Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью
Проведено исследование цитотоксичности и антибактериальной активности новых ингибиторов тромбина, содержащих ретро-D-последовательность -D-Arg-D-Phe-, модифицированную по аминогруппе D-аргинина остатками лауриновой кислоты или хромоном, в сравнении с известным консервантом этиловым эфиром Nα-лауроил...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Український біохімічний журнал |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19032 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью / А.А. Поярков, Н.А. Тимошок, Н.Я. Спивак, С.А. Пояркова // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 123-129. — Бібліогр.: 30 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859955328522649600 |
|---|---|
| author | Поярков, А.А. Тимошок, Н.А. Спивак, Н.Я. Пояркова, С.А. |
| author_facet | Поярков, А.А. Тимошок, Н.А. Спивак, Н.Я. Пояркова, С.А. |
| citation_txt | Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью / А.А. Поярков, Н.А. Тимошок, Н.Я. Спивак, С.А. Пояркова // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 123-129. — Бібліогр.: 30 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Український біохімічний журнал |
| description | Проведено исследование цитотоксичности и антибактериальной активности новых ингибиторов тромбина, содержащих ретро-D-последовательность -D-Arg-D-Phe-, модифицированную по аминогруппе D-аргинина остатками лауриновой кислоты или хромоном, в сравнении с известным консервантом этиловым эфиром Nα-лауроил-L-аргинина (LAE). Показано, что цитотоксичность Laur-DArg-D-Phe-OMe соизмерима с LAE, а Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe почти в два раза выше. Антибактериальная активность Laur-D-Arg-D-Phe-OMe по отношению к Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis близка по действию к LAE. Предполагается, что активность ингибиторов тромбина обусловлена их способностью подавлять активность родственных трипсиноподобных протеиназ, участвующих в процессе инфицирования S. aureus и оказывающих влияние на споруляцию бацилл. Полученные данные открывают новое направление в поиске эффективных антимикробных средств среди низкомолекулярных синтетических ингибиторов трипсиноподобных протеиназ.
Проведено дослідження цитотоксичної та антибактеріальної дії нових інгібіторів тромбіну, що містять ретро-D-послідовність -D-Arg-D-Phe-, модифіковану за аміногрупою D-аргініну залишками лауринової кислоти або хромоном. Встановлено, що цитотоксичність Laur-D-Arg-D-Phe-OMe така ж сама, як і в етилового ефіру Nα-лауроїл-L-аргініну (LAE), а токсичність Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe майже вдвічі вища. Антибактеріальна дія Laur-D-Arg-D-Phe-OMe по відношенню до Staphylococcus aureus та Bacillus subtilis близька до такої LAE. Висловлюється припущення, що подібна дія інгібіторів тромбіну обумовлена їхньою здатністю пригнічувати активність трипсиноподібних протеїназ, що беруть участь в інфікуванні S. aureus та впливають на спорогенез B. subtilis. Одержані дані відкривають новий напрям пошуку ефективних антимікробних засобів серед низькомолекулярних синтетичних інгібіторів трипсиноподібних протеїназ.
The investigation of cytotoxicity and antibacterial activity of the novel thrombin inhibitors containing retro-D-sequences -D-Arg-D-Phe – modified by D-arginine amino group by the residues of lauric acid or chromone-contained substituent, in comparison with known cationic preservative Nα-lauroyl-L-arginine ethyl ester (LAE) have been carried out. It has been shown that compound Laur-D-Arg-D-Phe-OMe has a similar cytotoxicity with LAE, and Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe has almost twice higher toxicity than it fatty moiety contained analogues. Antibacterial activity of Laur-D-Arg-D-Phe-OMe against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis is close in action to LAE. It is assumed that ability of thrombin inhibitors to suppress the growth of some microorganisms can be explained by their ability to suppress activity of trypsin-like serine proteinases, which participate in the infection process of Staphylococcus aureus and influence on Bacillus subtilis sporulation. These findings open new prospects for exploringefficient antimicrobial agents among synthetic low-molecular trypsin-like serine proteinase inhibitors.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:18:54Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 123
УДК 577. 152.344 + 615.33:577.182.34
ингибиторы тромбина, обладающие
антибактериальной активностью
А. А. ПОЯРКОВ1, Н. А. ТИМОШОК2, Н. Я. СПИВАК2, С. А. ПОЯРКОВА1
1Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев;
e-mail: alexp@bpci.kiev.ua;
2Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев;
e-mail: timoshok@rambler.ru
Проведено исследование цитотоксичности и антибактериальной активности новых ингиби-
торов тромбина, содержащих ретро-D-последовательность -D-Arg-D-Phe-, модифицированную по
аминогруппе D-аргинина остатками лауриновой кислоты или хромоном, в сравнении с известным кон-
сервантом этиловым эфиром Nα-лауроил-L-аргинина (LAE). Показано, что цитотоксичность Laur-D-
Arg-D-Phe-OMe соизмерима с LAE, а Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe почти в два раза выше. Антибакте-
риальная активность Laur-D-Arg-D-Phe-OMe по отношению к Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis
близка по действию к LAE. Предполагается, что активность ингибиторов тромбина обусловлена их
способностью подавлять активность родственных трипсиноподобных протеиназ, участвующих в про-
цессе инфицирования S. aureus и оказывающих влияние на споруляцию бацилл.
