Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії

Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії

Доведено перспективність застосування протокової цитометрії із використанням потенціал-чутливого зонда 3,3′-дигексилоксикарбоцианіну [DiOC6(3)] для дослідження формувания К+-рівноважного мембранного потенціалу на експериментальній моделі везикул плазматичної мембрани міометрія у присутності валіномі...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:Український біохімічний журнал
Datum:2010
Hauptverfasser: Данилович, Г.В., Данилович, Ю.В., Горчев, В.Ф.
Format: Artikel
Sprache:Ukrainian
Veröffentlicht: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 2010
Schlagworte:
Експериментальні роботи
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19023
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії / Г.В. Данилович, Ю.В. Данилович, В.Ф. Горчев // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 52-61. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-19023
record_format dspace
spelling Данилович, Г.В.
Данилович, Ю.В.
Горчев, В.Ф.
2011-04-16T09:25:34Z
2011-04-16T09:25:34Z
2010
Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії / Г.В. Данилович, Ю.В. Данилович, В.Ф. Горчев // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 52-61. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.
0201-8470
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19023
577.352.5
Доведено перспективність застосування протокової цитометрії із використанням потенціал-чутливого зонда 3,3′-дигексилоксикарбоцианіну [DiOC6(3)] для дослідження формувания К+-рівноважного мембранного потенціалу на експериментальній моделі везикул плазматичної мембрани міометрія у присутності валіноміцину. Визначена цим методом величина трансмембранного потенціалу сумірна з розрахованою за рівнянням Нернста. Пероксид водню та NO2-, ймовірно, підвищують проникність мембрани для К+ і призводять до дисипації раніше наведеного потенціалу. Цей ефект відсутній за наявності в середовищі нітропрусиду натрію. Одержані нами результати підтверджують припущення щодо посилення пасивного транспортування іонів калію крізь сарколему за дії вищезазначених сполук і, відповідно, до реполяризації мембрани та зниження рівня збудливості сарколеми.
Показана возможность использования метода проточной цитометрии для исследования формирования К+-равновесного мембранного потенциала на экспериментальной модели везикул плазматической мембраны миометрия в присутствии валиномицина с использованием потенциалчувствительного зонда 3,3′-дигексилоксикарбоцианина [DiOC6(3)]. Величина трансмембранного потенциала соответствует расчитанной по уравнению Нернста. Н2О2 и NO2-, вероятно, увеличивают проницаемость мембраны для К+ и приводят к диссипации ранее наведенного потенциала. Данный эффект не характерен для нитропруссида натрия. Полученные результаты предполагают возможность усиления пассивного транспортирования ионов калия сарколеммой.
Prospects of the use of flow cytometry analysis for investigation of forming К+- equilibrium membrane potential on the experimental model of myometrium plasma membrane vesicles in the presence of valinomycine using potential-sensitive probe of DiOC6(3). Transmembrane potential magnitude corresponds to magnitude by Nernst’s Н2О2 and NO2-, probably, increase permeability of membrane for К+ and result in potential dissipation. Given effect is not shown for sodium nitroprusside. The obtained results confirm an assumption as to enhancing the passive transport for К+ through sarcolemma under the action of these substances, that can lead to membrane repolarisation and decline of the level of its excitability.
uk
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
Український біохімічний журнал
Експериментальні роботи
Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії
Регистрация К+равновесного потенциала на плазматической мембране гладкомышечных клеток и изучение его модуляции NOx и Н2О2 методом проточной цитометрии
Registration of К+-equilibrium potential in myometrium cell plasma membrane and study of its modulation of Nox and Н2О2 using flow cytometry method
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії
spellingShingle Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії
Данилович, Г.В.
Данилович, Ю.В.
Горчев, В.Ф.
Експериментальні роботи
title_short Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії
title_full Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії
title_fullStr Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії
title_full_unstemmed Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії
title_sort реєстрація к+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції nox та h2o2 методом протокової цитометрії
author Данилович, Г.В.
Данилович, Ю.В.
Горчев, В.Ф.
author_facet Данилович, Г.В.
Данилович, Ю.В.
Горчев, В.Ф.
topic Експериментальні роботи
topic_facet Експериментальні роботи
publishDate 2010
language Ukrainian
container_title Український біохімічний журнал
publisher Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
format Article
title_alt Регистрация К+равновесного потенциала на плазматической мембране гладкомышечных клеток и изучение его модуляции NOx и Н2О2 методом проточной цитометрии
Registration of К+-equilibrium potential in myometrium cell plasma membrane and study of its modulation of Nox and Н2О2 using flow cytometry method
description Доведено перспективність застосування протокової цитометрії із використанням потенціал-чутливого зонда 3,3′-дигексилоксикарбоцианіну [DiOC6(3)] для дослідження формувания К+-рівноважного мембранного потенціалу на експериментальній моделі везикул плазматичної мембрани міометрія у присутності валіноміцину. Визначена цим методом величина трансмембранного потенціалу сумірна з розрахованою за рівнянням Нернста. Пероксид водню та NO2-, ймовірно, підвищують проникність мембрани для К+ і призводять до дисипації раніше наведеного потенціалу. Цей ефект відсутній за наявності в середовищі нітропрусиду натрію. Одержані нами результати підтверджують припущення щодо посилення пасивного транспортування іонів калію крізь сарколему за дії вищезазначених сполук і, відповідно, до реполяризації мембрани та зниження рівня збудливості сарколеми. Показана возможность использования метода проточной цитометрии для исследования формирования К+-равновесного мембранного потенциала на экспериментальной модели везикул плазматической мембраны миометрия в присутствии валиномицина с использованием потенциалчувствительного зонда 3,3′-дигексилоксикарбоцианина [DiOC6(3)]. Величина трансмембранного потенциала соответствует расчитанной по уравнению Нернста. Н2О2 и NO2-, вероятно, увеличивают проницаемость мембраны для К+ и приводят к диссипации ранее наведенного потенциала. Данный эффект не характерен для нитропруссида натрия. Полученные результаты предполагают возможность усиления пассивного транспортирования ионов калия сарколеммой. Prospects of the use of flow cytometry analysis for investigation of forming К+- equilibrium membrane potential on the experimental model of myometrium plasma membrane vesicles in the presence of valinomycine using potential-sensitive probe of DiOC6(3). Transmembrane potential magnitude corresponds to magnitude by Nernst’s Н2О2 and NO2-, probably, increase permeability of membrane for К+ and result in potential dissipation. Given effect is not shown for sodium nitroprusside. The obtained results confirm an assumption as to enhancing the passive transport for К+ through sarcolemma under the action of these substances, that can lead to membrane repolarisation and decline of the level of its excitability.
