Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293
Відомо, що транскрипційний фактор ZXDC, що належить до родини ZXD протеїнів, здатний утворювати транскрипційно активний комплекс із ZXDA фактором, що бере участь у регуляції експресії гена MHCII. У цій роботі проведено дослідження експресії великої групи генів в ембріональних клітинах нирки лінії HE...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Український біохімічний журнал |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19029 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 / О.В. Галкін, О.Г. Мінченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 100-107. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859733093230837760 |
|---|---|
| author | Галкін, О.В. Мінченко, О.Г. |
| author_facet | Галкін, О.В. Мінченко, О.Г. |
| citation_txt | Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 / О.В. Галкін, О.Г. Мінченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 100-107. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Український біохімічний журнал |
| description | Відомо, що транскрипційний фактор ZXDC, що належить до родини ZXD протеїнів, здатний утворювати транскрипційно активний комплекс із ZXDA фактором, що бере участь у регуляції експресії гена MHCII. У цій роботі проведено дослідження експресії великої групи генів в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293, що характеризувалися надекспресією транскрипційного фактора ZXDC, з метою ідентифікації генів, транскрипція яких контролюється цим транскрипційним фактором. Показано, що надекспресія транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 істотно змінює рівень експресії численної групи генів, що контролюють протікання різних процесів у клітинах, зокрема клітинний цикл, проліферацію та диференціацію клітин. Експресія більшості із них суттєво посилюється у клітинах нирки лінії HEK293 з надекспресією транскрипційного фактора ZXDC, зокрема генів EGR2, BDNF, CDKN1C та IL5Ra. Одержані результати свідчать про вагому роль транскрипційного фактора ZXDC у регуляції експресії великої групи генів, задіяних у регуляції важливих клітинних процесів.
Известно, что транскрипционный фактор ZXDC принадлежит к семейству ZXD-протеинов, способен образовывать транскрипционно активный комплекс с ZXDА и принимает участие в регуляции экспрессии гена MHCII. В работе проведено исследование экспрессии большой группы генов в эмбриональных клетках почки линии HEK293, которые имели надэкспрессию транскрипционного фактора ZXDC, с целью идентификации генов, транскрипция которых контролируется этим транскрипционным фактором. Показано, что надэкспрессия транскрипционного фактора ZXDC в эмбриональных клетках почки линии HEK293 существенно изменяет уровень экспрессии большой группы генов, которые контролируют протекание различных процессов в клетках, в частности, клеточный цикл, пролиферацию и дифференциацию клеток. Экспрессия большинства из них значительно усиливается в клетках почки линии HEK293 с надэкспрессией транскрипционного фактора ZXDC, в частности генов EGR2, BDNF, CDKN1C и IL5Ra. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли транскрипционного фактора ZXDC в регуляции экспрессии большой группы генов, которые вовлечены в контроль важных клеточных процессов.
The transcription factor ZXDC, a member of ZXD protein family, forms transcriptionally active complex with ZXDA and participates in the regulation of MHCII gene expression. In this work we investigate the expression of a large group of genes in kidney embry cell of line HEK293 with overexpression of transcription factor ZXDC for identification of genes, which transcription is controlled by this transcription factor. We have shown that overexpression of the transcription factor ZXDC in kidney embryo cell of HEK293 line significantly changes the level of expression of large group of genes,which control the behavior of different cell processes, in particular cell cycle, cell proliferation and differentiation. The expression of most of these genes is significantly increased in the kidney cell line HEK293 with overexpression of transcription factor ZXDC, in particular EGR2, BDNF, CDKN1C and IL5Ra genes. Our results clearly demonstrated that transcription factor ZXDC plays a significant role in the regulation of expression of a large group of genes, which control important cell processes.
|
| first_indexed | 2025-12-01T14:26:00Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1100
УДК 577.112:616
зміни в експресії генів, зумовлені
надекспресією транскрипційного фактора zxdc
в ембріональних клітинах нирки лінії hek293
О. В. Галкін1,2, О. Г. МінченкО3
1канзаський університет, медичний центр, СШа;
2київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна;
3інститут біохімії ім. О. В. Палладіна нан України, київ;
e-mail: ominchenko@yahoo.com
Відомо, що транскрипційний фактор ZXDC, що належить до родини ZXD протеїнів, здатний
утворювати транскрипційно активний комплекс із ZXDA фактором, що бере участь у регуляції екс-
пресії гена MHCII. У цій роботі проведено дослідження експресії великої групи генів в ембріональних
клітинах нирки лінії HEK293, що характеризувалися надекспресією транскрипційного фактора ZXDC,
з метою ідентифікації генів, транскрипція яких контролюється цим транскрипційним фактором.
Показано, що надекспресія транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії
HEK293 істотно змінює рівень експресії численної групи генів, що контролюють протікання різних
процесів у клітинах, зокрема клітинний цикл, проліферацію та диференціацію клітин. експресія біль-
шості із них суттєво посилюється у клітинах нирки лінії HEK293 з надекспресією транскрипційного
фактора ZXDC, зокрема генів EGR2, BDNF, CDKN1C та IL5Ra. Одержані результати свідчать про
вагому роль транскрипційного фактора ZXDC у регуляції експресії великої групи генів, задіяних у регу-
ляції важливих клітинних процесів.
к л ю ч о в і с л о в а: транскрипційний фактор ZXDC, клітини нирки HEK293, регуляція транс-
крипції.
Т ранскрипційний фактор ZXDC є «С»-
представником родини ZXD (zinc
finger X-linked duplicated) протеїнів.
