Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих
Сконструированы рекомбинантные бакуловирусные векторы Ac-CMV-GFP, Ac-M-GFP и Ac-IFN-GFP с различными регуляторными элементами (промотор CMV и кассета CAG), запускающими экспрессию репортерного гена eGfp и гена мышиного β-Ifn в клетках млекопитающих. Проведено сравнение эффективности трансдукции мыши...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18919 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих / О.В. Аноприенко, И.Н. Вагина, Е.А. Захарук, Л.И. Строковская, А.П. Соломко // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2010. — Т. 8, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 18 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859750972565225472 |
|---|---|
| author | Аноприенко, О.В. Вагина, И.Н. Захарук, Е.А. Строковская, Л.И. Соломко, А.П. |
| author_facet | Аноприенко, О.В. Вагина, И.Н. Захарук, Е.А. Строковская, Л.И. Соломко, А.П. |
| citation_txt | Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих / О.В. Аноприенко, И.Н. Вагина, Е.А. Захарук, Л.И. Строковская, А.П. Соломко // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2010. — Т. 8, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 18 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів |
| description | Сконструированы рекомбинантные бакуловирусные векторы Ac-CMV-GFP, Ac-M-GFP и Ac-IFN-GFP с различными регуляторными элементами (промотор CMV и кассета CAG), запускающими экспрессию репортерного гена eGfp и гена мышиного β-Ifn в клетках млекопитающих. Проведено сравнение эффективности трансдукции мышиных и человеческих клеточных линий рекомбинантными бакуловирусными векторами.
Cконструйовані рекомбінантні бакуловірусні вектори Ac-CMV-GFP, Ac-M-GFP и Ac-IFN-GFP із різними регуляторними елементами (промотор CMV і касета CAG), що забезпечують експресію репортерного eGfp і гена мишачого β-Ifn у клітинах ссавців. Проведено порівняння ефективності трансдукції клітинних ліній миші та людини отриманими рекомбінантніми бакуловірусними векторами.
Recombinant baculovirus vectors Ac-CMV-GFP, Ac-M-GFP and Ac-IFN-GFP with different (CMV and CAG) regulatory elements promoting eGfp reporter gene and mouse β-Ifn gene expression in mammalian cells have been constructed. Comparison of transduction efficiency of mouse and human cell lines by constructed baculovirus vectors has been carried out.
|
| first_indexed | 2025-12-01T23:56:52Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 18107834. Вісн. Óкр. товва генетиків і селекöіонерів. 2010, том 8, № 1 3
© î.â. àÍîПðèåÍêî, è.Í. âàãèÍà, å.à. Зàõàðóê, ë.è. ñòðîêîâñêàЯ, à.П. ñîëîìêî, 2010
Îðèã³íàëüí³ ñòàòò³
óäê 578.841:578.23
БАКУЛÎВИРУÑÍЫЕ ВЕКÒÎРЫ Añ-CMV-GFP, Añ-M-GFP
И Añ-IFN-GFP ДЛЯ ЭФФЕКÒИВÍÎГÎ ПЕРЕÍÎÑА ГЕÍÎВ
В КЛЕÒКИ ÌЛЕКÎПИÒАÞЩИХ
î.â. àÍîПðèåÍêî, è.Í. âàãèÍà, å.à. Зàõàðóê, ë.è. ñòðîêîâñêàЯ,
à.П. ñîëîìêî
èнститут ìолекулярной биологии и генетики ÍàÍ óкраины
óкраина, 03143, г. êиев, ул. Заболотного, 150
e-mail: solomko@imbg.org.ua
Сконструированы рекомбинантные бакуловирусные векторы AcCMVGFP, AcM
GFP и AcIFNGFP с различными регуляторными элементами (промотор CMV и кассе
та CAG), запускающими экспрессию репортерного гена eGfp и гена мышиного βIfn в
клетках млекопитающих. Проведено сравнение эффективности трансдукöии мышиных
и человеческих клеточных линий рекомбинантными бакуловирусными векторами.
Ключевые слова: рекомбинантный бакуловирус, AcMNPV, трансдукöия, генная тера
пия, βинтерферон, IFNβ.
Ввåдåíèå. Бакуловирус AcMNPV (вирус ìножественного ядерного поли-
эдроза Autographa californica) является новыì привлекательныì векто-
роì для геннотерапевтических приложений. Экспрессия трансгена in vivo при
трансдукции бакуловирусныì (Бâ) вектороì, сравниìа по уровню с экспрес-
сией, опосредованной аденовирусоì [1]. êроìе того, бакуловирусы характе-
ризуются рядоì преиìуществ, наприìер, отсутствиеì выраженной цитоток-
сичности в клетках ìлекопитающих in vitro даже при введении больших (500
moi) доз вируса, что свидетельствует о безопасности Бâ-векторов [2]. Баку-
ловирусы не реплицируются в клетках ìлекопитающих [3], способны трансду-
цировать широкий спектр типов клеток и тканей [2], и, благодаря структуре ге-
ноìа и вирусных частиц, включать большие (до 30 тыс.н.п.) фрагìенты гетеро-
логичной äÍê [4]. Показано, что при трансдукции Бâ не изìеняется потенциал
дифференцировки и спектр поверхностных ìаркеров клеток [4, 5].
