Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом
Вивчали експресію двох ізоформ мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази‑2 (PFKFB-2) з неоднаковою С-кінцевою частиною молекули в нирках та легенях щурів при експериментальному цукровому діабеті. У щурів з експериментальним цукровим діабетом виявлено зниження експресії обох ізоформ мРНК...
Saved in:
| Published in: | Український біохімічний журнал |
|---|---|
| Date: | 2010 |
| Main Authors: | , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
2010
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19028 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом / Н.М. Липова, Д.O. Мінченко, О.О. Ратушна, І.В. Божко, K. Тсучігара, Г. Eсумі, O.Г. Мінченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 90-99. — Бібліогр.: 48 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859715226266501120 |
|---|---|
| author | Липова, Н.М. Мінченко, Д.O. Ратушна, О.О. Божко, І.В. Тсучігара, K. Есумі, Г. Мінченко, O.Г. |
| author_facet | Липова, Н.М. Мінченко, Д.O. Ратушна, О.О. Божко, І.В. Тсучігара, K. Есумі, Г. Мінченко, O.Г. |
| citation_txt | Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом / Н.М. Липова, Д.O. Мінченко, О.О. Ратушна, І.В. Божко, K. Тсучігара, Г. Eсумі, O.Г. Мінченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 90-99. — Бібліогр.: 48 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Український біохімічний журнал |
| description | Вивчали експресію двох ізоформ мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази‑2 (PFKFB-2) з неоднаковою С-кінцевою частиною молекули в нирках та легенях щурів при експериментальному цукровому діабеті. У щурів з експериментальним цукровим діабетом виявлено зниження експресії обох ізоформ мРНК PFKFB-2 в досліджуваних органах. Більше того, аналізуючи клоновані кДНК PFKFB-2 нирок діабетичних щурів, було виділено чотири нових альтернативних сплайс-варіанти мРНК PFKFB-2, що відрізняються вставками та делеціями у 6-фосфофрукто-2-кіназній та у фруктозо-2,6-бісфосфатазній частинах молекули PFKFB-2. Три із цих альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 є монофункціональними, оскільки не здатні кодувати синтез функціонально активної 6-фосфофрукто-2-кінази. Установлено, що експресія альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 як у нирках, так і в легенях щурів змінюється порівняно з контрольними тваринами. Результати роботи свідчать про суттєві порушення синтезу мРНК PFKFB-2 на рівні альтернативного сплайсингу пре-мРНК PFKFB-2 у нирках та легенях при цукровому діабеті, що може бути доказом складності механізмів регуляції метаболізму глюкози, зокрема гліколізу, а також одним із численних чинників їхнього порушення при цьому захворюванні.
Проведено изучение экспрессии двух изоформ мРНК 6-фосфофрукто-2-киназы/фруктозо-2,6-бисфосфатазы-2 (PFKFB-2) с различной С-концевой частью в почках и легких крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Показано, что при сахарном диабете отмечается снижение экспрессии обоих изоформ мРНК PFKFB-2 в легких и в почках крыс. Более того, при анализе клонированных кДНК PFKFB-2 из почек диабетических крыс выделено четыре новых альтернативных сплайс-варианта мРНК PFKFB-2, которые имеют различные вставки и делеции в 6-фосфофрукто-2-киназной и в фруктозо-2,6-бисфосфатазной частях молекулы PFKFB-2. Три из этих альтернативных сплайс-вариантов мРНК PFKFB-2 могут кодировать синтез только фруктозо-2,6-бисфосфатазы, так как имеют делецию двух каталитических доменов 6-фосфофрукто-2-киназы (Е та F). Показано, что выявленные альтернативные сплайс-варианты мРНК PFKFB-2 экспрессируются в почках и в легких крыс. При этом по сравнению с контрольными крысами изменяется экспрессия у крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Результаты данной работы свидетельствуют о существенном нарушении синтеза мРНК PFKFB-2 на уровне альтернативного сплайсинга пре-мРНК PFKFB-2 в почках и легких при сахарном диабете, что может быть, в частности, доказательством сложности механизмов регуляции метаболизма глюкозы и гликолиза и одним из многочисленных факторов их нарушения при этом заболевании.
We studied the expression mRNA of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-2 (PFKFB-2) in the rat lung and kidney in experimental diabetes mellitus. For investigation we select two isoforms of PFKFB-2 with different C-terminus. The level of the expression of both PFKFB-2 mRNA isoforms is decreased in the kidney and lung in rats with experimental diabetes mellitus respect to the control animals. Moreover, four new alternative splice variants of PFKFB-2 mRNA were identified in the rat kidney. These splice variants of PFKFB-2 mRNA have differentinserts and/or deletions in 6-phosphofructo-2-kinase as well as in fructose-2,6-bisphosphatase part of PFKFB-2. Three alternative splice variants cannot encode active 6-phosphofructo-2-kinase as a result of deletion of two catalytic domains (E and F). They encode fructose-2,6-bisphosphatase. It was shown that these alternative splice variants express in the kidney and lung and that this expression changes in rats with experimental diabetes mellitus with respect to the control animals. The results of this investigation clearly demonstrated that diabetes mellitus significantly affects the expression and alternative splicing of PFKFB-2 in the kidney and lungs and showed the complexityof regulatory mechanisms of glucose metabolism in this disease.
|
| first_indexed | 2025-12-01T08:12:04Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 190
УДК 577.112:616
експресія мрнк 6-фосфофрукто-2-кінази/
фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних
сплайс-варіантів у щурів з експериментальним
цукровим діабетом
Н. М. ЛИПОВА1, Д. O. МІНЧЕНКО1, О. О. РАТУШНА1, І. В. БОЖКО1,
K. ТСУЧІГАРА2, Г. EСУМІ2, O. Г. МІНЧЕНКО1,2
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ;
2Науковий центр інноваційної онкології Східного госпіталю
Національного онкологічного центру Японії;
e-mail: ominchenko@yahoo.com
Вивчали експресію двох ізоформ мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфата-
зи-2 (PFKFB-2) з неоднаковою С-кінцевою частиною молекули в нирках та легенях щурів при експери-
ментальному цукровому діабеті. У щурів з експериментальним цукровим діабетом виявлено зниження
експресії обох ізоформ мРНК PFKFB-2 в досліджуваних органах. Більше того, аналізуючи клоно-
вані кДНК PFKFB-2 нирок діабетичних щурів, було виділено чотири нових альтернативних сплайс-
варіанти мРНК PFKFB-2, що відрізняються вставками та делеціями у 6-фосфофрукто-2-кіназній
та у фруктозо-2,6-бісфосфатазній частинах молекули PFKFB-2. Три із цих альтернативних сплайс-
варіантів мРНК PFKFB-2 є монофункціональними, оскільки не здатні кодувати синтез функціональ-
но активної 6-фосфофрукто-2-кінази. Установлено, що експресія альтернативних сплайс-варіантів
мРНК PFKFB-2 як у нирках, так і в легенях щурів змінюється порівняно з контрольними тваринами.
Результати роботи свідчать про суттєві порушення синтезу мРНК PFKFB-2 на рівні альтернативно-
го сплайсингу пре-мРНК PFKFB-2 у нирках та легенях при цукровому діабеті, що може бути доказом
складності механізмів регуляції метаболізму глюкози, зокрема гліколізу, а також одним із численних
чинників їхнього порушення при цьому захворюванні.
К л ю ч о в і с л о в а: PFKFB-2, альтернативний сплайсинг, цукровий діабет, легені, нирки,
щури.
