Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.)
Лактатдегідрогеназа (ЛДГ) з печінки і білих м’язів карася сріблястого Carassius auratus була частково очищена шляхом фракціонування сульфатом амонію. Ензим з печінки мав Vmax – 1,85 ± 0,31 од. акт./мг протеїну, а з білих м’язів – 3,74 ± 0,27 од. акт./мг протеїну. Проте, ЛДГ з печінки була менш чутли...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Український біохімічний журнал |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19038 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) / О.Ю. Васильків, В.І. Лущак // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 2. — С. 29-35. — Бібліогр.: 27 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-19038 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Васильків, О.Ю. Лущак, В.І. 2011-04-16T17:31:05Z 2011-04-16T17:31:05Z 2010 Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) / О.Ю. Васильків, В.І. Лущак // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 2. — С. 29-35. — Бібліогр.: 27 назв. — укр. 0201-8470 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19038 577.151.1.+ 577.151.03. Лактатдегідрогеназа (ЛДГ) з печінки і білих м’язів карася сріблястого Carassius auratus була частково очищена шляхом фракціонування сульфатом амонію. Ензим з печінки мав Vmax – 1,85 ± 0,31 од. акт./мг протеїну, а з білих м’язів – 3,74 ± 0,27 од. акт./мг протеїну. Проте, ЛДГ з печінки була менш чутливою до субстратного інгібування (І50 9,92 ± 1,09 мМ), порівняно з аналогічним показником для ЛДГ з білих м’язів (І50 5,87 ± 1,39 мМ). Встановлено оптимуми рН ізоензимів, які дорівнювали 7,0–8,0 і 7,25–8,75 для ЛДГ білих м’язів і печінки відповідно. Проведено інактивацію частково очищеної ЛДГ в системі вільнорадикального окислення Fe2+/H2O2. При інкубації ензиму протягом 5 хв з Н2О2 (10–50 мМ) і FeSО4 (20–500 мкМ) втрачалася приблизно половина початкової активності. Ступінь інактивації ензиму зростала зі збільшенням концентрації йонів заліза і пероксиду водню. При інкубації у присутності 20 мкМ FeSО4 і 10 мМ Н2О2 протягом 60 хв ензим з білих м’язів втрачав 44% активності, а ензим із печінки – 26%, незалежно від того який буфер використовували. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) из печени и белых мышц карася серебристого Carassius auratus была частично очищена путем фракционирования сульфатом аммония. Для энзима, полученного из печени, Vmax = 1,85 ± 0,31 ед. акт./мг протеина, а из белых мышц – 3,74 ± 0,27 ед. акт./мг протеина. ЛДГ из печени была менее чувствительна к субстратному ингибированию (I50 – 9,92 ± 1,09 мМ), по сравнению с аналогичным показателем для ЛДГ белых мышц (I50 – 5,87 ± 1,39 мМ). Установлены оптимумы рН исследуемых изоэнзимов, равные 7,0–8,0 и 7,25–8,75 для ЛДГ белых мышц и печени соответственно. Проведена инактивация частично очищенной ЛДГ в системе свободнорадикального окисления Fe2+/H2О2. При инкубации энзима в течение 5 минут с Н2О2 (10–50 мМ) и FeSО4 (20–500 мкМ), теряется приблизительно половина начальной активности. Степень инактивации энзима возрастает с увеличением концентрации ионов железа и пероксида водорода. При инкубации в присутствии 20 мкМ FeSО4 и 10 мМ Н2О2 в течение 60 мин энзим из белых мышц теряет 44% активности, а энзим из печени – 26%, независимо от того, какой буфер использовали. Lactate dehydrogenase (LDH) from the liver and white muscles of the gold fish Carassius auratus was partially purified by differential precipitation with ammonium sulfate. The enzyme from the liver had relatively low Vmax – 1.85 ± 0.31 U/mg protein, the muscle enzyme – 3.74 ± 0.27 U/mg protein. LDH from the liver was less sensitive to substrate inhibition (I50 – 9.92 ± 1.09 mM) compared to white muscles isozyme (I50 – 5.87 ± 1.39 mM). The studied isozymes had pH-dependencies with pH optima at 7.0–8.0 and 7.25–8.75 for LDH from the white muscle and liver, respectively. In this work the inactivation of partially purified LDH in the system free radicals oxidations Fe2+/H2О2 has been conducted. During incubation for 5 min of both isozymes with H2О2 (10–50 mM) and FeSО4 (20–500 μM), approximately 50% of their initial activities were lost. The level of enzyme inactivation increased with the increase of iron ion and hydrogen peroxide concentrations. During incubation in the presence of 20 µM FeSО4 and 10 mM H2О2 for 60 min white muscles isozyme lost 44% while liver isozyme – 26%, independent of buffer which was used. Автори щиро вдячні О. І. Кубрак за консультації під час проведення експериментів і обговорення рукопису статті. uk Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Український біохімічний журнал Експериментальні роботи Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) Сравнительная характеристика свойств лактатдегидрогеназы белых мышц и печени карася серебристого (Carassius auratus l.) Comparative characteristic of lactate dehydrogenase properties from white muscles and liver of goldfish (Carassius auratus l.) Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) |