Полученные данные открывают новое направление в поиске эффективных антимикробных
средств среди низкомолекулярных синтетических ингибиторов трипсиноподобных протеиназ.
К л ю ч е в ы е с л о в а: ингибиторы тромбина, антибактериальная активность, цитотоксич-
ность, ретро-D-пептиды, Nα-лауроил-L-аргинин этиловый эфир (LAE).
В последние годы установлено, что не-
которые известные синтетические ан-
тибактериальные препараты облада-
ют антибактериальным действием вследствие
эффективного ингибирования бактериальных
протеиназ. Поэтому исследование ингиби-
торов энзимов является перспективным на-
правлением в поиске новых синтетических
антибактериальных средств. В настоящее
время реализуются несколько направлений
в изучении энзимов с целью разработки ан-
тибактериальных препаратов [1]. Во-первых,
используются так называемые геномные под-
ходы, основанные на изучении структуры ге-
нома определенных бактериальных культур,
позволяющие обнаружить ранее неизвестные
энзимы – потенциальные мишени для созда-
ваемых антибактериальных препаратов. Во-
вторых, проводится всестороннее изучение
активных центров известных энзимов и разра-
ботка комплементарных им соединений – по-
тенциальных ингибиторов. В-третьих, ведется
интенсивное изучение целевых энзимов для
известных классов лекарственных препаратов,
систематизация данных о молекулярных меха-
низмах взаимосвязи структуры и активности
(SAR) с последующим моделированием но-
вых структур с более высоким ингибиторным
действием по отношению к целевым энзимам.
Наряду с более низкой токсичностью, соеди-
нения подобного рода могут превосходить из-
вестные предшественники по эффективности
действия, спектру биологической активности,
фармакокинетическим свойствам [1].
Бактериальные сигнальные пептидазы от-
носятся к классу сериновых протеиназ, ответ-
ственных за протеолитическое удаление N-кон-
цевого сигнального пептида от секретируемых
пропротеинов [2]. Недавно установлено, что
spsB ген, кодирующий сигнальную пептидазу
типа 1 в Staphylococcus aureus, важен для бак-
териального роста [3]. Сигнальные пептидазы
присутствуют как у грамположительных, так
и у грамотрицательных бактерий. Выдвинуто
предположение, что у них имеются значитель-
ные структурные отличия от их эукариотных
аналогов, которые кодируются соответствую-
щими последовательностями ДНК [4].
Поэтому бактериальные сигнальные пеп-
тидазы являются основными мишенями для
создания новых антибактериальных препара-
тов. В то же время, ряд ингибиторов биосин-
теза бактериальных стенок клетки проявляют
антибактериальную активность. Важно упо-
мянуть, что в данный процесс также вовлече-
ны многочисленные энзимы. Например, про-
дукты экспрессии генов murA, murB, murG, и
mraY являются энзимами, задействованными
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1124
в биосинтезе пептидогликанов Escherichia coli,
и рассматриваются в качестве потенциальных
мишеней для разрабатываемых антибактери-
альных препаратов [4, 5].
Ранее нами показано, что монохлоргидрат
этилового эфира Nα-лауроиларгинина (LAE) –
известный катионный консервант широкого
спектра биологического действия – обладает
свойствами конкурентного ингибитора трип-
синоподобных протеиназ, в частности – трип-
сина и тромбина [6]. При этом, LAE также
эффективно подавляет рост некоторых микро-
организмов – различных бактерий, грибов и
дрожжей. Данное соединение также проявляет
инактивирующее действие в отношении по-
верхностного антигена вируса гепатита В [7].
Как показано, при испытаниях на животных
токсичность LAE крайне низка, LD50 состав-
ляет 2,0 г/кг [8].
