Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18
Transformants Erwinia carotovora subsp. carotovora carrying pECL18 plasmid have been obtained with the help of the modified calcium method. The transformation frequency was 2.8 × 103 colonies per μg of plasmid DNA. It has been established that the calcium competence of E. carotovora could be obtaine...
Saved in:
| Date: | 2007 |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2007
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/1911 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 / Н.В. Черватюк, Ф.И. Товкач, Т.Е. Горб // Доп. НАН України. — 2007. — N 1. — С. 165–170. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859810211127099392 |
|---|---|
| author | Черватюк, Н.В. Товкач, Ф.И. Горб, Т.Е. |
| author_facet | Черватюк, Н.В. Товкач, Ф.И. Горб, Т.Е. |
| citation_txt | Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 / Н.В. Черватюк, Ф.И. Товкач, Т.Е. Горб // Доп. НАН України. — 2007. — N 1. — С. 165–170. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| description | Transformants Erwinia carotovora subsp. carotovora carrying pECL18 plasmid have been obtained with the help of the modified calcium method. The transformation frequency was 2.8 × 103 colonies per μg of plasmid DNA. It has been established that the calcium competence of E. carotovora could be obtained by subjecting the cell from the logarithmic phase of growth to 0.1 М CaCl2 per 5 × 108 cell/ml. The frequency of the spontaneous loss of pECL18 plasmid is less than 1%. The ability to restrict the phage reproduction and the nuclease synthesis by the transformants has been studied. Foreign and homing RM-systems are autonomous, i.e. inhibit the phage reproduction independently. The obtained data are the prerequisite to construct a biotechnological system on the basis of non-pathogenic E. carotovora.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:18:47Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 579.254.2
© 2007
Н.В. Черватюк, Ф. И. Товкач, Т.Е. Горб
Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora
плазмидой pECL18
(Представлено членом-корреспондентом НАН Украины И. Г. Скрипалем)
Transformants Erwinia carotovora subsp. carotovora carrying pECL18 plasmid have been obtai-
ned with the help of the modified calcium method. The transformation frequency was 2.8 ×
× 10
3 colonies per µg of plasmid DNA. It has been established that the calcium competence
of E. carotovora could be obtained by subjecting the cell from the logarithmic phase of growth
to 0.1 М CaCl2 per 5× 10
8 cell/ml. The frequency of the spontaneous loss of pECL18 plasmid
is less than 1%. The ability to restrict the phage reproduction and the nuclease synthesis by the
transformants has been studied. Foreign and homing RM-systems are autonomous, i. e. inhibit
the phage reproduction independently. The obtained data are the prerequisite to construct a
biotechnological system on the basis of non-pathogenic E. carotovora.
Erwinia carotovora привлекает внимание исследователей не только как возбудитель “мягкой
гнили” экономически важных групп растений, но и как перспективный биотехнологический
объект. Изучение молекулярной биологии и генетики этой важной фитопатогенной бакте-
рии связано с решением вопросов о наличии фагов, плазмид, транспозонов, а также о их
роли в горизонтальном переносе генов. Их решение возможно при разработке оригиналь-
ных генетических и молекулярно-биологических методов исследований. При этом создание
условий для горизонтального переноса генов (трансформации, трансдукции, трансфекции)
является одним из важных этапов в исследовании генетики данного фитопатогена.
Настоящая работа посвящена разработке эффективной трансформирующей системы
для E. carotovora, а также изучению основных свойств полученных трансформантов.