| spellingShingle |
Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) Васильків, О.Ю. Лущак, В.І. Експериментальні роботи |
| title_short |
Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) |
| title_full |
Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) |
| title_fullStr |
Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) |
| title_full_unstemmed |
Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) |
| title_sort |
порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (carassius auratus l.) |
| author |
Васильків, О.Ю. Лущак, В.І. |
| author_facet |
Васильків, О.Ю. Лущак, В.І. |
| topic |
Експериментальні роботи |
| topic_facet |
Експериментальні роботи |
| publishDate |
2010 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Український біохімічний журнал |
| publisher |
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Сравнительная характеристика свойств лактатдегидрогеназы белых мышц и печени карася серебристого (Carassius auratus l.) Comparative characteristic of lactate dehydrogenase properties from white muscles and liver of goldfish (Carassius auratus l.) |
| description |
Лактатдегідрогеназа (ЛДГ) з печінки і білих м’язів карася сріблястого Carassius auratus була частково очищена шляхом фракціонування сульфатом амонію. Ензим з печінки мав Vmax – 1,85 ± 0,31 од. акт./мг протеїну, а з білих м’язів – 3,74 ± 0,27 од. акт./мг протеїну. Проте, ЛДГ з печінки була менш чутливою до субстратного інгібування (І50 9,92 ± 1,09 мМ), порівняно з аналогічним показником для ЛДГ з білих м’язів (І50 5,87 ± 1,39 мМ). Встановлено оптимуми рН ізоензимів, які дорівнювали 7,0–8,0 і 7,25–8,75 для ЛДГ білих м’язів і печінки відповідно. Проведено інактивацію частково очищеної ЛДГ в системі вільнорадикального окислення Fe2+/H2O2. При інкубації ензиму протягом 5 хв з Н2О2 (10–50 мМ) і FeSО4 (20–500 мкМ) втрачалася приблизно половина початкової активності. Ступінь інактивації ензиму зростала зі збільшенням концентрації йонів заліза і пероксиду водню. При інкубації у присутності 20 мкМ FeSО4 і 10 мМ Н2О2 протягом 60 хв ензим з білих м’язів втрачав 44% активності, а ензим із печінки – 26%, незалежно від того який буфер використовували.
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) из печени и белых мышц карася серебристого Carassius auratus была частично очищена путем фракционирования сульфатом аммония. Для энзима, полученного из печени, Vmax = 1,85 ± 0,31 ед. акт./мг протеина, а из белых мышц – 3,74 ± 0,27 ед. акт./мг протеина. ЛДГ из печени была менее чувствительна к субстратному ингибированию (I50 – 9,92 ± 1,09 мМ), по сравнению с аналогичным показателем для ЛДГ белых мышц (I50 – 5,87 ± 1,39 мМ). Установлены оптимумы рН исследуемых изоэнзимов, равные 7,0–8,0 и 7,25–8,75 для ЛДГ белых мышц и печени соответственно. Проведена инактивация частично очищенной ЛДГ в системе свободнорадикального окисления Fe2+/H2О2. При инкубации энзима в течение 5 минут с Н2О2 (10–50 мМ) и FeSО4 (20–500 мкМ), теряется приблизительно половина начальной активности. Степень инактивации энзима возрастает с увеличением концентрации ионов железа и пероксида водорода. При инкубации в присутствии 20 мкМ FeSО4 и 10 мМ Н2О2 в течение 60 мин энзим из белых мышц теряет 44% активности, а энзим из печени – 26%, независимо от того, какой буфер использовали.
Lactate dehydrogenase (LDH) from the liver and white muscles of the gold fish Carassius auratus was partially purified by differential precipitation with ammonium sulfate. The enzyme from the liver had relatively low Vmax – 1.85 ± 0.31 U/mg protein, the muscle enzyme – 3.74 ± 0.27 U/mg protein. LDH from the liver was less sensitive to substrate inhibition (I50 – 9.92 ± 1.09 mM) compared to white muscles isozyme (I50 – 5.87 ± 1.39 mM). The studied isozymes had pH-dependencies with pH optima at 7.0–8.0 and 7.25–8.75 for LDH from the white muscle and liver, respectively. In this work the inactivation of partially purified LDH in the system free radicals oxidations Fe2+/H2О2 has been conducted. During incubation for 5 min of both isozymes with H2О2 (10–50 mM) and FeSО4 (20–500 μM), approximately 50% of their initial activities were lost. The level of enzyme inactivation increased with the increase of iron ion and hydrogen peroxide concentrations. During incubation in the presence of 20 µM FeSО4 and 10 mM H2О2 for 60 min white muscles isozyme lost 44% while liver isozyme – 26%, independent of buffer which was used.