Г омодимерний біфункціональний ензим
6-фосфофрукто-2-кіназа/фруктозо-2,6-
бісфосфатаза (PFKFB) є одним із клю-
чових ензимів регуляції метаболізму глюкози,
зокрема гліколізу, як у нормі, так і при різних
патологічних станах організму – цукровому
діабеті та злоякісних пухлинах [1–8]. PFKFB
[6-фосфофрукто-2-кіназа (EC 2.7.1.105) і фрук-
тозо-2,6-бісфосфатаза (EC 3.1.3.46)] має два
різні каталітичні центри на обох субодиницях:
один із них пов’язаний з 6-фосфофрукто-2-кі-
назною активністю (включає шість доменів –
А, B, C, D, E та F), а інший – із фруктозо-2,6-
бісфосфатазною (включає п’ять доменів – G,
H, I, J та K) [1, 9]. PFKFB контролює рівень
фруктозо-2,6-бісфосфату у клітинах, тому що
одна частина ензиму відповідає за його син-
тез, а інша – за дефосфорилювання [1, 9].
Фруктозо-2,6-бісфосфат – це ключовий регу-
лятор гліколізу, оскільки алостерично активує
6-фосфофрукто-1-кіназу – важливий ензим
гліколізу [1, 10, 11]. Більше того, фруктозо-
2,6-бісфосфат істотно впливає також на функ-
ціонування ензимів глюконеогенезу [12].
У людини та тварин виявлено чотири
гени, що розташовані на різних хромосомах і
кодують синтез ізоензимів з відмінними ка-
талітичними та регуляторними властивостями:
PFKFB-1, PFKFB-2, PFKFB-3 та PFKFB-4,
причому особливості перебігу гліколізу в тих
чи інших органах і тканинах визначаються,
імовірно, клітинною специфічністю експресії
різних генів PFKFB [1, 13–15]. При цьому для
мРНК PFKFB-2, PFKFB-3 і PFKFB-4 у клі-
тинах людини, а також у щурів та мишей, ві-
домо кілька альтернативних сплайс-варіантів
із різною довжиною С-кінця молекули. Однак
у цих сплайс-варіантах каталітичні домени не
змінюються не лише у 6-фосфофрукто-2-кіна-
зи, але і у фруктозо-2,6-бісфосфатази [16–20].
Водночас, раніше нами було встановлено, що
мРНК PFKFB-4 притаманна низка інших
альтернативних сплайс-варіантів із різними
вставками або делеціями в ділянках, що ко-
ЕКСПЕРИМЕНТАЛьНІ РОБОТИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 91
дують каталітичні частини 6-фосфофрукто-
2-кінази та фруктозо-2,6-бісфосфатази. Це
спричинює елімінацію частини каталітичних
доменів [21, 22]. Унаслідок таких модифікацій
первинної структури біфункціональний ен-
зим PFKFB-4 набуває монофункціональності
і виявляє лише 6-фосфофрукто-2-кіназну або
фруктозо-2,6-бісфосфатазну активність.
Відомо, що найпотужнішим активатором
гліколізу та утилізації глюкози у клітинах є
гіпоксія, яка істотно посилює експресію глі-
колітичних ензимів, переносників глюкози та
PFKFB, відповідального за регуляцію як глі-
колізу, так і глюконеогенезу [7, 13]. Фактори
росту також значно активують процеси гліколі-
зу [7, 23]. Вплив гіпоксії на інтенсивність глі-
колізу опосередковується індукцією залежного
від гіпоксії транскрипційного фактора HIF та
PFKFB [15, 24–26]. Значне підвищення інтен-
сивності гліколізу спостерігається у злоякіс-
них пухлинах, що обумовлюється наявністю
ефектів в них гіпоксії і посиленою експресією
факторів росту, а також опосередковується
індукцією транскрипційного фактора HIF та
PFKFB [2, 27–31].
Установлено, що інтенсивність перебі-
гу процесів гліколізу істотно змінюється при
цукровому діабеті внаслідок порушення мета-
болізму глюкози, що визначається зміною екс-
пресії та активності PFKFB і глюкокінази [32–
36]. Вивчаючи механізми регуляції гліколізу
при діабеті, автори значну увагу зосередили на
вивченні гена pfkfb1 [5, 6]. У цих експеримен-
тах було виявлено зниження синтезу PFKFB-1
у печінці щурів при експериментальному цук-
ровому діабеті, а також рівня фруктозо-2,6-
бісфосфату у здорових тварин внаслідок при-
гнічення експресії PFKFB-1, яке призводить
до гіперглікемії та набуття резистентності до
інсуліну [5, 32, 33].
Слід також відзначити, що посилення глі-
колізу при цукровому діабеті є надзвичайно
важливим чинником зниження рівня глюкози
шляхом ослаблення глюконеогенезу, а поси-
лення експресії PFKFB під впливом інсуліну
і надекспресія PFKFB у разі введення до ор-
ганізму відповідних аденовірусних генетич-
них конструкцій зумовлює збільшення рівня
фруктозо-2,6-бісфосфату та істотно зменшує
рівень глюкози у крові через інгібування ін-
тенсивності її синтезу. Це, у свою чергу, від-
новлює чутливість клітин до інсуліну [6, 18,
37–39]. Крім того, збільшення експресії PFKFB
і вмісту фруктозо-2,6-бісфосфату має важливе
значення для посилення метаболізму глюкози
шляхом активації глюкокінази та фосфори-
лювання глюкози як через безпосередню дію
фруктозо-2,6-бісфосфату на глюкокіназу, так і
взаємодію 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-
2,6-бісфосфатази із глюкокіназою [40–42].
PFKFB-2 посилено експресується в сер-
ці, легенях, нирках та мозку [14]. Активність
ензиму контролюється гормонами шляхом
фосфорилювання регуляторних сайтів ензи-
му – Ser29, Ser 466, Thr475 та Ser483 [1]. Відомо
також, що експресія PFKFB-2 є надзвичайно
важливою для нормального функціонування
серця, оскільки підвищення синтезу ізофор-
ми PFKFB-2, дефіцитної за 6-фосфофрукто-
2-кіназою, спричинює гіпертрофію міокарда,
порушує функцію міоцитів та зменшує чут-
ливість клітин до дії інсуліну [43].
Метою роботи було дослідити експресію
мРНК PFKFB-2 у різних органах щурів з екс-
периментальним цукровим діабетом, а також
особливостей альтернативного сплайсингу
пре-мРНК PFKFB-2 у контрольних та діабе-
тичних тварин.
матеріали і методи
Досліди проводили на щурах-самцях лінії
Вістар з масою тіла 220 – 240 г. Цукровий діа-
бет індукували одноразовою ін’єкцією до оче-
ревини стрептозотоцину (55 мг/кг маси тіла)
як було описано раніше [44, 45]. Діабетичними
вважали тварин, якщо рівень глюкози у крові
перевищував 14 ммоль/л. Тканини контроль-
них і діабетичних щурів для виділення РНК
заморожували в рідкому азоті. Тотальну РНК
виділяли зі 100–200 мг тканини, екстрагуючи її
гуанідином, фенолом та хлороформом [46, 47].
Спочатку екстракцію тканин щурів здійсни-
ли 1 мл 4 M розчину ізотіоціанату гуаніди-
ну (Ultra Pure), який містив 50 мM трис-HCl
(pH 7,5), 25 мM EДTA та 100 мM 2-меркап-
тоетанолу. Потім до лізату тканин поступово
додавали 0,1 мл 2 M ацетату натрію (pH 4,0),
1 мл водонасиченого фенолу та 0,2 мл суміші
хлороформу з ізоаміловим спиртом (49 : 1), пе-
ремішуючи розчин після додавання кожного
з реагентів. РНК осаджували рівним об’ємом
ізопропанолу. Осад РНК промивали 75%-м
етанолом і розчиняли у воді, в якій не було
рибонуклеази.
