Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин

В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, оброблених 0,1%-м розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію 5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арену (каліксарен С-107, наведено шифр) на Na+,K+-АТР-аз...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2010
Hauptverfasser:	Векліч, Т.О., Шкрабак, О.А., Родік, Р.В., Бойко, В.І., Кальченко, В.І., Костерін, С.О.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 2010
Schriftenreihe:	Український біохімічний журнал
Schlagworte:	Експериментальні роботи
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19020
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин / Т.О. Векліч, О.А. Шкрабак, Р.В. Родік, В.І. Бойко, В.І. Кальченко, С.О. Костерін // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 21-33. — Бібліогр.: 33 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-19020
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-190202025-02-23T17:09:12Z Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин Пространственное строение каликсарен-аминофосфоновых кислот существенно для проявления их ингибирующего действия на Nа+,К+-АТР-азную активность плазматических мембран гладкомышечных клеток Spatial structure of the сalixarene-aminophosphonic acids is important for their inhibition of the Na+, K+-ATPase activity in plasmatic membrane of smooth muscle cells Векліч, Т.О. Шкрабак, О.А. Родік, Р.В. Бойко, В.І. Кальченко, В.І. Костерін, С.О. Експериментальні роботи В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, оброблених 0,1%-м розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію 5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арену (каліксарен С-107, наведено шифр) на Na+,K+-АТР-азну активність. Структуру цього та інших каліксаренів, а також їхніх попередників, підтверджено методами ядерного магнітного резонансу та інфрачервоної спектроскопії. Визначено, що каліксарен С-107, 10^-8 – 10^-4 М, дозозалежно пригнічує активність Na+,K+-АТР-ази, практично не впливаючи на активність базальної Mg^2+-АТР-ази. Величина уявної константи інгібування І0,5 становить 33 ± 4 нМ, значення коефіцієнта Хілла nH складає 0,38 ± 0,06. Модельні сполуки: незаміщений по верхньому вінцю 25,27-дипропоксикаліксарен (каліксарен С-150, суто каліксаренова «платформа», 10^-8 – 10^-4 М) та N-(4-гідроксифеніл)-2-піридил-амінофосфонова кислота (сполука М‑3, амінофосфонова група разом з фенольним фрагментом, 10^-6 – 4×10^-3 М) практично не впливають на досліджувані ензимні системи. 5,11-Ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-17,23-ди-трет-бутил-27,28-дигідрокси-25,26-дипропоксикалікс[4]арен (каліксарен С-160, регіоізомер каліксарену С-107, 10^-8 – 10^‑4 М) не впливає як на Na+,K+-АТР-азну, так і на Mg^2+-АТР-азну активність плазматичної мембрани клітин міометрія. З метою вивчення структурних особливостей каліксаренів С-107 і С-160 у зв’язку з дією останніх на АТР-гідролазну активність проведено молекулярне моделювання цих сполук з використанням програми HyperChem 7.01. При цьому виходили із того, що молекули каліксаренів є дицвітеріонами із протонованими амінними атомами азоту та двома депротонованими гідроксилами різних фосфонових фрагментів. При розрахунках здійснено конформаційний пошук оптимальної геометрії молекули (використовували метод молекулярної механіки – силове поле ММ+). Для кожного каліксарену відібрано 5 енергетично-мінімізованих конформерів. Загальні енергії цих структур також перерахували напівемпіричним методом (поле CNDO), після чого вибрали по одній структурі з найменшою загальною енергією. Згідно із розрахунками каліксарени С-107 і С-160 мають практично однаковий за конформацією регулярний конус. Разом з тим відстані N…N, С…С, Р…Р (l) між амінофосфоновими фрагментами N–C–P суттєво різняться. При цьому у дистально-заміщеному каліксарені С-107 обидві фосфонові групи орієнтовано усередину макроциклічної порожнини. У проксимальнозаміщеному каліксарені С-160 фосфонові групи орієнтовано на периферію. Молекулярна порожнина даного макроциклу заповнена одним із піридильних фрагментів. Дійшли висновку, що інгібуючий вплив каліксарену С-107 на Na+,K+-АТР-азну активність визначається взаємним розташуванням амінофосфонових груп саме у положеннях 5,17 на протилежних фенольних фрагментах верхнього вінця молекули каліксарену, на відміну від каліксарену С-160, для якого властива локалізація цих груп у положеннях 5,11. Із використанням методу лазерної кореляційної спектроскопії продемонстровано, що 100 мкМ каліксарен С-107, розчинений у 2,5%-му розчині ДМСО, містить мікрочастинки, які характеризуються різним гідродинамічним діаметром – від 100 нм до 10 мкм. У присутності фрагментів плазматичних мембран утворюється певна кількість частинок із розміром, більшим ніж 10 мкм, тобто за наявності каліксаренів відбувається аглютинація фрагментів біологічних мембран з мікрочастинками каліксарену та/або між собою. Отже, в цілому біофізико-хімічні ефекти у гетерогенній системі каліксарен-мембранні фрагменти є вельми складними. Проте для інгібувальної дії каліксарену С-107. В экспериментах, выполненных на суспензии плазматических мембран клеток миометрия, обработанных 0,1%-м раствором дигитонина, исследовали ингибиторное действие 5,17-ди(фосфоно-2-пиридилметил)амино-11,23-ди-трет-бутил-26,28-ди-гидрокси-25,27-дипропоксикаликс[4]арена С-107 (указан шифр) на Na+,K+-АТР-азную активность. Этот каликсарен дозозависимо (10^-8 – 10^-4 М) угнетает активность Na+,K+-АТР-азы, практически невлияя на активность «базальной» Mg^2+-АТР-азы. Величина кажущейся константы ингибирования І0,5 составляет 33 ± 4 нМ, а значение коэффициента Хилла nH – 0,38 ± 0,06. Модельные соединения – незамещенный по верхнему ободу 25,27-дипропоксикаликсарен С-150 (10^-8 – 10^-4 М) – каликсареновая «платформа» и N-(4-гидроксифенил)-2-пиридил-аминофосфоновая кислота М-3 (1^0-8 – 4×10^-3 М) (аминофосфоновая группа вместе с фенольным фрагментом) – практически не влияют на исследованные энзиматические системы. 5,11-Ди(фосфоно-2-пиридилметил) амино-17,23-ди-трет-бутил-27,28-дигидрокси-25,26-дипропоксикаликс[4]арен С-160 – региоизомер каликсарена С-107 (10^-8–10^-4 М) не влияет как на Na+,K+-АТР-азную, так и на Mg^2+-АТР-азную активность плазматической мембраны клеток миометрия. Сделан вывод, что ингибирующее влияние каликсарена С-107 на Na+,K+-АТР-азу определяется взаимным расположением аминофосфоновых групп именно в положениях 5,17 на противоположных фенольных фрагментах верхнего венца молекулы каликсарена в отличие от каликсарена С-160, в котором эти группы локализованы в положении 5,11. It was found that calixarene С-107 (5,17-diamino(2-pyridyl)methylphosphono-11,23-di-tret-butyl-26,28-dihydroxy-25,27-dipropoxycalix[4]arene) could effectively reduce Na+,K+-АТРase activity of the myometrium cell plasmatic membranes (the value of the apparent constant of inhibition I0.5 was 33 ± 4 nМ) while it practically did not influence the «basal» Mg^2+-АТРase activity of the same membrane. In comparative experiments, we have shown that the model calixarene C-150 – the calixarene «scaffold» (26,28-dihydroxy-25,27-dipropoxycalix[4]arene), and the model compound М-3 (4-hydroxyaniline(2-pyridine)methylphosphonic acid) – a fragment of the calixarene С-107, had practically no influence on the enzymatic activities of Na+,K+-АТРase and Mg^2+-АТРаse over a wide range of concentrations. Hence, the influence of calixarene С-107 on Na+,K+-АТРase activity was caused by the joint action of two aminophosphonic substituents on the upper rim of the calixarene bowl. The isomer of calixarene С-107 – calixarene С‑ 160 (5,11-diamino(2-pyridyl)methylphosphono-17,23-di-tret-butyl-26,28-dihydroxy-25,27-dipropoxycalix[4]arene) also did not influence the Na+,K+-АТРase and Mg^2+-АТРаse activities of plasmatic membrane of myometrium cells. We carried out molecular modeling of calixarenes C-107 and C-160 and showed differences in interatomic distance between aminophosphonic substituents of mentioned calixarenes. We came to the conclusion that spatial structure of calixarene С-107, namely localization of two aminophosphonic substituents in 5,17 position of the upper rim of this calixarene, is crucial for inhibition of Na+,K+-АТРase activity. Using laser correlation spectroscopy it was found that the 100 μM solution of calixarene C-107 and 2.5% DMSO had microparticles with size range from 100 nm to 10 μm. Plasma membrane vesicles had average hydrodynamic diameter 401 ± 17 nm, but after interaction of these vesicles with calixarene C-107 we have registered the creation of some particles with sizes greater than 10 μm. Therefore membrane vesicles agglutinated to each other and/or to calixarene microparticles. 