Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora
Запропоновано метод специфiчної селекцiї за допомогою каротоворицинiв типу фагових хвостових вiдросткiв, який дозволяє проводити ефективний вiдбiр популяцiйних дисоцiантiв рiзних типiв Erwinia carotovora. Показано, що спонтаннi дисоцiанти i дисоцiанти, одержанi за допомогою селекцiї бактерiоцинiв, в...
Saved in:
| Published in: | Доповіді НАН України |
|---|---|
| Date: | 2010 |
| Main Authors: | , , |
| Language: | Russian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2010
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19271 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora / Ф.И. Товкач, Л.В. Романюк, Т.Е. Горб // Доп. НАН України. — 2010. — № 1. — С. 164-169. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859662122449895424 |
|---|---|
| author | Товкач, Ф.И. Романюк, Л.В. Горб, Т.Е. |
| author_facet | Товкач, Ф.И. Романюк, Л.В. Горб, Т.Е. |
| citation_txt | Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora / Ф.И. Товкач, Л.В. Романюк, Т.Е. Горб // Доп. НАН України. — 2010. — № 1. — С. 164-169. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Доповіді НАН України |
| description | Запропоновано метод специфiчної селекцiї за допомогою каротоворицинiв типу фагових хвостових вiдросткiв, який дозволяє проводити ефективний вiдбiр популяцiйних дисоцiантiв рiзних типiв Erwinia carotovora. Показано, що спонтаннi дисоцiанти i дисоцiанти, одержанi за допомогою селекцiї бактерiоцинiв, вiдрiзняються колонiально-морфологiчними, ростовими характеристиками i такою бiохiмiчною ознакою, як синтез позаклiтинної пектатлiази. Встановлено, що змiна поверхневих структур дисоцiантiв приводить до змiни апаратiв секрецiї II i III типу — основних факторiв патогенностi пектолiтичних ервiнiй. Одержанi результати є передумовою для вивчення напряму i механiзму дисоцiацiї у практично важливої бактерiї Е. carotovora.
We propose a method of specific selection of dissociants of varions strains of Erwinia carotovora, by using carotovoricins that are identical to the phage tails. It is shown the spontaneous dissociants and those which were obtained by the selection of bacteriocins differ by morphological and growing features and by the synthesis of outer pectatlyase. It is found that the modifications of the surface structures of dissociants are the reason for the change of mode secretions of II and III types — the main factors of pathogenicity of pectolytic erwinia. The obtained data are the prerequisite for studying the direction and the mechanism of dissociation of such practically important bacteria as E. carotovora.
|
| first_indexed | 2025-11-30T10:20:36Z |
| fulltext |
УДК 579.842.1/.2:578.26:578.89
© 2010
Ф. И. Товкач, Л.В. Романюк, Т.Е. Горб
Использование макромолекулярных бактериоцинов
для селекции популяционных диссоциантов Erwinia
carotovora subsp. сarotovora
(Представлено членом-корреспондентом НАН Украины И. Г. Скрипалем)
Запропоновано метод специфiчної селекцiї за допомогою каротоворицинiв типу фагових
хвостових вiдросткiв, який дозволяє проводити ефективний вiдбiр популяцiйних дисоцi-
антiв рiзних типiв Erwinia carotovora. Показано, що спонтаннi дисоцiанти i дисоцiанти,
одержанi за допомогою селекцiї бактерiоцинiв, вiдрiзняються колонiально-морфологiчни-
ми, ростовими характеристиками i такою бiохiмiчною ознакою, як синтез позаклiтин-
ної пектатлiази. Встановлено, що змiна поверхневих структур дисоцiантiв приводить
до змiни апаратiв секрецiї II i III типу — основних факторiв патогенностi пектолiти-
чних ервiнiй. Одержанi результати є передумовою для вивчення напряму i механiзму
дисоцiацiї у практично важливої бактерiї Е. carotovora.
Популяционная диссоциация является одной из форм естественной изменчивости бакте-
рий. Ее результат — это расщепление однородной популяции на варианты, отличающиеся
от исходной формы морфологическими, культуральными, физиологическими и биохимиче-
скими признаками. Изменения при диссоциативных переходах носят постоянный и обра-
тимый характер и происходят с высокой частотой порядка 10
−2–10−4 на одно клеточное
деление. Частота процесса диссоциации на несколько порядков выше частоты спонтанных
мутаций [1].