Експресію мРНК PFKFB-2 досліджува-
ли методом полімеразної ланцюгової реакції
кДНК. Для цього тотальну РНК із різних ор-
ганів щурів використовували як матрицю для
синтезу кДНК із допомогою оліго(dT)-прай-
мера та SuperScript II Reverse Transcriptase
(Invitrogen, СШA) згідно з рекомендацією
виробника. Для зворотної транскрипції бра-
Н. М. ЛИПОВА, Д. O. МІНЧЕНКО, О. О. РАТУШНА та ін.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 192
ли 0,4 мкг тотальної РНК, а для ампліфіка-
ції кДНК PFKFB-2 – 1 мкл продукту реакції
зворотної транскрипції, що було рівнознач-
ним 20 нг тотальної РНК, використаної в
реакції, і HotStarTaq Master Mix Kit (QIAGEN,
Німеччина). Ампліфікацію проводили в
апараті «MasterCycler Personal» (Eppendorf,
Німеччина), застосовуючи один прямий прай-
мер – 5′-TGССTCCTGAAGAACTACCATG-3′
(1) – та два зворотних для двох типів мРНК
PFKFB-2: 3′-CTGACTGCATCCTTAGCTG-5′
(2) і 3′-CAAGATGGCAAGTTGGGTC-5′ (3).
Ці олігонуклеотиди відповідають нуклео-
тидним послідовностям 171–192 (1) та 1907–
1925 (2) опублікованої кДНК PFKFB-2 щура
(GenBank-номер NM_080477) та 1617–1635 (3)
варіанта кДНК PFKFB-2 щура (GenBank-но-
мер GQ422137). Праймери отримано від ком-
панії Sigma (США).
Для проведення кількісної полімеразної
ланцюгової реакції в реальному часі кДНК
PFKFB-2 використовували інші пари прай-
мерів: 5′-CTGACTGCATCCTTAGCTG-3′ (4) і
3′-CAAGATGGCAAGTTGGGTC-5′ (5), які від-
повідали нуклеотидним послідовностям 1503–
1522 (4) та 1563–1582 (5) опублікованої кДНК
PFKFB-2 щура (GenBank-номер NM_080477),
а також 5′-CCGTGCCCTGGATATGCAAG-3′
(6) і 3′-CAAGTGTTAATCTGAACATG-5′ (7),
які відповідали нуклеотидним послідовностям
1388–1407 (6) та 1536–1555 (7) варіанта кДНК
PFKFB-2 щура (GenBank-номер GQ422137) [28].
Вивчаючи експресію альтернативних
сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2, засто-
совували специфічні для кожного сплайс-
варіанта пари праймерів. Для альтерна-
тивного сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2 з
делецією 8-го екзона (-125; GenBank-номер
GQ422137) були використані такі праймери: 5′-
GCTGCCAATATTCTGGGACC-3′ (прямий) та
3′-GAACAGGAGATCCAGGACCT-5′ (зворот-
ний). Прямий праймер починається з 521-го
нуклеотидного залишку (5′-позиція), а зворот-
ний – із 774 нуклеотидного залишку (3′-пози-
ція).
Для ампліфікації альтернативного
сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2 із вставкою
між 3–4-м екзонами (+55; GenBank-номер
GQ422138) використовували прямий прай-
мер 1, описаний вище; зворотний праймер (3′-
GTCTGTTAGGCCAAGAAGTC-5′) починався
із 239 нуклеотидного залишку (5′-позиція).
Для вивчення експресії альтернативного
сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2 з делецією
8-го екзона (-125) та вставкою між 9–10-м екзо-
нами (+20) були використані такі праймери: 5′-
GATCCTGATGTCATTGCTGC-3′ (прямий) та
зворотний 3′-CCCAGTTTGCTCAGGCTCTGA-
5′, що відповідають послідовностям нуклео-
тидів 506–525 та 758–779 опублікованого
варіанта кДНК PFKFB-2 щура (GenBank-но-
мер GQ438759).
Для ампліфікації альтернативного сплайс-
варіанта мРНК PFKFB-2 з делецією 8-го екзо-
на (-125) та двома вставками між 1–2-м (+10)
та 13–14-м екзонами (+66) були використані
праймери для ділянки із вставкою між 1–2-м
екзонами: 5′-ATGCTGTGAGTTCTGCATGG-3′
(прямий) та 3′-GAAGCAGTCAAGTCCTATAA-
5′ (зворотний). Прямий праймер починається
із 109 нуклеотидного залишку (5′-позиція), а
зворотний – із 276 нуклеотидного залишку
(3′-позиція; GenBank-номер GQ438758).
Кількісну полімеразну ланцюгову реак-
цію проводили на апараті Stratagene Mx 3000P
cycler, застосовуючи SYBRGreen Mix. Одер-
жані результати аналізували, використовуючи
спеціальну комп’ютерну програму «Differential
expression calculator», а статистичний аналіз
здійснювали у програмі Excel.
Експресія мРНК β-актину слугувала
додатковим контролем кількості аналізова-
ної РНК. Для ампліфікації кДНК β-актину
застосовували такі праймери: прямий
5′-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3′ та зворот-
ний 5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTT-3′ [48].
Продукти ампліфікації аналізували елек-
трофоретично в 1–2%-му агарозному гелі,
забарвлюючи ДНК бромистим етидієм. Гелі
аналізували в системі Quantity One BioRad
System (США).
Одержані продукти ампліфікації клону-
вали у векторі pCRII-TOPO (Invitrogen). Кло-
ни аналізували, застосовуючи електрофорез в
агарозному гелі, а фрагменти кДНК PFKFB-2
секвенували для ідентифікації сплайс-варіан-
тів мРНК PFKFB-2. Ензиматичну реакцію
подовження ланцюга для секвенування ДНК
проводили з допомогою спеціального набо-
ру Dye terminator cycle sequencing kit (Applied
Biosystems Inc.) та ДНК-термоциклера згідно
з рекомендаціями виробника. Продукти реак-
ції секвенування аналізували автоматично в
ДНК-секвенаторі (Applied Biosystems Inc.).
результати та обговорення
Експресію PFKFB-2 досліджували в нир-
ках та легенях щурів методом полімеразної
ланцюгової реакції кДНК, одержаних шляхом
зворотної транскрипції мРНК. Для аналізу
відібрали дві ізоформи мРНК PFKFB-2 – ос-
новну та додаткову [17], а також, відповідно,
ЕКСПЕРИМЕНТАЛьНІ РОБОТИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 93
дві пари праймерів із нуклеотидних послідов-
ностей цих ізоформ мРНК. Основну ізоформу
ампліфікували із праймерами 1 та 2, а додат-
кову – із праймерами 1 та 3. Результати про-
ведених нами досліджень наведено на рис. 1.
Установлено, що базальний рівень експресії
ізоформи мРНК PFKFB-2, яка синтезується за
участю праймерів 1 та 2 і відповідає основній
ізоформі мРНК PFKFB-2, в нирках і легенях
щурів неоднаковий (в легенях значно вищий;
рис. 1, А). Базальний рівень експресії додатко-
вої ізоформи мРНК PFKFB-2 у легенях також
істотно більший (рис. 1, Б).