2010 Article Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин / Т.О. Векліч, О.А. Шкрабак, Р.В. Родік, В.І. Бойко, В.І. Кальченко, С.О. Костерін // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 21-33. — Бібліогр.: 33 назв. — укр. 0201-8470 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19020 577.152.3+544.147+544.176+544.168 uk Український біохімічний журнал application/pdf Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Експериментальні роботи Експериментальні роботи
spellingShingle	Експериментальні роботи Експериментальні роботи Векліч, Т.О. Шкрабак, О.А. Родік, Р.В. Бойко, В.І. Кальченко, В.І. Костерін, С.О. Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин Український біохімічний журнал
description	В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, оброблених 0,1%-м розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію 5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арену (каліксарен С-107, наведено шифр) на Na+,K+-АТР-азну активність. Структуру цього та інших каліксаренів, а також їхніх попередників, підтверджено методами ядерного магнітного резонансу та інфрачервоної спектроскопії. Визначено, що каліксарен С-107, 10^-8 – 10^-4 М, дозозалежно пригнічує активність Na+,K+-АТР-ази, практично не впливаючи на активність базальної Mg^2+-АТР-ази. Величина уявної константи інгібування І0,5 становить 33 ± 4 нМ, значення коефіцієнта Хілла nH складає 0,38 ± 0,06. Модельні сполуки: незаміщений по верхньому вінцю 25,27-дипропоксикаліксарен (каліксарен С-150, суто каліксаренова «платформа», 10^-8 – 10^-4 М) та N-(4-гідроксифеніл)-2-піридил-амінофосфонова кислота (сполука М‑3, амінофосфонова група разом з фенольним фрагментом, 10^-6 – 4×10^-3 М) практично не впливають на досліджувані ензимні системи. 5,11-Ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-17,23-ди-трет-бутил-27,28-дигідрокси-25,26-дипропоксикалікс[4]арен (каліксарен С-160, регіоізомер каліксарену С-107, 10^-8 – 10^‑4 М) не впливає як на Na+,K+-АТР-азну, так і на Mg^2+-АТР-азну активність плазматичної мембрани клітин міометрія. З метою вивчення структурних особливостей каліксаренів С-107 і С-160 у зв’язку з дією останніх на АТР-гідролазну активність проведено молекулярне моделювання цих сполук з використанням програми HyperChem 7.01. При цьому виходили із того, що молекули каліксаренів є дицвітеріонами із протонованими амінними атомами азоту та двома депротонованими гідроксилами різних фосфонових фрагментів. При розрахунках здійснено конформаційний пошук оптимальної геометрії молекули (використовували метод молекулярної механіки – силове поле ММ+). Для кожного каліксарену відібрано 5 енергетично-мінімізованих конформерів. Загальні енергії цих структур також перерахували напівемпіричним методом (поле CNDO), після чого вибрали по одній структурі з найменшою загальною енергією. Згідно із розрахунками каліксарени С-107 і С-160 мають практично однаковий за конформацією регулярний конус. Разом з тим відстані N…N, С…С, Р…Р (l) між амінофосфоновими фрагментами N–C–P суттєво різняться. При цьому у дистально-заміщеному каліксарені С-107 обидві фосфонові групи орієнтовано усередину макроциклічної порожнини. У проксимальнозаміщеному каліксарені С-160 фосфонові групи орієнтовано на периферію. Молекулярна порожнина даного макроциклу заповнена одним із піридильних фрагментів. Дійшли висновку, що інгібуючий вплив каліксарену С-107 на Na+,K+-АТР-азну активність визначається взаємним розташуванням амінофосфонових груп саме у положеннях 5,17 на протилежних фенольних фрагментах верхнього вінця молекули каліксарену, на відміну від каліксарену С-160, для якого властива локалізація цих груп у положеннях 5,11. Із використанням методу лазерної кореляційної спектроскопії продемонстровано, що 100 мкМ каліксарен С-107, розчинений у 2,5%-му розчині ДМСО, містить мікрочастинки, які характеризуються різним гідродинамічним діаметром – від 100 нм до 10 мкм. У присутності фрагментів плазматичних мембран утворюється певна кількість частинок із розміром, більшим ніж 10 мкм, тобто за наявності каліксаренів відбувається аглютинація фрагментів біологічних мембран з мікрочастинками каліксарену та/або між собою. Отже, в цілому біофізико-хімічні ефекти у гетерогенній системі каліксарен-мембранні фрагменти є вельми складними. Проте для інгібувальної дії каліксарену С-107.
format	Article
author	Векліч, Т.О. Шкрабак, О.А. Родік, Р.В. Бойко, В.І. Кальченко, В.І. Костерін, С.О.
author_facet	Векліч, Т.О. Шкрабак, О.А. Родік, Р.В. Бойко, В.І. Кальченко, В.І. Костерін, С.О.
author_sort	Векліч, Т.О.
title	Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин
title_short	Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин
title_full	Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин
title_fullStr	Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин
title_full_unstemmed	Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин
title_sort	просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на nа+, k+-atp-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин
publisher	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
publishDate	2010
topic_facet	Експериментальні роботи
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19020
citation_txt	Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин / Т.О. Векліч, О.А. Шкрабак, Р.В. Родік, В.І. Бойко, В.І. Кальченко, С.О. Костерін // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 21-33. — Бібліогр.: 33 назв. — укр.
series	Український біохімічний журнал
work_keys_str_mv	AT veklíčto prostorovabudovakalíksarenamínofosfonovihkislotêsuttêvoûdlâproâvuíhnʹoííngíbuûčoídíínanakatpaznuaktivnístʹuplazmatičnihmembranahgladenʹkomâzovihklítin AT škrabakoa prostorovabudovakalíksarenamínofosfonovihkislotêsuttêvoûdlâproâvuíhnʹoííngíbuûčoídíínanakatpaznuaktivnístʹuplazmatičnihmembranahgladenʹkomâzovihklítin AT rodíkrv prostorovabudovakalíksarenamínofosfonovihkislotêsuttêvoûdlâproâvuíhnʹoííngíbuûčoídíínanakatpaznuaktivnístʹuplazmatičnihmembranahgladenʹkomâzovihklítin AT bojkoví prostorovabudovakalíksarenamínofosfonovihkislotêsuttêvoûdlâproâvuíhnʹoííngíbuûčoídíínanakatpaznuaktivnístʹuplazmatičnihmembranahgladenʹkomâzovihklítin AT kalʹčenkoví prostorovabudovakalíksarenamínofosfonovihkislotêsuttêvoûdlâproâvuíhnʹoííngíbuûčoídíínanakatpaznuaktivnístʹuplazmatičnihmembranahgladenʹkomâzovihklítin AT kosterínso prostorovabudovakalíksarenamínofosfonovihkislotêsuttêvoûdlâproâvuíhnʹoííngíbuûčoídíínanakatpaznuaktivnístʹuplazmatičnihmembranahgladenʹkomâzovihklítin AT veklíčto prostranstvennoestroeniekaliksarenaminofosfonovyhkislotsuŝestvennodlâproâvleniâihingibiruûŝegodejstviânanakatraznuûaktivnostʹplazmatičeskihmembrangladkomyšečnyhkletok AT škrabakoa prostranstvennoestroeniekaliksarenaminofosfonovyhkislotsuŝestvennodlâproâvleniâihingibiruûŝegodejstviânanakatraznuûaktivnostʹplazmatičeskihmembrangladkomyšečnyhkletok AT rodíkrv prostranstvennoestroeniekaliksarenaminofosfonovyhkislotsuŝestvennodlâproâvleniâihingibiruûŝegodejstviânanakatraznuûaktivnostʹplazmatičeskihmembrangladkomyšečnyhkletok AT bojkoví