Интерес к процессу диссоциации в последние годы значительно возрос в связи с ра-
звитием биотехнологии. Именно, нестабильность штаммов-продуцентов — одна из главных
причин снижения продуктивности микробов при синтезе биологически активных веществ.
Основной вклад в популяционное разнообразие вносят изменения в компонентах кле-
точных оболочек. У грамнегативных бактерий диссоциация затрагивает поверхностные
структуры или части наружной мембраны. Так, многочисленными биохимическими и им-
мунологическими исследованиями установлено, что диссоциативные варианты бактерий ха-
рактеризуются отсутствием или изменением О-специфических полисахаридных цепей или
отличаются по составу белков наружной оболочки по сравнению с исходной бактерией [2].
Так как диссоциация затрагивает поверхностные структуры или части наружной мем-
браны бактерии, то, соответственно, это приводит к утрате фаговых рецепторов [3]. Таким
образом, фаги могут быть применены для направленной и быстрой селекции популяцион-
ных диссоциантов.
Целью проведенного нами исследования было изучение возможности применения макро-
молекулярных каротоворицинов (МСТV) типа фаговых хвостовых отростков для селекции
популяционных диссоциантов и сравнение их с диссоциантами, полученными при спора-
дических отборах в ходе длительных наблюдений колониального роста Erwinia carotovora
subsp. сarotovora.
164 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2010, №1
В работе использовали коллекционные штаммы Е. carotovora subsp. сarotovora (Есс):
33А, 35А, 48А, 62А, 66А из музея бактериальных культур кафедры микробиологии Бело-
русского государственного университета, Минск (Ю.К. Фомичев), Есс 2 из музея Москов-
ской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (Е.В. Матвеева). Штамм Erwi-
nia sp. ZM1 выделен из пораженных клубней картофеля и предварительно идентифициро-
ван как E. carotovora (Т. Е. Горб, Ф.И. Товкач — Институт микробиологии и вирусологии
им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев).
Бактерии выращивали в полноценной (LB) и минимальной солевой среде А с лактозой
(0,2%), пектином (1,0%), а также на ЕМВ-агаре [4].
Для получения индуцированных лизатов эрвиний бактерии выращивали в минималь-
ной среде А с интенсивной аэрацией при 28 ◦C. По достижении клетками средины лога-
рифмической фазы роста (5,0·108 кл./мл) в среду добавляли митомицин С до конечной
концентрации 1,0 мкг/мл. Индуцированные лизаты обрабатывали хлороформом и осветв-
ляли центрифугированием при 8000 g, 45 мин. Обнаружение и титрование бактериоцинов
осуществляли методом негативных пятен [5].
Селекцию популяционных диссоциантов проводили на твердой среде с лактозой по сле-
дующей схеме. На бактериальные газоны наносили по 5 мкл исходного каротоворицина.
Чашки инкубировали 18 ч при 28 ◦C. Агаровые блоки размером 3 × 3 × 3 мм с клетками,
которые выжили после инфицирования указанным бактериоцином, вырезали в местах обра-
зования пятен. Затем их помещали в 2 мл жидкой среды LB и выращивали 18 ч при 28 ◦C.
Выросшие бактериальные клетки пассировали под селективным прессом бактериоцина до
получения устойчивых к нему диссоциантов.
Выделение плазмидных ДНК и их электрофоретический анализ проводили по мето-
ду [6]. Молекулярную массу криптических плазмид E. carotovora определяли как описано
ранее [7].
Гиперчувствительную реакцию исследовали на листьях табака. Бактериальные клетки
выращивали до плотности 2,0 · 10
8 кл./мл при 28 ◦C и отмывали солевой средой А. Полу-
ченной суспензией с помощью инсулинового шприца инокулировали полностью развитые
листья табака. Измеряли площадь заражения, которая была хорошо видна на внутренней
стороне листа. Растения анализировали через 48–72 ч после инокуляции, измеряя площадь
поражения [8]. Величину гиперчувствительной реакции (%) высчитывали как отношение
площади пораженного участка к общей площади заражения.