Із даних кількісної полімеразної ланцюго-
вої реакції, наведених на рис. 2, випливає, що
в нирках щурів з експериментальним цукро-
вим діабетом порівняно з контрольними тва-
ринами спостерігається значне зниження екс-
пресії основної (на 45%) і додаткової (на 53%)
ізоформ мРНК PFKFB-2. Для з’ясування цьо-
го були використані інші пари праймерів: для
основної ізоформи мРНК PFKFB-2 – 4,5, для
додаткової – 6,7. Водночас, експресія основної
ізоформи мРНК PFKFB-2 в легенях щурів з
експериментальним цукровим діабетом, хоча і
знижується порівняно з контрольними твари-
нами, але значно менше (на 19%), а додатко-
вої – лише на 13% (рис. 2).
Дані, наведені на рис. 1, Б, також свід-
чать, що додаткова ізоформа мРНК PFKFB-
2 нирок, незважаючи на її менш вираже-
ну експресію, виявляється негомогенною. У
зв’язку з цим, ми провели детальний аналіз
продуктів ампліфікації шляхом їхнього кло-
нування та секвенування. Було виділено ще
чотири нові альтернативні сплайс-варіанти
мРНК PFKFB-2 з С-кінцем, ідентичним до-
датковій ізоформі мРНК PFKFB-2, схематич-
не зображення яких відображено на рис. 3.
Один із цих альтернативних сплайс-варіантів
(GenBank-номер GQ422138) порівняно з додат-
ковою ізоформою мРНК PFKFB-2 (GenBank-
номер АВ040530) має вставку між 3–4-м екзо-
нами (55 нуклеотидних залишків), що вносить
позачерговий стоп-кодон до кодувальної пос-
лідовності. У передбачуваному протеїновому
продукті зазначеної ізоформи відсутні два ка-
талітичні домени, а також N-кінцева послідов-
ність 6-фосфофрукто-2-кінази, відповідальної
за формування гомодимеру, через що йому
притаманна лише фруктозо-2,6-бісфосфатазна
активність.
Другому альтернативному сплайс-варіан-
ту мРНК PFKFB-2 (GenBank-номер GQ422137)
притаманна делеція 8-го екзона (125 нуклео-
тидних залишків), який кодує синтез каталі-
тичних доменів E та F. Делеція 8-го екзона зу-
мовлює зміну рамки зчитування і передчасне
виникнення стоп-кодону під час трансляції
зазначеного сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2.
Цей сплайс-варіант мРНК PFKFB-2, ймовірно,
кодує синтез двох протеїнів: фруктозо-2,6-біс-
фосфатази та вкороченої 6-фосфофрукто-2-кі-
нази без двох каталітичних доменів (E та F) на
С-кінці, у яких відсутня кіназна активність.
Третій альтернативний сплайс-варіант
мРНК PFKFB-2 (GenBank-номер GQ438759)
також має делецію 8-го екзона (125 нуклео-
тидних залишків) та ще вставку між 9–10-м
екзонами (20 нуклеотидних залишків), яка
змінює рамку зчитування і спричинює перед-
часне утворення нового стоп-кодону. Через
це варіант мРНК PFKFB-2 не здатен коду-
вати ані функціонально активної 6-фосфо-
фрукто-2-кінази, ані функціонально актив-
ної фруктозо-2,6-бісфосфатази, оскільки у
Рис. 1. Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 у нирках та леге-
нях контрольних (К) щурів і тварин із стрептозотоциновим діабетом (Д). А – Ампліфікацію кДНК
PFKFB-2 проводили за допомогою прямого (1) та зворотного (2) праймерів; Б – ампліфікацію про-
водили за допомогою прямого (1) та зворотного (3) праймерів. Продукти ампліфікації розділяли елек-
трофорезом у 1%-му агарозному гелі, забарвлювали бромистим етидієм і фотографували, а кількість
РНК оцінювали за експресією мРНК β-актину
β-актин
К Д К Д
Нирки Легені
PFKFB-2 (1,3)
Б
β-актин
Нирки Легені
К Д К Д
PFKFB-2 (1,2)
А
Н. М. ЛИПОВА, Д. O. МІНЧЕНКО, О. О. РАТУШНА та ін.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 194
фруктозо-2,6-бісфосфатази також відсутні всі
необхідні для вияву ензиматичної активності
каталітичні домени, зокрема домен G. Зна-
чення зазначеного альтернативного сплайс-
варіанта мРНК PFKFB-2, ймовірно, полягає у
виключенні функції утворених транскриптів
PFKFB-2. Вірогідно також, що такий сплайс-
варіант мРНК PFKFB-2 виникає внаслідок
порушення альтернативного сплайсингу пре-
мРНК PFKFB-2.
У четвертого альтернативного сплайс-
варіанта мРНК PFKFB-2 (GenBank-номер
GQ438758) також виявлено делецію 8-го екзона
(125 нуклеотидних залишків) і дві вставки між
1–2-м (10 нуклеотидних залишків) та 13–14-м
екзонами (66 нуклеотидних залишків). Перша
вставка змінює рамку зчитування і зумовлює
передчасну появу стоп-кодону. Друга вставка
теоретично не здатна змінити рамку зчитуван-
ня, оскільки має 66 нуклеотидних залишків,
однак вона містить стоп-кодон у своїй послі-
довності. Тому цей варіант мРНК PFKFB-2 не
спроможний кодувати функціонально активну
6-фосфофрукто-2-кіназу, оскільки в передба-
чуваному протеїновому продукті немає всіх
необхідних для вияву ензиматичної актив-
ності каталітичних доменів, а також через від-
сутність N-кінця для утворення гомодимеру
PFKFB-2. Водночас, незважаючи на наявність
другої вставки, цей альтернативний сплайс-
Рис. 2. Аналіз експресії мРНК PFKFB-2 у печінці та легенях контрольних щурів (К) та із стрепто-
зотоциновим діабетом (Д) за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції і двох пар прай-
мерів: 4,5 та 6,7 відповідно. Величину експресії мРНК PFKFB-2 нормалізували за експресією β-актину
(n = 3). * Дані порівняно з контрлоем вірогідні, Р < 0,05
Ек
сп
ре
сі
я
м
РН
К
P
FK
FB
-2
,
%
в
ід
к
он
тр
ол
ю
К Д К Д К Д К Д
Нирки Легені
4,5 6,7 4,5 6,7
120
100
80
60
40
20
0
Рис. 3. Схематичне зображення екзонної організації додаткової ізоформи мРНК PFKFB-2 (АВ040530)
та її нових альтернативних сплайс-варіантів, ідентифікаційні GenBank-номери яких (GQ422137,
GQ422138, GQ438758 та GQ438759) наведено зліва. На рис. показано також делецію 8-го екзона (–)
та вставки між 1–2-м, 3–4-м, 9–10-м та 14–15-м екзонами, розмір яких становить 10, 55, 20 та
66 нуклеотидних залишків відповідно, які на рисунку позначені як +10, +55, +20 та +66
Номер екзонів: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
АВ040530
GQ422138
GQ422137
GQ438759
GQ438758
ЕКСПЕРИМЕНТАЛьНІ РОБОТИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 95
варіант мРНК PFKFB-2 спроможний кодувати
синтез фруктозо-2,6-бісфосфатази як окремого
ензиму з усіма каталітичними доменами, необ-
хідними для вияву ензиматичної активності,
але із вкороченим С-кінцем порівняно з вище-
описаними варіантами.