prostranstvennoestroeniekaliksarenaminofosfonovyhkislotsuŝestvennodlâproâvleniâihingibiruûŝegodejstviânanakatraznuûaktivnostʹplazmatičeskihmembrangladkomyšečnyhkletok AT kalʹčenkoví prostranstvennoestroeniekaliksarenaminofosfonovyhkislotsuŝestvennodlâproâvleniâihingibiruûŝegodejstviânanakatraznuûaktivnostʹplazmatičeskihmembrangladkomyšečnyhkletok AT kosterínso prostranstvennoestroeniekaliksarenaminofosfonovyhkislotsuŝestvennodlâproâvleniâihingibiruûŝegodejstviânanakatraznuûaktivnostʹplazmatičeskihmembrangladkomyšečnyhkletok AT veklíčto spatialstructureofthesalixareneaminophosphonicacidsisimportantfortheirinhibitionofthenakatpaseactivityinplasmaticmembraneofsmoothmusclecells AT škrabakoa spatialstructureofthesalixareneaminophosphonicacidsisimportantfortheirinhibitionofthenakatpaseactivityinplasmaticmembraneofsmoothmusclecells AT rodíkrv spatialstructureofthesalixareneaminophosphonicacidsisimportantfortheirinhibitionofthenakatpaseactivityinplasmaticmembraneofsmoothmusclecells AT bojkoví spatialstructureofthesalixareneaminophosphonicacidsisimportantfortheirinhibitionofthenakatpaseactivityinplasmaticmembraneofsmoothmusclecells AT kalʹčenkoví spatialstructureofthesalixareneaminophosphonicacidsisimportantfortheirinhibitionofthenakatpaseactivityinplasmaticmembraneofsmoothmusclecells AT kosterínso spatialstructureofthesalixareneaminophosphonicacidsisimportantfortheirinhibitionofthenakatpaseactivityinplasmaticmembraneofsmoothmusclecells
first_indexed	2025-11-24T03:03:41Z
last_indexed	2025-11-24T03:03:41Z
_version_	1849639222747594752
fulltext	ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 21 ЕКспЕримЕнта льні роботи УДК 577.152.3+544.147+544.176+544.168 просторова будова КаліКсарЕн-амінофосфонових Кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на nа+,k+-atp-азну аКтивність у плазматичних мЕмбранах гладЕньКом’язових Клітин Т. О. ВЕКЛІЧ1, О. А. ШКРАБАК1, Р. В. РОДІК2, В. І. БОЙКО2, В. І. КАЛЬЧЕНКО2, С. О. КОСТЕРІН1 1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ; 2Інститут органічної хімії НАН України, Київ; e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@bpci.kiev.ua В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, обробле- них 0,1%-м розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію 5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно- 11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арену (каліксарен С-107, наведено шифр) на Na+,K+-АТР-азну активність. Структуру цього та інших каліксаренів, а також їхніх по- передників, підтверджено методами ядерного магнітного резонансу та інфрачервоної спектроскопії. Визначено, що каліксарен С-107, 10-8–10-4 М, дозозалежно пригнічує активність Na+,K+-АТР-ази, практично не впливаючи на активність базальної Mg2+-АТР-ази. Величина уявної константи інгібу- вання І0,5 становить 33 ± 4 нМ, значення коефіцієнта Хілла nH складає 0,38 ± 0,06. Модельні сполуки: незаміщений по верхньому вінцю 25,27-дипропоксикаліксарен (каліксарен С-150, суто каліксаренова «платформа», 10-8–10-4 М) та N-(4-гідроксифеніл)-2-піридил-амінофосфонова кислота (сполука М-3, амінофосфонова група разом з фенольним фрагментом, 10-6–4⋅10-3 М) практично не впливають на досліджувані ензимні системи. 5,11-Ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-17,23-ди-трет-бутил-27,28- дигідрокси-25,26-дипропоксикалікс[4]арен (каліксарен С-160, регіоізомер каліксарену С-107, 10-8– 10-4 М) не впливає як на Na+,K+-АТР-азну, так і на Mg2+-АТР-азну активність плазматичної мем- брани клітин міометрія. З метою вивчення структурних особливостей каліксаренів С-107 і С-160 у зв’язку з дією останніх на АТР-гідролазну активність проведено молекулярне моделювання цих сполук з використанням програми HyperChem 7.01. При цьому виходили із того, що молекули каліксаренів є дицвітеріонами із протонованими амінними атомами азоту та двома депротонованими гідроксилами різних фосфонових фрагментів. При розрахунках здійснено конформаційний пошук оптимальної гео- метрії молекули (використовували метод молекулярної механіки – силове поле ММ+). Для кожного каліксарену відібрано 5 енергетично-мінімізованих конформерів. Загальні енергії цих структур та- кож перерахували напівемпіричним методом (поле CNDO), після чого вибрали по одній структурі з найменшою загальною енергією. Згідно із розрахунками каліксарени С-107 і С-160 мають практично однаковий за конформацією регулярний конус. Разом з тим відстані N…N, С…С, Р…Р (l) між аміно- фосфоновими фрагментами N–C–P суттєво різняться. При цьому у дистально-заміщеному калікса- рені С-107 обидві фосфонові групи орієнтовано усередину макроциклічної порожнини. У проксимально- заміщеному каліксарені С-160 фосфонові групи орієнтовано на периферію. Молекулярна порожнина даного макроциклу заповнена одним із піридильних фрагментів. Дійшли висновку, що інгібуючий вплив каліксарену С-107 на Na+,K+-АТР-азну активність визначається взаємним розташуванням амінофос- фонових груп саме у положеннях 5,17 на протилежних фенольних фрагментах верхнього вінця молекули каліксарену, на відміну від каліксарену С-160, для якого властива локалізація цих груп у положеннях 5,11. Із використанням методу лазерної кореляційної спектроскопії продемонстровано, що 100 мкМ каліксарен С-107, розчинений у 2,5%-му розчині ДМСО, містить мікрочастинки, які характеризу- ються різним гідродинамічним діаметром – від 100 нм до 10 мкм. У присутності фрагментів плазма- тичних мембран утворюється певна кількість частинок із розміром, більшим ніж 10 мкм, тобто за наявності каліксаренів відбувається аглютинація фрагментів біологічних мембран з мікрочастинками каліксарену та/або між собою. Отже, в цілому біофізико-хімічні ефекти у гетерогенній системі каліксарен-мембранні фрагменти є вельми складними. Проте для інгібувальної дії каліксарену С-107 ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 122 на мембранозв’язану Na+,K+-АТР-азну активність суттєвим є саме відносне розташування аміно- фосфонових груп на верхньому вінці макроциклу у положеннях 5,17, яке, вірогідно, є комплементарним сайту взаємодії цього каліксарену із Na+,K+-АТР-азою. Отже, просторова будова каліксарен-аміно- фосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібувальної дії на Na+,K+-АТР-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин. К л ю ч о в і с л о в а: Nа+,К+-АТР-аза, Mg2+-АТР-аза, плазматична мембрана, гладеньком’язові клітини, міометрій, каліксарени, амінофосфонові кислоти, просторова структура, гідродинамічні розміри. Г ладенькі м’язи, скорочення та роз- слаблення яких є основою функціо- нування кровоносних та лімфатичних судин, шлунково-кишкового тракту, дихаль- них шляхів, зіниці ока та матки, відіграють важливу роль у забезпеченні життєдіяльності організму. Відомо, що у контролі скорочення м’яза, зокрема гладенького, суттєва роль нале- жить Mg2+-залежним АТР-гідролазним катіон- транспортувальним ензиматичним системам [1,2]. Для плазматичної мембрани клітин гла- деньких м’язів властивим є широкий спектр АТР-азної активності. Зокрема фундаменталь- не значення для життєдіяльності клітин має Na+,K+-АТР-аза, яка забезпечує підтримку у цитоплазмі високої концентрації K+ та низь- кої концентрації Na+ [3]. Своєрідне місце серед АТР-гідролаз плазматичної мембрани займає так звана «базальна» Mg2+-АТР-аза. Її питома ензиматична активність значно перевищує ак- тивність Na+,K+-АТР-ази та інших АТР-аз [4,5] і є нечутливою до впливу відомих інгібіторів транспортних АТР-аз – уабаїну, олігоміцину, азиду натрію, циклопіазонієвої кислоти тощо [6]. Створення та пошук нових штучних ефективних селективних регуляторів систем АТР-залежного іонного транспортування є ак- туальним для подальшого з’ясування біохіміч- них механізмів електро- та фармакомеханічно- го спряження у м’язах, а також вивчення ролі іонів Na+, K+, Са2+ та Н+ в його забезпечен- ні. Згідно з цим каліксаренам в останній час приділяється все більше уваги. Ці синтетичні сполуки є циклічними олігомерами