|
| issn |
0201-8470 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19038 |
| citation_txt |
Порівняльна характеристика властивостей лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки карася сріблястого (Carassius auratus l.) / О.Ю. Васильків, В.І. Лущак // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 2. — С. 29-35. — Бібліогр.: 27 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT vasilʹkívoû porívnâlʹnaharakteristikavlastivosteilaktatdegídrogenazizbílihmâzívípečínkikarasâsríblâstogocarassiusauratusl AT luŝakví porívnâlʹnaharakteristikavlastivosteilaktatdegídrogenazizbílihmâzívípečínkikarasâsríblâstogocarassiusauratusl AT vasilʹkívoû sravnitelʹnaâharakteristikasvoistvlaktatdegidrogenazybelyhmyšcipečenikarasâserebristogocarassiusauratusl AT luŝakví sravnitelʹnaâharakteristikasvoistvlaktatdegidrogenazybelyhmyšcipečenikarasâserebristogocarassiusauratusl AT vasilʹkívoû comparativecharacteristicoflactatedehydrogenasepropertiesfromwhitemusclesandliverofgoldfishcarassiusauratusl AT luŝakví comparativecharacteristicoflactatedehydrogenasepropertiesfromwhitemusclesandliverofgoldfishcarassiusauratusl |
| first_indexed |
2025-11-24T15:54:08Z |
| last_indexed |
2025-11-24T15:54:08Z |
| _version_ |
1850849259737317376 |
| fulltext |
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 2 29
УДК 577.151.1.+ 577.151.03.
порівняльна характеристика властивостей
лактатдегідрогенази з білих м’язів і печінки
карася сріблястого (carassius auratus l.)
О. Ю. ВАСИЛЬКІВ, В. І. ЛУЩАК
Прикарпатський національний університет ім. Василя Стефаника,
Івано-Франківськ, Україна;
e-mail: lushchak@pu.if.ua
Лактатдегідрогеназа (ЛДГ) з печінки і білих м’язів карася сріблястого Carassius auratus
була частково очищена шляхом фракціонування сульфатом амонію. Ензим з печінки мав Vmax –
1,85 ± 0,31 од. акт./мг протеїну, а з білих м’язів – 3,74 ± 0,27 од. акт./мг протеїну. Проте, ЛДГ з
печінки була менш чутливою до субстратного інгібування (І50 9,92 ± 1,09 мМ), порівняно з аналогічним
показником для ЛДГ з білих м’язів (І50 5,87 ± 1,39 мМ). Встановлено оптимуми рН ізоензимів, які дорів-
нювали 7,0–8,0 і 7,25–8,75 для ЛДГ білих м’язів і печінки відповідно. Проведено інактивацію частково
очищеної ЛДГ в системі вільнорадикального окислення Fe2+/H2O2. При інкубації ензиму протягом 5 хв
з Н2О2 (10–50 мМ) і FeSО4 (20–500 мкМ) втрачалася приблизно половина початкової активності.
Ступінь інактивації ензиму зростала зі збільшенням концентрації йонів заліза і пероксиду водню. При
інкубації у присутності 20 мкМ FeSО4 і 10 мМ Н2О2 протягом 60 хв ензим з білих м’язів втрачав 44%
активності, а ензим із печінки – 26%, незалежно від того який буфер використовували.
К л ю ч о в і с л о в а: лактатдегідрогеназа, інактивація, Carassius auratus.
Л актатдегідрогеназа (L – лактат – NAD+ –
оксидоредуктаза, ЛДГ, КФ 1.1.1.27) –
неключовий ензим гліколізу, проте
йому приділяють багато уваги. Це пов’язано
з його важливим значенням як термінального
гліколітичного ензиму [1–3].
Найкраще досліджена ЛДГ теплокровних
організмів. Зокрема в літературі детально опи-
сані ізоензимний спектр і властивості окремих
ізоензимів, які найчастіше стосуються ЛДГ із
різних тканин ссавців [4]. У птахів і ссавців
звичайно знаходять п’ять ізоензимів ЛДГ. Усі ці
форми є тетрамерами, що утворюються різним
поєднанням двох типів субодиниць: серцевої
(Н) і м’язової (М), синтез яких контролюєть-
ся різними генами [5]. Комбінація субодиниць
призводить до утворення п’яти тетрамерів (H4,
H3M1, H2M2, H3M1, M4) [6]. Субодиниці Н і М
мають однакову молекулярну масу, але відріз-
няються за хімічними, фізичними та імуноло-
гічними властивостями [4]. Ізоензим H4 ЛДГ,
наприклад, домінує в серцевому м’язі, тоді
як ізоензим M4, навпаки, переважає в білих
м’язах [4]. Щодо пойкілотермних організмів,
зокрема риб, то ці дані відносно обмежені. Для
риб характерне полігенне програмування лак-
татдегідрогенази, що виражається в наявності від
1 до 20 ізоензимів [7].
Лактатдегідрогеназа, хоч і відносно резис-
тентна, проте може інактивуватись активова-
ними формами кисню (АФК). До них нале-
жать супероксид-аніон (О2
–), пероксид водню
(Н2О2), гідроксильний радикал (НО–) [8–10].