äля доставки генов в клетки ìлекопитающих были использованы векторы
на основе вирусов ядерного полиэдроза AcMNPV и BmNPV [4, 7]. Экспрес-
сия генов в клетках ìлекопитающих в составе бакуловирусов выявлялась при
встраивании генов под контроль цитоìегаловирусного (CMV) IE-проìотора и
проìотора из вируса саркоìы ðауса (RSV) [6, 7]. CAG-кассета, включающая
IE-энхансер цитоìегаловируса, проìотор гена β-актина цыпленка и сигнал по-
лиаденилирования гена β-глобина кролика, также эффективно запускает экс-
прессию во ìногих типах клеток и проявляет себя более сильныì регулятороì,
чеì проìоторы CMV и RSV [8].
Перечисленные выше свойства бакуловирусов делают их перспективны-
ìи для использования в систеìе ”клеточных векторов” в противоопухолевой
терапии. â качестве активного вещества для целей противоопухолевой тера-
ISSN 18107834. Вісн. Óкр. товва генетиків і селекöіонерів. 2010, том 8, № 14
Î.В. Аíопðèеíко, И.Н. Вàãèíà, Е.А. Зàхàðук, Л.И. Сòðоковñкàя, А.П. Соëомко
на и 100 ìкг/ìл стрептоìицина при 37 °ñ в
CO2-инкубаторе.
Рåêоìбèíàíòíыå бàêуëовèðуñы è
òðàíñ дуêöèя êëåòоê ìëåêопèòàющèх.
ðекоìбинантные бакуловирусы получа-
ли на основе вируса ядерного полиэд-
роза Autographa californica (AcMNPV)
в экспрессионной систеìе Bac-to-Bac
(Invitrogen). Íа первоì этапе были сконс-
труированы рекоìбинантные Бâ-векто-
ры – Ac-M-GFP и Ac-CMV-GFP с разныìи
проìотораìи, запускающиìи экспрессию
репортера EGFP (Enhanced Green Fluo-
rescent Protein). Экспрессия репортер-
ного гена в составе вектора Ac-CMV-GFP
осуществлялась под регуляцией проìото-
ра CMV, а вектора Ac-M-GFP – под регуля-
цией проìотора β-актина цыпленка в со-
ставе кассеты CAG.
äля исследования эффективности до-
ставки гена β-Ifn в клетки ìлекопитающих
был сконструирован рекоìбинантный ба-
куловирус Ac-IFN-GFP, содержащий два
гена – репортерный eGfp под регуляци-
ей проìотора CMV и ген ìышиного β-Ifn
под регуляцией кассеты CAG. Бакулови-
рус Ac-CMV-GFP с геноì Gfp под проìо-
тороì CMV служил контрольныì вирусоì.
âирусы концентрировали центрифугиро-
ваниеì при 100000g. òитр вирусных пре-
паратов после аìплификации и концент-
рирования составлял 2–4 х108 Бîå (бляш-
кообразующих единиц)/ìл.
òрансдукцию проводили в оптиìизи-
рованных наìи предварительно услови-
ях [12]. êлетки рассевали в 6-ти луноч-
ные плашки в концентрации 2×105 кле-
ток на лунку в культуральной среде DMEM
(Sigma) c добавлениеì 10 % FBS и анти-
биотиков с последующей инкубацией при
37 °ñ в ñî2 инкубаторе на протяжении
12 часов. êультуральную среду сливали,
клетки проìывали фосфатныì буфероì
D-PBS (Dulbecco PBS, без ионов ñа2+ и
Mg2+), и добавляли рекоìбинантный баку-
ловирус в концентрации 20, 200 и 500 moi
(multiplicisty of infection = количество Бîå
пии активно исследуется β-интерферон
(IFN-β) [9], являющийся одниì из чле-
нов целого сеìейства плейотропных ци-
токинов – интерферонов. â клинике ин-
терфероны используют для лечения ряда
вирусных инфекций, аутоиììунных забо-
леваний – рассеянного склероза и ревìа-
тоидного артрита, а также в противоопу-
холевой терапии. IFN-β усиливает апоптоз
опухолевых клеток, осуществляет торìо-
жение ангиогенеза в опухолевых тканях,
снижает частоту ìетастазирования [10].
åго введение с поìощью рекоìбинантно-
го вектора ìогло бы осуществить локаль-
ную продукцию IFN-β на достаточно высо-
коì уровне и реализовать терапевтичес-
кий потенциал.