В исследовании использованы следующие бактериальные штаммы, бактериофаги и
плазмиды:
Бактерии:
Erwinia carotovora subsp. carotovora
RC5297 Устойчивый к бактериоцину Еса153
M2-4/50RI Спонтанный диссоциант штамма ЕСА
М2-4 [12]
Escherichia coli
JM109 F′, proAB+, hsdR17(r−
K
m+
K
), λ-r
JM109(pECL18)
Бактериофаги:
ZF40 с5/5 clear-мутант фага ZF40
ZF40 mod c5/5 clear-мутант фага ZF40, модифицированный
на штамме M2–4/50RI
Плазмиды:
pECL18 Apr HSD-плазмида, restriction-modification
system Ecl18KI, RNAI, RNAII, mob и rom гены
pUC19 Apr
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2007, №1 165
Рис. 1. Плазмидные профили трансформантов E. carotovora RC5297(pECL18) (а) и E. coli
JM109(pECL18) (б ): 1 — ЕСА RC5297; 2–5 — отдельные клоны ЕСА RC5297(pECL18); 6 — нативная пла-
змида pUC19; 7 — плазмида pECL18. Ch — бактериальная хромосома; D — димерная плазмидная ДНК;
M — мономерная плазмидная ДНК; ССС — сверхспиральная ковалентнозамкнутая ДНК, которая была
учтена при расчетах концентрации (см. текст)
Для получения компетентных клеток и их трансформации применяли штамм R-типа
E. carotovora subsp. carotovora 62A — RC5297, устойчивый к бактериоцину EcaEc153 [1, 2].
Выбор штамма для трансформации обусловлен тем, что у R-диссоциантов изменены по-
верхностные свойства клеток, что, по-видимому, увеличивает их компетентность, т. е. вос-
приимчивость к чужеродной ДНК.
Компетентные клетки трансформировали плазмидой pECL18, которая, кроме гена син-
теза β-лактамазы, несет ген, экспрессирующий рестриктазу II типа, Ecl18kI [3]. В этом
случае предполагали использовать простой способ селективного отбора клонов и опреде-
ления их фенотипа: полученные трансформанты, помимо роста на среде с ампициллином
(50 мкг/мл), должны ограничивать развитие фагов — фенотип Apr Res+.
Получение компетентных клеток и их трансформацию проводили кальциевым методом
как указано в [4]. Частоту трансформации рассчитывали на 1 мкг сверхспиральной кова-
лентнозамкнутой ДНК (рис. 1).
Плазмидные ДНК, полученные по [5], разделяли в 0,8% агарозных гелях.
Для определения концентрации исходной плазмиды электрофореграммы анализировали
с помощью программы TotalLab v.2.01; в качестве эталона использовали плазмиду pUC19.
Рестриктазы выделяли согласно [6].
Для получения периплазматических фракций бактериальные клетки выращивали в те-
чение 14 ч в минимальной среде с 0,5% полипектатом натрия и собирали центрифугирова-
нием (6000 g, 30 мин). Клеточный осадок отмывали дважды водопроводной водой и инкуби-
ровали в течение 2 ч на льду в растворе, содержащем 200 мкг/мл лизоцима, 15% сахарозы,
30 мМ трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДTA. Содержимое супернатанта, полученного после опи-
санной обработки и центрифугирования (17000 g, 30 мин), использовали для проведения
гидролиза ДНК фага λ [7].
Трансформация бактерий предполагает получение компетентных клеток, которые спо-
собны поглощать ДНК из раствора. Кальцийзависимая компетентность позволяет транс-
166 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2007, №1
Рис. 2. Чашка Петри с LB-средой с 50 мкг/мл ампициллина после 48 ч культивирования трансформантов
E. carotovora RC5297(pECL18). Стрелками указаны колонии трансформантов (1 ) и пережившие за счет
наличия экзогенной β-лактамазы колонии исходного штамма E. carotovora RC5297 (2 )
формировать клетки с частотой до 105–108 клеток на 1 мкг плазмидной ДНК. Одна-
ко такая частота характерна лишь для специальных штаммов Escherichia coli, например
JM109, HB101, TG1, и плазмид pUC18/19, pBR322, pBluescript [4, 8]. Для других же мик-
роорганизмов она значительно ниже. Например, для E. carotovora subsp. carotovora час-
тота трансформации составляет приблизительно 1 · 10
2–2,6 · 10
3 на 1 мкг ДНК плазмиды
pBR322 [9].