На рис. 4 наведено результати досліджень
щодо експресії цих нових альтернативних
сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 у легенях
щурів з експериментальним цукровим діабе-
том. Установлено, що рівень експресії альтер-
нативного сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2
із вставкою між 3–4-м екзонами (55 нуклео-
тидних залишків) посилюється (на 15%) у ле-
генях діабетичних щурів порівняно з конт-
рольними. Рівень експресії альтернативного
сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2 з делецією
8-го екзона також збільшується (на 21%) у ле-
генях щурів з експериментальним цукровим
діабетом. Водночас, експресія альтернативно-
го сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2 з делецією
8-го екзона і вставкою між 9–10-м екзонами
в легенях діабетичних щурів істотно не змі-
нюється, у той час як 4-го сплайс-варіанта із
двома вставками підвищується на 29% порів-
няно з контролем (рис. 4).
Вираженіші зміни в експресії нових аль-
тернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2
були виявлені в нирках щурів з експеримен-
тальним цукровим діабетом (рис. 5). Уста-
новлено, що рівень експресії альтернативного
сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2 із вставкою
між 3–4-м екзонами (+55 нуклеотидних за-
лишків), як і сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2
з делецією 8-го екзона, в нирках діабетичних
щурів посилюється на 34 та 37% відповід-
но порівняно з контрольними тваринами.
Установлено, що експресія альтернативного
сплайс-варіанта мРНК PFKFB-2 з делецією
8-го екзона і вставкою між 9–10-м екзонами
порівняно з контролем в нирках діабетич-
них тварин істотно не змінюється. Водночас,
експресія альтернативного сплайс-варіанта
з делецією 8-го екзона та із двома вставками
(+10 та +66) – значно посилюється (на 48%) у
щурів з експериментальним цукровим діабе-
том (рис. 5).
Результати цих досліджень переконливо
свідчать про виражені зміни в експресії гена
надзвичайно важливого регуляторного біфунк-
ціонального ензиму PFKFB-2 у щурів з екс-
периментальним цукровим діабетом у таких
життєво важливих органах, як нирки та легені.
Зниження експресії мРНК PFKFB-2 у нирках і
легенях щурів з експериментальним цукровим
діабетом може свідчити про послаблення в цих
органах гліколізу, опосередкованого PFKFB-2.
Одержані нами дані стосовно експресії но-
вих альтернативних сплайс-варіантів мРНК
PFKFB-2 показують, що при діабеті значно
Рис. 4. Експресія альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 із вставкою між 3–4-м ек-
зонами (+55) та з делецією 8-го екзона (-125), а також із делецією 8-го екзона та вставкою між
9–10-м екзонами (-125+20) або із двома вставками у легенях контрольних щурів (К) та тварин з екс-
периментальним цукровим діабетом (Д) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі
та специфічних праймерів. Експресію мРНК PFKFB-2 нормалізували за експресією β-актину (n = 3)
Ек
сп
ре
сі
я
сп
ла
йс
-в
ар
іа
нт
ів
м
РН
К
PF
K
FB
-2
, %
в
ід
к
он
тр
ол
ю
К Д К Д К Д К Д
+55
120
100
80
60
40
20
0
140
160
-125 +20 -125 +10 +66-125
Н. М. ЛИПОВА, Д. O. МІНЧЕНКО, О. О. РАТУШНА та ін.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 196
порушується альтернативний сплайсинг пре-
мРНК PFKFB-2, внаслідок чого утворюються
ізоформи, що позбавлені 6-фосфофрукто-2-кі-
назної активності.
Результати проведених нами досліджень
переконливо свідчать про істотні порушен-
ня альтернативного сплайсингу пре-мРНК
PFKFB-2 у тварин із цукровим діабетом, що
зумовлює утворення альтернативних сплайс-
варіантів мРНК PFKFB-2, які здатні кодувати
один монофункціональний ізоензим (сплайс-
варіант із вставкою між 3–4-м екзонами) з ак-
тивністю фруктозо-2,6-бісфосфатази або два
поліпептиди, один із яких є фруктозо-2,6-біс-
фосфатазою – альтернативний сплайс-варіант
із делецією 8-го екзона – та сплайс-варіант із
делецією 8-го екзона та двома вставками (+10
та +66). Утворення фруктозо-2,6-бісфосфата-
зи спричинює зниження гліколізу і посилення
глюконеогенезу [1, 7, 12, 38]. У другому полі-
пептиді відсутні необхідні для вияву ензима-
тичної активності каталітичні домени 6-фос-
фофрукто-2-кінази (сплайс-варіант із делецією
8-го екзона, а також сплайс-варіант із делецією
8-го екзона і вставкою між 9–10-м екзонами).
Разом з тим, цьому поліпептиду притаман-
на N-кінцева частина. Можна припустити,
що він утворює димер із біфункціональним
мономером ензиму, який не здатен виявляти
6-фосфофрукто-2-кіназну активність через
відсутність у одного з компонентів двох ка-
талітичних доменів 6-фосфофрукто-2-кінази,
інгібуючи при цьому утворення фруктозо-2,6-
бісфосфату та інтенсивність гліколізу.
Отже, при експериментальному цук-
ровому діабеті в нирках і легенях щурів не
лише знижується експресія мРНК PFKFB-2,
а також порушується альтернативний сплай-
синг пре-мРНК PFKFB-2 у напрямі синте-
зу монофункціонального ензиму фруктозо-
2,6-бісфосфатази та вкорочених фрагментів
6-фосфофрукто-2-кінази за відсутності двох
каталітичних доменів. Фруктозо-2,6-бісфос-
фатаза і N-кінцеві частини 6-фосфофрукто-
2-кінази, які синтезуються альтернативними
сплайс-варіантами мРНК PFKFB-2 і які здатні
брати участь у формуванні та функціонуван-
ні гомодимерної форми ензиму, заслуговують
на подальше вивчення в аспекті створення за-
собів пригнічення гліколізу, що важливо для
інгібування злоякісного росту.
Проведені нами дослідження є важливим
внеском до молекулярної медицини, оскільки
висвітлюють молекулярні основи порушення
регуляції обмінних процесів при цукровому
діабеті і є підґрунттям для розроблення прин-
ципово нових молекулярних підходів до їхньої
діагностики, профілактики та лікування за-
хворювання.
Аналіз одержаних результатів свідчить:
1. У щурів з експериментальним цукровим
діабетом знижується експресія двох ізоформ
мРНК PFKFB-2 як у нирках, так і в легенях.
Рис. 5. Експресія альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 із вставкою між 3–4-м екзонами
(+55) та з делецією 8-го екзона (-125), а також із делецією 8-го екзона та вставкою між 9–10-м
екзонами (-125+20) або із двома вставками в нирках контрольних щурів (К) і тварин з експеримен-
тальним цукровим діабетом (Д) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі та
специфічних праймерів. Експресію мРНК PFKFB-2 нормалізували за експресією β-актину (n = 3)
Ек
сп
ре
сі
я
сп
ла
йс
-в
ар
іа
нт
ів
м
РН
К
PF
K
FB
-2
, %
в
ід
к
он
тр
ол
ю
К Д К Д К Д К Д
+55
120
100
80
60
40
20
0
140
160
-125 +20 -125 +10 +66-125
180
ЕКСПЕРИМЕНТАЛьНІ РОБОТИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 97
2. Ідентифіковано чотири нові альтерна-
тивні сплайс-варіанти мРНК PFKFB-2 щура,
що мають різні вставки та делеції у 6-фосфо-
фрукто-2-кіназній та в фруктозо-2,6-бісфос-
фатазній частинах молекули PFKFB-2.
3. Установлено, що три із цих альтерна-
тивних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 ко-
дують синтез лише фруктозо-2,6-бісфосфа-
тази, оскільки в них виявлено делецію двох
каталітичних доменів (E та F) 6-фосфофрук-
то-2-кінази, в якій передчасно виникає стоп-
кодон у мРНК.