äанная работа посвящена сравнению
эффективности доставки в клетки ìлеко-
питающих экзогенов (репортерного гена
eGfp и гена ìышиного β-Ifn) рекоìбинант-
ныìи бакуловирусныìи вектораìи с раз-
личныìи регуляторныìи элеìентаìи.
Ìàòåðèàëы è ìåòоды
Кëåòочíыå êуëüòуðы. ìонослойную
культуру клеток насекоìых Sf21 выращи-
вали в среде TC-100 (Sigma) с добавле-
ниеì 10 % FBS при 28 °ñ. èнфицирование
клеток бакуловирусаìи проводили соглас-
но стандартныì процедураì [11].
â работе использовали линии кле-
ток ìлекопитающих: Íåê293 (линия кле-
ток эìбриональной почки человека), ÍeLa
(клетки карциноìы шейки ìатки чело-
века), полученные из ðоссийской кол-
лекции клеточных культур (ñанкт-Петер-
бург), MM4 (клеточная линия из ìеланоìы
â-16), а также первичные фибробласты
ìышей линии C57BL/6j, которые получали
из ìягких тканей 14-дневных эìбрионов
ìетодоì ферìентативной дезагрегации
ткани (C57Fb). âсе линии клеток культиви-
ровали в среде DMEM (Sigma) с добавле-
ниеì 10 % эìбриональной телячьей сыво-
ротки FBS (Sigma), 100 ед/ìл пеницилли-
ISSN 18107834. Вісн. Óкр. товва генетиків і селекöіонерів. 2010, том 8, № 1 5
Бàкуëовèðуñíые векòоðы Añ-CMV-GFP, Añ-M-GFP И Añ-IFN-GFP ...
òакиì образоì, на первоì этапе ра-
боты были сконструированы два рекоì-
бинантных бакуловирусных вектора – Ac-
M-GFP и Ac-CMV-GFP с разныìи про-
ìотораìи, запускающиìи экспрессию
репортера EGFP. Экспрессия репортер-
ного гена в составе вектора Ac-CMV-GFP
осуществлялась под регуляцией проìо-
тора CMV, а вектора Ac-M-GFP – под ре-
гуляцией проìотора β-актина цыпленка в
составе кассеты CAG. êассета CAG, вклю-
чающая IE-энхансер цитоìегаловируса,
проìотор гена β-актина цыпленка и сиг-
нал полиаденилирования гена β-глобина
кролика, эффективно запускает экспрес-
сию во ìногих типах клеток и проявля-
ет себя более сильныì регулятороì, чеì
проìоторы CMV и RSV [8]. èсследовали
эффективность трансдукции клеточных
линий человека (HEK293 и HeLa) и ìыши
(фетальные фибробласты C57Fb) рекоì-
бинантныìи Бâ.
По литературныì данныì ìышиные
клеточные линии характеризовались очень
низкиìи эффективностью трансдукции и
уровнеì экспрессии репортерного гена
под регуляцией CMV-проìотора [14], что
осложняет их использование в генной те-
рапии. ðешениеì этой проблеìы ìог быть
подбор более сильной регуляторной кас-
сеты, ìодификация поверхностных белков
вируса и изìенение условий трансдукции.
ìы пошли по пути поиска и оценки более
сильной регуляторной кассеты ñAG и оп-
тиìизации условий трансдукции.
â противоопухолевой терапии иссле-
дуют возìожность использования как ìе-
зенхиìальных стволовых клеток, так и
зрелых фибробластов. Фетальные фибро-
бласты характеризуются более широкиì
потенциалоì в сравнении с фиброблас-
таìи взрослого организìа и более актив-
ныì ростоì в культуре in vitro и, возìож-
но, ìогут представлять альтернативный
ìезенхиìальныì стволовыì клеткаì ис-
точник для получения ”клеточных векто-
ров”. â связи с этиì было проведено ис-
на клетку), общий объеì PBS на лунку до-
водили до 500 ìкл. После этого использо-
вали оптиìизированный ìетод трансдук-
ции [12]. êлетки во всех вариантах инкуби-
ровали 4 часа при 28 °ñ затеì добавляли
1,5 ìл среды DMEM и культивировали 16
часов при 37 °ñ. â конце инкубационного
периода раствор с вирусоì сливали, клет-
ки проìывали PBS и добавляли 2 ìл среды
DMEM, содержащей 10% FBS, продолжая
культивирование клеток на протяжении
24 часов при 37°ñ, после чего клетки ана-
лизировали на проточноì цитофлуори-
ìетре.
Пðоòочíàя öèòоôëуоðèìåòðèя. Эф-
фек тивность трансдукции определяли
по количеству клеток, экспрессирующих
светящийся белок, с использованиеì ци-
тофлуориìетра Coulter Epics XL, предва-
рительно анализируя препараты на флуо-
ресцентноì ìикроскопе (ìикìед-2åñ).