фенолів, молекули яких мають чашоподібну будову з внутрішньомолекулярними високовпоряд- кованими ліпофільними порожнинами, які утворені ароматичними фрагментами макро- циклічного кістяка. Завдяки комплексоутво- рюючим властивостям каліксаренів та їхнім можливостям функціоналізуватися різними групами вони здатні, подібно до природних рецепторів, розпізнавати та розділяти близь- кі за властивостями молекули та іони [7,8]. У разі утворення супрамолекулярних комплексів з біологічно важливими молекулами та іона- ми каліксарени також впливають на перебіг біохімічних процесів і відповідно можуть бути перспективними молекулярними «платфор- мами» для створення фізіологічно активних сполук нового покоління. Адже каліксаре- нові матриці мають низьку токсичність [9,10] та імуногенність [11], їх легко синтезувати за відомими методиками [12]. На каліксареновій основі розроблено також ефективні інгібітори ензимів [13] та мембраноактивні сполуки, які здатні впливати на іонні канали [14] або про- являти йонофорні властивості [15]. Ці сполуки легко проникають у клітину через плазматич- ну мембрану і є досить перспективними для створення нових високоефективних селектив- них інгібіторів та активаторів внутрішньоклі- тинних біохімічних процесів, оскільки здатні оборотно модифікувати функціональну актив- ність окремих протеїнів [7,16]. У попередніх дослідах, які проведено із використанням 14 калікс[4]аренів, нами знай- дено, що 5,17-ди(фосфоно-2-піридил-метил)- аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрок- си-25,27-дипропоксикалікс[4]арен (каліксарен с-107) здатний ефективно інгібувати актив- ність Na+,K+-АТР-ази плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин матки [17]. Проте властивості інгібувальної дії зазначеного калік- сарену на Nа+,К+-АТР-азну активність, зокрема залежність цієї дії від структурної організації каліксаренової молекули, не з’ясовано. У цій роботі для вивчення ролі струк- турної організації каліксаренів у проявлен- ні їхньої інгібувальної дії на Na+,K+-АТР-азу плазматичної мембрани клітин міометрія ми провели дослідження впливу на вказану ен- зиматичну систему калікс[4]арен-1,3-бісамі- нофосфонової кислоти – каліксарену с-107, її проксимального 1,2-регіоізомеру – калікса- рену с-160, а також модельних сполук – не- заміщеного дипропоксикалікс[4]арену с-150 і N-(4-гідроксифеніл)-2-піридил-амінофосфо- нової кислоти м-3, структурні формули яких наведено нижче. ЕКСПЕРиМЕНТАЛЬНІ РОБОТи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 23 матеріали і методи Каліксарени синтезовано у відділі хімії фосфоранів Інституту органічної хімії НАН України. Вибір із 14 каліксаренів саме калікса- рену с-107 (5,17-ди(фосфоно-2-піридил-метил) аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси- 25,27-дипропоксикалікс[4]арен), як головного об’єкту нашого дослідження, обумовлено на- очною селективністю інгібуючої дії цієї спо- луки, що була нами попередньо виявлена на рівні двох Са2+-незалежних Mg2+-залежних ензиматичних систем плазматичної мембрани клітин – Nа+,К+-АТР-ази та «базальної» Mg2+- ATP-ази: ефективно гальмуючи першу з них, зазначений каліксарен практично не впливає на другу. Важливо, що калікс[4]арен с-107, по-перше, може мати здатність транспортува- ти катіони металів через біомембрани за ме- ханізмом переносників [18] завдяки утворен- ню міцних комплексів катіонів із залишками альфа-амінофосфонових кислот [19]; по-дру- ге, може вбудовуватися в ліпідні біомембра- ни, утворюючи канали для транспортування катіонів завдяки амфіфільному характеру, обу- мовленому просторовим розділенням гідро- фільних кислотних угруповань та ліпофіль- ного макроциклічного кістяка із алкільними залишками [20–22]; по-третє, має фрагменти альфа-амінофосфонової кислоти, які можуть бути сайтами зв’язування каліксарену з аміно- кислотними фрагментами іонтранспортуючих протеїнів [23]. Методику синтезу калікс[4]арену с-107 було описано раніше [17]. У цьому калікса- рені амінофосфонові групи на верхньому вінці макроциклу локалізовано у 5,17-положеннях на протилежних (дистальних) фенольних кіль- цях. Він складається як би із 3 частин: калік- саренової «чаши» як макроциклічної основи із 4 бензольних кілець, зв’язаних метиленовими групами (еквівалент – сполука с-150), і двох амінофосфонових груп, пов’язаних з феноль- ними фрагментами (еквівалент – сполука м-3). Для визначення ролі структурної ор- ганізації калікс[4]арену с-107 та взаємного розташування хімічних угруповань у складі його молекули у проявленні інгібуючої дії на Na+,K+-АТР-азну активність гладеньком’язових клітин матки було синтезовано калікс[4]арен с-160 (5,11-ди(фосфоно-2-піридил-метил) 5 [4] -150 N-(4- )-2- - -3, . N N H P O OH OH N OH O OH O N H P O OH OH N N N H P O OH OH OH O O OH NH P O OH OH -107 -160 N OH NH P OH O OH OH O OH O -3 -150 . 14 -107 (5,17- ( -2- - ) -11,23- - - -26,28- -25,27- [4] ) ’ , 2+- Mg2+- Т. О. ВЕКЛІЧ, О. А. ШКРАБАК, Р. В. РОДІК та ін. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 124 Схема. Синтез каліксарену С-160 аміно-17,23-ди-трет-бутил-27,28-дигідрокси- 25,26-дипропоксикалікс[4]арен), який відріз- няється від каліксарену с-107 лише взаємним розташуванням замісників на верхньому та нижньому вінцях макроциклу, тобто є ізоме- ром каліксарену с-107. Зокрема, у каліксарені с-160 амінофосфонові групи у верхньому він- ці макроциклу локалізовано у проксималь- 7 . -160. 1 2 3 54 ЕКСПЕРиМЕНТАЛЬНІ РОБОТи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 25 них 5,11 положеннях, а у випадку каліксарену с-107 вони локалізовані у дистальних 5,17 по- ложеннях. Каліксарен с-160 було синтезовано за та- кою схемою: - нітрування 1,2-дипропокси-трет-бутил- каліксарену 1 [24] сумішшю концентрованої азотної та льодяної оцтової кислот у сухому хлористому метилені до 1,2-динітрокаліксаре- ну 2; - відновлення 1,2-динітрокаліксарену надлишком гідразингідрату у присутності ка- талізатора нікелю Ренея у киплячому спирті до діамінокаліксарену 3. - за взаємодії діамінокаліксарену 3 з не- великим надлишком піридин-2-карбоксіаль- дегіду у киплячому бензолі утворюється діімі- нокаліксарен 4, який приєднує дві молекули діетилфосфіту у присутності надлишку ме- талічного натрію з утворенням каліксаренамі- нофосфонату 5; - за взаємодії каліксарену 5 із триметилб- ромсиланом у сухому хлороформі утворюються силілові ефіри, які розкладаються метанолом до каліксарен-1,2-діамінофосфонової кислоти с-160. Структуру каліксарену с-160 та його по- передників – каліксаренів 2–5 підтвердже- но методами ядерного магнітного резонансу (ЯМР) та інфрачервоної спектроскопії (ІЧ). Використано такі характеристики спектрів ЯМР: триплет (т), дублет (д), синглет (с) та мультиплет (м); м.ч. – мільйонні частинки, як одиниця розмірності шкали; J – частота, Гц; δ – шкала ЯМР-спектра, в якій сильнополь- ним сигналам притаманні менші цифрові зна- чення. 5,11-динітро-17,23-ди-трет-бутил-27,28- дигідрокси-25,26-дипропоксикалікс[4]арен 2. До 18 мл охолодженого (0 °С) розчину 1,2-дипро- поксикаліксарену 1 [24] (0,68 ммоль у сухому хлористому метилені) додавали по краплям суміш із 1 мл 65%-ї азотної та 1 мл оцтової кислот. Розчин набував спочатку синє-чорного кольору. З часом після зміни кольору реакцій- ної суміші на коричневий її виливали у 100 мл води, відділяли органічний шар, промивали во- дою, потім розсолом (по 20 мл) і сушили 12 год над сульфатом натрію. Розчинник відганяли у вакуумі (10 мм рт. ст., 20 °С). До залишку до- давали 4 мл метанолу, кип’ятили розчин упро- довж 3 год, після охолодження світло-жовтий осад продукту 2 відфільтровували та сушили протягом доби на повітрі. Вихід складав 50%. Тпл. 302–305 °С. ЯМР 1Н (CDCl3, 299,94 МГц), δ, м.