АФК взаємодіють практично з усіма типами
біологічно важливих молекул, зокрема про-
теїнів, нуклеїнових кислот та ліпідів [11].
Мета роботи – проведення порівняльного
аналізу властивостей частково очищеної лак-
татдегідрогенази з білих м’язів і печінки ка-
рася сріблястого (Carassius auratus), визначен-
ня рН-залежності, кінетичних характеристик,
дослідження характеру інактивації ЛДГ карася
сріблястого в системі H2O2/Fe2+.
матеріали і методи
У роботі використовували NАDН (Reanal,
Угорщина), піруват, сульфат заліза, ЕДТА (ети-
лендіамінтетраацетат), HEPES (N-2-гідрокси-
етилпіперазин N′-2-етансульфонова кислота,
Sigma, США). Решта реактивів вітчизняного
виробництва найвищого ступеня чистоти.
ЛДГ отримували з печінки і білих м’язів
карася віком один рік та масою 50–150 г. Риб
перед експериментом витримували протягом
тижня в резервуарі об’ємом 1000 л з відстоя-
ною водопровідною водою, концентрацію кис-
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 230
ню підтримували в межах 6–8 мг/л, при рН
води 7,5–8,0 і температурі 18 ± 2 °С. Зразки
тканин риб охолоджували до 1–3 °С в 0,9%-му
розчині NaCl, промокали фільтрувальним па-
пером та гомогенізували в гомогенізаторі Пот-
тера в 50 мМ калій-фосфатному буфері (КФБ;
рН 7,0) з 0,5 мМ ЕДТА (тут і далі наведені кін-
цеві концентрації). Одержані гомогенати цент-
рифугували 12 хв при 4 °С і 8000 g на центри-
фузі ОПН-8. Осад відкидали, а із супернатантів
виділяли ЛДГ, осаджуючи протеїн кристаліч-
ним сульфатом амонію при 0–4 °С [12].
Протеїни, що було осаджено при концен-
трації сульфату амонію в діапазоні насичення
50–52% супернатанту, виділяли центрифугу-
ванням (10 хв, 7000 g, 4 °С). Далі осад роз-
чиняли в 1–2 мл 50 мМ КФБ (рН 7,0) і вико-
ристовували як препарати лактатдегідрогенази
для визначення активності ензиму та концен-
трації протеїну.
Активність ЛДГ визначали спектро-
фотометричним методом із застосуванням
Specoll 211 (Німеччина) в середовищі, яке міс-
тило: 50 мМ КФБ (рН 7,0), 1 мМ ЕДТА, 0,2 мМ
NADН, 1 мМ піруват. Коефіцієнт молярного
поглинання вважали рівним 6220 М-1⋅см-1 [13].
Загальний об’єм проби – 1,25 мл. Реакцію по-
чинали внесенням до середовища інкубації
частково очищеного ензиму. При дослідженні
кінетичних параметрів – константи Міхаелі-
са (КМ) для NADН та пірувату і максимальної
активності (Vmах) – використовували NADН та
піруват у кінцевих концентраціях 4–400 мкМ
та 0,005–1 мМ відповідно; для визначення кое-
фіцієнта половинного інгібування (І50) над-
лишком пірувату – 1–40 мМ.
Залежність ЛДГ з білих м’язів і печінки від
рН досліджували в буферній системі (рН 5,75–
9,50), яка містила 50 мМ КФБ і 50 мМ трис-
НСl. Під час побудови графіків рН-залежності
ЛДГ за 100% приймали максимальне значення
її активності.
Активність у всіх випадках нормували на
міліграм загального протеїну, концентрацію
якого визначали методом Бредфорд за інтен-
сивністю забарвлення комплексу протеїну з
кумасі G-250 [14] із використанням БСА як
стандарту.
Інактивацію ЛДГ проводили в середови-
щі, яке містило 20 мкМ FeSO4 і різні концен-
трації H2O2 (10, 30, 50 мМ), а також – 50 мМ
H2O2 і різні концентрації FeSO4 (25, 50, 100,
250, 500 мкМ). Концентрація протеїну в роз-
чині, в якому здійснювали інактивацію ензи-
му, була 10 мкг/мл. У кожному випадку актив-
ність ЛДГ визначали у двох зразках: 1) ензим
інкубували в дистильованій воді; 2) ензим ін-
кубували в середовищі КФБ чи HEPES з дода-
ванням пероксиду водню та сульфату заліза.
За 100% приймали активність ензиму в пер-
шому зразку.
Кінетичні характеристики ензимів – КМ
для NADН та пірувату, Vmах і І50 для пірувату –
розраховували за допомогою комп’ютерної
прoграми KINETICS [15]. Дані представлено
як M ± m. Статистичне оброблення резуль-
татів здійснювали, використовуючи t-критерій
Стьюдента.