Подготовку клеток осуществляли анало-
гично [12]. äля каждого образца анализи-
ровали 10 000 событий. ñтатистическую
обработку результатов трансдукции про-
водили в соответствии со стандартныìи
ìетодаìи [13] c презентацией данных в
програììе Microsoft Excel.
Рåзуëüòàòы è обñуждåíèå
òрансдукция Бâ-вектороì клеток ìле-
копитающих происходит в достаточно ши-
роких пределах эффективности [14]. äля
точной оценки экспрессии трансгена не-
обходиìа количественная характерис-
тика, как уровня трансдукции клеток-ìи-
шеней, так и продукции белка. äля этой
цели было предложено сконструировать
вектор, содержащий два гена – целевой
ген β-интерферона и репортерный ген
eGfp, который и позволит оценить уровень
транс дукции рекоìбинантныì Бâ-векто-
роì. Íеобходиìость высокого уровня экс-
прессии трансгена требовала подбора и
оценки регуляторных элеìентов в составе
Бâ-вектора.
ISSN 18107834. Вісн. Óкр. товва генетиків і селекöіонерів. 2010, том 8, № 16
Î.В. Аíопðèеíко, И.Н. Вàãèíà, Е.А. Зàхàðук, Л.И. Сòðоковñкàя, А.П. Соëомко
Рèñ. 1. äозовая зависиìость эффективности трансдукции клеточных линий Íåê293, HeLa и C57Fb
рекоìбинантныìи бакуловирусныìи вектораìи Ac-CMV-GFP и Ac-M-GFP: по оси ординат – доля флуоресцирую-
щих (GFP+) клеток (%); по оси абсцисс – типы клеточных линий; 1 – 20 moi; 2 – 200 moi; 3 – 500 moi
следование эффективности трансдукции
первичной культуры фибробластов ìыши
(C57Fb).
îбе рекоìбинантные бакуловирусные
конструкции Ac-M-GFP и Ac-CMV-GFP
показали высокую эффективность транс-
дукции человеческих (HEK293, HeLa) и
ìышиных (C57Fb) клеток в соответствии
с дозой вируса (рис. 1). îднако дозо-
вая зависиìость для разных типов клеток
несколько отличалась. ó клеток HEK293
для доз 200moi и 500moi наблюдалась
практически одинаковая граничная эф-
фективность трансдукции 93,4±1,1 % и
93,5±2,5 % соответственно дозаì виру-
са Ac-M-GFP, и 90,0±2,1 % и 90,6±1,3 %
– для Ac-CMV-GFP. äля обеих конструк-
ций при этоì наблюдался незначитель-
ный сдвиг в значениях средних интенсив-
ностей флуоресценции в большую сторону
для дозы 500 moi. При дозе 20 moi эффек-
тивность трансдукции для обеих рекоì-
бинантных конструкций была достаточно
высокой и составляла для вируса Ac-M-
GFP 66,8±3,1%, и вируса Ac-CMV-GFP –
62,2±13,9 % (рис. 1).
äля клеток линии HeLa дозовая зави-
сиìость эффективности трансдукции для
вируса Ac-M-GFP и доз 20, 200 и 500 moi
выглядит соответственно как 30,8±1,5 %,
70,4±5,73 % и 82,8±3,8 %; для вируса
Ac-CMV-GFP – 14,2±2,3 %, 61,1±2,8%,
80,7±7,5 %. Эффективность трансдукции
первичных фибробластов ìыши C57Fb
вирусоì Ac-M-GFP при 20, 200, 500 moi
составляла соответственно 33,7±1,2 %,
69,6±3,8 %, 75,8±2,7 %; для вируса Ac-
CMV-GFP и аналогичных доз – 13,3±2,9 %,
59,1±13,1 %, 85,2±8,8 %. ó этих линий
клеток при дозе вируса 20 moi были вы-
явлены значительные различия ìежду ре-
коìбинантныìи конструкцияìи с большей
эффективностью для вируса Ac-M-GFP,
в то вреìя как при дозах 200 и 500 moi
эта разница практически нивелировалась
(рис. 1).
â некоторых работах показано, что вы-
сокие концентрации рекоìбинантного ви-
руса (800 moi и выше) ìогут приводить к
перегрузке клеток ìлекопитающих вирус-
ныìи геноìаìи и являться причиной нару-
шения клеточного ìетаболизìа, приводя-
щего в итоге к заìедлению теìпа деления
ISSN 18107834. Вісн. Óкр. товва генетиків і селекöіонерів. 2010, том 8, № 1 7
Бàкуëовèðуñíые векòоðы Añ-CMV-GFP, Añ-M-GFP И Añ-IFN-GFP ...
репортера Gfp – под CMV (рис. 2). âектор
Ac-CMV-GFP на второì этапе исследова-
ния использовали в качестве контрольно-
го. ìышиная опухолевая клеточная линия
MM4 была добавлена для сравнения эф-
фективности трансдукции Бâ-вектороì,
содержащиì ген βIfn, с норìальныìи
клеткаìи ìыши.