ZXDC було вперше виявлено завдяки його
зв’язуванню з регуляторними послідовностями
генів у клітинах дріжджів як транс-активатор
CII-го класу (СІІТА). Потім була синтезована
та клонована кДНК транскрипційного фак-
тора ZXDC, а також визначена послідовність
нуклеотидних залишків мРНК і амінокислот-
на послідовність протеїну [1].
У геномі людини знайдено ще два гени,
високогомологічні до гена транскрипційного
фактора ZXDC, які було названо ZXDа і ZXDВ
та включено до складу родини ZXD-протеїнів.
Схематичне зображення доменної організації
протеїнів родини ZXD та рівня гомології ок-
ремих доменів у межах родини представлено
на рис. 1. У гені транскрипційного фактора
ZXDC є ділянка активації транскрипції та
домен, що відповідає за взаємодію з CIITA, а
також ділянка, до складу якої входить десять
цинкових пальців. У структурі гена транскрип-
ційного фактора ZXDC є десять екзонів. Вод-
ночас гени транскрипційних факторів ZXDА
та ZXDВ людини, хоч і є високогомологіч-
ними до ZXDC, мають у своєму складі лише
один екзон. Транскрипційні фактори ZXDA та
ZXDC здатні взаємодіяти між собою, утворю-
ючи функціонально активний димер шляхом
взаємодії ділянок цинкових пальців у складі
обох протеїнів.
Нещодавно було відкрито ZXDC2, ізо-
форму транскрипційного фактора ZXDC, яка
утворюється шляхом транскрипції гена ZXDC
з альтернативного промотора [2]. Вона здатна
зв’язуватися як із ZXDA, так і з ZXDC.
Раніше було показано, що транскрипцій-
ний фактор ZXDС бере участь у регуляції екс-
пресії генів головного комплексу гістосуміс-
ності MHCII (major histocompatibility complex
class II), утворюючи комплекс із ZXDА, який,
взаємодіючи із CIITA, зв’язується із промо-
торними ділянками генів MHCII та активує
їх транскрипцію [3]. Також було показано, що
ZXDC2, ізоформа транскрипційного фактора
ZXDС, здатна блокувати активацію транс-
крипції гена MHCII фактором ZXDC і вико-
нує, таким чином роль, негативного регулято-
ра [2].
Окрім регуляції експресії гена МнСII,
інші функції транскрипційного фактора ZXDC
екСПериМенТальні рОбОТи
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 101
залишалися невідомими. У цьому дослідженні
ми вивчали вплив надекспресії транскрип-
ційного фактора ZXDC на експресію багатьох
генів в ембріональних клітинах нирки лінії
HEK293 з метою ідентифікувати ті гени, що
прямо чи опосередковано регулюються цим
транскрипційним фактором. Встановлено,
що надекспресія транскрипційного фактора
ZXDC змінює рівень експресії багатьох генів,
що беруть участь у різноманітних клітинних
процесах.
матеріали і методи
Дослідження проведено на ембріональних
клітинах нирки лінії НЕК293, які вирощува-
ли при 37 °С в середовищі DMEM (Cellgro,
США), до якого додавали глютамін до кінце-
вої концентрації 4 мM та ембріональну сиро-
ватку телят до кінцевої концентрації 10%, в
атмосфері з 5% СО2. Трансфекцію клітин ре-
комбінантними ДНК проводили з допомогою
Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) в чаш-
ках Петрі діаметром 35 мм. Для трансфекції
ембріональних клітин нирки лінії НЕК293
було використано дві рекомбінантні ДНК.
Одна з них, pcDNA3.1-ZXDC, містить кДНК
транскрипційного фактора ZXDC в еукаріо-
тичному експресійному векторі pcDNA3.1, а
друга, pCMV-SPORT6-β-gal, що була контро-
лем ефективності трансфекції, містила кДНК
β-gal в еукаріотичному експресійному век-
торі pCMV-SPORT6. Для трансфекції клітин
лінії НЕК293 у стерильні пробірки вносили
по 500 мкл середовища OptiMEM (Gibco) та
по 4 мкг ДНК, змішували, потім додавали по
10 мкл Lipofectamine 2000, знову перемішува-
ли й інкубували протягом 20 хв при кімнатній
температурі. Далі цю суміш додавали до куль-
тури клітин, попередньо промитих середови-
щем OptiMEM, та інкубували протягом трьох
годин при t = 37 °С в атмосфері з 5% СО2,
після чого змінювали середовище на DMEM з
10% ембріональної сироватки телят. Трансфор-
мовані клітини вирощували протягом 48 год
при 37 °С в атмосфері з 5% СО2.
РНК із клітин лінії НЕК293 виділяли за
допомогою реагенту Trizol (Invitrogen). Для
цього клітини відмивали і додавали до них
1 мл реагенту Trizol. Лізат клітин переносили у
пробірки, в які вносили 200 мкл хлороформу,
перемішували та центрифугували (16 600 g,
+4 °С) протягом 15 хв. Відбирали 300 мкл
супернатанту і РНК осаджували 240 мкл ізо-
пропанолу протягом двох годин при –20 °С.
Одержані під час центрифугування осади РНК
промивали 600 мкл 70%-го етанолу та розчи-
няли у стерильній воді, вільній від нуклеаз
(BioRad Lab., США).
Виділені РНК додатково очищали за до-
помогою RNAasy Mini Kit (Qiagen, Німеччи-
на) відповідно до протоколу виробника. Якість
виділених РНК перевіряли на аналізаторі
«Agilent 2100 Bioanalyzer» (США). Одержані
препарати РНК були придатними для мікро-
арей-аналізу. В них не було виявлено домішок
ДНК, наявність яких в одержаних препаратах
РНК перевіряли шляхом ампліфікації фраг-
мента гена GAPDH з використанням «PCR
Master Mix» (Fermentas) та специфічних прай-
мерів до цього гена (Invitrogen).