Исследования показали, что каротоворицины являются удобным инструментом для се-
лекции популяционных вариантов E. сarotovora. С их помощью были отобраны специфиче-
ские диссоцианты с нарушениями наружной оболочки бактериальной клетки. Установлено,
что в пределах одного и того же штамма для отбора таких диссоциантов пригодны пред-
ставители не менее шести групп бактериоцинов.
Обнаружено, что спонтанные диссоцианты и диссоцианты E. carotovora, полученные
при селекции бактериоцинами, имеют множественные изменения фенотипа. В результате
исследований роста бактерий родительских штаммов и их фенотипических производных
установлено, что на среде с лактозой хорошо различаются S-колонии ветвистой формы
и неветвистые R-колонии. Такой рост отсутствует на среде с пектином (рис. 1).
Вариабельность диссоциантов S- и R-типов наблюдали по изменению скорости линей-
ного роста колоний. Она существенно уменьшалась у R-вариантов (рис. 2).
Использование дифференциальной среды с эозин-метиленовым-синим показало, что ин-
тенсивность развития окраски растущих колоний в случае диссоциантов происходит зна-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2010, №1 165
Рис. 1. Морфологические различия диссоциантов Есс 66А на среде А с лактозой (а) и пектином (б ). Пяти-
значные числа — лабораторные номера диссоциантов
Рис. 2. Рост колоний S- (1 ) и R-диссоциантов (2, 3, 4 ) штамма Есс 33А на твердой минимальной среде
с лактозой
чительно медленнее, чем у природных штаммов E. carotovora. На этой среде колонии дис-
социативных вариантов имели вид сухих “звездочек”, были выпуклыми или шероховатыми
(рис. 3).
Для установления связи между возникновением фенотипических вариантов и измене-
нием плазмидного спектра бактериальные клетки проверяли на содержание экстрахромо-
сом. Показано, что процесс диссоциации не затрагивает плазмидный состав клеток и спектр
экстрахромосом остается неизменным у всех исследуемых диссоциантов.
Таким образом, спонтанные диссоцианты и варианты, отобранные с помощью бактери-
оцинов, отличаются от родительских штаммов E. carotovora по росту на средах с лактозой,
пектином и эозин-метиленовым-синим. Такие колониально-морфологические изменения не
связаны с потерей криптических плазмид [7].
Далее мы исследовали влияние популяционной диссоциации на патогенность. У фито-
патогенной бактерии E. carotovora обратимые изменения поверхностных структур клетки,
при которых обычно меняется морфология колоний, могут рассматриваться исключитель-
166 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2010, №1
Рис. 3. Гетерогенность популяционных диссоциантов штамма Есс 2 на среде ЕМВ. 2/S1 — исходный штамм;
2/Т2, 2/RI и 2/М3 — диссоцианты R-типа
но с точки зрения способности вызывать патогенный процесс. Ключевая роль в нем прина-
длежит комплексу пектолитических ферментов, основную долю которых составляют вне-
клеточные пектатлиазы. Именно, внеклеточная локализация активного фермента, который
обеспечивает эффективный гидролиз пектиковых компонентов клеточной стенки растения
и составляет особенность поражения растения-хозяина этой бактерией.
Ранее в тесте на патогенность с использованием ткани клубня картофеля было установ-
лено, что исходные штаммы эрвиний и различные популяционные диссоцианты вызывают
развитие поражений двух типов — так называемой черной и белой гнили [9]. При чер-
ной гнили нарушается целостность растительной ткани, что приводит к осмотическому
шоку клеток. Белая гниль является следствием преимущественного разрушения средин-
ной пластинки растительной ткани. Эти данные свидетельствуют о том, что на уровне се-
креции II типа популяционная диссоциация может действительно влиять на патогенность
E. carotovora.
Однако патогенный процесс у эрвиний в основном обусловлен системами секреции II
и III типа, функционирование которых, как установлено, является взаимосвязанным. Сис-
тема секреции III типа задействована в формировании вирулентности на ранней стадии
развития инфекции. Об эффективности ее действия можно судить по интенсивности гипер-
чувствительной реакции, которая является специфическим защитным механизмом против
патогена в устойчивых индикаторных растениях. Опыты показали, что селектированные
каротоворицинами диссоцианты имеют разную степень гиперчувствительной реакции, ко-
торая проявляется характерными поражениями (рис. 4).