Эффективность трансдукции контроль-
ныì бакуловирусоì Ac-CMV-GFP кле-
ток Íåê293, C57Fb и MM4 составляла со-
ответственно 95,8±2,5 %, 52,9±4,2 % и
44,9±1,6 %. â то вреìя как бакуловирус
Ac-IFN-GFP в той же дозе трансдуциро-
вал клетки с эффективностью 42,2±4,4 %,
16,2±1,6 % и 2,8±0,5 % соответственно
(рис 3). òакиì образоì, эффективность
трансдукции Бâ-вектороì с геноì ìыши-
ного β-Ifn человеческих клеток (Íåê293)
уìеньшилась в 2,3 раза, норìальных кле-
ток ìыши (C57Fb) в 3,2 раза и опухолевых
клеток ìыши (MM4) в 16 раз относительно
контрольного вектора, характеризующе-
го среднюю эффективность трансдукции
клеток ìыши и человека бакуловирусоì.
â качестве причины уìеньшения эф-
фективности трансдукции ìожно пред-
положить активность саìого интерферо-
на. Эффект ”вставки” (увеличение разìе-
ра клонированного фрагìента) в целоì
не исключен, однако ìаловероятен. ìи-
ниìальное (в 2,3 раза) отличие в эффек-
тивности трансдукции контрольныì виру-
клеток и снижению их жизнеспособнос-
ти [15]. â наших экспериìентах снижение
жизнеспособности клеток, отìечаеìое по
увеличению количества клеток позитив-
но окрашиваеìых флуоресцентныì кра-
сителеì PI (пропидиуì йодид, предвари-
тельные данные), наблюдалось для кле-
ток HеLа и для фибробластов ìыши C57Fb
при трансдукции дозой вируса 500 moi.
èсследование продолжительности флу-
оресценции трансдуцированных клеток по-
казало, что количество флуоресцирующих
клеток постепенно уìеньшается для всех
доз и конструкций. îднако для конструкции
Ac-M-GFP количество интенсивно флуо-
ресцирующих клеток было большиì, и в от-
дельных клетках флуоресценция наблюда-
лась на 20 сутки. äля вируса Ac-CMV-GFP
флуоресценция в целоì была ìенее про-
должительной (13 сутки).
òакиì образоì, было показано, что обе
рекоìбинантные конструкции обеспечи-
вают удовлетворительный уровень экс-
прессии репортерного гена в исследован-
ных клеточных линиях человека и ìыши.
ðекоìбинантний бакуловирус Ac-M-GFP
в целоì обеспечивал более интенсивную
и продолжительную экспрессию репор-
терного GFP. îптиìальной дозой, обес-
печивающей достаточно высокий уровень
трансдукции всех исследованных клеток
и не влияющей на их жизнеспособность
в культуре in vitro была доза вируса 200
moi. Полученные фетальные фибробласты
продеìонстрировали спо-
собность эффективно транс-
дуцироваться бакуловирус-
ныìи вектораìи в оптиìи-
зированных наìи условиях
трансдукции. â связи с этиì,
в рекоìбинантноì бакулови-
русе Ac-IFN-GFP, конструи-
руеìоì для экспрессии двух
генов в клетках ìлекопитаю-
щих, целевой ген ìышиного
βIfn был встроен под регу-
ляцию более сильного про-
ìотора кассеты CAG, а ген
Рèñ. 2. ñтруктура рекоìбинантного бакуловируса Ac-IFN-GFP. Показаны
порядок и ориентация двух клонированных генов – репортерного eGfp
под регуляцией проìотора CMV и гена ìышиного β-Ifn под регуляцией
кассеты CAG: pA – сигнал полиаденилирования; enh – энхансерная после-
довательность; pr – проìотор; Gm – ген гентаìицина; SpeI – сайт рестрик-
ции; по котороìу клонирован фрагìент с геноì eGfp; Tn7L и Tn7R – участ-
ки гоìологичной рекоìбинации бакìиды
ISSN 18107834. Вісн. Óкр. товва генетиків і селекöіонерів. 2010, том 8, № 18
Î.В. Аíопðèеíко, И.Н. Вàãèíà, Е.А. Зàхàðук, Л.И. Сòðоковñкàя, А.П. Соëомко
Íеобходиìо также продолжение опти-
ìизации конструкции Бâ-векторов для ис-
пользования в генной терапии. òак, для вы-
ключения экспрессии некоторых “ранних”
бакуловирусных генов в клетках ìлекопи-
тающих было предложено коìплексное ре-
шение, заключающееся в инактивации уни-
версального для ìногих вирусных генов
трансактиватора IE1 [2]. Псевдотипиро-
вание бакуловирусов ìожет повысить эф-
фективность опосредованной Бâ-вектороì
доставки генов, что было продеìонстри-
ровано на приìере G-белка вируса везику-
лярного стоìатита (VSVG) [17, 18].