Мікроарей-аналіз експресії генів та об-
роблення результатів проводили на системі
Affymetrix GeneChip з використанням мікро-
арея HG-U133 Plus 2.0 (виробництва Affymetrix)
згідно з протоколом виробника на базі Медич-
ного центру Канзаського університету.
Зворотну транскрипцію РНК проводи-
ли за допомогою набору «Quantiteсt Reverse
Transcription Kit» (Qiagen) відповідно до прото-
колу виробника. Для реакції зворотної транс-
крипції брали 1 мкг РНК та оліго-dТ прай-
мер. Далі проводили ампліфікацію одержаних
препаратів кДНК. Реакційна суміш містила
8,2 мкл води, вільної від нуклеаз, 1 мкл кДНК,
0,8 мкл 10 мкM суміші праймерів та 10 мкл
двократної суміші для полімеразної ланцюго-
вої реакції (Fermentas).
Для дослідження експресії мРНК
транскрипційного фактора ZXDС ви-
користовували такі праймери: 5′–
GCTGCCAATATTCTGGGACC–3′ (прямий) та
зворотний 3′–GAACAGGAGATCCAGGACCT–
5′. Прямий праймер починається з 521 нуклео-
тидного залишку (5′–позиція), а зворотний – з
774 нуклеотидного залишку (3′–позиція).
Послідовності праймерів, які було вико-
ристано для визначення рівнів експресії цільо-
вих генів:
рис. 1. Схематичне зображення доменної ор-
ганізації протеїнів родини ZXD. наведено рівень
гомології окремих доменів у межах родини у від-
сотках
О. В. Галкін, О. Г. МінченкО
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1102
GAPDH:
прямий
5′–ATCACTGCCACCCAGAAGACT–3′
та зворотний
3′–GATGACCTTGCCCACAGCCTT–5′;
IL5Ra:
прямий
5′–GCCAAGAATACAGCAAAGACACACT–3′
та зворотний
3′–TAACAAGCACCGCAAGCCAGTCA–5′;
GATA1:
прямий
5′–TCTACCCTGCCTCAACTGTGTGT–3′
та зворотний
3′–GCCGCTCTGTCTTCAAAGTCTC–5′;
BDNF:
прямий
5′–CGTGTGTGACAGTATTAGTGAGT–3′
та зворотний
3′–CTTGGTCTCGTAGAAGTATTGCT–5′;
CDKN1C:
прямий
5′–CCTGGCGTGGGCTCGGTGGA–3′
та зворотний
3′–GGTTGCTGCTACATGAACGGTCC–5′;
EGR2:
прямий
5′–GTAAGCCCTTTCCCTGCCCACTG–3′
та зворотний
3′–GGTCCCTCGCTGCCTCCACTG–3′.
Ампліфікацію проводили за таких умов:
94 °С, 15 с; 60 °С, 20 с; 72 °С, 20 с; 24–45
циклів. Для ампліфікації EGR2 гібридизацію
праймерів проводили при 70 °С.
Продукти реакції аналізували застосовую-
чи електрофорез у 2%-му агарозному гелі з
використанням буфера ТВЕ. Гелі фотографу-
вали, використовуючи систему Typhoon 9410
(GE Healthcare). Денситометричний аналіз
продуктів реакції було проведено за програ-
мою TotalLab.
Вестерн-блот аналіз. Надекспресію гена
ZXDC у контрольних пробах було додатко-
во підтверджено за допомогою вестерн-блот
аналізу. Для цього 1х106 клітин лінії HEK293,
з надекспресією ZXDC чи β-галактозидази, лі-
зували у буфері Леммлі, інкубували 3 хв при
94 °С і центрифугували при 16 600 g та +24 °С
протягом 3 хв. Одержані лізати розділяли
електрофорезом в 10%-му поліакриламідному
гелі з використанням трис-гліцинової системи
буферів. Продукти електрофорезу переносили
на мембрану PVDF шляхом електропереносу у
25 мM трис – 192 мM гліциновому буфері з
10% метанолу протягом 1 год при 100 В. Далі
мембрану інкубували у буфері TBS-T (10 мM
трис-HCl, pH 7,5, 150 мM NaCl, 0,05% Tween-
20) із додаванням 5% знежиреного молока
(BioRad), протягом 1 год при кімнатній тем-
пературі. Для вестерн-блот аналізу було вико-
ристано моноклональні первинні антитіла до
ZXDC (GenScript, США) та поліклональні до
GAPDH (GenScript), що додавалися у TBS-T
буфері із 3% знежиреного молока у відношен-
ні 1 : 2000 та 1 : 10 000 відповідно. Мембрану
інкубували з первинними антитілами протя-
гом 18 год при +4 °С з постійним перемішу-
ванням на платформі. Далі мембрани з ZXDC
та GAPDH промивали буфером TBS-T та ін-
кубували протягом 1 год із вторинними ан-
тикролячими антитілами, кон’югованими з
НRP (Santa-Cruz, США), які додавали в роз-
веденні 1 : 5000 у буфері TBS-T, у складі якого
було 3% знежиреного молока. Далі мембрану
промивали буфером TBS-T та проявляли, ви-
користовуючи реагент ESL+ (GE Healthcare)
відповідно до протоколу виробника, та фото-
графували за допомогою системи Typhoon 9410
(GE Healthcare).