issn 0201-8470
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19023
citation_txt Реєстрація К+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції Nox та H2O2 методом протокової цитометрії / Г.В. Данилович, Ю.В. Данилович, В.Ф. Горчев // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 52-61. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.
work_keys_str_mv AT danilovičgv reêstracíâkrívnovažnogopotencíalunaplazmatičníimembraníklítinmíometríâívivčennâiogomodulâcíínoxtah2o2metodomprotokovoícitometríí
AT danilovičûv reêstracíâkrívnovažnogopotencíalunaplazmatičníimembraníklítinmíometríâívivčennâiogomodulâcíínoxtah2o2metodomprotokovoícitometríí
AT gorčevvf reêstracíâkrívnovažnogopotencíalunaplazmatičníimembraníklítinmíometríâívivčennâiogomodulâcíínoxtah2o2metodomprotokovoícitometríí
AT danilovičgv registraciâkravnovesnogopotencialanaplazmatičeskoimembranegladkomyšečnyhkletokiizučenieegomodulâciinoxin2o2metodomprotočnoicitometrii
AT danilovičûv registraciâkravnovesnogopotencialanaplazmatičeskoimembranegladkomyšečnyhkletokiizučenieegomodulâciinoxin2o2metodomprotočnoicitometrii
AT gorčevvf registraciâkravnovesnogopotencialanaplazmatičeskoimembranegladkomyšečnyhkletokiizučenieegomodulâciinoxin2o2metodomprotočnoicitometrii
AT danilovičgv registrationofkequilibriumpotentialinmyometriumcellplasmamembraneandstudyofitsmodulationofnoxandn2o2usingflowcytometrymethod
AT danilovičûv registrationofkequilibriumpotentialinmyometriumcellplasmamembraneandstudyofitsmodulationofnoxandn2o2usingflowcytometrymethod
AT gorčevvf registrationofkequilibriumpotentialinmyometriumcellplasmamembraneandstudyofitsmodulationofnoxandn2o2usingflowcytometrymethod
first_indexed 2025-11-24T05:06:18Z
last_indexed 2025-11-24T05:06:18Z
_version_ 1850842321739841536
fulltext ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 152 УДК 577.352.5 реєстрація к+-рівноважного потенціалу на плазматичній мембрані клітин міометрія і вивчення його модуляції nox та н2о2 методом протокової цитометрії Г. В. ДАНИЛОВИЧ, Ю. В. ДАНИЛОВИЧ, В. Ф. ГОРЧЕВ Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ; e-mail: danylovych@biochem.kiev.ua Доведено перспективність застосування протокової цитометрії із використанням потенціал- чутливого зонда 3,3′-дигексилоксикарбоцианіну [DiOC6(3)] для дослідження формувания К+-рівноваж- ного мембранного потенціалу на експериментальній моделі везикул плазматичної мембрани міометрія у присутності валіноміцину. Визначена цим методом величина трансмембранного потенціалу сумірна з розрахованою за рівнянням Нернста. Пероксид водню та NO2 -, ймовірно, підвищують проникність мембрани для К+ і призводять до дисипації раніше наведеного потенціалу. Цей ефект відсутній за на- явності в середовищі нітропрусиду натрію. Одержані нами результати підтверджують припущення щодо посилення пасивного транспор- тування іонів калію крізь сарколему за дії вищезазначених сполук і, відповідно, до реполяризації мемб- рани та зниження рівня збудливості сарколеми. К л ю ч о в і с л о в а: К+-рівноважний мембранний потенціал, сарколема, пероксид водню, оксиди азоту, протокова цитометрія. Дослідження останніх років свідчать про можливу участь оксидів азоту і пер­ оксиду водню у процесах тривалої ре­ лаксації міометрія на тлі зменшеної чутливості до утероконстрикторних агентів, що спостері­ гається під час вагітності за підвищеного рівня прогестерону у тканинах матки (прогестероно­ ва блокада). NOx та Н2О2 іноді виявляють од­ носпрямовану функціональну активність, зок­ рема зумовлюють релаксацію клітин міометрія [1–5]. Одним із механізмів міорелаксаційного ефекту вважають активацію Са2+­залежних К+­каналів сарколеми оксидом азоту шляхом окислення функціонально важливих сульфгід­ рильних груп або протеїнкіназа G­залежни­ ми шляхами. Активація К+­каналів, імовірно, пов’язана з дією Н2О2 – фактора, що гіперпо­ ляризує гладенькі м’язи. Зважаючи на незнач­ ну роль cGMP у механізмах релаксації міомет­ рія за дії оксиду азоту та пероксиду водню [2, 3], актуальності набуває вивчення їхнього без­ посереднього впливу на мембрану, передусім на пасивне транспортування крізь неї К+ та на трансмембранний потенціал. Досить зручною моделлю для вивчення впливу потенціалу на обмін катіонів є вези­ кули плазматичної мембрани. Раніше в наших експериментах було встановлено, що фракція плазматичних мембран клітин міометрія свині містить близько 80% везикульованих фрагмен­ тів [6, 7]. Цю модель апробовано в багатьох до­ слідженнях з вивчення дії хімічних речовин на сарколему [8]. Отже, метою роботи було довести, засто­ совуючи потенціалчутливий флуоресцентний зонд 3,3′­дигексилоксикарбоцианін [DiOC6(3)] і методи спектрофлуориметрії та протокової цитометрії, можливість формування трансмем­ бранного потенціалу Δφ, який за значенням відповідав би розрахованому за рівнянням Нернста, та дослідити можливий вплив ніт­ рит­аніонів, нітропрусиду натрію та пероксиду водню на його величину. матеріали і методи Фракцію сарколеми виділяли з міометрія свині методом диференційного центрифугу­ вання у градієнті густини сахарози як