результати та обговорення
Одержані дані свідчать про те, що спе-
цифічна активність ЛДГ з печінки і білих
м’язів карася сріблястого, при концентрації
сульфату амонію у діапазоні насичення 52–
55% перевищує таку у вихідному гомогенаті
з печінки у три рази, а в гомогенаті з білих
м’язів у чотири рази. Активність ЛДГ у гомоге-
натах печінки і білих м’язів дорівнює близько
1 од. акт./мг протеїну. Максимальна актив-
ність ЛДГ незалежно від способу висолюван-
ня для протеїнових фракцій, які осаджували
при певних концентраціях сульфату амонію,
є незмінною. Виділена протеїнова фракція з
найвищою активністю ЛДГ містила 21% ензи-
му для ЛДГ з печінки і 29% для ЛДГ із бі-
лих м’язів. Частково очищені препарати ЛДГ
з тканин карася порівнювали за кінетичними
параметрами. У жодному з експериментів не
виявлено відхилення від кінетики Міхаеліса–
Ментен (nH = 1). У частково очищеного ензиму
з печінки і білих м’язів КМ для NADН є майже
однаковою (18,8 ± 5,5 мкМ і 24,0 ± 5,9 мкМ
відповідно). Показник КМ для NADН (ЛДГ пе-
чінки) удвічі нижче від такого з печінки ко-
ропа [16], з яким збігається одержана нами ве-
личина КМ для NADН з білих м’язів. У наших
екпериментах значення КМ для пірувату ензи-
му з печінки карася дорівнює 37,5 ± 18,0 мкМ
і дещо відрізняється від КМ ензиму з білих
м’язів, яке дорівнює 26,6 ± 7,0 мкМ, проте ця
різниця статистично невірогідна. G. Tripathi і
O. Shukla [7], досліджуючи лактатдегідрогеназу
печінки Clarias batrachus, одержали схожі ре-
зультати (КМ для пірувату становила 32 мкМ).
J. Cronczewska та колеги [17] вивчали ізоен-
зими лактатдегідрогенази Clupea harengus і
виявили, що КМ для пірувату ензиму з білих
м’язів – 220 мкМ, що майже у вісім разів пе-
ревищує одержаний нами показник для карася
сріблястого.
ЛДГ із печінки має відносно низьку Vmах
(1,85 ± 0,31 од. акт./мг протеїну) порівняно
ЕКСПЕрИМЕНтАЛЬНІ рОбОтИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 2 31
з аналогічним показником для ЛДГ з білих
м’язів (3,74 ± 0,27 од. акт./мг протеїну). Зна-
чення І50 для ЛДГ із печінки в наших експе-
риментах дорівнює 9,92 ± 1,09 мМ і вірогідно
відрізняється від І50 ензиму з білих м’язів, яке
дорівнює 5,87 ± 1,39 мМ (р < 0,05) (рис. 1).
Подібний характер інгібування виявлено для
ЛДГ деяких антарктичних риб [18], а також
C. harengus: активність ензиму з м’язів при ви-
щих концентраціях пірувату (1–5 мМ) стрім-
ко знижувалась [17]. Аналізуючи одержані
результати, можна дійти висновку, що ЛДГ з
білих м’язів та печінки карася сріблястого ма-
ють подібні кінетичні характеристики. ЛДГ з
білих м’язів карася виявляє максимальну ак-
тивність при рН 7,5, а ензим з печінки при
рН 8,5 (рис. 2).
Система окислення Fe2+/H2O2 часто вико-
ристовується в експериментах з окисної інак-
тивації ензимів [19–21]. Слід зазначити, що
концентрації йонів заліза та пероксиду водню,
які необхідні для досягнення певного ступеня
інактивації, залежать як від стійкості ензиму
до окислення, так і від його концентрації при
інактивації [19]. Повністю очищені ензими
інактивуються при нижчих концентраціях пе-
роксиду водню та йонів двовалентного заліза,
ніж неочищені або очищені частково [19, 22]. В
цій роботі проведено часткове очищення ЛДГ,
і концентрація протеїну в інкубаційній суміші
під час інкубації в системі Fe2+/H2O2 дорівнює
10 мкг/мл.
Після інактивації ЛДГ протягом 2,5 хв у
50 мкМ FeSO4 (за відсутності H2O2) активність
ензиму знижується на 52%, тоді як у присут-
ності 10 мМ H2O2 та 50 мкМ FeSO4, його ак-
тивність становить 20% від початкової. Отже,
йони заліза призводять до часткової інакти-
вації ензиму, проте у присутності перокси-
ду водню ступінь інактивації істотно зростає
(рис. 3). Подібну інактивацію багатьох ен-
зимів спостерігали інші дослідники. У роботі
L. Szweda та Е. Stadtman [19] при дослідженні
інактивації глюкозо-6-фосфатдегідрогенази
рис. 1. І50 для ЛДГ з білих м’язів і печінки кара-
ся сріблястого. *3начення вірогідно відмінні між
собою (M ± m; n = 3; р < 0,025)
рис. 2. Вплив значення рН середовища на актив-
ність ЛДГ: ▲ – з білих м’язів, ■ – з печінки.
Активність надана у відсотках відносно макси-
мального значення (M ± m; n = 3)
*
0
3
6
9
12
50
,
'
Васильків, Лущак, Рис. 1.