Таким образом, можно предположить, что изменения поверхностных структур клетки
E. carotovora приводит к изменению аппарата секреции II и III типа. При этом происходят
нарушения локализации внеклеточной пектатлиазы, а также других экстрацеллюлярных
ферментов [9]. Не исключено, что такие нарушения приводят к изменению патогенности
микроба по отношению к растению. Особенно наглядно это видно на примере селекцион-
ного популяционного диссоцианта 62A-RC5195 (табл. 1). Следует подчеркнуть, что у этого
диссоцианта R-типа, кроме значительного усиления реакции гиперчувствительности и уве-
личения количества экзогенной пектатлиазы, возникают способность к репродукции ба-
ктериофага Т7 и неспособность к адсорбции фага ZF40 [10]. Последнее свидетельствует
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2010, №1 167
Рис. 4. Реакция гиперчувствительности, вызванная штаммом Есс 62А и его диссоциантами на листьях
табака. 1 — незараженный лист; 2 — Есс 62А; 3 — Есс 62А-5d; 4 — Есс 62А-RC5297; 5 — Есс 62А-RC5S-3;
6 — Есс 62А-RC5195
Таблица 1. Гиперчувствительная реакция, пектолитическая активность и чувствительность диссоциантов
к фагам
Штамм
Есс
Гиперчувствительная
реакция (HR), %
Удельная пектолитическая
активность, % к контролю
Чувствительность
к фагам
ZF40 T7
62А 51,5 100,0 + −
RC5195 68,0 200,0 − +
о глубоком изменении структуры S-LPS. Наличие такого типа диссоциантов создает пер-
спективы для фундаментального изучения процесса секреции II и III типа как основных
факторов патогенности E. carotovora.
Таким образом, предложенный метод специфической селекции с помощью каротово-
рицинов — типа фаговых хвостовых отростков позволяет проводить эффективный отбор
популяционных диссоциантов различных типов и изучать направление, скорость, причины
и механизмы процесса диссоциации, а также причастность к этому процессу умеренных
фагов у важной фитопатогенной бактерии E. carotovora.
1. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. – Москва:
Изд-во Моск. ун-та, 1991. – 144 с.
2. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П. и др. Нетипичный характер R-S диссоциации
Azospirillum brasiilense // Микробиология. – 2003. – 72, № 1. – С. 60–63.
3. Милько Е.С., Егоров Н.С. О роли умеренного фага в диссоциации бактерий // Биол. науки. – 1986. –
№ 4. – С. 6–19.
4. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. – Москва: Мир, 1976. – 436 с.
5. Товкач Ф.И. Биологические свойства и классификация бактериоцинов Erwinia carotovora // Микро-
биология. – 1998. – 67, № 6. – С. 767–774.
6. Kado C. I., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteri-
ol. – 1981. – 145, No 3. – P. 1365–1373.
7. Товкач Ф.И. Выделение и предварительная характеристика криптических плазмид Erwinia caroto-
vora // Микробиология. – 2001. – 70, № 6. – С. 804–810.
8. Jap M.-N., Barak J. D., Charkowski A.O. Genomic diversity of Erwinia carotovora subsp. carotovora and
its correlation with virulence // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – 70, No 5. – P. 3013–3023.
9. Кушкина А.И., Романюк Л.В., Горб Т. Е., Товкач Ф.И. Влияние профага ZF40 на секрецию пектат-
лиазы у Erwinia carotovora // Доп. НАН України. – 2006. – № 6. – С. 154–156.
168 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2010, №1
10. Товкач Ф.И. Изучение фагоустойчивости Erwinia carotovora с помощью умеренного бактериофага
ZF40 // Микробиология. – 2002. – 71, № 1. – С. 82–88.