описано у статті [9]. Раніше нами було виявлено, що одержана фракція плазматичних мембран має, переважно, везикульовану структуру [6, 7]. Вміст протеїну визначали методом M. Bradford [10]. Середнє значення його в мембранній фракції становило 1,5–3,6 мг/мл. Мембранний потенціал реєстрували за зміною інтенсивності флуоресценції потенціалчут­ ливого зонда 3,3′­дигексилоксикарбоцианіну [DiOC6(3)]. ЕКсПЕРИмЕНтАЛьНІ РОбОтИ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 53 O N+ N O CH3(CH2)4CH2 CH2(CH2)-4CH3 I - Препарат везикул сарколеми попередньо врівноважували упродовж 15–18 год при 4 °С в середовищі, що містило 300 мМ KCl і 20 мМ HEPES­Tris (рН 7,4). Зміни флуоресценції DіОС6(3) методом спектрофлуориметрії (λзб = 450 нм, λфл = 506 нм) вивчали за допомогою спектрофлуориметра Signе­4М (Латвія) в середовищі (об’єм 2 мл), що містило: 5 мкМ DіОС6(3), 20 мМ HEPES­ Tris (рН 7,4; температура – 37 °С), 150 мкг/мл протеїну і 0,5 мкМ валіноміцину. Потенціал певного значення створювали внесенням до розчину KCl в різних концентраціях (темпе­ ратура – 37 °С), розрахованих за рівнянням Нернста, а іонну силу доводили до 300 мМ до­ даванням холінхлориду (ChCl) – варіанти екс­ перименту 1–7: 1. 300 мМ [K+]i/300 мМ [K+]e (Δφ= 0 мВ), 2. 300 мМ [K+]i/250 мМ [K+]e + 50 мМ [Ch+]e (Δφ= ­4,9 мВ), 3. 300 мМ [K+]i/200 мМ [K+]e + 100 мМ [Ch+]e (Δφ= ­10,8 мВ), 4. 300 мМ [K+]i/150 мМ [K+]e + 150 мМ [Ch+]e (Δφ= ­18,5 мВ), 5. 300 мМ [K+]i/100 мМ [K+]e + 200 мМ [Ch+]e (Δφ= ­29,3 мВ), 6. 300 мМ [K+]i/50 мМ [K+]e + 250 мМ [Ch+]e (Δφ= ­47,8 мВ), 7. 300 мМ [K+]i/30 мМ [K+]e + 270 мМ [Ch+]e (Δφ= ­61,5 мВ). К+­рівноважний потенціал у везикулярній мембранній системі визначали у присутності 0,5 мкМ валіноміцину (Val). Значення К+­рів­ новажного потенціалу обчислювали за рівнян­ ням Нернста: , ][ ][ ln i e K K F RT    , Δ Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , )(Δ )(Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   (1) де [K+]e та [K +]і – концентрація іонів калію поза везикулами та всередині них відповідно. У разі застосування протокового цитомет­ ра COULTER EPICS XLTM (Beckman Coulter, США) з аргоновим лазером (λзб = 488 нм, λфл = 510 нм) значення К+­рівноважного по­ тенціалу Δφ обчислювали при 23 °С (варіанти досліду 1–7): 1. 300 мМ [K+]i/300 мМ [K+]e (Δφ= 0 мВ), 2. 300 мМ [K+]i/250 мМ [K+]e + 50 мМ [Ch+]e (Δφ = ­4,6 мВ), 3. 300 мМ [K+]i/200 мМ [K+]e + 100 мМ [Ch+]e (Δφ = ­10,3 мВ), 4. 300 мМ [K+]i/150 мМ [K+]e + 150 мМ [Ch+]e (Δφ = ­17,5 мВ), 5. 300 мМ [K+]i/100 мМ [K+]e + 200 мМ [Ch+]e (Δφ = ­27,8 мВ), 6. 300 мМ [K+]i/50 мМ [K+]e + 250 мМ [Ch+]e (Δφ = ­45,3 мВ), 7. 300 мМ [K+]i/30 мМ [K+]e + 270 мМ [Ch+]e (Δφ = ­58,3 мВ). Концентрація пероксиду водню, ніт­ рит­аніонів та нітропрусиду натрію (NPS) становила 50 мкМ. Для визначення впливу оксидів азоту та пероксиду водню на К+­рів­ новажний потенціал використовували емпі­ ричні формули. Інтенсивність флуоресценції DiOC6(3) розраховували у відносних одиницях (відн. од.), що відповідали б залежності флуо­ ресцентної відповіді зонда від значення Δφ, об­ численого за рівнянням Нернста. Варіанти експериментів: ­ Контроль: , ][ ][ ln i e K K F RT    , Δ Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , )(Δ )(Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   (2) де ΔPkPosX300 – різниця між положеннями піків до та після внесення до середовища валі­ номіцину при Δφ = 0 мВ ([K+]i=[K+]e = 300 мМ); ΔPkPosX100 – різниця між положення­ ми піків до та після внесення валіноміци­ ну при Δφ = ­27,8 мВ (300 мМ [K+]i/100 мМ [K+]e + 200 мМ [Ch+]e). ­Вплив Н2О2, NO2 ­ та NPS на флуоресцен­ цію зонда за наявності градієнта К+ на мемб­ рані: , ][ ][ ln i e K K F RT    , Δ Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , )(Δ )(Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   (3) де ΔPkPosX300(ефектор) – різниця між положення­ ми піків до та після внесення ефекторів (Н2О2, NO2 ­, NPS) за відсутності градієнта іонів калію ([K+]i = [K+]e = 300 мМ); ΔPkPosX100(ефектор) – різ­ ниця між положеннями піків до та після вне­ сення Н2О2, NO2 ­, NPS за наявності градієнта К+, спрямованого із внутрішньовезикулярно­ го середовища назовні (300 мМ [K+]i/100 мМ [K+]e + 200 мМ [Ch+]e). ­ Дія Н2О2, NO2 ­, NPS на флуоресценцію зонда за наявності наведеного трансмембран­ ного потенціалу (­27,8 мВ): Г. В. ДАНИЛОВИЧ, Ю. В. ДАНИЛОВИЧ, В. Ф. ГОРЧЕВ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 154 , ][ ][ ln i e K K F RT    , Δ Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , )(Δ )(Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   (4) де ΔPkPosX300(Val+ефектор) – різниця між поло­ женнями піків до та після внесення валіно­ міцину, Н2О2, NO2 ­ і NPS – за відсутності градієнта іонів калію ([K+]i = [K+]e = 300 мМ); ΔPkPosX100(Val+ефектор) – різниця між положення­ ми піків до та після внесення валіноміцину, Н2О2, NO2 ­ і NPS – за наявності градієнта К+ (300 мМ [K+]i/100 мМ [K+]e+200 мМ [Ch+]e). ­ Вплив валіноміцину на флуоресцентну відповідь зонда після попереднього оброблен­ ня везикул Н2О2, NO2 ­ та NPS: , ][ ][ ln i e K K F RT    , Δ Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , )(Δ )(Δ )( 300 100 PkPosX PkPosX ..  , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   , Δ Δ )( )300( )100( Val Val PkPos PkPos ..   (5) де ΔPkPosX300(ефектор+Val) – різниця між поло­ женнями піків до та після внесення валі­ номіцину у присутності в середовищі Н2О2, NO2 ­, NPS та за відсутності градієнта іонів калію ([K+]i=[K+]e=300 мМ); ΔPkPosX100(ефектор+Val) – різ­ ниця між положеннями піків до та після вне­ сення валіноміцину у присутності Н2О2, NO2 ­, NPS і наявності градієнта К+ (300 мМ [K+]i/ 100 мМ [K+]e+200 мМ [Ch+]e). Для статистичного аналізу одержаних да­ них використовували пакет стандартних прог­ рам IBM PC. У роботі застосовували такі реактиви: HEPES (Sigma, США), трис­гідроксиметил­ амінометан (Reanal, Угорщина), тритон Х­100 (Merk, Німеччина), ЕГТА, 3,3′­дигексилокси­ карбоціанін (Fluka, Швейцарія). Інші реакти­ ви вітчизняного виробництва кваліфікації чда та хч. результати та обговорення Реєстрація К+-рівноважного потенціа- лу на мембрані везикул сарколеми. Реєстрацію трансмембранного потенціалу здійснювали за допомогою ліпофільного і позитивно зарядже­ ного потенціалчутливого зонда DiOC6(3), що належить до ціанінових барвників [11]. Макси­ мум його флуоресценції в буферному розчині (20 мМ HEPES­Tris, 300 мМ KCl) становить 500 нм, а спектр збудження флуоресценції – має два максимуми (450 та 488 нм). Інтенсив­ ність флуоресценції зонда лінійно зростає в межах 0–26 мкМ з подальшим насиченням зі збільшенням його концентрації. Внесен­ ня суспензії везикул до реакційного середо­ вища підвищує інтенсивність флуоресцен­ ції та зміщує її максимум до довгохвильової області (506 нм), що, ймовірно, пояснюється зв’язуванням DiOC6(3) з мембранами. Для ви­ бору оптимального співвідношення концен­ трації зонда та суспензії мембран досліджу­ вали залежність інтенсивності флуоресценції зонда від концентрації та кількості протеїну у пробі (50, 100 та 150 мкг/мл). Максимальну ін­ тенсивність флуоресценції зареєстровано при 5 кМ концентрації зонда та вмісті протеїну 150 мкг/мл суспензії плазматичних мембран. Для створення трансмембранного потенціа­ лу суспензію везикул із 300 мМ іонів калію у внутрішньовезикулярному середовищі вноси­ ли до буферного розчину, концентрація К+ в якому становила від 30 до 300 мМ. Одержані нами дані свідчать (рис. 1, а), що внесення суспензії везикул до реакційного середовища спричинює помірне зростання ін­ тенсивності флуоресценції DiOC6(3). Відповід­ но до даних літератури [12, 13] швидкий вихід К+ із везикул за градієнтом концентрації після внесення до середовища валіноміцину зумов­ лює створення на внутрішній поверхні вези­ кулярної мембрани від’ємного заряду, внаслі­ док чого позитивно заряджені молекули зонда акумулюються у внутрішньовезикулярному середовищі. Це може спричинити короткотри­ валий спалах світіння зонда. Як випливає з результатів типового експерименту (рис. 1, а), валіноміцин дійсно індукує істотний спалах флуоресценції, який ми умовно позначили ΔF. На другій стадії процесу зонд димеризується через високу концентрацію всередині везикул, що, у свою чергу, зумовлює стрімке гасіння флуоресценції (ΔІ) [12, 13], причому ступінь її залежить від величини градієнта К+, спря­ мованого із внутрішнього середовища везикул до позавезикулярного. Пізніше спостерігаєть­ ся повільне зростання інтенсивності флуорес­ ценції, яке, ймовірно, пов’язано з дисипацією потенціалу на мембрані. Нами встановлено, що базальна флуорес­ ценція DіОС6(3) та її інтенсивність після вне­ сення до середовища суспензії везикул майже не залежить від концентрації іонів калію в бу­ ферному розчині (графічні дані не наведено). Водночас, на величину спалаху флуоресцен­ ції зонда у присутності валіноміцину впли­ ває концентрація в ньому К+. Але криві за­ лежності відносної зміни флуоресценції зонда (ΔF/F0) та величини потенціалу, обчисленого за рівнянням Нернста (­Δφ), від зміни кон­ центрації К+ ззовні везикул повністю не збі­ гаються (рис. 1, б). Отже, відносне зростання флуоресценції на першому етапі акумуляції зонда безпосередньо не пов’язане з величиною обчисленого трансмембранного потенціалу. Однак дані літератури свідчать [11], що існує ЕКсПЕРИмЕНтАЛьНІ РОбОтИ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 55 пряма залежність між димеризацією зонда, гасінням флуоресценції та величиною Δφ на мембрані. Інтенсивність гасіння флуоресцен­ ції збільшується зі зниженням концентрації К+ в зовнішньому середовищі (зі збільшенням Δφ). У цьому разі крива залежності відносного гасіння флуоресценції зонда (ΔІ/І0) майже збі­ гається із кривою відповідної залежності Δφ, обчисленого за рівнянням Нернста, від зміни концентрації К+ у позавезикулярному просторі (рис. 1, в). Отже, на мембрані везикул фор­ мується К+­рівноважний потенціал (всередині них від’ємний), значення якого визначається величиною калієвого градієнта. У присутності детергенту – 0,1%­го дигі­ тоніну – флуоресцентна відповідь зонда ана­ логічна такій, як у везикулах типу 300 мМ [K+]i/300 мМ [K+]e, так і 300 мМ [K+]i/30 