свойствам Tn5�мутанты клубеньковых бактерий горо� 45ISSN 1810�7834. Вісн. Укр. тов�ва генетиків і селекціонерів. 2009, том 7, № 1 Фізіолого6біохімічні та генетичні характеристики Tn56мутантів Rhizobium ... ха имеют как общие, так и отличительные признаки в сравнении со штаммом4реци4 пиентом. Ключевые слова: транспозоновый мутаге� нез, Tn5�мутанты ризобий гороха, полиме� разная цепная реакция. THE PHYSIOLOGO4BIOCHEMICAL AND GENETICAL CHARACTERISTICS OF TN54MUTANTS OF RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. VICEAE S.Ya. Kots, N.M. Mandrovska, O.D. Krugova, V.M. Zaets Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Ukraine, 03022, Kyiv, Vasylkivska St., 31/17 e4mail: azot@ifrg.kiev.ua The genetical and physiological and bioche4 mical properties of pea nodule bacteria were studied. Using of polymerase chain reaction it was established that studied strain were actually Tn54mutants of pea rhizobia, since they contained part of structure sequence of Tn5 kanamicin resistance gene. It was shown that Tn54mutants of pea nodule bacteria had as the same as distinctive signs by physiolo4 gical and biochemical properties in com4 parison with strain4recipient. Key words: transposon mutogenesis, Tn5� mutants of pea rhizobie, polymerase chain reaction.

Фізіолого-біохімічні та генетичні характеристики Tn5-мутантів Rhizobium leguminosarum bv. viceae

Репозитарії

Схожі ресурси