Известен класс протеиновых ингибито-
ров сериновых протеиназ, обладающих ан-
тигрибковым действием. В последние годы
появились публикации о важной роли сери-
новых протеиназ трипсиноподобного действия
в процессе инфицирования некоторыми вида-
ми грибов [9]. Поэтому мы предположили, что
не только LAE, но и синтезированные нами
ингибиторы тромбина [10], содержащие рет-
ро-D-последовательность, модифицированные
лауриновой кислотой или ароматическим гид-
рофобным остатком 3-[7-гидрокси-3-(4-метил-
1,3-тиазолил-2-ил)-6-этил-4-oксо-4H-хромен-
2-ил]пропановой кислотой (хромоном) могут
проявлять антигрибковую и антибактериаль-
ную активность. Известно, что бактерии рода
Bacillus являются активными продуцентами
различных протеинов. Так, бактерии B. subtilis
являются активными продуцентами внекле-
точных и внутриклеточных субтилаз, среди
которых доминирует субтилизинподобная се-
риновая протеиназа [12, 13]. Относящиеся к
группе субтилаз энзимы обладают высокой го-
мологией структурно-консервативного региона
протеиновой глобулы и содержат общие ами-
нокислотные остатки (Asp-32, His-64, Ser-221)
[14]. Рентгеноструктурный анализ субтилизи-
нов представителей рода Bacillus свидетельс-
твует о структурной идентичности в строении
и организации активных центров данных эн-
зимов, что объясняет их схожую субстратную
специфичность [15]. Показано, что эти энзи-
мы продуцируются Bacillus как в период роста
культуры, так и в период споруляции [16]. Важ-
но отметить, что синтез щелочных сериновых
протеиназ происходит одновременно с синте-
зом лектинов, причем секреция протеиназы и
лектинов происходит в культуральных средах,
то есть и энзимы, и лектин не связаны с клет-
кой продуцента. Максимальное накопление
протеиназы наблюдается через 16 часов куль-
тивирования, а лектина уже через 14 часов [17].
Показано, что при культивировании в среде,
содержащей 1 М NaCl, биосинтез субтилизин-
подобных протеиназ B. subtilis повышается [18].
В данной работе культуры B. subtilis использо-
вались в качестве тест-культур для исследова-
ния некоторых биологических свойств новых
ингибиторов сериновых протеиназ. Кроме того
установлено, что некоторые грибы, в частности
Aspergillus fumigatus, вызывающие аспергиллез
человека, продуцируют сериновую протеиназу
субтилизинового типа [9], а нередко и Candida
аlbicans, продуцирующие сериновые протеи-
назы, проявляют патогенную активность, не-
редко зависящую от энзиматической актив-
ности штамма продуцента [19].
Скрининг новых биологически активных
веществ предполагает исследование цитоток-
сичности и определение их ключевых фар-
макологических свойств. Согласно данным
литературы, эффективность действия анти-
бактериальных препаратов как in vitro, так и
in vivo сохраняется приблизительно в 80% слу-
чаев [20].
Целью данной работы является проведе-
ние сравнительного анализа цитотоксичной и
антибактериальной активности новых ингиби-
торов сериновых протеиназ (тромбина) в сис-
теме in vitro.
материалы и методы
Синтез, а также антитромбиновая и анти-
трипсиновая активность новых синтетических
ингибиторов сериновых протеиназ: Laur-D-
Arg-D-Phe-OMe, Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe и
известного консерванта LAE (в качестве пре-
парата сравнения) описаны в работах [6,12]. В
настоящей работе исследовали антибактери-
альные и цитотоксичные свойства этих соеди-
нений.
Для оценки антибактериальной актив-
ности соединений использовали тест-культуру
штамма S. aureus 209p депонированного в де-
позитарии Института микробиологии и виру-
сологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины
за № В-4001, American type culture collection –
АТСС 6538 Р, FDA 209-Р, а также культуры
B. subtilis 3, B. licheniformis 31 и B. subtilis 44-p,
полученные из Института сельскохозяйствен-
ной микробиологии УААН.
Препараты растворяли в питательной сре-
де (1 мг/мл), а нерастворимое в воде соедине-
еКСПеРИМеНТАльНі РОбОТИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 125
ние (Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe) растворяли
сначала в 3%-м водном растворе диметил-
сульфоксида (ДМСО) и затем разводили пи-
тательной средой. Минимальные бактериоста-
тические концентрации (МБстК) препаратов
по отношению к тест культурам определяли
методом серийных разведений в жидкой пита-
тельной среде в соответствии с рекомендаци-
ями NCCLS [21] при визуальной регистрации
видимого роста.
Использовали питательные среды: мясо-
пептонный бульон (МПБ) и мясопептонный
агар (МПА) (рН 7,2–7,4) для культуры S. aureus
209p, а также среду Гаузе и МПА для культиви-
рования культур аэробных спорообразующих
бактерий. Микробная нагрузка S. aureus 209p и
опытных культур составляла (1×105 кл/мл).
Из прозрачных пробирок, содержащих
МПБ, исследуемый препарат и S. aureus 209p,
а также пробирок, содержащих среду Гаузе,
бактерии рода Bacillus и препарат делали кон-
трольные посевы на чашки Петри с 2% МПА.
Посевы инкубировали при 37 °С в течение
5 суток. Отсутствие роста на агаре показывало
минимальную бактерицидную концентрацию
препаратов (МБцК) к S. aureus 209p и культу-
рам B. subtilis 3, B. licheniformis 3, B. subtilis 44-p.
Все опыты проводили в 2–3-кратной повтор-
ности.
Изучение токсичности исследуемых инги-
биторов проводили в системе in vitro в монослое
культуры клеток перевиваемых тестикулов по-
росенка (ПТП), взятых из коллекции отдела
проблем интерферона и иммуномодуляторов
Института микробиологии и вирусологии им.