мМ [K+]e + 270 мМ [Ch+]e. Це свідчить, що в разі порушення цілісності везикул сарколеми по­ тенціал не формується. Отже, флуоресцентний потенціалчутли­ вий зонд DiOC6(3) можна використовувати для реєстрації К+­рівноважного трансмембранного потенціалу Δφ, який за величиною є сумірним із потенціалом, розрахованим за рівнянням Нернста. Використання методу протокової цитомет­ рії уможливлює якісний та кількісний аналіз біологічних та фізичних властивостей клітин і субклітинних структур за кількома параметра­ ми одночасно: розміром (величиною прямого світлорозсіювання FS), гранулярністю (бічним світлорозсіюванням SS) і інтенсивністю флуо­ Рис. 1. Реєстрація К+-рівноважного мембранного потенціалу на мембрані везикул сарколеми із ви- користанням потенціалчутливого флуоресцентного зонда DіОс6(3) (Val – 0,5 мкм валіноміцин): а – флуоресцентна відповідь зонда, яка залежить від величини калієвого градієнта, спрямованого у позавезикулярне середовище; б – вплив [К+]е на відносну інтенсивність (ΔF/F0 ) спалаху флуоресценції DіОс6(3) при внесенні валіноміцину до середовища інкубації; в – вплив [К+]е на відносну інтенсивність (ΔІ/І0) гасіння флуоресценції DіОс6(3) після внесення валіноміцину до середовища інкубації. 1 – Значення Δφ, розраховане за рівнянням Нернста при 37 °с; 2 – везикули типу [K+]i /[K +]e+[Ch+]e; F0 та І0 – зміни інтенсивності флуоресценції при Δφ=0 мВ ([K+]i=[K+]e=300 мм), ΔF та ΔІ – зміни інтенсивності флуоресценції залежно від концентрації позавезикулярного калію ([K+]i/[K +]e+[Ch+]e ) 17 Рис. 1 17 Рис. 1 ln[K+]e, M ln[K+]e, M 3,5        4,0         4,5         5,0         5,5        6,0 4,0                  5,0  DI/I0 3,0  2,5  2,0 1,5  1,0  0,5  0  вб DF/F0 3,0  2,5  2,0 1,5  1,0  0,5  0  70  60  50 40  30  20  0  10  3,5 4,0  4,5 -Dφ, мВ 1 2 1 2 -Dφ, мВ 70  60  50 40  30  20  0  10  17 Рис. 1 а 90  70  50 30  DI DF [K+]i /[K +]e Val О ди ни ці  ф лу ор ес це нц ії  везикули  300/30 300/50 300/100 1 хв Г. В. ДАНИЛОВИЧ, Ю. В. ДАНИЛОВИЧ, В. Ф. ГОРЧЕВ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 156 ресцентного сигналу при різних довжинах хвиль у видимому діапазоні спектра (FL1­FL4) [14–15]. У цих дослідженнях використовували канал флуоресценції FL1. На рис. 2 репрезен­ товано типові результати дослідів. Положення піка PkPosX відповідає інтенсивності флуорес­ ценції більшості везикул у загальній популя­ ції. Зміщення PkPosX залежить від значення калієвого градієнта, який спрямовується із внутрішньовезикулярного середовища: від­ стань між положеннями контрольного піка (PkPosX0 – везикули + зонд) та піка після додавання валіноміцину (PkPosXVal – везику­ ли + зонд + Val) зменшується зі збільшенням градієнта калію. Через 2–3 хв відбувається по­ ступова дисипація наведеного потенціалу Δφ, що визначається зміщенням PkPosX у напрям­ ку збільшення інтенсивності флуоресценції (вправо). Відповідні криві залежності інтенсив­ ності флуоресценції від часу за різних значень початкового потенціалу наведено на рис. 3. Чим менше значення наведеного потенціалу (градієнт К+), тим більше зростання інтен­ сивності, оскільки дисипація градієнта також прискорюється. Внесення до середовища інку­ бації з наведеним потенціалом Δφ = ­45,3 мВ (300 мМ [K+]i/50 мМ [K+]e + 250 мМ [Ch+]e) 0,05%­го тритону Х­100 призводить до зміни положення піка в бік підвищення інтенсив­ ності флуоресценції. Водночас, за відсутності потенціалу на мембрані зміщення піка не спостерігається (графічні дані не наведено). У подальших дослідженнях ми обчислювали різницю між інтенсивністю флуоресценції до (PkPosX0) та після додавання валіноміцину (PkPosXVal), що характеризує флуоресцентну Рис. 2. Вплив 0,5 мкм валіноміцину (Val) на флуоресценцію DіОс6(3). PkPosX0 – інтенсивність флуо- ресценції DіОс6(3) перед внесенням до середовища інкубації валіноміцину, PkPosXVal – інтенсивність флуоресценції DіОс6(3) після його внесення. Дані типового досліду 18 . 2. 18 . 2. 18 . 2. 18 . 2. К іл ьк іс ть  п од ій Інтенсивність флуоресценції DiOC6(3) 0               200             400             600             800          10000             200           400           600           800         1000 0            5             10           1 5          20   Контроль PkPosX0 = 385 Val 0            8             16           2 4          32   К іл ьк іс ть  п од ій К іл ьк іс ть  п од ій 18 . 2. 18 . 2. 