Одним из важных условий получения компетентных клеток и их успешной трансфор-
мации является плотность культуры и поддержание во время всех процедур температуры
на уровне 0–4 ◦С. Большинство описанных протоколов создания компетентности E. coli
с помощью хлорида кальция предполагают использование клеток в активной логарифми-
ческой фазе роста (2 ч при сильной аэрации для E. coli) [4]. Однако с применением это-
го подхода нам не удалось осуществить трансформацию E. carotovora RC5297. Одной из
причин этого может быть следующее. В независимых исследованиях было показано, что
периплазматическая фракция клеток E. carotovora после культивирования в течение 12 ч
содержит ферменты, деградирующие ДНК. К 24 часам пул этих ферментов в периплазме
резко уменьшается. Не исключено, что проведение трансформации в логарифмической фазе
роста не будет достаточно эффективным за счет накопления нуклеаз в периплазматичес-
ком пространстве. Поэтому для получения компетентных клеток использовали культуру,
которая достигала стационарной фазы роста в богатой LB-среде с интенсивной аэрацией
при 25 ◦С.
Тем не менее попытка создать Ca2+-зависимую компетентность клеток E. carotovora
RC5297 при помощи стандартного протокола для E. coli с использованием 0,1 М СaCl2
на 1 ·10
9 кл./мл оказалась неуспешной. Поэтому обработку клеток проводили в более жест-
ких условиях, используя 0,1 М CaCl2 на 5 · 10
8 кл./мл.
На LB-среде с 50 мкг/мл ампициллина после 20 ч инкубации были отобраны устойчи-
вые клоны — трансформанты E. carotovora RC5297, несущие плазмиду pECL18 (рис. 2).
При дальнейшей инкубации этих чашек вокруг больших колоний трансформантов появи-
лись более мелкие (см. рис. 2). Оказалось, что эти колонии, выросшие на среде с ампицил-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2007, №1 167
лином, не являются трансформантами. Хотя описанный феномен имеет самостоятельное
значение, однако его можно объяснить секрецией эрвиниями β-лактамазы — фермента,
разрушающего β-лактамное кольцо антибиотиков пенициллинового ряда — в окружающую
среду [10].
С помощью описанного выше метода удалось достичь частоты трансформации 2,8 · 10
3
на 1 мкг сверхспиральной ковалентнозамкнутой ДНК плазмиды pECL18, что является до-
вольно высоким показателем для E. carotovora [9]. Причем полученные трансформанты
оказались очень стабильными: частота потери плазмиды в отсутствие селективного прес-
са составляла менее 1%. В то время как для штамма E. carotovora RC5297, содержащего
плазмиду R68.45, частота ее потери достигала 67 % [11].
Известно, что при межвидовом и межродовом переносе плазмид характер их репликации
изменяется [9]. Поэтому выделенные из тарансформантов плазмиды были проанализирова-
ны в 0,8% агарозных гелях. Сравнительный анализ содержания плазмиды pECL18 в E. coli
JM109 и в E. carotovora RC5297 показал, что в этих двух штаммах она реплицируется в виде
двух форм — мономерной и димерной (см. рис. 1).
У некоторых трансформантов E. carotovora RC5297(pECL18) было проверено свойство
ограничивать развитие фагов. Для этого использовали clear-мутанты эрвиниофага ZF40.
В табл. 1 приведены показатели эффективности посева исходного и модифицированного на
штамме E. carotovora M2–4/50RI clear-мутанта c5/5 фага ZF40. Незначительное уменьшение
эффективности посева (в пределах одного порядка) фага ZF40 с5/5 на штамме с плазмидой
pECL18 свидетельствует о наличии частично модифицированных сайтов для рестриктазы
Ecl18kI на ДНК фага ZF40. В случае же модифицированного мутанта наблюдали значи-
тельное снижение эффективности посева (см. табл. 1). Эти результаты свидетельствуют
о том, что плазмида pECL18 нормально экспрессируется в клетках данного штамма, что
приводит к синтезу рестриктазы и ограничению развития фагов за счет гидролиза их ДНК.
