Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека

Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека

Розроблені твердофазнi імуноферментні тест-системи для визначення загального та антиендотоксинового секреторного ІgA людини. Основною областю застосування сконструйованих тест-систем є дослідження, спрямовані на подальше вивчення ролі мукозального імунітету в патогенезі широкого кола...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:Таврический медико-биологический вестник
Datum:2009
1. Verfasser: Гордиенко, А.И.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Кримський науковий центр НАН України і МОН України 2009
Schlagworte:
Экспериментально-теоретические вопросы
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/25325
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека / А.И. Гордиенко // Таврический медико-биологический вестник. — 2009. — Т. 12, № 3 (47). — С. 82-89. — Бібліогр.: 23 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-25325
record_format dspace
spelling Гордиенко, А.И.
2011-08-04T09:23:48Z
2011-08-04T09:23:48Z
2009
Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека / А.И. Гордиенко // Таврический медико-биологический вестник. — 2009. — Т. 12, № 3 (47). — С. 82-89. — Бібліогр.: 23 назв. — рос.
2070-8092
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/25325
57.083.3
Розроблені твердофазнi імуноферментні тест-системи для визначення загального та антиендотоксинового секреторного ІgA людини. Основною областю застосування сконструйованих тест-систем є дослідження, спрямовані на подальше вивчення ролі мукозального імунітету в патогенезі широкого кола захворювань людини. Крім того, дані тест-системи можуть бути використані для оцінки ефективності застосування мукозальных вакцин і полібактеріальних імуностимуляторів, що роблять переважний вплив на MALT-систему.
Quantitative two-site and indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of total and antiendotoxin human sIgA are developed. The basic area of application of the designed ELISA are investigations of role mucosal immunity in pathogenesis of human diseases. Designed ELISA can be used for an estimation of efficiency of mucosal vaccines and polybacterial immunostimulators, rendering primary influence on MALT-system.
ru
Кримський науковий центр НАН України і МОН України
Таврический медико-биологический вестник
Экспериментально-теоретические вопросы
Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека
Використання твердофазного iмуноферментного аналізу для визначення загального та антиeндотоксинового секреторного ІgA людини
Quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for determination of total and antiendotoxin human secretory IgA
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека
spellingShingle Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека
Гордиенко, А.И.
Экспериментально-теоретические вопросы
title_short Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека
title_full Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека
title_fullStr Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека
title_full_unstemmed Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека
title_sort использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного iga человека
author Гордиенко, А.И.
author_facet Гордиенко, А.И.
topic Экспериментально-теоретические вопросы
topic_facet Экспериментально-теоретические вопросы
publishDate 2009
language Russian
container_title Таврический медико-биологический вестник
publisher Кримський науковий центр НАН України і МОН України
format Article
title_alt Використання твердофазного iмуноферментного аналізу для визначення загального та антиeндотоксинового секреторного ІgA людини
Quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for determination of total and antiendotoxin human secretory IgA
description Розроблені твердофазнi імуноферментні тест-системи для визначення загального та антиендотоксинового секреторного ІgA людини. Основною областю застосування сконструйованих тест-систем є дослідження, спрямовані на подальше вивчення ролі мукозального імунітету в патогенезі широкого кола захворювань людини. Крім того, дані тест-системи можуть бути використані для оцінки ефективності застосування мукозальных вакцин і полібактеріальних імуностимуляторів, що роблять переважний вплив на MALT-систему. Quantitative two-site and indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of total and antiendotoxin human sIgA are developed. The basic area of application of the designed ELISA are investigations of role mucosal immunity in pathogenesis of human diseases. Designed ELISA can be used for an estimation of efficiency of mucosal vaccines and polybacterial immunostimulators, rendering primary influence on MALT-system.