0            8             16           2 4          32   0            8             16           2 4          32   [K+]i/[K +]e = 300 мМ/300 мМ PkPosXVal = 622 Контроль Val [K+]i/[K +]e = 300 мМ/200 мМ PkPosXVal = 523 0            8             16           2 4          32   0            8             16           2 4          32   0               200             400             600             800          10000               200             400             600             800          1000 0               200             400             600             800          10000               200             400             600             800          1000 Контроль Val [K+]i/[K +]e = 300 мМ/150 мМ PkPosXVal = 502 Контроль Val Контроль Val [K+]i/[K +]e = 300 мМ/50 мМ PkPosXVal = 473 Контроль Val [K+]i/[K +]e = 300 мМ/30 мМ PkPosXVal = 450 [K+]i/[K +]e = 300 мМ/100 мМ PkPosXVal = 488 ЕКсПЕРИмЕНтАЛьНІ РОбОтИ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 57 відповідь DiOC6(3) – ΔPkPosXn – при неодна­ ковій концентрації іонів калію в середовищі. Таким чином: ΔPkPosXn = PkPosXVal – PkPosX0, де n – концентрація К+ в мМ в середовищі ін­ кубації. Відповідно до одержаних даних було по­ будовано калібрувальну криву, яка віддзер­ калює взаємозв’язок між флуоресцентною відповіддю зонда при різних концентраціях К+ в середовищі та величиною потенціалу, об­ численого за рівнянням Нернста (рис. 4). Як випливає з рис. 4, пряма залежність між флуо­ ресцентною відповіддю зонда та розрахованим Δφ спостерігається лише при зміні наведено­ го потенціалу – від ­58,3 мВ до ­10,3 мВ. У разі зменшення потенціалу (тобто зниженні градієнта К+) спостерігається відхилення від лінійної залежності, що потребує подальшого з’ясування. Величина відносної флуоресцент­ ної відповіді зонда (виражена у відн. од.) при зміні концентрації К+ від 30 до 200 мМ у по­ завезикулярному середовищі наближається до значень Δφ, розрахованих за рівнянням Нерн­ ста (рис. 5). Отже, проведені експерименти з вико­ ристанням потенціалчутливого зонда DіОС6(3) свідчать про можливість тестування штучного К+­рівноважного потенціалу Δφ на мембрані везикул сарколеми міоцитів методом протоко­ вої цитометрії, який за значенням відповідає потенціалу, обчисленого за рівнянням Нернста. Вивчення впливу нітрит-аніонів, NPS і Н2О2 на флуоресценцію зонда DiOC6(3) в разі формування К+-рівноважного трансмембранного потенціалу у везикульованій фракції сарколеми. Проведеними дослідженнями встановлено, що за відсутності градієнта К+ і, відповідно, трансмембранного потенціалу валіноміцин, H2O2, NO2 ­ та NPS істотно впливають на ін­ тенсивність флуоресценції DiOC6(3), унаслідок чого спостерігається зміщення піків кривих у координатах – кількість подій, інтенсивність флуоресценції DiOC6(3) – в бік інтенсивності, тобто в напрямі підвищення квантового ви­ ходу (типові результати дії Н2О2 наведено на рис. 6; для інших речовин напрям зміщення піків аналогічний). Імовірно, це явище можна пояснити впливом досліджуваних сполук на взаємодію зонда з мембраною, оскільки, згідно з даними літератури та результатами наших екс­ периментів, наведених вище, квантовий вихід DiOC6(3) в разі взаємодії із протеїн­ліпідними комплексами зростає. Зазначені вище попе­ редні дослідження обумовили доцільність ви­ Рис. 3. Динаміка зміни інтенсивності флуорес- ценції DіОс6(3) після внесення валіноміцину до суспензії везикул. Дані типового експерименту 19 . 3. . 4. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 Δφ, мВ ΔP kP os X n 600 550  500 Ін те нс ив ні ст ь  фл уо ре сц ен ці ї D iO C 6(3 )  0 450 400 1 2 3 Час, хв 19 . 3. . 4. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 Δφ, мВ ΔP kP os X n -45,3 мВ -4,6 мВ 19 . 3. . 4. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 Δφ, мВ ΔP kP os X n -58,3 мВ -75,8 мВ Рис. 4. Залежність флуоресцентної відповіді зонда (ΔPkPosXn) від значення Δφ, обчисленого за рівнян- ням Нернста (M ± m, n = 5); коефіціент кореляції r – 0,97 ± 0,02 19 . 3. . 4. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 Δφ, мВ ΔP kP os X n Δ Pk Po sX n 0-10 -20 Δφ, мВ -30-40-50-60-70 Г. В. ДАНИЛОВИЧ, Ю. В. ДАНИЛОВИЧ, В. Ф. ГОРЧЕВ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 158 раження наших подальших результатів у відн. од. флуоресценції. Цей спосіб обчислення вра­ ховує неспецифічні зміни флуоресцентної від­ повіді (емпіричні формули наведено в розділі «Матеріали і методи»). Розподіл інтенсивності флуоресценції в координатах FL1/SS (інтен­ сивність флуоресценції, бічне світлорозсіюван­ ня, рис. 6) свідчить, що під час експериментів структура везикул залишається стабільною, а змінюється лише інтенсивність флуоресценції зонда. Для з’ясування впливу оксидів азоту і пер­ оксиду водню на інтенсивність флуоресценції зонда та Δφ було вибрано такі варіанти пос­ тановки експериментів (відповідні результати наведено на рис. 7): 1. Контроль. Відношення флуоресцент­ ної відповіді DiOC6(3) у присутності на мем­ брані градієнта К+ (300 мМ [K+]i /100 мM [K+]e + 200 мM [Ch+]e, Δφ = ­27,8 мВ) до флуо­ ресцентної відповіді зонда за відсутності градієнта ([K+]i = [K+]e = 300 мM, Δφ = 0 мВ). Емпіричну формулу (2) наведено в «Матеріа­ лах і методах». 2. Дія H2O2, NO2 ­, NPS на флуоресценцію зонда (відн. од.) у присутності градієнта К+, але за відсутності валіноміцину, тобто попередньої відсутності потенціалу на мембрані). Емпірич­ на формула (3). 3. Вплив H2O2, NO2 ­, NPS у разі внесен­ ня їх до середовища інкубації та формування Δφ = ­27,8 мВ на мембрані (тобто після вне­ сення валіноміцину до середовища). Емпірич­ на формула (4). 4. Флуоресцентна відповідь DiOC6(3) у присутності градієнта К+ на мембрані і послі­ Рис. 5. Вплив [К+]е на флуоресцентну відповідь DіОс6(3): ΔPkPosX300 – різниця між положеннями піків при Δφ = 0 мВ ([K+]i = [K+]e= 300 мм), ΔPkPosXn – різниця між положеннями піків при неоднакових значеннях Δφ ([K+]i /[K +]e + [Ch+]e). 