Д. К. Заболотного НАН Украины, или в сус-
пензии спленоцитов мышей [11]. Культуры кле-
ток культивировали в питательной среде 199,
которая содержала 10% прогретой при 56 °С на
протяжении 30 мин эмбриональной сыворотки
телят и антибиотики (100 ед./мл пенициллина,
100 мкг/мл стрептомицина).
Через 24 и 48 часов инкубации проводи-
ли подсчет клеток и определение их жизне-
способности после окрашивания их водным
раствором витального красителя (трипановый
синий). При отсутствии токсичного эффек-
та клетки усваивали витальный краситель.
Окраску контрольных культур принимали за
100%. Разведение препарата, которое вызывало
усвоение красителя на 50%, считали токсич-
ным. Изучение ориентировочных показателей
токсичности для соединений с наибольшей
антимикробной активностью проводили со-
гласно [22].
результаты и обсуждение
Как известно, тромбин (ЕС 3.4.21.5) иг-
рает ключевую роль в гомеостазе, участвуя в
регуляции процессов, направленных как на
свертывание крови, так и на поддержание ее
жидкого состояния в кровяном русле [23]. Он
является терапевтической мишенью для созда-
ния антикоагулянтов прямого действия, по-
тенциально эффективных в терапии тромбо-
эмболических заболеваний. Тромбин обладает
широким спектром биологического действия.
Он специфически взаимодействует с многими
клетками крови, соединительной и нервной
ткани, связываясь с лейкоцитами, активирует
систему комплемента. Кроме того, он индуци-
рует хемотаксис моноцитов, синтез ДНК и про-
лиферацию фибробластов, эндотелиальных и
других клеток комплемента [24, 25]. Тромбин,
модифицируя липопротеиновые рецепторы,
оказывает влияние на развитие атеросклеро-
за [26], усиливает инфицирование некоторы-
ми респираторными вирусами [27], участвует
в развитии опухолей и метастазирования [28].
Учитывая тот факт, что тромбин усиливает
инфицирование некоторыми вирусами, по-
видимому, опосредованное активацией вирус-
ных проэнзимов, представлялось интересным
изучить влияние ингибиторов этого энзима на
жизнедеятельность некоторых бактерий. Коль
скоро в процессе активации некоторых вирусов
и бактерий принимают участие еще неизвест-
ные сериновые протеиназы трипсиноподобно-
го действия, то весьма вероятно подавление
ингибиторами этих энзимов жизнедеятель-
ности некоторых бактерий и вирусов. Ввиду
высокой активности новых ингибиторов, син-
тезированных на основе ретро-D пептидной
последовательности -D-Аrg-D-Phe-OМe [6,10],
представлялось целесообразным исследование
их антимикробного действия.
Как следует из данных, приведенных в
табл. 1, максимальным ингибиторным эффек-
том на амидолитическую активность тромбина
обладает соединение Laur-D-Аrg-D-Phe-OМe,
модифицированное остатком лауриновой кис-
лоты. Соединение Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe,
содержащее в своей структуре остаток хромо-
на, ингибирует на порядок слабее.
Поскольку LAE является известным и хо-
рошо изученным консервантом с высоким ан-
тибактериальным и антигрибковым действием,
мы решили исследовать способность дипептид-
ного производного лауриновой кислоты и ди-
пептида, содержащего остаток хромона вместо
остатка жирной кислоты, подавлять рост неко-
А. А. ПОЯРКОВ, Н. А. ТИМОШОК, Н. Я. СПИВАК, С. А. ПОЯРКОВА
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1126
Т а б л и ц а 1. Антитромбиновая активность (Ki ) соединений
Соединение Структурная формула Ki, мкМ
Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe*
N
H
HN
NH
H2N
O
OHO
O
N
S
O H
N
O O
O
O
H
N
HN
NHH2N
O
N
H
O
O
H
N
HN
NHH2N
O
O
14,3 ± 0,9
Laur-D-Arg-D-Phe-OMe
N
H
HN
NH
H2N
O
OHO
O
N
S
O H
N
O O
O
O
H
N
HN
NHH2N
O
N
H
O
O
H
N
HN
NHH2N
O
O
1,76 ± 0,09
LAE
N
H
HN
NH
H2N
O
OHO
O
N
S
O H
N
O O
O
O
H
N
HN
NHH2N
O
N
H
O
O
H
N
HN
NHH2N
O
O
2,00 ± 0,02
торых микроорганизмов и изучить другие их
фармакологически важные свойства.
Как известно, уровень токсичности явля-
ется одним из важнейших характеристик био-
логически активных веществ.
Цитотоксичность новых ингибиторов
оценивали по снижению жизнеспособности
эукариотических клеток ПТП и спленоцитов
мыши под их влиянием.