результати та обговорення
Транскрипційні фактори відіграють важ-
ливу роль у регуляції метаболізму, а тому
ідентифікація генів, рівень транскрипції яких
вони контролюють, має надзвичайне значення
для розуміння біологічної ролі цього транс-
крипційного фактора, можливих механізмів
його дії в нормі та за патологічних станів, а
також порушень регуляторних шляхів і мета-
болічних процесів у разі його виключення або
надекспресії. У цій роботі нами проаналізова-
но експресію великої кількості генів в ембріо-
нальних клітинах нирки лінії HEK293 з над-
експресією транскрипційного фактора ZXDC
з допомогою мікроарей аналізу, в якому для
тестування генів використовують олігонук-
леотид, специфічний до певних генів люди-
ни. Для цього треба було одержати клітини
лінії HEK293 з надекспресією транскрипцій-
ного фактора ZXDC. Рекомбінантну плазмі-
ду pcDNA-3.1-ZXDC, що містить клоновану
кДНК ZXDC, вводили до клітин нирки лінії
HEK293 шляхом трансфекції і потім відбирали
клони клітин з надекспресією транскрипцій-
ного фактора ZXDC. Для того, щоб нівелю-
вати зміни у транскрипції генів, спричинені
клітинним стресом через трансфекцію та
надекспресію великої кількості протеїну, для
контролю клітини лінії HEK293 були транс-
фековані плазмідою pCMV-SPORT6-β-gal, що
містить кДНК α-субодиниці β-галактозида-
екСПериМенТальні рОбОТи
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 103
зи, рівень експресії якої у цих клітинах був
подібним до рівня експресії ZXDC із плазміди
pcDNA-3.1-ZXDC. Надекспресію транскрип-
ційного фактора ZXDC у цих клітинах було
перевірено за допомогою вестерн-блот аналізу,
потім підтверджено напівкількісним аналізом
полімеразної ланцюгової реакції (рис. 2 та 3).
Було показано, що трансфековані клітини над-
експресують β-галактозидазу у значній кіль-
кості (дані не наведено).
Для виявлення генів, експресія яких у клі-
тинах лінії HEK293 змінилася внаслідок над-
експресії транскрипційного фактора ZXDC,
із використанням групи контрольних генів,
дані трьох повторів мікроарей-аналізу було
нормалізовано та усереднено, відібрано гени з
низьким рівнем варіабельності поміж кожного
арею та у межах ареїв. За допомогою застосо-
ваного алгоритму було виявлено 632 гени, екс-
пресія яких змінилася у три та більше разів, а
потім з них було відібрано лише ті гени, мРНК
яких кодують протеїни з уже відомою функ-
цією. Варто зазначити, що типовий мікроарей
виробництва «Affymetrix» містить кілька груп
проб для кожного гена. До складу кожної групи
проб входять 11 олігонуклеотидних проб. За-
гальний сигнал вираховується шляхом усеред-
нення сигналів, одержаних для окремих проб
в межах групи. Подальший аналіз сигналів,
одержаних у мікроарей-аналізі, показав, що
для багатьох генів підвищення загального сиг-
налу для групи проб обумовлене підвищенням
сигналу для окремих проб, перевіркою яких із
використанням blast-аналізу встановлено, що
велика кількість проб здатна за цих експери-
рис. 2. Вестерн-блот аналіз експресії транс-
крипційного фактора ZXDC в ембріональних клі-
тинах нирки лінії HEK293, що надекспресували
цей фактор, порівняно з контрольними кліти-
нами з надекспресією β-галактозидази (β-gal).
По рівню експресії GAPDH оцінювали кількість
аналізуємого протеїну
рис. 3. аналіз експресії генів в ембріональних
клітинах нирки лінії HEK293 з надекспресією
транскрипційного фактора ZXDC або β-галак-
тозидази (β-gal) за допомогою полімеразної лан-
цюгової реакції кДнк, синтезованих зворотною
транскриптазою з тотальної рнк. Продукти
ампліфікації розділяли за допомогою електрофо-
резу в 2%-му агарозному гелі, забарвлювали бро-
мистим етидієм і фотографували
β-gal
zxdc
a-FLAG
1 : 2000
a-GAPdh
1 : 10 000
+
+
GAPDH
ZXDC
BDNF
CDKN1C
IL5Ra
EGR2
GATA1
β-gal zxdc надекспресія
ментальних умов гібридизуватися до сторонніх
мРНК, таким чином завищуючи сигнал.
Було проаналізовано проби для близько
300 генів (дані не наведено) і відібрано ті з
них, для яких зміна сигналу не була обумов-
лена неякісним дизайном проб чи дефектами
поверхні чипу. У таблиці представлені гени,
рівень експресії яких, згідно з результатами
мікроарей-аналізу, змінювався у клітинах лінії
HEK293 внаслідок надекспресії транскрипцій-
ного фактора ZXDC у три і більше разів, і які
відіграють важливу роль у регуляції багатьох
внутрішньоклітинних процесів, включаючи
О. В. Галкін, О. Г. МінченкО
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1104
регуляцію клітинного циклу, диференціації та
проліферації.
Так, гени CDC14 (CDC14 homolog A),
CCNA1 (cyclin A1), MAPK1 (mitogen-activated
protein kinase 1), CDK10 (cyclin-dependent kinase
10) та CDKN1C (cyclin-dependent kinase inhibitor
1C) беруть участь у регуляції клітинного циклу
[4–8]. Експресія трьох з них (CDC14, CCNA1 та
CDKN1C) посилилася у клітинах лінії HEK293
внаслідок надекспресії транскрипційного фак-
тора ZXDC у 8,14; 4,14 та 3,01 раза відповідно, а
експресія двох інших (MAPK1 та CDK10), нав-
паки, знизилася у 4,16 та 5,16 раза відповідно.