ч.: 1,16 с (18H, t-BuH) 1,17 т (J = 7,2 Гц, 6H, O-CH2-CH2-CH3) 2,14 м (4H, O-CH2-CH2-CH3), 3,45 д (J = 12,5 Гц, 1H, ArCHeqAr), 3,46 д (J = 13,1 Гц, 1H, ArCHeqAr), 3,56 д (J = 13,7 Гц, 2H, ArCHeqAr), 3,92 м (2H, O-CH2-CH2-CH3), 4,15 м (2H, O-CH2-CH2-CH3), 4,18 д (J = 13,7 Гц, 2H, ArCHaxAr), 4,41 д (J = 12,5 Гц, 1H, ArCHaxAr), 4,64 д (J = 13,1 Гц, 1H, ArCHaxAr), 6,99 д (J = 2,3 Гц, 2H, t-Bu-ArH), 7,19 д (J = 2,3 Гц, 2H, t-Bu-ArH), 7,96 д (J = 2,7 Гц, 2H, O2N-ArH), 7,99 д (J = 2,7 Гц, 2H, O2N-ArH), 9,69 с (2H, OH). Розраховано для C42H50N2O8, %: C 70,96; Н 7,09; N 3,94. Знайдено, %: C 71,13; H 7,14; N 3,79. 5,11-діаміно-17,23-ди-трет-бутил-27,28- дигідрокси-25,26-дипропоксикалікс[4]арен 3. До суспензії динітрокаліксарену 2 (1,4 ммоль) в абсолютному етанолі (50 мл) додавали гідра- зингідрат (2,9 мл). Реакційну суміш нагріва- ли за перемішування до 70 °С, до неї дода- вали суспензію нікелю Ренея (0,1–0,2 мл) і кип’ятили при перемішуванні суміш до пов- ного розчинення осаду та знебарвлення розчи- ну (7 год). Після охолодження суміші до кім- натної температури (атмосфера аргону) нікель Ренея відфільтровували крізь шар силікагелю (1–1,5 см). Розчинник відганяли у вакуумі (10 мм рт. ст., 80 °С). Для повного видален- ня води до продукту додавали толуол (20 мл), який потім відганяли у вакуумі (10 мм рт. ст., 110 °С). Залишок, тобто діамінокаліксарен 3, є безбарвною кристалічною речовиною, яка легко окислюється на повітрі. Вихід складав 90%. Спектр ЯМР 1H, (CDCl3, 299.94 МГц), δ, м.ч.: 1,12 т (J = 7,5 Гц, 6H, O-CH2-CH2-CH3), 1,19 с (18H, t-Bu), 2,11 м (4H, O-CH2-CH2-CH3), 3,12 д (J = 13,2 Гц, 1H, ArCHeqAr), 3,15-3,24 уш. с (4H, NH2), 3,27 д (J = 12,9 Гц, 2H, ArCHeqAr), 3,37 д (J = 12,3 Гц, 1H, ArCHeqAr), 3,87 м (2H, O-CH2-CH2-CH3), 4,03 м (2H, O-CH2-CH2- CH3), 4,27 д (J = 12,9 Гц, 2H, ArCHaxAr), 4,35 д (J = 13,2 Гц, 1H, ArCHaxAr), 4,45 д (J = 12,2 Гц, 1H, ArCHaxAr), 6,35 д (J = 2,8 Гц, 2H, NH2- ArH), 6,38 д (J = 2,8 Гц, 2H, NH2-ArH), 6,95 д (J = 2,8 Гц, 2H, t-Bu-ArH), 7,09 д (J = 2,8 Гц, 2H, t-Bu-ArH), 8,28 с (2H, OH). ІЧ спектр (KBr, см-1) νNH = 3510, νOH = 3300. Розраховано для C42H54N2O4, %: С 77,50; Н 8,36; N 4,30. Знайде- но, %: C 77,86; H 8,23; N 4,02. 5,11-ди(2-піридилметиліден)аміно-17,23- ди-трет-бутил-27,28-дигідрокси-25,26- дипропоксикалікс[4]арен 4. До розчину діамі- нокаліксарену 3 (1 ммоль) у бензолі (20 мл) додавали альдегід (2,2 ммоля). Реакційну суміш кип’ятили над молекулярними ситами упро- довж 15 год. Після її охолодження молекулярні сита відокремлювали, розчинник відганяли у Т. О. ВЕКЛІЧ, О. А. ШКРАБАК, Р. В. РОДІК та ін. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 126 вакуумі (10 мм рт. ст., 90 °С). Залишок пере- мішували протягом 3 год у киплячому гексані (10 мл), одержаний продукт 4 (жовто-оранжеву тверду речовину) відфільтровували з гарячо- го розчину. Сушили на повітрі. Вихід скла- дав 72%. Тпл 260 °С (розкл.). ЯМР 1Н (CDCl3, 299,94 МГц), δ, м.ч.: 0,85 т (J = 6,5 Гц, 6H, O-CH2-CH2-CH3), 1,15 с (18H, t-BuH) 2,14 м (4H, O-CH2-CH2-CH3), 3,41 д (J = 13,0 Гц, 1H, ArCHeqAr), 3,43 д (J = 12,6 Гц, 1H, ArCHeqAr), 3,46 д (J = 13,0 Гц, 2H, ArCHeqAr), 3,91 м (2H, O-CH2-CH2-CH3), 4,11 м (2H, O-CH2-CH2- CH3), 4,31 д (J = 13,0 Гц, 2H, ArCHaxAr), 4,47 д (J = 13,0 Гц, 1H, ArCHaxAr), 4,50 д (J = 12,6 Гц, 1H, ArCHaxAr), 6,99 д (J = 2,3 Гц, 2H, t-Bu- ArH), 7,10 д (J = 2,4 Гц, 2H, N-ArH), 7,11 д (J = 2,3 Гц, 2H, t-Bu-ArH), 7,11 д (J = 2,4 Гц, 2H, N-ArH), 7,22 и 7,69 два м (4Н 4,5-PyrH), 8,11 д (J = 8,0 Гц, 2H, 3 PyrH) 8,55 с (2H N=CH-Pyr), 8,60 д (J = 4,6 Гц, 2H, 6-PyrH), 9,07 с (2H, OH), ІЧ-спектр (KBr, см-1) νC=N = 1575, νOH = 3290. Розраховано для C54H60N4O4, %: C 78,23; Н 7,29; N 6,76. Знайдено, %: C 78,13; H 7,14; N 6,78. 5,11-ди(діетоксифосфорил-2-піридил- метил)аміно-17,23-ди-трет-бутил-27,28- дигідрокси-25,26-дипропоксикалікс[4]арен 5. До діетилфосфіту (5 мл) додавали 30 мг натрію (1,304 ммоль), після розчинення якого до отри- маного розчину додавали 100 мг (0,12 ммоль) каліксареніміну 4. Розчин залишали при кім- натній температурі на 18 год, його колір ста- вав блідо-оранжевим, при цьому з’являлась незначна кількість безбарвного осаду. Реак- ційну суміш виливали у воду (230 мл), до неї додавали при перемішуванні триетиламін до стійкого в часі рН 8–9 і залишали на 8–12 год при 5 °С. Безбарвний осад відфільтровували і висушували на повітрі. Вихід складав 55%. Тпл 118 °С. (RR+SS+RS+SR – стереоізомерні фор- ми) ЯМР 1Н (CDCl3, 299,94 МГц), δ, м.ч.: 0,80- 1,17 м (72H, P-O-CH2-CH3, O-CH2-CH2-CH3), 1,07 с (18H, t-Bu), 1,08 с (18H, t-Bu), 1,15 с (18H, t-Bu), 1,17 с (18H, t-Bu), 1,19 т (J = 7,5 Гц,), 2,05 м (16H, O-CH2-CH2-CH3), 2,98-3,31 три м (16H, ArCHeqAr), 3,78-4,27 три м (63H, P-O-CH2-CH3, O-CH2-CH2-CH3, ArCHaxAr), 4,39 д (J = 13,2 Гц, 1Н, ArCHaxAr), 4,73-4,89 чотири д (J = 21,6- 22,4 Гц, 8H CH-P(O)), 6,11 д (J = 2,6 Гц, 2Н, N-ArH), 6,16 д ((J = 2,4 Гц, 2Н, N-ArH), 6,30- 6,37 м (12Н, N-ArH), 6,75 д (J = 1,9 Гц, 2H, t-Bu-ArH), 6,91 м (4H, t-Bu-ArH), 7,00-7,06 м (10Н, t-Bu-ArH), 7,15, 7,46, 7,59 три м (24 Н, 3,4,5-PyrH) 8,19, 8,29, 8,35 та 8,36 чотири с (8H, OH), 8,61 уш. д (8H, 6-PyrH). ЯМР 31P, (CDCl3, 80,95 МГц) d, м.д.: 22,1 м (НC-P(O)(OEt)2). ІЧ спектр (KBr, см-1) νP-O 965, νC-O-P 1027, 1056, νP=O 1240, νOH 3330, νNH 3475. Розраховано для C62H82N4O10P2, %: C 67,37; Н 7,48; N 5,07; Р 5,60. Знайдено, %: C 67,85; H 7,53; N 4,89; Р 5,79. 5,11-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно- 17,23-ди-трет-бутил-27,28-дигідрокси-25,26- дипропоксикалікс[4]арен (каліксарен с-160). До 5 мл розчину амінофосфонату 5 у хлоро- формі (0,1 ммоль) додавали щойно перегнаний триметилсилілбромід (2 ммоль) і залишали на 48 год. Реакційна суміш набуває яскраво- го оранжево-червоного кольору. Розчинник та надлишок реагенту відганяли у вакуумі (10 мм рт. ст., 70 °С), склоподібний залишок витримували у вакуумі (0,05 мм. рт. ст., 20 °С) протягом 3 год і розчиняли у метанолі (10 мл). Через 4 год розчинник відганяли у вакуумі (10 мм рт. ст., 80 °С). Отримували жовто-ко- ричневу тверду речовину. Вихід складав 60%. Тпл 108 °С. (RR+SS+RS+SR стереоізомерні форми) ЯМР 1Н (CD3OD, 299,94 МГц), δ, м.ч.: 1,60-1,80 м (96H, t-Bu, O-CH2-CH2-CH3), 2,46- 2,69 м (16H, O-CH2-CH2-CH3), 3,72-4,09 м (16H, ArCHeqAr), 4,37-4,86 м (32H, O-CH2-CH2-CH3, ArCHaxAr), 5,97-6,13 м (8H, CH-P(O)), 6,85 – 9,26 п’ять м (64H, N-ArH, t-Bu-ArH, PyrH). ЯМР 31P, (CD3OD, 80,95 МГц) d, м.д.: 12,96 м (НC-P(O)(OH)2). ІЧ спектр (KBr, см-1) νP-O 978, νC-O-P 1028, 1070, νP=O 12605, νNH,OH 3330, (ши- рока), νNH, OH 3505 (широка). Розраховано для C54H66N4O10P2, %: C 65,31; Н 6,70; N 5,64; Р 6,24. Знайдено, %: C 66,23; H 6,94; N 5,12; Р 5,96. Молекулярне моделювання струк- турних особливостей каліксаренів с-107 і с-160 проводили з використанням програми HyperChem 7.01. біохімічні дослідження Вивчення впливу каліксаренів на актив- ність Nа+,К+-АТР-ази у плазматичних мем- бранах гладеньком’язових клітин проведе- но у відділі біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України. Фракцію плазматичних мембран гладеньком’язових клітин виділяли з міомет- рія свині, як було описано раніше [4,25]. За допомогою методу фотон-кореляційної спектроскопії визначали середній гідродина- мічний діаметр та функцію розподілу везикул плазматичної мембрани міометрія за розміром. Дослідження проводили за допомогою лазер- ного кореляційного спектрометра ZetaSizer-3 (Malvern Instrument, Велика Британія), який обладнаний корелятором (multi computing correlator, type 7032 се). Суспензію плазматич- них мембран готували в середовищі такого складу (мМ): NaCl – 50, KCl – 100, ЕГТА – 1, ЕКСПЕРиМЕНТАЛЬНІ РОБОТи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 27 HEPES-Tris-буфер – 20 (рН 7,4). Зразок об’ємом 1,5 мл розташовували у циліндричній скляній кюветі діаметром 10 мм. Реєстрацію розсіяно- го від суспензії під кутом 90° лазерного випро- мінювання (використовували гелій-неоновий лазер ЛГ-111 потужністю 25 мВт з довжиною хвилі 633 нм) проводили протягом 300–400 сек при кімнатній температурі. З експерименталь- но одержаної автокореляційної функції за до- помогою стандартної комп’ютерної програми PCS-Size mode v 1. розраховували функцію розподілу мікрочастинок за