Поступило в редакцию 06.04.2009Институт микробиологии и вирусологии
им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
F. I. Tovkach, L.V. Romanyuk, T. E. Gorb
The selection of populative dissociants of Erwinia carotovora subsp.
carotovora with the use of macromolecular bacteriocins
We propose a method of specific selection of dissociants of varions strains of Erwinia carotovora,
by using carotovoricins that are identical to the phage tails. It is shown the spontaneous dissociants
and those which were obtained by the selection of bacteriocins differ by morphological and growing
features and by the synthesis of outer pectatlyase. It is found that the modifications of the surface
structures of dissociants are the reason for the change of mode secretions of II and III types —
the main factors of pathogenicity of pectolytic erwinia. The obtained data are the prerequisite for
studying the direction and the mechanism of dissociation of such practically important bacteria as
E. carotovora.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2010, №1 169
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-19271 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-30T10:20:36Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Товкач, Ф.И. Романюк, Л.В. Горб, Т.Е. 2011-04-23T17:18:26Z 2011-04-23T17:18:26Z 2010 Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora / Ф.И. Товкач, Л.В. Романюк, Т.Е. Горб // Доп. НАН України. — 2010. — № 1. — С. 164-169. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19271 579.842.1/.2:578.26:578.89 Запропоновано метод специфiчної селекцiї за допомогою каротоворицинiв типу фагових хвостових вiдросткiв, який дозволяє проводити ефективний вiдбiр популяцiйних дисоцiантiв рiзних типiв Erwinia carotovora. Показано, що спонтаннi дисоцiанти i дисоцiанти, одержанi за допомогою селекцiї бактерiоцинiв, вiдрiзняються колонiально-морфологiчними, ростовими характеристиками i такою бiохiмiчною ознакою, як синтез позаклiтинної пектатлiази. Встановлено, що змiна поверхневих структур дисоцiантiв приводить до змiни апаратiв секрецiї II i III типу — основних факторiв патогенностi пектолiтичних ервiнiй. Одержанi результати є передумовою для вивчення напряму i механiзму дисоцiацiї у практично важливої бактерiї Е. carotovora. We propose a method of specific selection of dissociants of varions strains of Erwinia carotovora, by using carotovoricins that are identical to the phage tails. It is shown the spontaneous dissociants and those which were obtained by the selection of bacteriocins differ by morphological and growing features and by the synthesis of outer pectatlyase. It is found that the modifications of the surface structures of dissociants are the reason for the change of mode secretions of II and III types — the main factors of pathogenicity of pectolytic erwinia. The obtained data are the prerequisite for studying the direction and the mechanism of dissociation of such practically important bacteria as E. carotovora. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Доповіді НАН України Біологія Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora The selection of populative dissociants of Erwinia carotovora subsp. carotovora with the use of macromolecular bacteriocins published earlier |
| spellingShingle | Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora Товкач, Ф.И. Романюк, Л.В. Горб, Т.Е. Біологія |
| title | Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora |
| title_alt | The selection of populative dissociants of Erwinia carotovora subsp. carotovora with the use of macromolecular bacteriocins |
| title_full | Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora |
| title_fullStr | Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora |
| title_full_unstemmed | Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora |
| title_short | Использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов Erwinia carotovora subsp. сarotovora |
| title_sort | использование макромолекулярных бактериоцинов для селекции популяционных диссоциантов erwinia carotovora subsp. сarotovora |
| topic | Біологія |
| topic_facet | Біологія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/19271 |
| work_keys_str_mv | AT tovkačfi ispolʹzovaniemakromolekulârnyhbakteriocinovdlâselekciipopulâcionnyhdissociantoverwiniacarotovorasubspsarotovora AT romanûklv ispolʹzovaniemakromolekulârnyhbakteriocinovdlâselekciipopulâcionnyhdissociantoverwiniacarotovorasubspsarotovora AT gorbte ispolʹzovaniemakromolekulârnyhbakteriocinovdlâselekciipopulâcionnyhdissociantoverwiniacarotovorasubspsarotovora AT tovkačfi theselectionofpopulativedissociantsoferwiniacarotovorasubspcarotovorawiththeuseofmacromolecularbacteriocins AT romanûklv theselectionofpopulativedissociantsoferwiniacarotovorasubspcarotovorawiththeuseofmacromolecularbacteriocins AT gorbte theselectionofpopulativedissociantsoferwiniacarotovorasubspcarotovorawiththeuseofmacromolecularbacteriocins |