1 – величина Δφ, розрахована за рівнянням Нернста (температура 23 °с), 2 – везикули типа [K+]i /[K +]e+[Ch+]e (M ± m, n = 5). Коефіціент кореляції r – 0,98 ± 0,03 довному додаванні до середовища H2O2, NO2 ­, NPS та валіноміцину. Емпірична формула (5). Значення флуоресцентної відповіді DiOC6(3) у відн. од. за наявності градієнта К+ (300 мМ [K+]i /100 мM [K+]e + 200 мM [Ch+]e) становило 0,63 ± 0,07 (n = 14) і відповіда­ ло Δφ = ­27,8 мВ, обчисленого за рівнянням Нернста (контроль, варіант експерименту 1). Одиницею вважали флуоресцентну відповідь зонда за відсутності градієнта іонів калію ([K+]i = [K+]e = 300 мM, Δφ = 0 мВ). Виявлено, що H2O2 та NO2 ­, найімовірніше, підвищують проникність мембрани до іонів калію, що при­ водить до можливої поляризації мембрани та відповідної зміни величини флуоресцентної відповіді зонда, яка досягає розрахованої для Δφ = ­ 27,8 мВ (варіант експерименту 2). Цього ефекту не виявлено в дослідах із NPS. Внесення H2O2 та NO2 ­ до середовища ін­ кубації після утворення потенціалу на плаз­ матичній мембрані (варіант експерименту 3), вірогідно, спричинює дисипацію штучно наведеного потенціалу, оскільки величина флуоресцентної відповіді наближається до 1 (відсутність потенціалу). Внесення NPS на флуоресцентну відповідь (Δφ) не впливає. У варіанті досліду 4 після попереднього внесен­ ня до середовища інкубації пероксиду водню (перед додаванням валіноміцину) флуоресцен­ тна відповідь зонда, а отже Δφ і К+­проник­ ність, вірогідно підвищується (0,50 ± 0,06, n = 5) порівняно з потенціалом, сформованим за дії лише валіноміцину. Це дає підставу при­ пустити, що мембранні механізми формування потенціалу за участю валіноміцину та Н2О2 за штучного градієнта К+ на мембрані неодна­ 20 . 5. 0,8 0,7  0,6 Δ Pk Po sX n/Δ Pk Po sX 30 0 0 0,5 0,4 2,5 3,5 4,5 ln[K+ e], M 0,3 0,2 0,1 5,5 0 -10  -20 Δφ , м В -80 -30 -40 -50 -60 -70 ЕКсПЕРИмЕНтАЛьНІ РОбОтИ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 59 Рис. 6. Вплив Н2О2 на інтенсивність флуоресценції DiOC6(3): а, в – зміни інтенсивності флуоресцен- ції DiOC6(3) у присутності градієнта К+ на мембрані (300 мм [K+]i /100 мм [K+]e + 200 мм [Ch+]e, Δφ = -27,8 мВ); б, г – зміни інтенсивності флуоресценції DiOC6(3) за відсутності градієнта K+ на мембрані ([K+]i = [K+]e = 300 мм, Δφ = 0 мВ). Дані типового експерименту 21 . 6. а К іл ьк іс ть  п од ій Флуоресценція DiOC6(3) 21 . 6. Флуоресценція DiOC6(3) б [K+]i/[K +]e = 300 мМ/100 мМ Δφ = -27,8 мВ [K+]i/[K +]e = 300 мМ/300 мМ Δφ = 0 мВ 0                 200               400               600               800 0               200             400             600             800 0              15              3 0              45          6 0  Контроль Val Контроль Val        H2O2 H2O2 FL 1 0                            1 28 0                              12 8 0                              12 8 0             0              0                     SS 0              11              2 2              33          4 4  Контроль Val Контроль Val        H2O2 H2O2 FL 1 0                            1 28 0                            1 28 0          0           0                   SS 0                            1 28 К іл ьк іс ть  п од ій 21 . 6. 21 . 6. Флуоресценція DiOC6(3)Флуоресценція DiOC6(3) в г 0              14             28              4 2           5 6  0                 200               400               600               800 Val Контроль H2O2    Val H2O2 FL 1 0                              12 8 0              0           0                         SS 0            1 2              24             36           4 8  Val Контроль H2O2      ValH2O2 0            0           0                    SS 0                            1 28Контроль 0                            1 28 0                              12 8 0                 200               400               600               800 Контроль 0                            1 28 FL 1 0                             1 28 кові. Окисли азоту практично не впливають на величину флуоресцентної відповіді порівняно з контролем в цьому варіанті експерименту. Відсутність ефекту нітрит­аніонів, як і в екс­ периментах із NPS, потребують подальших досліджень. За наявності в середовищі нітро­ прусиду натрію суттєвим є наявність у сере­ довищі, окрім окислів азоту, катіонів заліза та ціанід­аніонів. Отже, дані різних варіантів експеримен­ ту свідчать про можливість підвищення про­ никності мембрани до іонів калію за дії H2O2 та NO2 ­. Екстраполяція цих результатів на ін­ тактні клітини уможливлює припущення щодо посилення пасивного транспортування калію з міоцитів, яке супроводжується відповідною реполяризацією мембрани. Іn vivo це має спри­ чинити зниження рівня збудження сарколеми. В наших попередніх дослідженнях, здійсне­ них на суспензії міоцитів та везикульованій фракції плазматичної мембрани, виявлено, що оксиди азоту і пероксид водню підвищують рН міоплазми та транспортування протонів у сарколемі за градієнтом