гідродинамічним діаметром. Фракція мембран, яка була одержана за допомогою диференційного центрифугування, містила широкий спектр частинок різного роз- міру, що розсіювали світло. Проте переважна кількість зареєстрованих частинок мала роз- міри від ~ 100 до 600 нм. Частинки меншого гідродинамічного діаметра, наявні у досліджу- ваній фракції, вірогідно є високомолекуляр- ними протеїновими комплексами та невезику- льованими фрагментами мембран. У незначній кількості були присутні також великі частинки діаметром до 1 мкм, якими можливо є залиш- ки мітохондрій та агломерати везикул різного походження. Середній (найбільш вірогідний) гідродинамічний діаметр везикул плазматич- них мембран міометрія складав 401 ± 17 нм (M ± m; n = 13). Вміст протеїну в мембранній фракції виз- начали методом М. Bradford [26] із використан- ням реакції з реактивом Кумасі G250. «Загальну» Mg2+,Na+,K+-АТР-азну ак- тивність визначали у фракції плазматичних мембран клітин міометрія, як описано рані- ше [4], при 37 °С у стандартному середовищі об’ємом 0,4 мл, яке містило (мМ): АТР – 1, MgCl2 – 3, NaCl – 125, КCl – 25, ЕГТА – 1, HEPES-Тris-буфер (рН 7,4) – 20, NaN3 (інгібі- тор АТР-ази мітохондрій [27]) – 1, 0,1 мкМ тапсигаргін (селективний інгібітор Са2+,Mg2+- АТР-ази ендо(сарко)-плазматичного ретикулу- му [27]) і 0,1%-й дигітонін (фактор перфорації плазматичної мембрани [28]). Кількість про- теїну мембранної фракції у пробі – 20–30 мкг, час інкубації – 4 хв. Ензиматичну реакцію ініціювали внесенням у середовище інкубації 50 мкл суспензії плазматичних мембран, а зу- пиняли при 8 °С додаванням до інкубаційної суміші 1 мл «стоп»-розчину такого складу: 1,5 М натрій оцтовокислий, 3,7%-й формальдегід, 14%-й етанол, 5%-й ТХУ, рН 4,3. «Базальну» Mg2+-АТР-азну активність визначали у тому самому середовищі інкуба- ції, але у присутності 1 мМ уабаїну (селектив- ний інгібітор Nа+,К+-АТР-ази [29, 30]). «Уабаїнчутливу» Nа+,К+-АТР-азну актив- ність розраховували за різницею між величи- нами «загальної» АТР-азної і Mg2+-АТР-азної активністю. У всіх дослідах контролем на неензима- тичний гідроліз АТР слугувало середовище ін- кубації, що мало склад, аналогічний описано- му вище, але не містило фракції плазматичної мембрани. Контролем на кількість ендогенно- го неорганічного фосфату (Рі ) у мембранному препараті було середовище, яке містило тільки фракцію мембранного препарату у водному роз- чині. Отже питому «загальну» АТР-азну ензи- матичну активність розраховували за різницею між кількістю Рі, що утворився у середовищі інкубації у присутності та за відсутністі фраг- ментів плазматичної мембрани з урахуванням поправки на неензиматичний гідроліз АТР та вміст ендогенного Рі у мембранному препараті. Кількість продукту реакції Рі визначали за ме- тодом W. Rathbun et V. Betlach [31]. При вивченні впливу калікс[4]аренів (10-8– 10-4 М) на питому ензиматичну активність Nа+,К+-АТР-ази та Mg2+-АТР-ази використо- вували описане вище стандартне середовище інкубації, до якого додавали аліквоту розчину каліксарену у відповідній початковій концен- трації. У дослідах використовували концент- ровані (4 мМ) вихідні розчини каліксаренів у ДМСО, які далі розводили водою. За 100% («нульову точку») приймали значення АТР-гід- ролазної активності за відсутності зазначених речовин у стандартному середовищі інкубації. При вивченні впливу різних концентрацій мо- дельної сполуки м-3 (10-8–4⋅10-3 М) на пито- му ензиматичну активність Nа+,К+-АТР-ази та Mg2+-АТР-ази до стандартного середовища додавали аліквоту водного розчину модельної сполуки м-3 у відповідній концентрації. Статистичний аналіз одержаних даних проводили із залученням загальновідомих стандартних методів із використанням t-кри- терію Стьюдента. Кінетичні та статистичні розрахунки здійснювали за допомогою про- грамного забезпечення MS Office. У роботі використано реактиви: АТР, НEPES, уабаїн та тапсигаргін (Sigma, США), tris-гідроксиметил-амінометан (Reanal, Угор- щина), дигітонін (Merсk, Німеччина), ЕГТА (Fluka, Швейцарія). Інші реактиви вітчизня- ного виробництва кваліфікації чда та хч. результати та обговорення Раніше нами було з’ясовано, що у випадку сарколеми міометрія свині питома активність Na+,K+-АТР-ази і Mg2+-АТР-ази складає від- Т. О. ВЕКЛІЧ, О. А. ШКРАБАК, Р. В. РОДІК та ін. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 128 повідно 10,2 ± 0,7 та 18,1 ± 1,2 мкмоль Рі /год на 1 мг протеїну (M ± m; n = 7) [4]. У попередніх дослідах, які проведено із ви- користанням широкого загалу калікс[4]аренів (14 сполук), було знайдено, що найефективні- шу гальмівну дію на активність Na+,K+-АТР- ази виявляє саме каліксарен с-107, який змен- шує її активність до 2–3% відносно контролю. У порівняльних дослідах ми також вивчили вплив 100 мкМ каліксарену с-107 на пито- му ензиматичну активність «базальної» Mg2+- АТР-ази. Було показано, що він майже не зни- жує активність цього ензиму. Таким чином, каліксарен с-107 у концен- трації 100 мкМ ефективно (на 97–98% стосов- но контрольного значення) інгібує активність Na+,K+-АТР-ази у фракції плазматичних мем- бран міоцитів матки, практично не впливаючи на активність Mg2+-АТР-ази (гальмівний ефект лише на 10–11%). Ми дослідили концентраційну залежність впливу каліксарену с-107 (10-8–10-4 М) на ак- тивність Na+,K+-АТР-ази (рис. 2). Виявилось, що цей каліксарен дозозалежно пригнічує активність Na+,K+-АТР-ази (рис. 2, А). У кон- центрації 10-5 М він гальмує активність цього ензиму повністю (залишкова активність – до 2% відносно контрольного значення). Вели- чина уявної константи інгібування І0,5 стано- вить 33 ± 4 нМ, значення коефіцієнта Хілла nH складає 0,38 ± 0,06 (M ± m; n = 6). Для визначення ролі хімічних угруповань у складі молекули каліксарену с-107 в інгі- буванні активності Nа+,К+-АТР-ази дослідже- но дві модельні сполуки: каліксарен с-150 та 4-гідроксіаніліно(2-піридил)метилфосфонова кислота м-3. Як видно із структурних фор- мул каліксаренів, каліксарен с-150 не містить жодних додаткових хімічних угруповань на верхньому вінці макроциклу, тобто по відно- шенню до досліджуваних каліксаренів він є суто каліксареновою «чашею». Сполука м-3 містить один фенольний фрагмент та аміно- фосфонове угруповання, аналогічне до такого самого у складі молекули каліксарену с-107. У порівняльних дослідах із каталітично- го титрування Nа+,К+-АТР-ази та Mg2+-АТР- ази плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин матки каліксареном с-107 та його структурними фрагментами с-150 та м-3 по- казано, що каліксарен с-107 при вельми ви- соких концентраціях (10-5–10-4 М) практично нездатний інгібувати (лише на 10%) Mg2+- АТР-азну активність. Структурні фрагменти цього каліксарену с-150 (10-8–10-4 М) та м-3 (10-8–4⋅10-3 М) у широкому діапазоні концен- трацій практично не впливають на обидві до- сліджувані ензиматичні системи (рис. 2, А і Б). Слід зазначити, що сполука М-3 у концен- трації 4⋅10-3 М незначно (приблизно на 15%) інгібує Nа+,К+-АТР-азну (але не на Mg2+-АТР- азну) активність. Отже, інгібуюча дія каліксарену с-107 на активність Nа+,К+-АТР-ази передусім пов’язана саме з кооперативним впливом двох просторо- во орієнтованих на каліксареновій платформі амінофосфонових груп, а не з дією тетрафе- нольного макроциклу як такого, або обумовле- на дією окремого амінофосфонового залишку. Для подальшого визначення ролі струк- тури макроциклічної платформи каліксарену с-107 та взаємного розташування на ній амі- нофосфонових угруповань в інгібуючій дії на Na+,K+-АТР-азну активність гладеньком’язових клітин матки досліджено каліксарен с-160, що є регіоізомером каліксарену с-107. Ці калікса- рени відрізняються положенням амінофосфо- нових та третбутильних залишків на верхньому вінці каліксаренової чаші та положенням про- поксизалишків на нижньому вінці макроцик- лу. Саме у каліксарену с-160 вказані залиш- Рис. 1. Порівняльне дослідження впливу калік- сарену С-107 (100 мкМ) на питому ензиматич- ну активність Na+,K+-АТР-ази та «базальної» Mg2+-АТР-ази у фракції плазматичних мембран клітин міометрія (M ± m; n = 7). За 100% прийнято значення питомої ензима- тичної активності за відсутності каліксарену у середовищі інкубації 25 0 20 40 60 80 100 Na+,K+-ATP- Mg2+-ATP- , % . 