*
0
3
6
9
12
50
,
'
Васильків, Лущак, Рис. 1.
Печінка
Білі м’язи
I 50
, м
М
12
9
6
3
0
рН
5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5
А
кт
ив
ні
ст
ь,
%
120
100
80
60
0
40
20
рис. 3. Залежність активності ЛДГ з білих
м’язів від часу інкубації ензиму у присутності
Н2О2, Н2О2 + FeSО4 та FeSО4. Активність на-
дана у відсотках відносно активності у зразку,
в якому ензим інкубували в дистильованій воді.
Наведені дані типового експерименту
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25,
,%
+
Васильків, Лущак, Рис. 3.
Час, хв
0 5 10 15 20 25
А
кт
ив
ні
ст
ь,
%
100
80
60
0
40
20
H2O2
H2O2 + FeSO4
FeSO4
О. Ю. ВАСИЛЬКІВ, В. І. ЛУЩАК
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 232
Lactobacyllus mesenteroides було встановлено, що
активність ензиму зменшується на 50% за пер-
ші 20 с інкубації у присутності 10 мкМ H2O2 та
10 мкМ FeSO4. Аналогічний ефект описано в
роботі Господарьова Д. В. та співавт. [20].
Інактивація ЛДГ йонами заліза за від-
сутності пероксиду водню можна пояснити
зв’язуванням їх з боковими групами аміно-
кислотних залишків, зокрема гістидину, глу-
тамінової та аспарагінової кислот тощо [23].
Додавання пероксиду водню в розчин, де зна-
ходяться йони заліза та ензим, призводить до
утворення гідроксильних радикалів, які окис-
люють переважно амінокислоти, що знахо-
дяться поблизу місця зв’язування йонів заліза
[19, 24–26]. Інкубація ЛДГ в середовищі, що
містить Fe2+ і H2O2, призводить до інактивації
ензиму, який може втрачати активність різ-
ними шляхами. Одним з них є модифікація
центрів зв’язування субстрату та коензиму, як
описано у роботі L. Szweda та Е. Stadtman [19].
У дослідженнях з інактивації глутамінсин-
тетази Escherichia coli в системі Fe2+/H2O2 ви-
явлено, що ензим інактивується вже внаслідок
окислення тільки одного залишку гістидину,
найближче розташованого до місця приєднан-
ня йонів заліза [27]. Відомо, що крім гістидину
чутливим до окислення є залишки цистеїну,
аргініну та проліну [10].
Інактивацію ЛДГ проводили в середови-
щі, яке містило 20 мкМ FeSO4 і різні концен-
трації H2O2 (10, 30, 50 мМ) або 50 мМ H2O2
і різні концентрації FeSO4 (25, 50, 100, 250,
500 мкМ) (рис. 4, 5).
При інкубації ензиму протягом 5 хв з H2O2
(10–50 мМ) і FeSO4 (20–500 мкМ), приблизно
половина початкової активності втрачається.
Подальше збільшення часу інактивації ензи-
му в суміші, де проводили інактивацію, не-
значно впливає на його активність. Ступінь
інактивації ензиму зростає у разі збільшення
концентрації іонів заліза і пероксиду водню
(рис. 4, 5).
В роботі ми також дослідили вплив КФБ
і HEPES на процес інактивації ЛДГ, для чого
у середовище інактивації додавали або 25 мМ
КФБ (рН 7,0) або 25 мМ HEPES (рН 7,0),
(рис. 6; А, б). Виявлено, що інактивація ен-
зиму у присутності HEPES відбувається дещо
швидше, ніж у КФБ. Наприклад, після 5 хв ін-
кубації у КФБ з 30 мМ Н2О2 та 20 мкМ FeSO4,
активність ЛДГ з печінки вірогідно знижуєть-
ся до 80%, а в HEPES – до 60% (рис. 6, б).
Збільшення часу інактивації призводить до
вірогідного зниження активності, зокрема, на
20-ту хв інкубації активність ензиму у разі до-
давання КФБ становить 72%, а за додавання
HEPES – 57%. Подібний характер інактивації
спостерігається і в процесі інактивації ЛДГ із
білих м’язів (рис. 6, А). Ті ж самі концентрації
пероксиду водню і сульфату заліза у разі до-
рис. 4. Залежність активності ЛДГ з білих
м’язів від часу інкубації ензиму у присутності
20 мкМ FeSО4 та різних концентрацій Н2О2 (10,
30, 50 мМ). Активність надана у відсотках від-
носно активності у зразку, в якому ензим інку-
бували в дистильованій воді. Наведено дані ти-
пового експерименту
рис. 5. Залежність активності ЛДГ з білих м’язів
від часу інкубації ензиму у присутності 50 мМ
Н2О2 та різних концентрацій FeSО4. Активність
надана у відсотках відносно активності у зраз-
ку, в якому ензим інкубували в дистильованій
воді. Наведено дані типового експерименту
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70
,
,%
10
30 M
50
Васильків, Лущак, Рис. 4.