концентрації, а та­ кож пасивне транспортування Са2+ в окремих експериментальних моделях. Локальне зрос­ тання рН та [Са2+] зумовлює потужну акти­ вацію Са+­залежних К+­каналів, що доповнює результати, наведені в цій роботі. Вірогідний напрям наших подальших досліджень – це ви­ користання інтактних міоцитів для вивчення змін мембранного потенціалу, що наблизить експерименти до фізіологічних умов. Г. В. ДАНИЛОВИЧ, Ю. В. ДАНИЛОВИЧ, В. Ф. ГОРЧЕВ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 160 Рис. 7. Вплив Н2О2, NO2 -, та NPS на величину К+-рівноважного трансмембранного потенціалу плазма- тичної мембрани. За відн. од. прийнято зміни флуоресценції в разі відсутності градієнта іонів калію ([K+]i = [K+]e = 300 мм, Δφ = 0 мВ). * Дані відносно контролю (Δφ= -27,8 мВ, 300 мм [K+]i /100 мм [K+]e + 200 мм [Ch+]e ) вірогідні, Р ≤ 0,05 регистрация к+-равновесного потенциала на плазматической мембране гладкомЫШечнЫХ клеток и изучение его модуляции nox та н2о2 методом проточной цитометрии А. В. Данилович, Ю. В. Данилович, В. Ф. Горчев Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев; e­mail: danylovych@biochem.kiev.ua Показана возможность использования ме­ тода проточной цитометрии для исследования формирования К+­равновесного мембранного потенциала на экспериментальной модели ве­ зикул плазматической мембраны миометрия в присутствии валиномицина с использованием потенциалчувствительного зонда 3,3′­дигек­ силоксикарбоцианина [DiOC6(3)]. Величина трансмембранного потенциала соответствует расчитанной по уравнению Нернста. Н2О2 и NO2 ­, вероятно, увеличивают про­ ницаемость мембраны для К+ и приводят к диссипации ранее наведенного потенциала. Данный эффект не характерен для нитропрус­ сида натрия. Полученные результаты пред­ полагают возможность усиления пассивного транспортирования ионов калия сарколеммой при действии вышеуказанных соединений с соответствующей реполяризацией мембраны и снижением уровня ее возбудимости. К л ю ч е в ы е с л о в а: К+­равновесный мембранный потенциал, сарколемма, перок­ сид водорода, оксиды азота, проточная цито­ метрия. RegistRation of к+-equilibRium potential in myometRium cell plasma membRane and study of its modulation of nox and н2о2 using flow cytometRy method G. V. Danylovych, Yu. V. Danylovych, V. F. Gorchev Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Science of Ukraine, Kyiv; e­mail: danylovych@biochem.kiev.ua S u m m a r y Prospects of the use of flow cytometry analy­ sis for investigation of forming К+­ equilibrium membrane potential on the experimental model of myometrium plasma membrane vesicles in the presence of valinomycine using potential­sensi­ tive probe of DiOC6(3). Transmembrane potential magnitude corresponds to magnitude by Nernst’s equation. 22 . 7 1,4 1,2  1,0 Ф лу ор еc це нт на  в ід по ві дь  D iC O 6(3 ),   в ід н.  о д. 0 0,8 0,6 0,4 0,2 n = 14 n = 5 n = 5 n = 6 * n = 5 * * n = 6 n = 5 n = 5 * n = 5 n = 5 Контроль -27,8 мВ H2O2   NO2 -   NPS Val + H2O2 Val + NO2 - Val + NPS H2O2 + Val NO2 - + Val NPS + Val ЕКсПЕРИмЕНтАЛьНІ РОбОтИ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 61 Н2О2 and NO2 ­, probably, increase permeabili­ ty of membrane for К+ and result in potential dis­ sipation. Given effect is not shown for sodium nitroprusside. The obtained results confirm an as­ sumption as to enhancing the passive transport for К+ through sarcolemma under the action of these substances, that can lead to membrane repolarisa­ tion and decline of the level of its excitability. K e y w o r d s: hydrogen peroxide, nitric oxi­ de, flow cytometry, К+­equilibrium membrane po­ tential, sarcolemma. 1. Sladek S. M., Magness R. R., Conrad K. P. // Am. J. Physiol. – 1997. – 272, N 41. – P. R. 444–463. 2. Buxton I. L. // Mol. Pharmacol. – 2004. – 65, N 5. – P. 1051–1059. 3. Warren A. Y., Matharoo-Ball B., Shaw R. W., Khan R. N. // Reproduction. – 2005. – 130. – P. 539–544. 4. Chung D., Caruso R. L. // Toxicol. Sci. – 2006. – 93, N 1. – P. 172–179. 5. Matoba T., Shimokawa H. // J. Pharmacol. Sci. – 2003. – 92. – P. 1–6. 6. Шкрабак О., Данилович Г., Векліч т. // Вісн. КНУ. Біол. – 2006. – 47–48. – С. 55–57. 7. Данилович Ю. В., тугай В. А. // Укр. біохім. журн. – 2001. – 73, № 1. – С.48–­53. 8. бабич Л. Г., Фомин В. П., Костерин с. А. // Биохимия. – 1990. – 55, № 10. – С. 1890– 1901. 9. Кондратюк т. П., быченюк с. Ф., Прище- па Л. А. и др. // Укр. биохим. журн. – 1986. – 58, № 4. – С. 50–56. 10. Bradford M. M. // Anal. Biochem. – 1976. – 72, N 1. – P. 248–282. 11. Brewis I. A., Morton I. A., Mohammad S. N. et al. // J. Andrology. – 2000. – 21, N 2. – Р. 238–249. 12. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. – М.: Наука. 1989. – 277 с. 13. Косников В. В. // Укр. биохим. журн. – 1990. – 62, № 1. – С. 3–15. 14. болдырев А. А., Юнева м. О. // Сорос. образоват. журн. – 2004. – 8, № 2. – С. 7– 14. 15. бабіч Л. Г., Шликов с. Г., Наумова Н. В., Костерін с. О. // Укр. біохім. журн. – 2007. – 79, № 6. – С. 34–41. Отримано 12.07.2009 Г. В. ДАНИЛОВИЧ, Ю. В. ДАНИЛОВИЧ, В. Ф. ГОРЧЕВ

Ähnliche Einträge