1. Na+,K+-ATP-аза Mg2+-ATP-аза ЕКСПЕРиМЕНТАЛЬНІ РОБОТи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 29 ки розташовано у проксимальних положеннях каліксаренової основи, а у каліксарену с-107 ці самі залишки знаходяться у дистальних по- ложеннях. Незважаючи на лише зміни положення замісників каліксаренової чаші це призводить до повної утрати інгібувальних властивос- тей каліксарену с-160 щодо Nа+,К+-АТР-ази порівняно з каліксареном с-107, що показано для широкого діапазону концентрацій цих ре- човин (10-8–10-4 М). Активність Mg2+-АТР-ази також не виявляє чутливості до дії каліксарену с-160. Зважаючи на такий результат, можна при- пустити, що головну роль у подібній різниці між каліксаренами с-107 і с-160 відіграє саме розташування амінофосфонових замісників цих каліксаренів (у випадку каліксарену с-107 вони знаходяться у положеннях 5,17, а у ви- падку каліксарену с-160 у положеннях 5,11). Зміни положення третбутильних та пропок- сизалишків можна вважати несуттєвими для інгібування Na+,K+-АТР-ази, тому що пропок- сизалишки на нижньому вінці макроциклу присутні також у складі молекули каліксарену с-150, який нездатний інгібувати АТР-гідро- лазну реакцію, а третбутильні замісники вза- галі відсутні у каліксаренів с-97 і с-99, які, подібно до каліксарену с-107, є високоефек- тивними інгібіторами Na+,K+-АТР-азної актив- ності плазматичних мембран клітин міометрія [17]. З метою вивчення структурних особли- востей каліксаренів с-107 і с-160 ми провели молекулярне моделювання їхніх конформацій з використанням програми HyperChem 7.01. При цьому виходили із того, що молекули каліксаренів є дицвітеріонами із протоновани- ми амінними атомами азоту та двома депро- тонованими гідроксилами різних фосфонових фрагментів. Для уникнення проблеми локаль- них мінімумів енергії при розрахунках ми провели конформаційний пошук оптимальної геометрії молекули, використавши метод мо- лекулярної механіки (силове поле ММ+). Для кожного каліксарену було відібрано 5 енерге- тично-мінімізованих конформерів. Загальні енергії цих структур також перерахували напів- емпіричним методом (поле CNDO), після чого вибрали по одній структурі з найменшими за- Рис. 2. Порівняльне дослідження концентраційної залежності впливу каліксаренів С-107, С-150 і С-160, а також модельної сполуки М-3 на активність Na+,K+-АТР-ази та «базальної» Mg2+-АТР-ази плазматичних мембран клітин міометрія (M ± m, n = 5). За 100 % прийнято значення питомої активності ензиму за відсутності каліксаренів у середовищі інкубації; [Е] – концентрація ефекторів 26 . 2. 26 . 2. lg[E], M lg[E], M -8 -7 -6 -5 -4 -3 -8 -7 -6 -5 -4 -3 Ен зи м ат ич на а кт ив ні ст ь, % Ен зи м ат ич на а кт ив ні ст ь, % 100 120 80 60 40 20 0 100 120 80 60 40 20 0 Na+,K+-ATP-аза Mg2+-ATP-аза С-150 С-160 С-107 М-3 С-150 С-160 С-107 М-3 А Б Т. О. ВЕКЛІЧ, О. А. ШКРАБАК, Р. В. РОДІК та ін. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 130 Рис. 3. Розраховані конформації каліксаренів С-107 і С-160. Проекції: а, в – бокові; б, г – верхні. Ато- ми вуглецю показано зеленим, кисню – червоним, азоту – синім, фосфору – жовтим, атоми водню не показано 27 -107 -160 . 3 27 -107 -160 . 3 Каліксарен С-107 а б в г Каліксарен С-160 гальними енергіями (рис. 3). Різниця в енергії каліксаренів с-107 і с-160 складає 0,1%. Згідно з розрахунками каліксарени с-107 і с-160 мають практично однакову конформа- цію «регулярний конус». Разом з тим відстані N…N, С…С, Р…Р (l) між амінофосфоновими фрагментами N–C–P суттєво різняться (таб- лиця). Наприклад, значення Δl для атомів фос- фору сягає 0,455 нм. При цьому в дистальноза- міщеному каліксарені с-107 обидві фосфонові ЕКСПЕРиМЕНТАЛЬНІ РОБОТи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 31 групи орієнтовано усередину макроцикліч- ної порожнини. У проксимальнозаміщеному каліксарені с-160 фосфонові групи орієнто- вано на периферію. Молекулярна порожнина даного макроциклу заповнена одним із піри- дильних фрагментів. Таким чином, можна стверджувати, що вплив каліксарену с-107 на Na+,K+-АТР-азну активність визначається оптимальним просто- ровим розташуванням амінофосфонових груп на каліксареновій платформі, що вірогідно є комплементарним до сайта Na+,K+-АТР-ази, з яким відбувається взаємодія. Однак слід зазначити, що за інтерпрета- ції можливого механізму дії каліксаренів на активність Na+,K+-АТР-ази треба враховувати той факт, що молекули каліксаренів можуть агрегувати між собою та утворювати асоціа- ти із мембранними фрагментами, а зазначе- ний ензим знаходиться у мембранозв’язаному стані. Дійсно, із використанням методу лазер- ної кореляційної спектроскопії було визначе- но, що 100 мкМ розчин каліксарену с-107 у 2,5% ДМСО містить мікрочастинки, які ха- рактеризуються різним гідродинамічним діа- метром – від 100 нм до 10 мкм. При цьому у 2,5%-му розчині ДМСО без каліксарену с-107 світлорозсіюючих частинок не було виявле- но. Відомо, що деякі амфіфільні каліксарени, розчинені в органічному розчиннику, при по- дальшому розчиненні у воді утворюють так звані «тверді ліпідні частинки», розміри яких залежать від складу розчину. Такі мезоскопіч- ні системи розглядаються деякими дослідни- ками як транспортувальна форма каліксаренів у разі інтравенозного застосування їх як мож- ливих фармакологічних агентів [32]. Безпе- речно, присутність таких частинок ускладнює аналіз взаємодії каліксаренів із мембранами, але результати дослідів свідчать про те, що після такої взаємодії може утворюватися пев- на кількість частинок із розміром, більшим ніж 10 мкм, тобто у присутності каліксаренів відбувається аглютинація фрагментів біоло- гічних мембран із мікрочастинками калікса- рену та/або між собою. Також описано злиття міцел каліксаренів із ліпідними мембранами [33], тому такий шлях збільшення гідродина- мічного діаметра мембранних везикул також можливий. На користь того, що каліксарени можуть утворювати комплекси із фрагментами плазматичних мембран, свідчать також дані електронної мікроскопії. Таким чином, слід вважати, що в цілому біофізикохімічні ефекти у системі «калікса- рен – мембранні фрагменти» є вельми склад- ними. Проте для інгібуючої дії каліксарену с-107 на Na+,K+-АТР-азну активність, що виз- начається у зазначеній гетерогенній системі, суттєвим є саме відносне розташування амі- нофосфонових груп на верхньому вінці мак- роциклу. Отже, просторова будова калікса- рен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Na+,K+-АТР- азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин. Автори висловлюють подяку к.ф.-м.н. В. Ф. Горчеву, к.б.н. В. І. Чернишову за участь у проведенні експериментів із використанням методів лазерної кореляційної спектроскопії та електронної мікроскопії відповідно. Робота фінансувалась Державним фон- дом фундаментальних досліджень (гранти № Ф7/426-2001 та 5А/4Б-2005). пространствЕнноЕ строЕниЕ КалиКсарЕн- аминофосфоновЫх Кислот суЩЕствЕнно для проявлЕния их ингибируюЩЕго дЕЙствия на nа+,К+-атр-азную аКтивность плазматичЕсКих мЕмбран гладКомЫШЕчнЫх КлЕтоК Т. А. Веклич1, А. А. Шкрабак1, Р. В. Родик2, В. и. Бойко2, В. и. Кальченко2, С. А. Костерин1 1Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев; 2Институт органической химии НАН Украины, Киев; e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@bpci.kiev.ua В экспериментах, выполненных на сус- пензии плазматических мембран клеток мио- метрия, обработанных 0,1%-м раствором дигитонина, исследовали ингибиторное дейс- Характеристичні відстані між дистальними та проксимальними фрагментами N–C–P калікса- ренів С-107 і С-160 Відстані між атомами Величина відстані (l), нм Δl, нм с-107 с-160 N…N 0,943 0,673 0,270 С…С 0,775 0,809 0,034 Р…Р 0,485 0,940 0,455 Т. О. ВЕКЛІЧ, О. А. ШКРАБАК, Р. В. РОДІК та ін. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 132 твие 5,17-ди(фосфоно-2-пиридилметил)амино- 11,23-ди-трет-бутил-26,28-ди-гидрокси-25,27- дипропоксикаликс[4]арена с-107 (указан шифр) на Na+,K+-АТР-азную активность. Этот каликсарен дозозависимо (10-8–10-4 М) угнета- ет активность Na+,K+-АТР-азы, практически не влияя на активность «базальной» Mg2+-АТР- азы. Величина кажущейся константы инги- бирования І0,5 составляет 33 ± 4 нМ, а зна- чение коэффициента Хилла nH – 0,38 ± 0,06. Модельные соединения – незамещенный по верхнему ободу 25,27-дипропоксикаликсарен с-150 (10-8–10-4 М) – каликсареновая «плат- форма» и N-(4-гидроксифенил)-2-пиридил- аминофосфоновая кислота м-3 (10-8–4⋅10-3 М) (аминофосфоновая группа вместе с феноль- ным фрагментом) – практически не влияют на исследованные энзиматические системы. 5,11-Ди(фосфоно-2-пиридилметил) амино- 17,23-ди-трет-бутил-27,28-дигидрокси-25,26- дипропоксикаликс[4]арен с-160 – региоизо- мер каликсарена с-107 (10-8–10-4 М) не влияет как на Na+,K+-АТР-азную, так и на Mg2+-АТР- азную активность плазматической мембраны клеток миометрия. Сделан вывод, что ингибирующее влия- ние каликсарена с-107 на Na+,K+-АТР-азу оп- ределяется взаимным расположением амино- фосфоновых групп именно в положениях 5,17 на противоположных фенольных фрагментах верхнего венца молекулы каликсарена в отли- чие от каликсарена с-160, в котором эти груп- пы локализованы в положении 5,11. К л ю ч е в ы е с л о в а: Nа+,К+-АТР-аза, Mg2+-АТР-аза, плазматическая мембрана, гладкомышечные клетки, миометрий, каликса- рены, аминофосфоновые кислоты, пространс- твенная структура, гидродинамические размеры. spatial structure of the сalixarene-aminophosphonic acids is important for their inhibition of the na+,k+-атрase activity in plasmatic membrane of smooth muscle cells T. O. Veklich1, A. О. Shkrabak1, R. V. Rodik2, V. I. Boyko2, V. I. Kalchenko2, S. O. Kosterin1 1Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv; 2Institute of Organic Chemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv; e-mail: kinet@biochem.kiev.ua; vik@bpci.kiev.ua S u m m a r y It was found that calixarene с-107 (5,17-diami- no(2-pyridyl)methylphosphono-11,23-di-tret-butyl- 26,28-dihydroxy-25,27-dipropoxycalix[4]arene) could effectively reduce Na+,K+-АТРase activity of the myometrium cell plasmatic membranes (the value of the apparent constant of inhibition I0.5 was 33 ± 4 nМ) while it practically did not in- fluence the «basal» Mg2+-АТРase activity of the same membrane. In comparative experiments, we have shown that the model calixarene c-150 – the calixarene «scaffold» (26,28-dihydroxy-25,27- dipropoxycalix[4]arene), and the model compound м-3 (4-hydroxyaniline(2-pyridine)methylphospho nic acid) – a fragment of the calixarene с-107, had practically no influence on the enzymatic activities of Na+,K+-АТРase and Mg2+-АТРаse over a wide range of concentrations. Hence, the influence of calixarene с-107 on Na+,K+-АТРase activity was caused by the joint action of two aminophosphonic substituents on the upper rim of the calixarene bowl. The isomer of calixarene с-107 – calixarene с-160 (5,11-diamino(2-pyridyl)methylphosphono- ЕКСПЕРиМЕНТАЛЬНІ РОБОТи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 33 17,23-di-tret-butyl-26,28-dihydroxy-25,27-diprop- oxycalix[4]arene) also did not influence the Na+,K+-АТРase and Mg2+-АТРаse activities of plasmatic membrane of myometrium cells. We car- ried out molecular modeling of calixarenes c-107 and c-160 and showed differences in interatomic distance between aminophosphonic substituents of mentioned calixarenes. We came to the conclusion that spatial structure of calixarene с-107, namely localization of two aminophosphonic substituents in 5,17 position of the upper rim of this calixarene, is crucial for inhibition of Na+,K+-АТРase activity. Using laser correlation spectroscopy it was found that the 100 µM solution of calixarene c-107 and 2.5% DMSO had microparticles with size range from 100 nm to 10 µm. Plasma membrane vesicles had average hydrodynamic diameter 401 ± 17 nm, but after interaction of these vesicles with calix- arene c-107 we have registered the creation of some particles with sizes greater than 10 µm. Therefore membrane vesicles agglutinated to each other and/ or to calixarene microparticles. K e y w o r d s: Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATP- ase, plasma membrane, smooth muscle cells, myo- metrium, calixarenes, aminophosphonic acid, spa- tial structure, hydrodynamic dimensions. 1. Ishida Y., Paul R. J. // J. Smooth Muscle Res. – 2005. – 41, N 5. –P. 235–45. 2. Floyd R., Wray S. // Cell Calcium. – 2007. – 42, N 4–5 – P. 467–76. 3. Geering K. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2006. – 290. – P. 241–250. 4. Векліч Т. О., Костерін С. О. // Укр. біохім. журн. – 2005. – 77, № 2. – С. 66–75. 5. Selvendiran K., Sakthisekaran D. // Biomed. Pharmacother. – 2004. – 58, N 4. – Р. 264–267. 6. Данилович Г. В., Костерін С. О. // Укр. біохім. журн. – 2001. – 73, № 6. – С. 30–40. 7. Кальченко В. І., Родік Р. В., Бойко В. І. // Журнал органічної та фармацевтичної хімії. – 2005. – 3, № 4. – С. 13–29. 8. Geide I., Soldatov D., Kramarenko O. et al. // J. Struct. Chem. – 2005. – 46. – P. S28–S32. 9. Coleman A. W., Jebors S., Cecillon S. et al. // New J. Chem. – 2008. – 32. – P. 780–782. 10. Da Silva E., Lazar A. N., Coleman A. W. // J. Drug Deliv. Sci. Technol. – 2004. – 14, N 1. – P. 3–20. 11. Paclet M-H., Rousseau C. F., Yannick C. et al. // J. Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry. – 2006. – 55, N 3–4. – P. 353–357. 12. Gutsche C. D. Calixarenes Revisited / Ed. J. F. Stoddart. – Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 1998. – P. 233. 13. Vovk A. I., Kalchenko V. I., Cherenok S. A. et al. // Org. Biomol. Chem. – 2004. – 2. – Р. 3162–3166. 14. Dérand R., Bulteau-Pignoux L., Becq F. // J. Membr. Biol. – 2003. – 194, N 2. – P. 109–17. 15. Mutihac L. // Curr. Drug Discov. Technol. – 2008. – 5, N 2. – P. 98–104. 16. Perret F., Lazar A. N., Coleman A. W. // Chem. Commun. – 2006. – Р. 2425–2438. 17. Векліч Т. О., Костерін С. О., Родік Р. В. та ін. // Укр. біохім. журн. – 2006. – 78, № 1. – С. 62–78. 18. Jin T., Kinjo M., Koyama Y. et al. // Langmuir. – 1996. – 12. – P. 2684–2689. 19. Дятлова Н. М., Темкина В. Я., Попов К. и. Комплексоны и комплексонаты метал- лов. – М.: Химия, 1988. – 544 с. 20. Houel E., Lazar A. , Da Silva E. et al. // Langmuir. – 2002. – 18. – P. 1374–1379. 21. Yoshino N., Satake A., Kobuke Y. // Angew. Chem. Int. Ed. – 2001. – 40, N 2. – P. 457–459. 22. Tanaka Y., Kobuke Y., Sokabe M. // Ibid. – 1995. – 34, N 6 – P. 693–694. 23. Casnati A., Sansone F., Ungaro U. // Acc. Chem. Res. – 2003. – 36. – Р. 246–254. 24. Boyko V. I., Podoprigorina A. A., Yakovenko A. V. et al. // J. Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry. – 2004. – 50. – P. 193–197. 25. Кондратюк Т. П., Быченюк С. Ф., Прище- па А. А. и др. // Укр. биохим. журн. – 1986. – 58, № 4. – С. 50–56. 26. Bradford M. M. // Anal. Biochem. – 1976. – 72. – P. 248–282. 27. Flynn E. R. M., Bradley K. N., Muir T. C., McCarron J. G. // J. Biol. Chem. – 2001. – 276, N 39. – P. 36411–36418. 28. Векліч Т. О., Костерін С. О., Шинлова О. П. // Укр. біохім. журн. – 2002. – 74, № 1. – С. 42–48. 29. Valente R. C., Capella L. S., Monteiro R. Q. et al. // FASEB J. – 2003. – 17, N 12. – Р. 1700– 1702. 30. Wang H., Haas M., Liang M. et al. // J. Biol. Chem. – 2004. – 279, N 17. – Р. 17250– 17259. 31. Rathbun W., Betlach V. // Anal. Biochem. – 1969. – 28, N 1–3. – P. 436–445. 32. Gualbert J., Shahgaldian P., Coleman A. W. // Int. J. Pharm. – 2003. – 257, N 1–2. – P. 69–73. 33. Iqbal K. S. J., Allen M. C., Fucassi F. et al. // Chem. Commun. (Camb). – 2007. – N 38. – P. 3951–3953. Отримано 30.12.2009 Т. О. ВЕКЛІЧ, О. А. ШКРАБАК, Р. В. РОДІК та ін.

Institution

Ähnliche Einträge