Час, хв
0 10 20 30 40 50 60 70
А
кт
ив
ні
ст
ь,
%
100
80
60
0
40
20
10 мМ H2O2
30 мМ H2O2
50 мМ H2O2
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60
,
,%
25 50
100 250
500 1000
Васильків, Лущак, Рис. 5.
Час, хв
0 10 20 30 40 50 60
А
кт
ив
ні
ст
ь,
%
100
80
60
0
40
20
25 мкМ
100 мкМ
500 мкМ
50 мкМ
250 мкМ
1000 мкМ
ЕКСПЕрИМЕНтАЛЬНІ рОбОтИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 2 33
рис. 6. Залежність активності ЛДГ з білих м’язів (А) і печінки (б) від часу інкубації ензиму в різних
буферних системах. Концентрація FeSО4 дорівнює 20 мкМ, а Н2О2 – 10 і 30 мМ. Активність подана
у відсотках відносно активності у зразку, в якому ензим інкубували в дистильованій воді. * Вірогідно
відмінне від відповідних значень у калій-фосфатному буфері р < 0,05, **р < 0,025; (M ± m; n = 3)
0
20
40
60
80
100
0 5 10 20 30 40 60
,
, %
10
HEPES 10
30
HEPES 30
.
Васильків, Лущак, Рис. 6, А.
Час, хв
0 5 10 20 30 40 60
А
кт
ив
ні
ст
ь
Л
Д
Г,
%
100
80
60
0
40
20
КФБ 10 мМ H2O2
HEPES 10 мМ H2O2
КФБ 30 мМ H2O2
HEPES 30 мМ H2O2
А
0
20
40
60
80
100
0 5 10 20 30 40 60
,
, %
10
HEPES 10
30
HEPES 30
** *
***
Васильків, Лущак, Рис. 6, Б.
Час, хв
100
80
60
0
40
20
Б
0 5 10 20 30 40 60
А
кт
ив
ні
ст
ь
Л
Д
Г,
%
КФБ 10 мМ H2O2
HEPES 10 мМ H2O2
КФБ 30 мМ H2O2
HEPES 30 мМ H2O2
О. Ю. ВАСИЛЬКІВ, В. І. ЛУЩАК
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 234
давання калій-фосфатного буфера зменшують
активність до 60%, а з HEPES – до 38%. Отже,
ензим швидше інактивується у буферному се-
редовищі, яке містить HEPES, ніж у такому
самому з фосфатом.
Таким чином, результати наших експери-
ментів свідчать про те, що в системі Fe2+/H2O2
відбувається інактивація лактатдегідрогена-
зи, проте механізм інактивації залишається
нез’ясованим. За зазначених умов спостері-
гається зменшення максимальної активності
цього ензиму, що може відбуватися за рахунок
відповідного зменшення кількості його актив-
них молекул, але КМ не змінюється.
Автори щиро вдячні О. І. Кубрак за кон-
сультації під час проведення експериментів і
обговорення рукопису статті.
сравнительная характеристика
свойств лактатдегидрогеназы
белых мышц и печени карася
серебристого (carassius auratus l.)
Е. Ю. Васылькив, В. И. Лущак
Прикарпатский национальный
университет им. Васыля Стефаныка,
Ивано-Франковск, Украина;
e-mail: lushchak@pu.if.ua
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) из печени и бе-
лых мышц карася серебристого Carassius auratus
была частично очищена путем фракциониро-
вания сульфатом аммония. Для энзима, полу-
ченного из печени, Vmax = 1,85 ± 0,31 ед. акт./мг
протеина, а из белых мышц – 3,74 ± 0,27 ед.
акт./мг протеина. ЛДГ из печени была менее
чувствительна к субстратному ингибированию
(I50 – 9,92 ± 1,09 мМ), по сравнению с ана-
логичным показателем для ЛДГ белых мышц
(I50 – 5,87 ± 1,39 мМ). Установлены оптимумы
рН исследуемых изоэнзимов, равные 7,0–8,0 и
7,25–8,75 для ЛДГ белых мышц и печени соот-
ветственно. Проведена инактивация частично
очищенной ЛДГ в системе свободнорадикаль-
ного окисления Fe2+/H2О2. При инкубации эн-
зима в течение 5 минут с Н2О2 (10–50 мМ) и
FeSО4 (20–500 мкМ), теряется приблизитель-
но половина начальной активности. Степень
инактивации энзима возрастает с увеличением
концентрации ионов железа и пероксида водо-
рода. При инкубации в присутствии 20 мкМ
FeSО4 и 10 мМ Н2О2 в течение 60 мин энзим из
белых мышц теряет 44% активности, а энзим
из печени – 26%, независимо от того, какой
буфер использовали.
К л ю ч е в ы е с л о в а: лактатдегидрогена-
за, Carassius auratus, инактивация.
comparative characteristic
of lactate dehydrogenase
properties from white
muscles and liver of goldfish
(carassius auratus l.)