Кроме того, из полученных результатов можно сделать вывод, что хозяйская RM-система
штамма E. carotovora RC5297 и привнесенная с плазмидой pECL18 RM-система ведут себя
автономно, т. е. ограничивают развитие фага независимо друг от друга (см. табл. 1).
Для подтверждения приведенных результатов проводили выделение нуклеаз из полу-
ченных трансформантов и контрольных штаммов. Как видно из рис. 3, нуклеаза Ecl18kI,
выделенная из штамма E. coli JM109(pECL18), гидролизует ДНК фага λ более чем на 14
фрагментов. Проверку сайтспецифической эндонуклеазной активности проводили также и
в лизатах клеток E. carotovora M2–4/50RI, RC5297 и RC5297(pECL18). Во всех этих случаях
наличия явных дискретных фрагментов ДНК λ не обнаружено (см. рис. 3), что может быть
связано с превалированием неспецифического гидролиза ДНК. Поэтому для идентифика-
ции дискретности фрагментов, полученных при гидролизе нуклеазами штамма E. carotovora
RC5297(pECL18), была использована программа TotalLab v.2.01. Установлено, что на фоне
продуктов неспецифического гидролиза присутствуют дискретные полосы ДНК, которые,
Таблица 1. Эффективность посева clear-мутантов фага ZF40 на различных штаммах E. carotovora
Штамм Erwinia carotovora
subsp. carotovora
Эффективность посева
c5/5 mod c5/5
RC5297 1,0 0,3 · 10−6
RC5297(pECL18) 0,35 менее 1 · 10−7
M2-4/50RI 0,9 · 10−5 1,0
168 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2007, №1
Рис. 3. Гидролиз ДНК фага λ нуклеазами из штаммов E. carotovora subsp. carotovora (1–3) и E. coli
JM109 (4, 5 ): 1 — ЕСА M2–4/50RI, 2 — ЕСА RC5297, 3 — ЕСА RC5297(pECL18), 4 — E. coli JM109(pECL18),
5 — E. coli JM109
очевидно, являются рестриктами Ecl18kI. Их наличие свидетельствует об экспрессии дан-
ной эндонуклеазы в клетках трансформантов E. carotovora RC5297(pECL18).
Таким образом, нами изучены особенности трансформации клеток E. carotovora subsp.
carotovora плазмидой pECL18 и получены трансформанты E. carotovora RC2597(pECL18)
с частотой 2,8 · 10
3 на 1 мкг плазмидной ДНК. Показано, что частота трансформации су-
щественно зависит от стадии роста культуры и от количества хлорида кальция, используе-
мого для получения компетентных клеток. Привнесенная с данной плазмидой и хозяйская
RM-системы ведут себя автономно, т. е. ограничивают развитие фага независимо друг от
друга. Полученные результаты являются предпосылкой для разработки биотехнологичес-
кой системы на основе непатогенной для человека бактерии E. carotovora, ее экзогенных
и эндогенных плазмид.
1. Кушкина А.И., Товкач Ф.И. Индикаторная система для изучения лизогенного развития умеренного
бактериофага ZF40 Erwinia carotovora // Мiкробiол. журн. – 2005. – 67, № 3. – С. 50–61.
2. Товкач Ф.И. Изучение фагоустойчивости Erwinia carotovora с помощью умеренного бактериофага
ZF40 // Микробиология. – 2002. – 71, № 1. – С. 82–88.
3. Zakharova M.V., Beletskaya I. V., Denjmukhametov M.M. Characterization of pECL18 and pKPNo 2. –
a proposed pathway for the evolution of two plasmids that carry identical genes for a type II restriction-
modification system // Mol. Genet. Genomics. – 2002. – 267, No 2. – P. 171–178.