Выводы
Полученные данные свидетельствуют
об эффективности использования бакуло-
вирусных векторов для переноса экзоге-
нов в клетки ìлекопитающих, перспектив-
ныì является их дальнейшее изучение в
качестве коìпонента систеìы ”клеточных
векторов” для стратегий генной и клеточ-
ной терапии.
Ñпèñоê ëèòåðàòуðы
1. Airenne K.J., Hiltunen M.O., Turunen M.P. et al.
Baculovirus-mediated periadventitial gene
transfer to rabbit carotid artery // Gene Ther. –
2000. – Vol. 7. – P. 1499–1504.
2. Kenoutis C., Efrose R.C., Swevers L. et al.
Baculovirus-mediated gene delivery into
Mammalian cells does not alter their trans-
criptional and differentiating potential but is
accompanied by early viral gene expression //
J. Virol. –2006. – Vol. 80. – P. 4135–4146.
3. Condreay J.P., Witherspoon S.M., Clay W.C.,
Kost T.A. Transient and stable gene expression in
mammalian cells transduced with a recombinant
baculovirus vector // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
– 1999. – Vol. 96. – P. 127–132.
4. Fujita R., Matsuyama T., Yamagishi J. et al. Ex-
pression of Autographa californica multiple nu-
cleopolyhedrovirus genes in mammalian cells
and upregulation of the host beta-actin gene // J.
Virol. – 2006. – Vol. 80. – P. 2390–2395.
5. Chuang C.K., Wong T.H., Hwang S.M. et al.
Baculovirus transduction of mesenchymal stem
cells: in vitro responses and in vivo immune
responses after cell transplantation // Mol. Ther.
– 2009. – Vol. 17. – P. 889–896.
6. Boyce F.M., Bucher N.L. Baculovirus-mediated
gene transfer into mammalian cells // Proc. Natl.
соì и вирусоì с геноì интерферона для
линии человеческих клеток (HeLa), ìожет
являться следствиеì видовой специфич-
ности IFN-β. âозìожно, даже небольшая
начальная секреция цитокина приводит
к блокированию либо непосредственно
проникновения вируса в клетку, либо экс-
прессии белков, в тоì числе и ìаркерного
GFP. Эффективность трансдукции в дан-
ноì экспериìенте определялась по доле
клеток, экспрессирующих светящийся
GFP – косвенноìу показателю проникнув-
ших в клетку активных вирусных частиц,
точно отражающеìу иìенно экспрессию
репортерного белка. ðанее было показа-
но, что процедура трансдукции дикиì Бâ
приводит к увеличению экспрессии неко-
торых цитокинов, таких как IL-1β, IFN-α,
IL-6 и, по некоторыì данныì, IFN-β, хотя
секреция происходит на незначительноì
уровне [16]. âоздействие Бâ-вектора на
клетки ìлекопитающих, дополненное син-
тезоì плейотропного β-интерферона ìо-
жет приводить к изìенению профиля экс-
прессии генов в векторных клетках, что
безусловно требует дополнительного изу-
чения.
Рèñ. 3. Эффективность трансдукции клеточных
линий Íåê293, C57Fb и MM4 рекоìбинантныìи
бакуловирусныìи вектораìи Ac-IFN-GFP и Ac-CMV-
GFP (доза 200 moi): по оси ординат – доля флуорес-
цирующих (GFP+) клеток (%), по оси абсцисс – типы
клеточных линий; 1 – Ac-IFN-GFP; 2 – Ac-CMV-GFP
ISSN 18107834. Вісн. Óкр. товва генетиків і селекöіонерів. 2010, том 8, № 1 9
Бàкуëовèðуñíые векòоðы Añ-CMV-GFP, Añ-M-GFP И Añ-IFN-GFP ...
БàêóëîâІðóñÍІ âåêòîðè Añ-CMV-GFP,
Añ-M-GFP І Añ-IFN-GFP äëЯ åФåêòèâÍîãî
ПåðåÍîñó ãåÍІâ ó êëІòèÍè ññàâöІâ
О.В. Анопрієнко, І.М. Вагіна, О.А. Захарук,
Л.І. Строковська, О.П. Соломко
Інститут ìолекулярної б³олог³ї ³ генетики ÍàÍ
óкраїни
óкраїна, 03143, ì. êиїв, вул. Заболотного, 150
e-mail: solomko@imbg.org.ua
Cконструйован³ рекоìб³нантн³ бакулов³рус-
н³ вектори Ac-CMV-GFP, Ac-M-GFP и Ac-IFN-
GFP ³з р³зниìи регуляторниìи елеìентаìи
(проìотор CMV ³ касета CAG), що забезпечу-
ють експрес³ю репортерного eGfp ³ гена ìиша-
чого β-Ifn у кл³тинах ссавц³в. Проведено пор³в-
няння ефективност³ трансдукц³ї кл³тинних л³н³й
ìиш³ та людини отриìаниìи рекоìб³нантниìи
бакулов³русниìи вектораìи.