Гени, рівень експресії яких в ембріональних клітинах нирки лінії нек293 змінився внаслідок надекспресії
гена транскрипційного фактора ZXDC
Позначення
гена
Повна назва гена
Зміна рівня
експресії гена,
рази
Диференціація та функціонування клітин імунної системи
IL5RA Альфа рецептор інтерлейкіну 5 (interleukin 5 receptor, α) 8,84
IL9R Рецептор інтерлейкіну 9 (interleukin 9 receptor) 3,72
EGR2 Фактор 2 ранніх змін росту (early growth response 2) 3,52
регуляція клітинного циклу
CDC14A Гомолог А CDC14 (CDC14 homolog A) 8,14
RSPO3 R-спондин 3 (R-spondin 3) 7,85
FGF18 Попередник фактора росту фібробластів 18 (fibroblast growth
factor 18 precursor)
5,98
CCNA1 Циклін А1 (cyclin A1) 4,14
FGFR3 Рецептор 3 фактора росту фібробластів (fibroblast growth factor
receptor 3)
3,7
CDKN1C Інгібітор 1С циклін-залежної кінази (cyclin-dependent kinase
inhibitor 1C)
3,01
MAPK1 Активуєма мітогеном протеїнкіназа 1 (mitogen-activated protein
kinase 1)
-4,16
CDK10 Циклінзалежна кіназа 10 (cyclin-dependent kinase 10) -5,16
Утворення та функціонування нервової тканини
BDNF Нейротропний фактор, отриманий з мозку (brain-derived
neurotrophic factor)
6,32
GABRG3 А-гама-3 рецептор гама-аміномасляної кислоти (γ-amino butyric acid
(GABA) A receptor, γ 3)
6,12
CHRNA3 Альфа-3 поліпептид холінергічного рецептора нікотинового
типу (cholinergic receptor, nicotinic, α polypeptide 3)
3,85
Міжклітинні взаємодії
MMP15 Металопротеїназа матриксу 15 (matrix metalloproteinase 15) 7,78
ICAM4 Внутрішньоклітинна молекула адгезії 4 (intercellular adhesion
molecule 4)
3,89
Гени RSPO3 (R-spondin 3), FZD1 [Frizzled
(Drosophila) homologs 1] та FGFR3 (fibroblast
growth factor receptor 3) задіяні у сигнальній
трансдукції [9–11]. Експресія генів RSPO3 та
FGFR3 посилилася у клітинах лінії HEK293 у
разі надекспресії транскрипційного фактора
ZXDC у 7, 85 та 3,37 раза відповідно. Частина
генів, представлених у таблиці, бере участь у
проліферації та диференціації клітин. Це гени
FGF18 (fibroblast growth factor 18 precursor),
FGFR3 та MAPK1 [6, 11, 12]. Експресія гена
FGF18 посилилася у клітинах лінії HEK293
внаслідок надекспресії транскрипційного фак-
екСПериМенТальні рОбОТи
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 105
тора ZXDC майже у шість разів. Гени FGF18
та CDC14 також беруть участь у формуванні та
рості пухлин [13].
За надекспресії транскрипційного фак-
тора ZXDC у клітинах лінії HEK293 більше
ніж у шість разів посилюється експресія гена
BDNF (brain-derived neurotrophic factor), задія-
ного в регуляції диференціації та проліфе-
рації нейронів [14]. Показано, що експресія
генів GABRG3 (γ-aminobutyric acid (GABA) A
receptor, γ 3) та CHRNA3 (cholinergic receptor,
nicotinic, α-polypeptide 3), які беруть участь у
механізмах синаптичної передачі [15, 16], та-
кож істотно посилюється у клітинах лінії
HEK293 у разі надекспресії транскрипційно-
го фактора ZXDC: гена GABRG3 у 6,12 раза, а
гена CHRNA3 у 3,85 раза.
Встановлено також, що внаслідок над-
експресії гена транскрипційного фактора
ZXDC у клітинах лінії HEK293 істотно (у
3,89 раза) посилюється експресія гена ICAM4
(intercellular adhesion molecule 4) та у 7,78 раза
MMP15 (matrix metalloproteinase 15). Ці гени
беруть участь у міжклітинних взаємодіях та
взаємодіях клітин з міжклітинним матриксом
[17, 18]. Виявлено також групу генів, чутливих
до надекспресії гена транскрипційного факто-
ра ZXDC, що мають відношення до диферен-
ціації клітин імунної системи. Це гени IL5Ra
(interleukin 5 receptor, α), EGR2 (early growth
response 2) та IL9R (interleukin 9 receptor), екс-
пресія яких посилювалась у клітинах лінії
HEK293 внаслідок надекспресії ZXDC у 8,84;
3,72 та 3,52 раза відповідно. Низкою авторів
встановлено, що IL5Ra, IL9R та EGR2 беруть
участь у диференціації клітин крові [19–21].
Для підтвердження змін в експресії де-
яких генів, про які згадувалося вище, ми про-
вели аналіз експресії декількох генів (BNDF,
CDKN1C, EGR2, IL5Ra та GAPDH як конт-
рольного гена) з допомогою напівкількісного
варіанта полімеразної ланцюгової реакції. Ре-
зультати цих досліджень представлено на рис. 3
та 4. Для денситометричних розрахунків ми
використали дані трьох незалежних повторів
експерименту.
Згідно з результатами аналізу рівнів мРНК
полімеразною ланцюговою реакцією, спос-
терігається підвищення експресії генів BDNF,
CDKN1C, EGR2, GATA1 та IL5Ra у клітинах
нирки лінії HEK293 внаслідок надекспресії
гена транскрипційного фактора ZXDC, що
підтверджує результати мікроарей-аналізу.