4. Стикланд Ю.Е. Получение зондов и их мечение // Молекулярная клиническая диагностика. Мето-
ды / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. – Москва: Мир, 1999. – 558 с.
5. Kado C. I., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteri-
ol. – 1981. – 145, No 3. – P. 1365–1373.
6. Белавин П.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях
бактерий // Прикл. биохимия и микробиология. – 1988. – 24, № 1. – С. 121–124.
7. Hu N.T., Hung M.N., Chion S. J. et al. Cloning and characterization of a gene required for the secretion of
extracellular enzymes across the outer membrane by Xantomonas campestris pv. campestris // J. Bacteri-
ol. – 1992. – 174, No 8. – P. 2679–2687.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирова-
ние: Пер. с англ. – Москва: Мир, 1984. – 480 с.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2007, №1 169
9. Hinton J. C., Perombelon M.C., Salmond G. P. Efficient transformation of Erwinia carotovora subsp.
carotovora and E. carotovora subsp. atroseptica // J. Bacteriol. – 1985. – 161, No 2. – P. 786–788.
10. Черватюк Н. В, Товкач Ф.И. Влияние экзогенной плазмиды R68.45 на продуктивное и лизогенное
развитие умеренного бактериофага ZF40 Erwinia carotovora // Мiкробiол. журн. – 2006. – 68, № 2. –
С. 48–57.
11. Housby J.N., Thomas J. D., Wharam S.D. et al. Conditional mutations in OutE and OutL block exoenzyme
secretion across the Erwinia carotovora outher membrane // FEMS Microbial. Lett. – 1998. – 162, No 1. –
P. 91–102.
12. Товкач Ф.И. Популяционная гетерогенность коллекционных штаммов Erwinia carotovora subsp. caro-
tovora и ее связь с фаговой лизогенной конверсией // Микробиология и биотехнология XXI столетия:
Материалы междунар. конф. – Минск, 2002. – С. 103–104.
Поступило в редакцию 30.06.2006Институт микробиологии и вирусологии
им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
170 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2007, №1
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1911 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T15:18:47Z |
| publishDate | 2007 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Черватюк, Н.В. Товкач, Ф.И. Горб, Т.Е. 2008-09-03T13:12:59Z 2008-09-03T13:12:59Z 2007 Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 / Н.В. Черватюк, Ф.И. Товкач, Т.Е. Горб // Доп. НАН України. — 2007. — N 1. — С. 165–170. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/1911 579.254.2 Transformants Erwinia carotovora subsp. carotovora carrying pECL18 plasmid have been obtained with the help of the modified calcium method. The transformation frequency was 2.8 × 103 colonies per μg of plasmid DNA. It has been established that the calcium competence of E. carotovora could be obtained by subjecting the cell from the logarithmic phase of growth to 0.1 М CaCl2 per 5 × 108 cell/ml. The frequency of the spontaneous loss of pECL18 plasmid is less than 1%. The ability to restrict the phage reproduction and the nuclease synthesis by the transformants has been studied. Foreign and homing RM-systems are autonomous, i.e. inhibit the phage reproduction independently. The obtained data are the prerequisite to construct a biotechnological system on the basis of non-pathogenic E. carotovora. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Біологія Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 Article published earlier |
| spellingShingle | Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 Черватюк, Н.В. Товкач, Ф.И. Горб, Т.Е. Біологія |
| title | Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 |
| title_full | Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 |
| title_fullStr | Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 |
| title_full_unstemmed | Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 |
| title_short | Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 |
| title_sort | особенности трансформации клеток erwinia carotovora плазмидой pecl18 |
| topic | Біологія |
| topic_facet | Біологія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/1911 |
| work_keys_str_mv | AT červatûknv osobennostitransformaciikletokerwiniacarotovoraplazmidoipecl18 AT tovkačfi osobennostitransformaciikletokerwiniacarotovoraplazmidoipecl18 AT gorbte osobennostitransformaciikletokerwiniacarotovoraplazmidoipecl18 |