Ключові слова: рекоìб³нантний бакулов³-
рус, AcMNPV, трансдукц³я, генна терап³я,
β-³нтерферон, IFN-β.
BACULOVIRUS VECTORS Añ-CMV-GFP,
Añ-M-GFP AND Añ-IFN-GFP FOR EFICIENT
GENE TRANSFER TO THE MAMMALIAN
CELLS
О.V. Anopriyenko, І.N. Vagyna, О.А. Zakharuk,
L.І. Strokovska, О.P. Solomko
Institute of molecular biology and genetics of NAS
of Ukraine
Ukraine, 03143, Kyiv, Akademika Zabolotnogo str.,
150
e-mail: solomko@imbg.org.ua
Recombinant baculovirus vectors Ac-CMV-GFP,
Ac-M-GFP and Ac-IFN-GFP with different (CMV
and CAG) regulatory elements promoting eGfp
reporter gene and mouse β-Ifn gene expression
in mammalian cells have been constructed.
Comparison of transduction efficiency of mouse
and human cell lines by constructed baculovirus
vectors has been carried out.
Key words: recombinant baculovirus, AcMNPV,
transduction, gene therapy, β-interferon, IFN-β.
Acad. Sci. USA. 1996. – Vol. 93, № 6. – P. 2348–
2352.
7. Hofmann C., Sandig V., Jennings G. et al. Effi-
cient gene transfer into human hepatocytes by
baculovirus vectors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA
– 1995. – Vol. 92, № 22. – P. 10099-10103.
8. Shoji I., Aizaki H., Tani H., et al. Efficient gene trans-
fer into various mammalian cells, including non-he-
patic cells, by baculovirus vectors // J. Gen. Virol. –
1997. – Vol. 78, № 10. – P. 2657–2664.
9. Studeny M., Marini F.C., Dembinski J.L. et al.
Mesenchymal stem cells: potential precursors
for tumor stroma and targeted-delivery vehicles
for anticancer agents // J. Natl. Cancer. Inst. –
2004. – Vol. 96. – P. 1593–603.
10. Zhang F., Lu W., Dong Zh. Tumor-infiltrating
macrophages are involved in suppressing growth
and metastasis of human prostate cancer cells
by IFN-β gene therapy in nude mice // Clinical
Cancer Research – 2002. – Vol. 8. – P.2942–
2951.
11. King L.A., Possee R.D. The baculovirus expres-
sion system. A laboratory guide // London: Chap-
mann and Hall, 1992. – P. 220.
12. Вагина И.Н., Аноприенко О.В., Захарук Е.А.,
Строковская Л.И., Соломко А.П. Эффективность
доставки генов бакуловирусаìи в клетки ìлеко-
питающих in vitro // Biopolymers and cell – 2008.
– ò. 24, №6. – ñ. 508–512.
13. Лакин Г.Ф. Биоìетрия. – ì.: âысш. шк., 1990.
– 352 с.
14. Hsu C.S., Ho Y.C., Wang K.C., Hu Y.C. Investiga-
tion of optimal transduction conditions for bacu-
lovirus-mediated gene delivery into mammalian
cells // Biotechnol. Bioeng. –2004. – Vol. 88. –
P. 42–51.
15. Hu Y.C. Baculovirus vectors for gene therapy //
In:Bonning DC (ed). Insect viruses: Biotechno-
logical Applications. Elsevier: New York, – 2006.
– Vol. 68. – P. 287–320.
16. Chen G.Y., Shiah H.C., Su H.J. et al. Baculovirus
transduction of mesenchymal stem cells triggers
the toll-like receptor 3 pathway // J. Virol. – 2009.
– Vol. 83. – P. 10548–10556.
17. Barsoum J., Brown R., McKee M., Boyce F.M.
Efficient transduction of mammalian cells by a
recombinant baculovirus having the vesicular
stomatitis virus G glycoprotein // Hum. Gene
Ther. – 1997. – Vol. 20. – P. 2011–2018.
18. Mäkelä A.R., Matilainen H., White D.J., Ruos
lahti E., OkerBlom C. Enhanced baculovirus-
mediated transduction of human cancer cells by
tumor-homing peptides // J. Virol. – 2006. – Vol.
80. – P. 6603–6611.
Представлена Н.В. Кучуком.