Деяка невідповідність кількісних характерис-
тик рівнів експресії проаналізованих мРНК,
одержаних за допомогою двох методів, можна
пояснити тим, що використаний нами метод
полімеразної ланцюгової реакції є напівкіль-
рис. 4. результати денситометричного аналізу продуктів полімеразної ланцюгової реакції, проведено-
го за допомогою програми TotalLab. рівні експресії мрнк BDNF, CDKN1C, IL5Ra, GATA1 та EGR2
нормалізували за експресією мрнк GAPDH; P < 0,05
м
P
h
k
е
кс
пр
ес
ія
,
%
в
ід
к
он
тр
ол
ю
ZXDCβ-gal ZXDCβ-gal ZXDCβ-gal ZXDCβ-galZXDCβ-gal
BDNF CDKN1C GATA1EGR2IL5Ra
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
О. В. Галкін, О. Г. МінченкО
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1106
кісним, хоча і дані мікроарей-аналізу зрідка
завищені.
Таким чином, надекспресія транскрипцій-
ного фактора ZXDC змінює у клітинах нирки
лінії НЕК293, порівняно з контрольними клі-
тинами, що надекспресували β-галактозидазу,
експресію значного числа генів, задіяних у ре-
гуляції багатьох важливих внутрішньоклітин-
них процесів.
Зміна експресії досить великої кількості
генів внаслідок надекспресії ZXDC свідчить
про те, що транскрипційний фактор ZXDC
може грати роль активатора чи супресора їх-
ньої транскрипції, або здійснювати опосе-
редкований вплив через регуляторні каскади,
або взаємодіючи з іншими транскрипційними
факторами. Так, експресія низки генів збіль-
шилася під впливом транскрипційного фак-
тора ZXDC, включаючи гени, що є малоак-
тивними у клітинах HEK293 (BDNF, IL5Ra,
EGR2, GATA1 та інші згідно з результатами
мікроарей-аналізу), але експресуються в інших
типах клітин стабільно на окремих етапах клі-
тинного розвитку чи у відповідь на певні регу-
ляторні сигнали. Так, Raf/MEK/ERK-залежна
активація PU.1 та C/EBPa, які регулюють рівні
EGR2 та GATA1 і таким чином опосередкову-
ють диференціацію мієлоїдних попередників,
та SMAD-каскад, що опосередковує BDNF-
залежну проліферацію та диференціацію ней-
ронів, повністю або частково не функціонують
у клітинах лінії HEK293. Відомо, що високий
рівень експресії ZXDC спостерігається в кіст-
ковому мозку та тимусі, що експресія генів
EGR2 та IL5Ra звичайно є значно вищою у спе-
ціалізованих клітинах мієлоїдного ряду, при-
чому рівень їх є критичним на певних етапах
диференціації макрофагів та еозинофілів, і,
можливо, що транскрипційний фактор ZXDC
відіграє певну роль у виборі мієлоїдними по-
передниками напрямку диференціації.
Високий рівень експресії транскрипцій-
ного фактора ZXDC в мозку [1] може свідчити
про його можливу роль у регуляції експресії
генів і у нервових клітинах, зокрема гена BDNF,
задіяного в регуляції диференціації та пролі-
ферації нейронів [14], а також генів GABRG3
та CHRNA3, що беруть участь у механізмах си-
наптичної передачі [15, 16], експресія яких іс-
тотно посилюється у разі надекспресії транс-
крипційного фактора ZXDC у клітинах нирки
лінії HEK293.
Таким чином, результати проведених до-
сліджень свідчать про можливу роль транс-
крипційного фактора ZXDC у регуляції екс-
пресії великої групи генів, що контролюють
перебіг важливих клітинних процесів, зокрема
таких як клітинний цикл, міжклітинні взає-
модії, проліферація та диференціація клітин:
1. За допомогою мікроарей-аналізу іден-
тифіковано гени, експресія яких змінилася в
ембріональних клітинах нирки лінії HEK293
під впливом надекспресії транскрипційного
фактора ZXDC, серед них IL5Rа, IL9R, EGR2,
CDC14A, RSPO3, FGF18, CCNA1, FGFR3,
CDKN1C, MAPK1, CDK10, BDNF, GABRG3,
CHRNA3, MMP15 та ICAM4.
2. Посилення експресії генів IL5Rа, BDNF,
EGR2 та CDKN1C в ембріональних клітинах
нирки лінії HEK293 з надекспресією транс-
крипційного фактора ZXDC підтверджено за
допомогою полімеразної ланцюгової реакції.
3. Результати роботи свідчать про вагому
роль транскрипційного фактора ZXDC у регу-
ляції експресії великої групи генів, задіяних у
регуляції важливих клітинних процесів.
Автори вдячні Dr. Joseph D. Fontes з Ме-
дичного центру Канзаського університету
США за надану можливість виконання цієї
роботи під його керівництвом.
изменения в Экспрессии
генов, обусловленные
надЭкспрессией
транскрипционного фактора
zxdc в Эмбриональных клетках
поЧки линии hek293
а. В. Галкин1,2, а. Г. Минченко3
1Канзасский Университет,
медицинский центр, США;
2Киевский национальный университет
имени Тараса Шевченко, Украина;
3Институт биохимии им. А.В. Палладина
НАН Украины, Киев;
e-mail: ominchenko@yahoo.com
Известно, что транскрипционный фактор
ZXDC принадлежит к семейству ZXD-протеи-
нов, способен образовывать транскрипцион-
ноактивный комплекс с ZXDА и принимает
участие в регуляции экспрессии гена MHCII.