4. Показано, що виявлені нами альтер-
нативні сплайс-варіанти мРНК PFKFB-2 екс-
пресуються як у нирках, так і в легенях щурів,
причому порівняно з контрольними щурами
експресія трьох із них посилюється у тварин з
експериментальним цукровим діабетом.
5. Результати цих досліджень свідчать про
істотні порушення експресії мРНК PFKFB-2 на
рівні альтернативного сплайсингу пре-мРНК
PFKFB-2 у нирках та легенях щурів з експери-
ментальним цукровим діабетом.
експрессия мрнк
6-фосфофрукто-2-киназы/
фруктозо-2,6-бисфосфатазы-2
и ее альтернативных
сплайс-вариантов у крыс
с экспериментальным
сахарным диабетом
Н. М. Липова1, Д. А. Минченко1,
О. О. Ратушная1, И. В. Божко1,
K. Tсучигарa2, Г. Эсуми2, А. Г. Минченко1,2
1Институт биохимии им. А. В. Палладина
НАН Украины, Киев;
2Научно-исследовательский центр инновационной
онкологии Восточного госпиталя Национального
онкологического центра Японии;
e-mail: ominchenko@yahoo.com
Проведено изучение экспрессии двух изо-
форм мРНК 6-фосфофрукто-2-киназы/фрук-
тозо-2,6-бисфосфатазы-2 (PFKFB-2) с различ-
ной С-концевой частью в почках и легких крыс
с экспериментальным сахарным диабетом. По-
казано, что при сахарном диабете отмечается
снижение экспрессии обоих изоформ мРНК
PFKFB-2 в легких и в почках крыс. Более того,
при анализе клонированных кДНК PFKFB-2
из почек диабетических крыс выделено четыре
новых альтернативных сплайс-варианта мРНК
PFKFB-2, которые имеют различные вставки
и делеции в 6-фосфофрукто-2-киназной и в
фруктозо-2,6-бисфосфатазной частях моле-
кулы PFKFB-2. Три из этих альтернативных
сплайс-вариантов мРНК PFKFB-2 могут ко-
дировать синтез только фруктозо-2,6-бисфос-
фатазы, так как имеют делецию двух катали-
тических доменов 6-фосфофрукто-2-киназы
(Е та F). Показано, что выявленные альтерна-
тивные сплайс-варианты мРНК PFKFB-2 экс-
прессируются в почках и в легких крыс. При
этом по сравнению с контрольными крысами
изменяется экспрессия у крыс с эксперимен-
тальным сахарным диабетом. Результаты дан-
ной работы свидетельствуют о существенном
нарушении синтеза мРНК PFKFB-2 на уров-
не альтернативного сплайсинга пре-мРНК
PFKFB-2 в почках и легких при сахарном
диабете, что может быть, в частности, дока-
зательством сложности механизмов регуляции
метаболизма глюкозы и гликолиза и одним из
многочисленных факторов их нарушения при
этом заболевании.
К л ю ч е в ы е с л о в а: PFKFB-2 мРНК,
альтернативный сплайсинг, сахарный диабет,
легкие, почки, крысы.
expression of 6-phosphofructo-
2-kinase/fructose-2,6-
bisphosphatase-2 pfkfb-2
mrna and its alternative
splice variants in rats with
experimental diabetes mellitus
N. M. Lypova1, D. O. Minchenko1,
O. O. Ratushna1, I. V. Bozhko1,
K. Tsuchihara2, H. Esumi2,
O. H. Minchenko1,2
1Palladin Institute of Biochemistry, National
Academy of Science of Ukraine, Kyiv;
2Research Center for Innovative Oncology, National
Cancer Center East Hospital, Kashiwa, Japan;
e-mail: ominchenko@yahoo.com
S u m m a r y
We studied the expression mRNA of 6-phos-
phofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-
2 (PFKFB-2) in the rat lung and kidney in ex-
perimental diabetes mellitus. For investigation we
select two isoforms of PFKFB-2 with different
C-terminus. The level of the expression of both
PFKFB-2 mRNA isoforms is decreased in the
kidney and lung in rats with experimental diabetes
mellitus respect to the control animals. Moreover,
four new alternative splice variants of PFKFB-2
mRNA were identified in the rat kidney. These
splice variants of PFKFB-2 mRNA have different
inserts and/or deletions in 6-phosphofructo-2-ki-
Н. М. ЛИПОВА, Д. O. МІНЧЕНКО, О. О. РАТУШНА та ін.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 198
nase as well as in fructose-2,6-bisphosphatase part
of PFKFB-2. Three alternative splice variants
cannot encode active 6-phosphofructo-2-kinase as
a result of deletion of two catalytic domains (E
and F). They encode fructose-2,6-bisphosphatase.
It was shown that these alternative splice variants
express in the kidney and lung and that this ex-
pression changes in rats with experimental diabetes
mellitus with respect to the control animals. The
results of this investigation clearly demonstrated
that diabetes mellitus significantly affects the ex-
pression and alternative splicing of PFKFB-2 in
the kidney and lungs and showed the complexity
of regulatory mechanisms of glucose metabolism
in this disease.
K e y w o r d s: PFKFB-2, mRNA, alternative
splicing, diabetes mellitus, lung, kidney, rats.
1. Rider M. H., Bertrand L., Vertommen D. et al. //
Biochem. J. – 2004. – 381, Pt. 3. – P. 561–579.
2. Bando H., Atsumi T., Nishio T. et al. // Clin.
Cancer Res. – 2005. – 11, N 16. – P. 5784–
5792.
3. Chesney J. // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab.
Care. – 2006. – 9, N 5. – P. 535–539.
4. Atsumi T., Nishio T., Metz C. et al. // Diabetes. –
2005. – 54, N 12. – P. 3349–3357.
5. Wu C., Khan S. A., Peng L. J. et al. // Am. J.
Physiol. Endocrinol. Metab. – 2006. – 291,
N 3. – P. E536–E543.
6. Wu C., Okar D. A., Newgard C. B., Lange A. J.
// Ibid. – 2002. – 282, N 1. – P. E38–E45.
7. Denko N. C. // Nat. Rev. Cancer. – 2008. –
8. – P. 705–713.
8. Smith W. E., Langer S., Wu C. et al. // Mol.
Endocrinol. – 2007. – 21, N 6. – P. 1478–
1487.
9. Okar D. A., Manzano A., Navarro-Sabate A.
et al. // Trends Biochem. Sci. – 2001. – 26,
N 1. – P. 30–35.
10. Okar D. A., Lange A. J. // Biofactors. – 1999. –
10, N 1. – P. 1–14.
11. Kawaguchi T., Veech R. L., Uyeda K. // J. Biol.
Chem. – 2001. – 276, N 30. – P. 28554–
28561.
12. Wu C., Khan S. A., Peng L.-J., Lange A. J. //
Adv. Enzyme Regul. – 2006. – 46. – P. 72–88.
13. Minchenko O., Opentanova I., Caro J. // FEBS
Lett. – 2003. – 554, N 3. – P. 264–270.
14. Minchenko A. G., Leshchinsky I., Opentanova I.
et al. // J. Biol. Chem. – 2002. – 277, N 8. –
P. 6183–6187.
15. Minchenko O. H., Opentanova I. L., Minchen-
ko D. O. et al. // FEBS Lett. – 2004. – 576,
N 1. – P. 14–20.
16. Kessler R., Eschrich K. // Brain Res. Mol. Brain
Res. – 2001. – 87, N 2. – P. 190–195.
17. Watanabe F., Furuya E. // Biochem. Biophys.
Res. Commun. – 2001. – 282, N 3. – P. 803–
810.