issn 2070-8092
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/25325
citation_txt Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека / А.И. Гордиенко // Таврический медико-биологический вестник. — 2009. — Т. 12, № 3 (47). — С. 82-89. — Бібліогр.: 23 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT gordienkoai ispolʹzovanietverdofaznogoimmunofermentnogoanalizadlâopredeleniâobŝegoiantiéndotoksinovogosekretornogoigačeloveka
AT gordienkoai vikoristannâtverdofaznogoimunofermentnogoanalízudlâviznačennâzagalʹnogotaantiendotoksinovogosekretornogoígalûdini
AT gordienkoai quantitativeenzymelinkedimmunosorbentassayfordeterminationoftotalandantiendotoxinhumansecretoryiga
first_indexed 2025-11-26T07:17:41Z
last_indexed 2025-11-26T07:17:41Z
_version_ 1850616882979143680
fulltext 82 ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК2009, том 12, № 3 (47) УДК 57.083.3 © А. И. Гордиенко, 2009. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО И АНТИЭНДОТОКСИНОВОГО СЕКРЕТОРНОГО IGA ЧЕЛОВЕКА А. И. Гордиенко Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, г. Симферополь. QUANTITATIVE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FOR DETERMINATION OF TOTALAND ANTIENDOTOXIN HUMAN SECRETORY IGA A. I. Gordienko SUMMARY Quantitative two-site and indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of total and antiendotoxin human sIgA are developed. The basic area of application of the designed ELISA are investigations of role mucosal immunity in pathogenesis of human diseases. Designed ELISA can be used for an estimation of efficiency of mucosal vaccines and polybacterial immunostimulators, rendering primary influence on MALT-system. ВИКОРИСТАННЯ ТВЕРДОФАЗНОГО IМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ЗАГАЛЬНОГО ТА АНТИEНДОТОКСИНОВОГО СЕКРЕТОРНОГО ІGA ЛЮДИНИ А. I. Гордiєнко РЕЗЮМЕ Розроблені твердофазнi імуноферментні тест-системи для визначення загального та антиендотоксинового секреторного ІgA людини. Основною областю застосування сконструйованих тест-систем є дослідження, спрямовані на подальше вивчення ролі мукозального імунітету в патогенезі широкого кола захворювань людини. Крім того, дані тест-системи можуть бути використані для оцінки ефективності застосування мукозальных вакцин і полібактеріальних імуностимуляторів, що роблять переважний вплив на MALT-систему. Ключевые слова: твердофазный иммуноферментный анализ, определение общего и антиэндотоксинового секреторного IgA человека. Секреторный иммуноглобулин А (sIgA) являет- ся основной эффекторной молекулой системы му- козального иммунитета и составляет большую часть иммуноглобулинов в секретах слизистой оболочки носа, бронхов, кишок, а также в слюне и молозиве. В отличие от сывороточного IgA, sIgA представляет собой полимерную молекулу, которая чаще всего состоит из двух или четырех мономерных субъеди- ниц IgA, соединенных между собой J-цепью - не- большим полипептидом с молекулярной массой (ММ) 15 кДа. Кроме того, в состав sIgA входит секре- торный компонент (SC) – полипептид с ММ около 80 кДа, который является протеолитическим фрагмен- том внеклеточной части полимерного иммуногло- булинового рецептора (pIgR), обеспечивающего трансэпителиальный транспорт IgA-димеров [1-4]. sIgA играет важную роль в защите мукозальных поверхностей (МП) от колонизации и инвазии пато- генными бактериями, вирусами и простейшими. В течение дня в просвет желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) взрослого человека секретируется около 40 мг sIgA в пересчете на 1 кг массы тела, что почти в 1,5 раза превышает ежедневную продукцию IgG (око- ло 30 мг/кг). При этом sIgA способен формировать иммунные комплексы (ИК) не только с инфекцион- ными агентами и их компонентами, которые нахо- дятся на МП, но и с теми из них, которые в силу опре- деленных причин преодолевают эпителиальный ба- рьер и проникают непосредственно в lamina propria. В последнем случае образующиеся ИК при участии pIgR снова транслоцируются на МП, что служит од- ним из важных механизмов поддержания “иммуно- структурного” гомеостаза внутренней среды орга- низма. Вместе с тем sIgA индифферентен по отно- шению к нормальной симбионтной микрофлоре МП. К тому же в отличие от других иммуноглобулинов, sIgA не взаимодействует с компонентами системы комплемента, и поэтому образуемые им ИК не ока- зывают повреждающего действия на МП [5-8]. По данным литературы, вследствие ряда особен- ностей, присущих