В работе проведено исследование экспрес-
сии большой группы генов в эмбриональных
клетках почки линии HEK293, которые име-
ли надэкспрессию транскрипционного фак-
тора ZXDC, с целью идентификации генов,
транскрипция которых контролируется этим
транскрипционным фактором. Показано, что
надэкспрессия транскрипционного фактора
ZXDC в эмбриональных клетках почки ли-
нии HEK293 существенно изменяет уровень
экспрессии большой группы генов, которые
екСПериМенТальні рОбОТи
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 107
контролируют протекание различных процес-
сов в клетках, в частности, клеточный цикл,
пролиферацию и дифференциацию клеток.
Экспрессия большинства из них значительно
усиливается в клетках почки линии HEK293
с надэкспрессией транскрипционного фак-
тора ZXDC, в частности генов EGR2, BDNF,
CDKN1C и IL5Ra. Полученные результаты
свидетельствуют о важной роли транскрипци-
онного фактора ZXDC в регуляции экспрессии
большой группы генов, которые вовлечены в
контроль важных клеточных процессов.
К л ю ч е в ы е с л о в а: транскрипционный
фактор ZXDC, клетки почки HEK293, регуля-
ция транскрипции.
chAnGes in Genes exPression
cAused by overexPression
oF the trAnsdcriPtion FActor
zxdc in embryonic kidney ceLL
oF hek293 Line
O. V. Galkin1,2, O. H. Minchenko3
1University of Kansas, Medical Center, USA;
2Taras Shevchenko Kyiv National University, Ukraine;
3Palladin Institute of Biochemistry, National
Academy of Science of Ukraine, Kyiv;
e-mail: ominchenko@yahoo.com
S u m m a r y
The transcription factor ZXDC, a member of
ZXD protein family, forms transcriptionally ac-
tive complex with ZXDA and participates in the
regulation of MHCII gene expression. In this work
we investigate the expression of a large group of
genes in kidney embry cell of line HEK293 with
overexpression of transcription factor ZXDC for
identification of genes, which transcription is con-
trolled by this transcription factor. We have shown
that overexpression of the transcription factor
ZXDC in kidney embryo cell of HEK293 line sig-
nificantly changes the level of expression of large
group of genes,which control the behavior of dif-
ferent cell processes, in particular cell cycle, cell
proliferation and differentiation. The expression
of most of these genes is significantly increased
in the kidney cell line HEK293 with overexpres-
sion of transcription factor ZXDC, in particular
EGR2, BDNF, CDKN1C and IL5Ra genes. Our re-
sults clearly demonstrated that transcription factor
ZXDC plays a significant role in the regulation of
expression of a large group of genes, which control
important cell processes.
K e y w o r d s: transcription factor ZXDC,
kidney cells HEK293, transcription regulation.
1. Al-Kandari W., Jambunathan S., Navalgund V.
et al. // Mol. Immunol. – 2007. – 44, N 4. –
P. 311–321.
2. Aleksandrova A., Galkin O., Koneni R. et al.
// Mol. Cell. Biochem. – 2009. – Sep. 24.
(E-pub).
3. Al-Kandari W., Koneni R., Navalgund V. et al.
// J. Mol. Biol. – 2007. – 369, N 5. – P. 1175–
1187.
4. Kaiser B., Zimmerman A., Charbonneau H. et
al. // Mol. Biol. Cell. – 2002. – 13, N 7. –
P 2289–2300.
5. Ji P., Agrawal S., Diederichs S. et al. //
Oncogene. – 2005. – 24, N 16. – P. 2739–
2744.
6. Lavoie J., L’Allemain G., Brunet A. et al. //
J. Biol. Chem. – 1996. – 271. – P. 20608–
20616.
7. Li S., MacLachlan T., De Luca A. et al. //
Cancer. Res. – 1995. – 55. – P. 3992–3995.
8. Lee M., Reynisdottir I., Massague J. et al. //
Genes. Dev. – 1995. – 9. – P. 639–649.
9. Kim K., Zhao J., Andarmani S. et al. // Cell.
Cycle. – 2006. – 5, N 1. – P. 23–26.
10. Zilberberg A., Yaniv A., Gazit A. et al. // J. Biol.
Chem. – 2004. – 279. – P. 17535–17542.
11. Ornitz D., Marie J. // Genes. Dev. – 2002. –
16. – P. 1446–1465.
12. Ohbayashi N., Shibayama M., Kurotaki Y. et al.
// Genes. Dev. – 2002. – 16, N 7. – P. 870–
879.
13. Li L., Ljungman M., Dixon J. // J. Biol. Chem. –
2000. – 275, N 4. – P. 2410–2414.
14. Timmusk T., Lendahl U., Funakoshi H. et al.
// J. Cell. Biol. – 1995. – 128, N 1. – P 185–
199.
15. Glatt K., Glatt H., Lalande M. et al. //
Genomics. – 1997. – 41, N 1. – P. 63–69.
16. Dani J. // Biol. Psychiatry. – 2001. – 49. –
P. 166–174.
17. Southcott M., Tanner M., Anstee D. // Blood. –
1999. – 93. – P. 4425–4435.
18. d’Ortho M., Will H., Atkinson S. et al. // Eur. J.
Biochem. – 1997. – 250, N 3. – P. 751–757.
19. Plaetinck G., Van der Heyden J., Tavernier J.
et al. // J. Exp. Med. – 1990. – 172, N 3. –
P. 683–691.
20. Laslo P., Spooner C., Warmflash A. et al. //
Cell. – 2006. – 126, N 4. – P. 755–766.