Поступила 26.03.2010.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-18919 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1810-7834 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-01T23:56:52Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Аноприенко, О.В. Вагина, И.Н. Захарук, Е.А. Строковская, Л.И. Соломко, А.П. 2011-04-12T10:47:45Z 2011-04-12T10:47:45Z 2010 Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих / О.В. Аноприенко, И.Н. Вагина, Е.А. Захарук, Л.И. Строковская, А.П. Соломко // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2010. — Т. 8, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 18 назв. — рос. 1810-7834 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18919 578.841:578.23 Сконструированы рекомбинантные бакуловирусные векторы Ac-CMV-GFP, Ac-M-GFP и Ac-IFN-GFP с различными регуляторными элементами (промотор CMV и кассета CAG), запускающими экспрессию репортерного гена eGfp и гена мышиного β-Ifn в клетках млекопитающих. Проведено сравнение эффективности трансдукции мышиных и человеческих клеточных линий рекомбинантными бакуловирусными векторами. Cконструйовані рекомбінантні бакуловірусні вектори Ac-CMV-GFP, Ac-M-GFP и Ac-IFN-GFP із різними регуляторними елементами (промотор CMV і касета CAG), що забезпечують експресію репортерного eGfp і гена мишачого β-Ifn у клітинах ссавців. Проведено порівняння ефективності трансдукції клітинних ліній миші та людини отриманими рекомбінантніми бакуловірусними векторами. Recombinant baculovirus vectors Ac-CMV-GFP, Ac-M-GFP and Ac-IFN-GFP with different (CMV and CAG) regulatory elements promoting eGfp reporter gene and mouse β-Ifn gene expression in mammalian cells have been constructed. Comparison of transduction efficiency of mouse and human cell lines by constructed baculovirus vectors has been carried out. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів Оригінальні статті Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих Бакуловірусні вектори Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP і Aс-IFN-GFP для ефективного переносу генів у клітини ссавців Baculovirus vectors Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP and Aс-IFN-GFP for eficient gene transfer to the mammalian cells Article published earlier |
| spellingShingle | Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих Аноприенко, О.В. Вагина, И.Н. Захарук, Е.А. Строковская, Л.И. Соломко, А.П. Оригінальні статті |
| title | Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих |
| title_alt | Бакуловірусні вектори Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP і Aс-IFN-GFP для ефективного переносу генів у клітини ссавців Baculovirus vectors Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP and Aс-IFN-GFP for eficient gene transfer to the mammalian cells |
| title_full | Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих |
| title_fullStr | Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих |
| title_full_unstemmed | Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих |
| title_short | Бакуловирусные векторы Aс-CMV-GFP, Aс-M-GFP и Aс-IFN-GFP для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих |
| title_sort | бакуловирусные векторы aс-cmv-gfp, aс-m-gfp и aс-ifn-gfp для эффективного переноса генов в клетки млекопитающих |
| topic | Оригінальні статті |
| topic_facet | Оригінальні статті |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/18919 |
| work_keys_str_mv | AT anoprienkoov bakulovirusnyevektoryascmvgfpasmgfpiasifngfpdlâéffektivnogoperenosagenovvkletkimlekopitaûŝih AT vaginain bakulovirusnyevektoryascmvgfpasmgfpiasifngfpdlâéffektivnogoperenosagenovvkletkimlekopitaûŝih AT zaharukea bakulovirusnyevektoryascmvgfpasmgfpiasifngfpdlâéffektivnogoperenosagenovvkletkimlekopitaûŝih AT strokovskaâli bakulovirusnyevektoryascmvgfpasmgfpiasifngfpdlâéffektivnogoperenosagenovvkletkimlekopitaûŝih AT solomkoap bakulovirusnyevektoryascmvgfpasmgfpiasifngfpdlâéffektivnogoperenosagenovvkletkimlekopitaûŝih AT anoprienkoov bakulovírusnívektoriascmvgfpasmgfpíasifngfpdlâefektivnogoperenosugenívuklítinissavcív AT vaginain bakulovírusnívektoriascmvgfpasmgfpíasifngfpdlâefektivnogoperenosugenívuklítinissavcív AT zaharukea bakulovírusnívektoriascmvgfpasmgfpíasifngfpdlâefektivnogoperenosugenívuklítinissavcív AT strokovskaâli bakulovírusnívektoriascmvgfpasmgfpíasifngfpdlâefektivnogoperenosugenívuklítinissavcív AT solomkoap bakulovírusnívektoriascmvgfpasmgfpíasifngfpdlâefektivnogoperenosugenívuklítinissavcív AT anoprienkoov baculovirusvectorsascmvgfpasmgfpandasifngfpforeficientgenetransfertothemammaliancells AT vaginain baculovirusvectorsascmvgfpasmgfpandasifngfpforeficientgenetransfertothemammaliancells AT zaharukea baculovirusvectorsascmvgfpasmgfpandasifngfpforeficientgenetransfertothemammaliancells AT strokovskaâli baculovirusvectorsascmvgfpasmgfpandasifngfpforeficientgenetransfertothemammaliancells AT solomkoap baculovirusvectorsascmvgfpasmgfpandasifngfpforeficientgenetransfertothemammaliancells |