При изучении токсичности исследуемых
ингибиторов также было установлено, что эти
соединения в дозах 10–75 мкг/мл нетоксичны
для культур лимфоцитов селезенки мышей и
клеток культуры ПТП. Снижение жизнеспо-
собности указанных клеток на 30% наблюда-
лось лишь при повышении дозы препаратов от
75 до 150 мкг/мл (табл. 2)
Спленоциты мыши оказались более ус-
тойчивыми к токсичному действию препара-
тов, чем клетки ПТП. Как следует из данных,
приведенных в таблице 2, цитотоксичность
LAE и Laur-D-Arg-D-Phe-OMe одинаковая и
Примечание: измерения проводили в 0,05М трис-НСl буфере, рН 8,0, содержащем 0,15 М NaCl, при 25 °С.
*Буфер содержит 3% ДMСO в конечной концентрации.
еКСПеРИМеНТАльНі РОбОТИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 127
по значению ниже токсичности Chrom-D-Arg-
D-Phe-OMe.
Главным показателем антибактериальной
активности препаратов было бактериостати-
ческое действие по отношению к S. aureus 209p.
Известно, что этот штамм чувствителен к ан-
тибиотикам – пенициллину, стрептомицину,
биомицину, окситетрациклину, полимиксину,
макролидам, фторхинолинам, аминогликози-
дам, ванкомицину. Тем не менее, в литературе
отсутствуют данные относительно чувстви-
тельности этого тест-штамма к ингибиторам
сериновых протеиназ. Проведенные исследо-
вания показали, что ингибиторы протеиназ
проявляют значительную антибактериальную
активность, поскольку контакт S. aureus 209p
с исследуемыми препаратами сопровождает-
ся снижением жизнеспособности указанного
тест-штамма.
Расчет результатов антимикробной актив-
ности проводили согласно методическим реко-
мендациям [29].
Испытание препаратов начинали с концен-
трации 100 мкг/мл, в дальнейшем дозу препара-
тов уменьшали. Результаты антибактериальной
активности препаратов приведены в табл. 3.
Как видно, исследуемые вещества задер-
живают рост разных бактериальных культур
(S. aureus 209p, B. subtilis 3, B. licheniformis 31 и
B. subtilis 44-p).
Таблица 2. Цитотоксичные свойства препаратов ингибиторов тромбина
Препараты
Цитотоксичная доза, мкг/мл
Культура клеток перевиваемых
тестикулов поросенка
Спленоциты мыши
Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe 75 150
Laur-D-Arg-D-Phe-OMe 150 200
LAE 150 200
Проведенные исследования показали, что
бактерицидные концентрации препаратов ко-
леблются в зависимости от вида и штамма бак-
териальных культур (табл. 4).
Изучение прямого антибактериального
действия исследуемых препаратов на между-
народный стандарт S. aureus 209p показало,
что жизнеспособность тест-штамма зависит от
времени контакта с препаратами. Продолжи-
тельный контакт S. aureus 209p с препаратами
сопровождается усилением бактерицидного
действия. Так, результаты пересевов тест-штам-
ма из пробирок на чашки с МПА через 24 часа
инкубации свидетельствуют об уменьшении
бактерицидной концентрации препаратов по
сравнению с концентрацией при двухчасовом
контакте. Для большинства препаратов при
двухчасовом контакте бактерицидность прояв-
ляется при концентрации 25 мкг/мл, а через 12
часов контакта при 15 мкг/мл. Таким образом,
можно сделать вывод, что антибактериальная
активность препаратов варьирует в широких
пределах и находится в прямой зависимости от
времени контакта S. aureus 209p с препаратом.
Важным результатом исследований явля-
ется определение оптимальной дозы препара-
тов – 25 мкг/мл. Полученные результаты со-
гласуются с данными литературными по LAE,
антибактериальные свойства которого хорошо
изучены. Установлено, что подавление LAE
Т а б л и ц а 3. Величины МбстК (в мкг/мл) исследуемых соединений в отношении Staphylococcus
аureus 209p, композиции культур (Bacillus licheniformis 31 и Bacillus subtilis 3) и Bacillus subtilis 44-p
Культуры микроорганизмов
Конечная концентрация препаратов, мкг/мл
Laur-D-Arg-D-Phe-OMe LAE
12,5 25 50 100 12,5 25 50 100
S. аureus 209p н – – – н – н –
B. subtilis 3, B. licheniformis 31 + – н н н – – –
B. subtilis 44-p н – – – н – н –
Примечание: – отсутствие роста; + наличие роста культуры; н – не исследовано. Микробная нагрузка
2×105 кл/мл.
А. А. ПОЯРКОВ, Н. А. ТИМОШОК, Н. Я. СПИВАК, С. А. ПОЯРКОВА
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1128
S. aureus обусловлено повреждением мембраны
бактериальной клетки [8].
Предположение о том, что бактерио-
статическая активность препаратов частично
обусловлена подавлением активности субтили-
зиноподобных протеиназ, биосинтез которых
связывают со споруляцией бацилл [30], кос-
венно подтверждается данными об ингибиро-
вании роста этих аэробных спорообразующих
бактерий как LAE, так и другими синтетичес-
кими ингибиторами протеиназ.