21. Loder B., Mutschler R. J., Ray C. J. // J. Exp.
Med. – 1999. – 190. – P. 75–89.
Отримано 11.01.2010
О. В. Галкін, О. Г. МінченкО
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-19029 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0201-8470 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-01T14:26:00Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Галкін, О.В. Мінченко, О.Г. 2011-04-16T09:46:48Z 2011-04-16T09:46:48Z 2010 Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 / О.В. Галкін, О.Г. Мінченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 100-107. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. 0201-8470 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19029 577.112:616 Відомо, що транскрипційний фактор ZXDC, що належить до родини ZXD протеїнів, здатний утворювати транскрипційно активний комплекс із ZXDA фактором, що бере участь у регуляції експресії гена MHCII. У цій роботі проведено дослідження експресії великої групи генів в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293, що характеризувалися надекспресією транскрипційного фактора ZXDC, з метою ідентифікації генів, транскрипція яких контролюється цим транскрипційним фактором. Показано, що надекспресія транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 істотно змінює рівень експресії численної групи генів, що контролюють протікання різних процесів у клітинах, зокрема клітинний цикл, проліферацію та диференціацію клітин. Експресія більшості із них суттєво посилюється у клітинах нирки лінії HEK293 з надекспресією транскрипційного фактора ZXDC, зокрема генів EGR2, BDNF, CDKN1C та IL5Ra. Одержані результати свідчать про вагому роль транскрипційного фактора ZXDC у регуляції експресії великої групи генів, задіяних у регуляції важливих клітинних процесів. Известно, что транскрипционный фактор ZXDC принадлежит к семейству ZXD-протеинов, способен образовывать транскрипционно активный комплекс с ZXDА и принимает участие в регуляции экспрессии гена MHCII. В работе проведено исследование экспрессии большой группы генов в эмбриональных клетках почки линии HEK293, которые имели надэкспрессию транскрипционного фактора ZXDC, с целью идентификации генов, транскрипция которых контролируется этим транскрипционным фактором. Показано, что надэкспрессия транскрипционного фактора ZXDC в эмбриональных клетках почки линии HEK293 существенно изменяет уровень экспрессии большой группы генов, которые контролируют протекание различных процессов в клетках, в частности, клеточный цикл, пролиферацию и дифференциацию клеток. Экспрессия большинства из них значительно усиливается в клетках почки линии HEK293 с надэкспрессией транскрипционного фактора ZXDC, в частности генов EGR2, BDNF, CDKN1C и IL5Ra. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли транскрипционного фактора ZXDC в регуляции экспрессии большой группы генов, которые вовлечены в контроль важных клеточных процессов. The transcription factor ZXDC, a member of ZXD protein family, forms transcriptionally active complex with ZXDA and participates in the regulation of MHCII gene expression. In this work we investigate the expression of a large group of genes in kidney embry cell of line HEK293 with overexpression of transcription factor ZXDC for identification of genes, which transcription is controlled by this transcription factor. We have shown that overexpression of the transcription factor ZXDC in kidney embryo cell of HEK293 line significantly changes the level of expression of large group of genes,which control the behavior of different cell processes, in particular cell cycle, cell proliferation and differentiation. The expression of most of these genes is significantly increased in the kidney cell line HEK293 with overexpression of transcription factor ZXDC, in particular EGR2, BDNF, CDKN1C and IL5Ra genes. Our results clearly demonstrated that transcription factor ZXDC plays a significant role in the regulation of expression of a large group of genes, which control important cell processes. Автори вдячні Dr. Joseph D. Fontes з Медичного центру Канзаського університету США за надану можливість виконання цієї роботи під його керівництвом. uk Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Український біохімічний журнал Експериментальні роботи Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 Изменения в экспрессии генов, обусловленные надэкспрессией транскрипционного фактора ZXDC в эмбриональных клетках почки линии HEK293 Changes in genes expression caused by overexpression of the transdcription factor ZXDC in embryonic kidney cell of HEK293 line Article published earlier |
| spellingShingle | Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 Галкін, О.В. Мінченко, О.Г. Експериментальні роботи |
| title | Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 |
| title_alt | Изменения в экспрессии генов, обусловленные надэкспрессией транскрипционного фактора ZXDC в эмбриональных клетках почки линии HEK293 Changes in genes expression caused by overexpression of the transdcription factor ZXDC in embryonic kidney cell of HEK293 line |
| title_full | Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 |
| title_fullStr | Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 |
| title_full_unstemmed | Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 |
| title_short | Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 |
| title_sort | зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора zxdc в ембріональних клітинах нирки лінії hek293 |
| topic | Експериментальні роботи |
| topic_facet | Експериментальні роботи |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19029 |
| work_keys_str_mv | AT galkínov zmínivekspresíígenívzumovlenínadekspresíêûtranskripcíinogofaktorazxdcvembríonalʹnihklítinahnirkilínííhek293 AT mínčenkoog zmínivekspresíígenívzumovlenínadekspresíêûtranskripcíinogofaktorazxdcvembríonalʹnihklítinahnirkilínííhek293 AT galkínov izmeneniâvékspressiigenovobuslovlennyenadékspressieitranskripcionnogofaktorazxdcvémbrionalʹnyhkletkahpočkiliniihek293 AT mínčenkoog izmeneniâvékspressiigenovobuslovlennyenadékspressieitranskripcionnogofaktorazxdcvémbrionalʹnyhkletkahpočkiliniihek293 AT galkínov changesingenesexpressioncausedbyoverexpressionofthetransdcriptionfactorzxdcinembryonickidneycellofhek293line AT mínčenkoog changesingenesexpressioncausedbyoverexpressionofthetransdcriptionfactorzxdcinembryonickidneycellofhek293line |