18. Watanabe F., Sakai A., Furuya E. // J. Neuro-
chem. – 1997. – 69, N 1. – P. 1–9.
19. Watanabe F., Furuya E. // FEBS Lett. –
1999. – 458, N 1. – P. 304–308.
20. Minchenko D. O., Tsuchihara K., Komisaren-
ko S. V. et al. // Sci. Bull. Nation. Bohomoletz
Med. Univer. – 2008. – № 1. – P. 22–31.
21. Minchenko D. O., Mykhalchenko V. G., Tsuchiha-
ra K. et al. // Укр. біохім. журн. – 2008. – 80,
№ 4. – С. 66–73.
22. Мінченко Д. О., Ковтун О. О., Мінченко О. Г.,
Биць Ю. В. // Наук. вісн. Нац. мед. ун-ту
ім. О. О. Богомольця. – 2006. – № 4. –
C. 72–78.
23. Lu H., Forbes R. A., Verma A. // J. Biol. Chem. –
2002. – 277, N 26. – P. 23111–23115.
24. Donti R., Ye G., Wu C., Lange A. J. // Ibid. –
2004. – 279, N 46. – P. 48085–48090.
25. Wenger R. H. // FASEB J. – 2002. – 16,
N 10. – P. 1151–1162.
26. Clem B., Telang S., Clem A. et al. // Mol.
Cancer Ther. – 2008. – 7, N 1. – P. 110–120.
27. Бобарикіна А. Ю., Мінченко Д. О., Опентано-
ва І. Л. та ін. // Укр. біохім. журн. – 2006. –
78, № 2. – С. 49–59.
28. Minchenko O. H., Ochiai A., Opentanova I. L.
et al. // Biochimie. – 2005. – 87, N 11. –
P. 1005–1010.
29. Minchenko O. H., Ogura T., Opentanova I. L.
et al. // Укр. біохім. журн. – 2005. – 77,
№ 6. – С. 46–50.
30. Bobarykina A. Y., Minchenko D. O., Opentano-
va I. L. et al. // Acta Biochim. Pol. – 2006. –
53, N 4. – P. 789–799.
31. Kessler R., Bleichert F., Warnke J. P., Eschrich K.
// J. Neurooncol. – 2008. – 86, N 3. – P. 257–
264.
32. Miralpeix M., Carballo E., Bartrons R. et al. //
Diabetologia. – 1992. – 35, N 3. – Р. 243–
248.
33. Inoue H., Kaku K., Matsutani A. et al. // Endocr.
J. – 1994. – 41, N 1. P. – 75–82.
34. Mykhalchenko V. G., Tsuchihara K., Minchen-
ko D. O. et al. // Biopolymers & Cell. –
2008. – 24, N 3. – P. 260–266.
35. Arden C., Hampson L. J., Huang G. C. et al. //
Biochem J. – 2008. – 411, N 1. – Р. 41–51.
36. Duran J., Navarro-Sabate A., Pujol A. et al. //
Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2008. –
365, N 2. – P. 291–297.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛьНІ РОБОТИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 99
37. Wu C., Okar D. A., Newgard C. B., Lange A. J.
// J. Clin. Invest. – 2001. – 107, N 1. – Р. 91–
98.
38. Wu C., Okar D. A., Kang J., Lange A. J. //
Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol.
Disord. – 2005. – 5, N 1. – P. 51–59.
39. Riera L., Manzano A., Navarro-Sabaté A. et al.
// Biochim. Biophys. Acta. – 2002. – 1589,
N 2. – Р. 89–92.
40. Massa L., Baltrusch S., Okar D. A. et al. //
Diabetes. – 2004. – 53, N 4. – Р. 1020–1029.
41. Wu C., Okar D. A., Stoeckman A. K. et al. //
Endocrinology. – 2004. – 145. – Р. 650–658.
42. Payne V. A., Arden A., Wu C. et al. // Diabetes. –
2005. – 54. – P. 1949 – 1957.
43. Donti R., Ye G., Wu C., Lange A. J. // J. Biol.
Chem. – 2004. – 279, N 46. – P. 48085–
48090.
44. Minchenko A. G., Stevens M. J., White L. et al.
// FASEB J. –2003. – 17. – Р. 1514–1516.
45. Obrosova I. G., Minchenko A. G., Frank R. N.
et al. // Іnt. J. Mol. Med. – 2004. – 14, N 1. –
Р. 55–64.
46. Minchenko A., Bauer T., Salceda S., Caro J. //
Lab. Invest. – 1994. – 71, N 3. – P. 374–379.
47. Minchenko A. G., Caro J. // Mol. Cell.
Biochem. – 2000. – 208. – P. 53–62.
48. Minchenko A. G., Armstead V. E., Opentano-
va I. L., Lefer A. M. // Endothelium. – 1999. –
6. – P. 303–314.
Отримано 08.12.2009
Н. М. ЛИПОВА, Д. O. МІНЧЕНКО, О. О. РАТУШНА та ін.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-19028 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0201-8470 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-01T08:12:04Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Липова, Н.М. Мінченко, Д.O. Ратушна, О.О. Божко, І.В. Тсучігара, K. Есумі, Г. Мінченко, O.Г. 2011-04-16T09:44:08Z 2011-04-16T09:44:08Z 2010 Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом / Н.М. Липова, Д.O. Мінченко, О.О. Ратушна, І.В. Божко, K. Тсучігара, Г. Eсумі, O.Г. Мінченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 90-99. — Бібліогр.: 48 назв. — укр. 0201-8470 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19028 577.112:616 Вивчали експресію двох ізоформ мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази‑2 (PFKFB-2) з неоднаковою С-кінцевою частиною молекули в нирках та легенях щурів при експериментальному цукровому діабеті. У щурів з експериментальним цукровим діабетом виявлено зниження експресії обох ізоформ мРНК PFKFB-2 в досліджуваних органах. Більше того, аналізуючи клоновані кДНК PFKFB-2 нирок діабетичних щурів, було виділено чотири нових альтернативних сплайс-варіанти мРНК PFKFB-2, що відрізняються вставками та делеціями у 6-фосфофрукто-2-кіназній та у фруктозо-2,6-бісфосфатазній частинах молекули PFKFB-2. Три із цих альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 є монофункціональними, оскільки не здатні кодувати синтез функціонально активної 6-фосфофрукто-2-кінази. Установлено, що експресія альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 як у нирках, так і в легенях щурів змінюється порівняно з контрольними тваринами. Результати роботи свідчать про суттєві порушення синтезу мРНК PFKFB-2 на рівні альтернативного сплайсингу пре-мРНК PFKFB-2 у нирках та легенях при цукровому діабеті, що може бути доказом складності механізмів регуляції метаболізму глюкози, зокрема гліколізу, а також одним із численних чинників їхнього порушення при цьому захворюванні. Проведено изучение экспрессии двух изоформ мРНК 6-фосфофрукто-2-киназы/фруктозо-2,6-бисфосфатазы-2 (PFKFB-2) с различной С-концевой частью в почках и легких крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Показано, что при сахарном диабете отмечается снижение экспрессии обоих изоформ мРНК PFKFB-2 в легких и в почках крыс. Более того, при анализе клонированных кДНК PFKFB-2 из почек диабетических крыс выделено четыре новых альтернативных сплайс-варианта мРНК PFKFB-2, которые имеют различные вставки и делеции в 6-фосфофрукто-2-киназной и в фруктозо-2,6-бисфосфатазной частях молекулы PFKFB-2. Три из этих альтернативных сплайс-вариантов мРНК PFKFB-2 могут кодировать синтез только фруктозо-2,6-бисфосфатазы, так как имеют делецию двух каталитических доменов 6-фосфофрукто-2-киназы (Е та F). Показано, что выявленные альтернативные сплайс-варианты мРНК PFKFB-2 экспрессируются в почках и в легких крыс. При этом по сравнению с контрольными крысами изменяется экспрессия у крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Результаты