Таким образом, результаты проведенных
исследований свидетельствуют о бактерио-
статическом и бактерицидном действии иссле-
дуемых ингибиторов тромбина, что, по всей
видимости, обусловлено ингибированием се-
риновых протеиназ, продуцируемых B. subtilis.
Полученные результаты указывают на пер-
спективность дальнейшего поиска препаратов,
обладающих антибактериальной активностью
среди низкомолекулярных синтетических ин-
гибиторов сериновых протеиназ тромбинопо-
добного действия.
ІнгІбІтори тромбІну, що
виявляють антибактерІальну
дІю
O. О. Поярков1, Н. О. Тимошок2,
М. Я. Співак2, С. О. Пояркова1
1Інститут біоорганічної хімії і
нафтохімії НАН України, Київ;
e-mail: alexp@bpci.kiev.ua
2Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ;
e-mail: timoshok@rambler.ru
Проведено дослідження цитотоксич-
ної та антибактеріальної дії нових інгібіторів
тромбіну, що містять ретро-D-послідовність
-D-Arg-D-Phe-, модифіковану за аміногрупою
D-аргініну залишками лауринової кислоти
або хромоном. Встановлено, що цитотоксич-
ність Laur-D-Arg-D-Phe-OMe така ж сама,
як і в етилового ефіру Nα-лауроїл-L-аргініну
(LAE), а токсичність Chrom-D-Arg-D-Phe-
OMe майже вдвічі вища. Антибактеріальна
дія Laur-D-Arg-D-Phe-OMe по відношенню до
Staphylococcus aureus та Bacillus subtilis близька
до такої LAE. Висловлюється припущення,
що подібна дія інгібіторів тромбіну обумовле-
на їхньою здатністю пригнічувати активність
трипсиноподібних протеїназ, що беруть участь
в інфікуванні S. aureus та впливають на споро-
генез B. subtilis.
Одержані дані відкривають новий напрям
пошуку ефективних антимікробних засобів
серед низькомолекулярних синтетичних ін-
гібіторів трипсиноподібних протеїназ.
К л ю ч о в і с л о в а: інгібітори тромбіну,
антибактеріальна дія, цитотоксичність, ретро-
D-пептиди, етиловий ефір Nα-лауроїл-L-ар-
гініну (LAE).
thrombin inhibitors which
display antibacterial activity
A. A. Poyarkov1, N. A. Timoshok2,
M. Ya. Spivak2, S. A. Poyarkova1
1Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry,
National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: alexp@bpci.kiev.ua;
2Zabolotny Institute of Microbiology and Virology,
National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: timoshok@rambler.ru
S u m m a r y
The investigation of cytotoxicity and antibac-
terial activity of the novel thrombin inhibitors con-
taining retro-D-sequences -D-Arg-D-Phe – modi-
fied by D-arginine amino group by the residues
of lauric acid or chromone-contained substituent,
in comparison with known cationic preservative
Т а б л и ц а 4. Величины МбцК (в мкг/мл) исследуемых соединений в отношении Staphylococcus аureus
209р, композиции культур (Bacillus licheniformis 31, Bacillus subtilis 3) и Bacillus subtilis 44-p
Примечание: – отсутствие роста при высеве на МПА; + наличие бактериального роста при высеве на МПА;
н – не исследовано.
Культуры микроорганизмов
Конечная концентрация препаратов, мкг/мл
Laur-D-Arg-D-Phe-OMe LAE
25 50 100 25 50 100
S. аureus 209р + + – – н –
B. subtilis 3, B. licheniformis 31 – н н – – –
B. subtilis 44-p – – – – н н
еКСПеРИМеНТАльНі РОбОТИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 129
Nα-lauroyl-L-arginine ethyl ester (LAE) have been
carried out. It has been shown that compound
Laur-D-Arg-D-Phe-OMe has a similar cytotoxici-
ty with LAE, and Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe has
almost twice higher toxicity than it fatty moiety
contained analogues. Antibacterial activity of Laur-
D-Arg-D-Phe-OMe against Staphylococcus aureus
and Bacillus subtilis is close in action to LAE. It
is assumed that ability of thrombin inhibitors to
suppress the growth of some microorganisms can
be explained by their ability to suppress activity of
trypsin-like serine proteinases, which participate
in the infection process of Staphylococcus aureus
and influence on Bacillus subtilis sporulation.
These findings open new prospects for
exploring efficient antimicrobial agents among
synthetic low-molecular trypsin-like serine protei-
nase inhibitors.
K e y w o r d s: thrombin inhibitors, antibac-
terial activity, cytotoxicity, retro-D-peptide, Nα-
lauroyl-L-arginine ethyl ester (LAE).
1. Roychoudhury S. / In Enzyme technologies
for pharmaceutical and biotechnology
application. – Ed. by H. A. Kirst. Wu-Kuang
Yeh, Milton J. Zmijewski, Jr. – 2001. –
P. 245–263. by Marcel Dekker, Inc. http://
www.dekker.com
2. Black M. T., Burton G. // Curr. Pharm. Des. –
1998. – 2. – P. 133–154.