O. Yu. Vasylkiv, V. I. Lushchak
Vassyl Stephanyk Precarpathian National
University, Ivano-Frankivsk, Ukraine;
e-mail: lushchak@pu.if.ua
S u m m a r y
Lactate dehydrogenase (LDH) from the liver
and white muscles of the gold fish Carassius auratus
was partially purified by differential precipitation
with ammonium sulfate. The enzyme from the liver
had relatively low Vmax – 1.85 ± 0.31 U/mg protein,
the muscle enzyme – 3.74 ± 0.27 U/mg protein.
LDH from the liver was less sensitive to substrate
inhibition (I50 – 9.92 ± 1.09 mM) compared to
white muscles isozyme (I50 – 5.87 ± 1.39 mM).
The studied isozymes had pH-dependencies with
pH optima at 7.0–8.0 and 7.25–8.75 for LDH from
the white muscle and liver, respectively. In this
work the inactivation of partially purified LDH in
the system free radicals oxidations Fe2+/H2О2 has
been conducted. During incubation for 5 min of
both isozymes with H2О2 (10–50 mM) and FeSО4
(20–500 μM), approximately 50% of their initial
activities were lost. The level of enzyme inactiva-
tion increased with the increase of iron ion and
hydrogen peroxide concentrations. During incuba-
tion in the presence of 20 μM FeSО4 and 10 mM
H2О2 for 60 min white muscles isozyme lost 44%
while liver isozyme – 26%, independent of buffer
which was used.
K e y w o r d s: lactate dehydrogenase, Caras-
sius auratus, inactivation.
1. Лущак В. И. // Биохимия. – 1992. – 57,
№ 8. – С. 1142–1153.
2. Maxime V., Pichavant К., Boeuf G. et al. // Fish
Physiol. Biochem. – 2000. – 22. – P. 51–59.
3. Chippari-Gomes A. R., Leitao M. A. B., Paula-
Silva M. N. et al. // Genet. Моl. Evol. –
2003. – 26. – Р. 27–32.
4. Bailey G. S., Wilson A. C. // J. Biol. Chem. –
1968. – N 22. – P. 5843–5853.
5. Ziętara M. S., Skorkowski E. F. // Comp.
Biochem. Physiol. – l993. – 105. – P. 349–
356.
ЕКСПЕрИМЕНтАЛЬНІ рОбОтИ
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 2 35
6. Cronczewska J., Zietara M. S., Biegniewska A.
et al. // Ibid. – 2003. – 134B. – P. 399–406.
7. Tripathi G., Skukla S. P. // Biochem. Arch. –
1988. – 4. – P. 25–34.
8. Fridovich I. // Mol. Cell. Biol. – 1998. – 25. –
P. 1–14.
9. Лущак В. И. // Биохимия. – 2001. – 66,
№ 5. – С. 592–609.
10. Лущак В. И. // Там же. – 2007. – 72, № 8. –
С. 995–1017.
11. Stadtman E. R. // Science. – 1992. – 257,
N 5074. – P. 1220–1224.
12. Лущак В. И. // Укр. биохим. журн. – 1992. –
62, № 6. – С. 38–42.
13. Северин С. Е., Соловьева Г. А. Практикум
по биохимии. – М.: Изд-во МГУ. – 1989. –
509 с.
14. Bradford M. M. // Anal. Biochem. – 1976. –
72. – Р. 289–292.
15. Brooks S. P. J. // Bio Techniques. – 1992. –
13. – P. 906–911.
16. Кубрак О. І., Лущак О. В., Лущак В. І. //
Укр. біохім. журн. – 2008. – 80, № 4. –
С. 35–41.
17. Cronczewska J., Biegniewska A., Zietara M. S.
et al. // Соmр. Biochem. Physiol. – 2003. –
137c. – P. 207–311.
18. Fitch N. A. // Ibid. – 1988. – 91B, N 4. –
P. 671–676.
19. Szweda L. I., Stadtman E. R. // J. Biol. Chem. –
1992. – 267, N 5. – P. 3096–3100.
20. Господарьов Д. B., байляк М. М., Лущак В. І.
// Укр. біохім. журн. – 2005. – 77, № 1. –
С. 88–94.
21. Гусак В. В., Лущак В. І. // Там само. –
2007. – 79, № 6. – Р. 42–47.
22. Hermes-Lima M., Storey K. B. // Моl. Cell.
Віосhem. – 1993. – 124. – P. 149–158.
23. Jeffery J., Hobbs L., Jornvall H. // Biochem. –
1985. – 24, N 3. – P. 666–671.
24. Davies K. J. A., Delsignore M. E., Lin S. W. // J.
Biol. Chem. – 1987. – 262, N 20. – P. 9902–
9907.
25. Davies K. J. A., Delsignore M. E. // Ibid. –
P 9908–9913.
26. Davies K. J. A., Lin S. W., Pacifici R. // Ibid. –
P. 9914–9920.
27. Oliver C. N., Levine R. L., Stadtman E. R. //
J. Amer. Geriat. Soc. – 1987. – 37. – P. 947–
956.
Отримано 12.03.2009
О. Ю. ВАСИЛЬКІВ, В. І. ЛУЩАК
|