данной работы свидетельствуют о существенном нарушении синтеза мРНК PFKFB-2 на уровне альтернативного сплайсинга пре-мРНК PFKFB-2 в почках и легких при сахарном диабете, что может быть, в частности, доказательством сложности механизмов регуляции метаболизма глюкозы и гликолиза и одним из многочисленных факторов их нарушения при этом заболевании. We studied the expression mRNA of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-2 (PFKFB-2) in the rat lung and kidney in experimental diabetes mellitus. For investigation we select two isoforms of PFKFB-2 with different C-terminus. The level of the expression of both PFKFB-2 mRNA isoforms is decreased in the kidney and lung in rats with experimental diabetes mellitus respect to the control animals. Moreover, four new alternative splice variants of PFKFB-2 mRNA were identified in the rat kidney. These splice variants of PFKFB-2 mRNA have differentinserts and/or deletions in 6-phosphofructo-2-kinase as well as in fructose-2,6-bisphosphatase part of PFKFB-2. Three alternative splice variants cannot encode active 6-phosphofructo-2-kinase as a result of deletion of two catalytic domains (E and F). They encode fructose-2,6-bisphosphatase. It was shown that these alternative splice variants express in the kidney and lung and that this expression changes in rats with experimental diabetes mellitus with respect to the control animals. The results of this investigation clearly demonstrated that diabetes mellitus significantly affects the expression and alternative splicing of PFKFB-2 in the kidney and lungs and showed the complexityof regulatory mechanisms of glucose metabolism in this disease. uk Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Український біохімічний журнал Експериментальні роботи Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом Экспрессия мРНК 6‑фосфофрукто-2-киназы/фруктозо-2,6-бисфосфатазы‑2 и ее альтернативных сплайс-вариантов у крыс с экспериментальным сахарным диабетом Expression of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-2 PFKFB-2 mRNA and its alternative splice variants in rats with experimental diabetes mellitus Article published earlier |
| spellingShingle | Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом Липова, Н.М. Мінченко, Д.O. Ратушна, О.О. Божко, І.В. Тсучігара, K. Есумі, Г. Мінченко, O.Г. Експериментальні роботи |
| title | Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом |
| title_alt | Экспрессия мРНК 6‑фосфофрукто-2-киназы/фруктозо-2,6-бисфосфатазы‑2 и ее альтернативных сплайс-вариантов у крыс с экспериментальным сахарным диабетом Expression of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-2 PFKFB-2 mRNA and its alternative splice variants in rats with experimental diabetes mellitus |
| title_full | Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом |
| title_fullStr | Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом |
| title_full_unstemmed | Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом |
| title_short | Експресія мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом |
| title_sort | експресія мрнк 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-2 та її альтернативних сплайс-варіантів у щурів з експериментальним цукровим діабетом |
| topic | Експериментальні роботи |
| topic_facet | Експериментальні роботи |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19028 |
| work_keys_str_mv | AT lipovanm ekspresíâmrnk6fosfofrukto2kínazifruktozo26bísfosfatazi2taííalʹternativnihsplaisvaríantívuŝurívzeksperimentalʹnimcukrovimdíabetom AT mínčenkodo ekspresíâmrnk6fosfofrukto2kínazifruktozo26bísfosfatazi2taííalʹternativnihsplaisvaríantívuŝurívzeksperimentalʹnimcukrovimdíabetom AT ratušnaoo ekspresíâmrnk6fosfofrukto2kínazifruktozo26bísfosfatazi2taííalʹternativnihsplaisvaríantívuŝurívzeksperimentalʹnimcukrovimdíabetom AT božkoív ekspresíâmrnk6fosfofrukto2kínazifruktozo26bísfosfatazi2taííalʹternativnihsplaisvaríantívuŝurívzeksperimentalʹnimcukrovimdíabetom AT tsučígarak ekspresíâmrnk6fosfofrukto2kínazifruktozo26bísfosfatazi2taííalʹternativnihsplaisvaríantívuŝurívzeksperimentalʹnimcukrovimdíabetom AT esumíg ekspresíâmrnk6fosfofrukto2kínazifruktozo26bísfosfatazi2taííalʹternativnihsplaisvaríantívuŝurívzeksperimentalʹnimcukrovimdíabetom AT mínčenkoog ekspresíâmrnk6fosfofrukto2kínazifruktozo26bísfosfatazi2taííalʹternativnihsplaisvaríantívuŝurívzeksperimentalʹnimcukrovimdíabetom AT lipovanm ékspressiâmrnk6fosfofrukto2kinazyfruktozo26bisfosfatazy2ieealʹternativnyhsplaisvariantovukrysséksperimentalʹnymsaharnymdiabetom AT mínčenkodo ékspressiâmrnk6fosfofrukto2kinazyfruktozo26bisfosfatazy2ieealʹternativnyhsplaisvariantovukrysséksperimentalʹnymsaharnymdiabetom AT ratušnaoo ékspressiâmrnk6fosfofrukto2kinazyfruktozo26bisfosfatazy2ieealʹternativnyhsplaisvariantovukrysséksperimentalʹnymsaharnymdiabetom AT božkoív ékspressiâmrnk6fosfofrukto2kinazyfruktozo26bisfosfatazy2ieealʹternativnyhsplaisvariantovukrysséksperimentalʹnymsaharnymdiabetom AT tsučígarak ékspressiâmrnk6fosfofrukto2kinazyfruktozo26bisfosfatazy2ieealʹternativnyhsplaisvariantovukrysséksperimentalʹnymsaharnymdiabetom AT esumíg ékspressiâmrnk6fosfofrukto2kinazyfruktozo26bisfosfatazy2ieealʹternativnyhsplaisvariantovukrysséksperimentalʹnymsaharnymdiabetom AT mínčenkoog ékspressiâmrnk6fosfofrukto2kinazyfruktozo26bisfosfatazy2ieealʹternativnyhsplaisvariantovukrysséksperimentalʹnymsaharnymdiabetom AT lipovanm expressionof6phosphofructo2kinasefructose26bisphosphatase2pfkfb2mrnaanditsalternativesplicevariantsinratswithexperimentaldiabetesmellitus AT mínčenkodo expressionof6phosphofructo2kinasefructose26bisphosphatase2pfkfb2mrnaanditsalternativesplicevariantsinratswithexperimentaldiabetesmellitus AT ratušnaoo expressionof6phosphofructo2kinasefructose26bisphosphatase2pfkfb2mrnaanditsalternativesplicevariantsinratswithexperimentaldiabetesmellitus AT božkoív expressionof6phosphofructo2kinasefructose26bisphosphatase2pfkfb2mrnaanditsalternativesplicevariantsinratswithexperimentaldiabetesmellitus AT tsučígarak expressionof6phosphofructo2kinasefructose26bisphosphatase2pfkfb2mrnaanditsalternativesplicevariantsinratswithexperimentaldiabetesmellitus AT esumíg expressionof6phosphofructo2kinasefructose26bisphosphatase2pfkfb2mrnaanditsalternativesplicevariantsinratswithexperimentaldiabetesmellitus AT mínčenkoog expressionof6phosphofructo2kinasefructose26bisphosphatase2pfkfb2mrnaanditsalternativesplicevariantsinratswithexperimentaldiabetesmellitus |