3. Cregg K. M., Wilding I., Black M. T. // J.
Bacteriol. – 1996. – 178. – P. 5712–5718.
4. Skarzynski T., Mistry A., Wonacott A. et al. //
Structure. – 1996. – 4. – P. 1465–1474.
5. Benson T. E., Walsh C. T., Hogle J. M. //
Ibid. – P. 47–54.
6. Поярков А. А., Пояркова С. А., Кухарь В. П.
// Укр. біохім. журн. – 2007. – 79, № 1. –
С. 87–94.
7. Sugimoto Y., Toyoshima S. // Antimicrob.
Agents Chemother. – 1981. – 20. – P. 120–
127.
8. Ruckman S. A., Rocabayera X., Borzelleca J. F.,
Sandusky C. B. // Food Chem. Toxicol. –
2004. – 42. – P. 245–259.
9. Дэвис Д. А., Калинина Н. А., Самохвалова л. В.
и др. // Биоoрган. химия. – 2005. – 31,
№ 3. – С. 259–268.
10. Poyarkov A. A., Rocabayera X., Poyarkova S. A.,
Kukhar V. P. // Open Biochem. J., Bentham. –
2008. – 2. – P. 143–149.
11. Абдувалиев А. А., Гильдиева М. С. // Клин.
лабор. диагн. – 2006. – № 2. – С. 36–37.
12. Mala B. Rao, Aparna M. Tanksale, Mohini S.
Ghatge, Vasanti V. Deshpande // Microbiol. Mol.
Biol. Rev. – 1998. – 62, N 3. – P. 597–635.
13. Nugroho F. A., Yamamoto H., Kobayashi Y.,
Sekiguchi J. // J. Bacteriol. – 1999. – 181,
N 20. – P. 6230–6237.
14. Siezen R. J., Vos W. M., Leunissen J. A. M.,
Dijkstra B. W. // Protein Eng. – 1991. – 4. –
P.719–737.
15. Siezen R. J., Leunissen J. A. M. // Protein
Sci. – 1997. – 6. – P. 501–523.
16. Кириллова Ю. М., Михайлова е. О., бала-
бан Н. П. и др. // Микробиология. – 2006. –
75, № 2. – С. 179–185.
17. Kudria V. A., Simonenko I. A. // Appl. Microbiol.
Biotechnol. – 1994. – 41, N 5. – P. 505–509.
18. Kunst F., Rapport G. // J. Bactetiol. – 1995. –
175, N 9. – P. 2403–2407.
19. BanerjeeA., Ganesan K., Datta A. // J. Gen.
Microbiology. – 1991. – 137. – P. 2455–2461.
20. Шорин В. А. // Антибиотики. – 1958. –
№ 6. – С. 113–116.
21. National Committee for Clinical Laboratory
Standars. 1997. Method for dilution
antimicrobial susceptibility tests for bacteria
that grow aerobically / Approved standart M7-
A4./ 4th ed Villanova.
22. Методы испытания и оценки проти-
вовирусной активности химических
соединений в отношении вируса гриппа.
Метод указания. Составил проф.
В. И. Ильенко. – Л., 1977. – 35 с.
23. Fenton J. W., Ofosu F. A., Moon D. G., Maraga-
nore J. M. // Blood Coagul. Fibrinolysis. –
1991. – 2(1). – P. 69–75.
24. Bar-Shvit K. A., Hruska A. J., Kahn G. D.,
Wilner R. // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1986. –
485. – P. 335–348.
25. Shuman M. A. // Ibid. – P. 228–239.
26. Giaturco S. H., Bradley W. A. // Semin. Thromb.
Hemost. – 1986. – 12, N 4. – P. 277–279.
27. Dubovi E. J., Geratz J. D., Tidwell R. R. //
Infect. Immunol. Hemost. – 1986. – 12,
N 4. – P. 294–307.
28. Goldfarb R. H., Liotta L. A. // Semin. Tromb.
Hemost. – 1986. – 12, N 4. – P. 294–307.
29. Методические указания МУК 4.2.1890-04.
Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. –
2004. – 6, № 4. – С. 306–359.
30. Errington J. // Microbiol. Rev. – 1993. – 57,
N 1. – P. 1–33.
Получено 14.12.2009
А. А. ПОЯРКОВ, Н. А. ТИМОШОК, Н. Я. СПИВАК, С. А. ПОЯРКОВА
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-19032 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0201-8470 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:18:54Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Поярков, А.А. Тимошок, Н.А. Спивак, Н.Я. Пояркова, С.А. 2011-04-16T09:58:16Z 2011-04-16T09:58:16Z 2010 Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью / А.А. Поярков, Н.А. Тимошок, Н.Я. Спивак, С.А. Пояркова // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 123-129. — Бібліогр.: 30 назв. — рос. 0201-8470 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19032 577. 152.344 + 615.33:577.182.34 Проведено исследование цитотоксичности и антибактериальной активности новых ингибиторов тромбина, содержащих ретро-D-последовательность -D-Arg-D-Phe-, модифицированную по аминогруппе D-аргинина остатками лауриновой кислоты или хромоном, в сравнении с известным консервантом этиловым эфиром Nα-лауроил-L-аргинина (LAE). Показано, что цитотоксичность Laur-DArg-D-Phe-OMe соизмерима с LAE, а Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe почти в два раза выше. Антибактериальная активность Laur-D-Arg-D-Phe-OMe по отношению к Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis близка по действию к LAE. Предполагается, что активность ингибиторов тромбина обусловлена их способностью подавлять активность родственных трипсиноподобных протеиназ, участвующих в процессе инфицирования S. aureus и оказывающих влияние на споруляцию бацилл. Полученные данные открывают новое направление в поиске эффективных антимикробных средств среди низкомолекулярных синтетических ингибиторов трипсиноподобных протеиназ. Проведено дослідження цитотоксичної та антибактеріальної дії нових інгібіторів тромбіну, що містять ретро-D-послідовність -D-Arg-D-Phe-, модифіковану за аміногрупою D-аргініну залишками лауринової кислоти або хромоном. Встановлено, що цитотоксичність Laur-D-Arg-D-Phe-OMe така ж сама, як і в етилового ефіру Nα-лауроїл-L-аргініну (LAE), а токсичність Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe майже вдвічі вища. Антибактеріальна дія Laur-D-Arg-D-Phe-OMe по відношенню до Staphylococcus aureus та Bacillus subtilis близька до такої LAE. Висловлюється припущення, що подібна дія інгібіторів тромбіну обумовлена їхньою здатністю пригнічувати активність трипсиноподібних протеїназ, що беруть участь в інфікуванні S. aureus та впливають на спорогенез B. subtilis. Одержані дані відкривають новий напрям пошуку ефективних антимікробних засобів серед низькомолекулярних синтетичних інгібіторів трипсиноподібних протеїназ. The investigation of cytotoxicity and antibacterial activity of the novel thrombin inhibitors containing retro-D-sequences -D-Arg-D-Phe – modified by D-arginine amino group by the residues of lauric acid or chromone-contained substituent, in comparison with known cationic preservative Nα-lauroyl-L-arginine ethyl ester (LAE) have been carried out. It has been shown that compound Laur-D-Arg-D-Phe-OMe has a similar cytotoxicity with LAE, and Chrom-D-Arg-D-Phe-OMe has almost twice higher toxicity than it fatty moiety contained analogues. Antibacterial activity of Laur-D-Arg-D-Phe-OMe against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis is close in action to LAE. It is assumed that ability of thrombin inhibitors to suppress the growth of some microorganisms can be explained by their ability to suppress activity of trypsin-like serine proteinases, which participate in the infection process of Staphylococcus aureus and influence on Bacillus subtilis sporulation. These findings open new prospects for exploringefficient antimicrobial agents among synthetic low-molecular trypsin-like serine proteinase inhibitors. ru Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Український біохімічний журнал Експериментальні роботи Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью Інгібітори тромбіну, що виявляють антибактеріальну дію Thrombin inhibitors which display antibacterial activity Article published earlier |
| spellingShingle | Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью Поярков, А.А. Тимошок, Н.А. Спивак, Н.Я. Пояркова, С.А. Експериментальні роботи |
| title | Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью |
| title_alt | Інгібітори тромбіну, що виявляють антибактеріальну дію Thrombin inhibitors which display antibacterial activity |
| title_full | Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью |
| title_fullStr | Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью |
| title_full_unstemmed | Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью |
| title_short | Ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью |
| title_sort | ингибиторы тромбина, обладающие антибактериальной активностью |
| topic | Експериментальні роботи |
| topic_facet | Експериментальні роботи |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19032 |
| work_keys_str_mv | AT poârkovaa ingibitorytrombinaobladaûŝieantibakterialʹnoiaktivnostʹû AT timošokna ingibitorytrombinaobladaûŝieantibakterialʹnoiaktivnostʹû AT spivaknâ ingibitorytrombinaobladaûŝieantibakterialʹnoiaktivnostʹû AT poârkovasa ingibitorytrombinaobladaûŝieantibakterialʹnoiaktivnostʹû AT poârkovaa íngíbítoritrombínuŝoviâvlâûtʹantibakteríalʹnudíû AT timošokna íngíbítoritrombínuŝoviâvlâûtʹantibakteríalʹnudíû AT spivaknâ íngíbítoritrombínuŝoviâvlâûtʹantibakteríalʹnudíû AT poârkovasa íngíbítoritrombínuŝoviâvlâûtʹantibakteríalʹnudíû AT poârkovaa thrombininhibitorswhichdisplayantibacterialactivity AT timošokna thrombininhibitorswhichdisplayantibacterialactivity AT spivaknâ thrombininhibitorswhichdisplayantibacterialactivity AT poârkovasa thrombininhibitorswhichdisplayantibacterialactivity |