структурно-функциональной орга- низации мукозальной иммунной системы, антиген- ное воздействие на индуктивные сайты лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником (Gut- Associated Lymphoid Tissue, GALT), сопровождает- ся развитием иммунного ответа не только в ЖКТ, но и в других органах, имеющих МП [6, 7, 9, 10]. Благода- ря этому представляется возможным по содержанию и динамике изменений уровней антител различных классов в таком легкодоступном биологическом ма- териале, каковым является слюна, изучать не только местный иммунитет ротовой полости, но и в опреде- ленной мере оценивать состояние эффекторного зве- на системы мукозального иммунитета в целом. В 83 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ одной из недавних работ немецких исследователей было показано, что у детей с гемолитическими энте- ропатиями повышение содержания в слюне IgA и IgM, специфичных к ЛПС E. coli O157, может слу- жить чувствительным иммунологическим маркером кишечных заболеваний, вызываемых этим микроор- ганизмом [11]. Однократная парентеральная вакци- нация обезьян рибосомальной вакциной Shigella sonnei (РВЗ) приводила не только к нарастанию уров- ней специфических IgA-, IgM- и IgG-антител в сыво- ротке крови, но и к появлению специфических sIgA- антител в слюне. При этом как парентеральная им- мунизация РВЗ, так и пероральное заражение жи- вотных вирулентной культурой S. sonnei вызывали сходную по интенсивности стимуляцию мукозально- го иммунитета [12]. Значительный интерес, на наш взгляд, может представлять исследование уровней sIgA, специфич- ных к антигенным детерминантам липополисахари- дов (ЛПС) энтеробактерий. В силу целого ряда об- стоятельств ЛПС относятся к числу облигатных анти- генов естественной среды обитания человека. С од- ной стороны, это определяется тем, что множество видов грамотрицательных микроорганизмов не толь- ко повсеместно распространены в окружающей сре- де, но и колонизируют МП тела человека. С другой стороны, ЛПС обладают высокой химической ста- бильностью. Так, например, для полной термичес- кой инактивации ЛПС необходима 4-часовая экспо- зиция при +160єС. Поэтому в следовых количествах ЛПС присутствуют практически везде: в воде, возду- хе, пищевых продуктах, домашней пыли и т.д. При этом в зависимости от места проживания (город или сельская местность), а также от климатических и са- нитарно-гигиенических условий, концентрация ЛПС, контаминирующих объекты окружающей среды, может существенно варьировать [13, 14]. Помимо внешней среды, естественным резерву- аром ЛПС и одним из важных источников их поступ- ления в организм человека являются дистальные от- делы ЖКТ. Нормоценотическая микрофлора кишеч- ника, представленная в том числе и широким спект- ром различных видов грамотрицательных бактерий, играет существенную роль в формировании GALT- системы и поддержании ее нормального функцио- нирования. Показано, что у мышей, выросших в гно- тобиотических условиях, наблюдается недоразвитие иммунокомпетентных органов и уменьшение бакте- рицидной и фагоцитарной активности плазмы кро- ви; в слизистой оболочке кишечника таких живот- ных имеет место существенный дефицит IgA-плаз- мацитов, а в сыворотке крови практически не обна- руживается IgA и понижено содержание IgM и IgG. Колонизация кишечника мышей-гнотобионтов мик- рофлорой, выделенной от обычных мышей, приво- дит к довольно быстрой нормализации указанных показателей. При этом позитивный вектор воздей- ствия кишечной микрофлоры на GALT-систему во многом обусловлен стимулирующим влиянием ЛПС на лимфоидные структуры ЖКТ [15]. Таким образом, в силу перечисленных выше обстоятельств все МП организма человека постоян- но в большей или меньшей степени контактируют с ЛПС широкого спектра грамотрицательных бакте- рий. Представляется достаточно очевидным, что та- кая перманентная антигенная стимуляция ЛПС MALT-системы должна проявляться в поддержании некоторого сугубо индивидуального базового уров- ня синтеза антиэндотоксиновых sIgA различной спе- цифичности (анти-ЛПС-sIgA), включая антитела к высококонсервативным антигенным эпитопам внут- ренней области олигосахаридного кора (анти-Кор- sIgA). Следовательно, с помощью мониторинга за содержанием анти-ЛПС-sIgA и анти-Кор-sIgA мож- но оценивать не только уровень антигенного воздей- ствия ЛПС на индуктивные сайты GALT-системы, но и, в определенной мере, контролировать функцио- нальное состояние системы мукозального иммуни- тета в целом. Особенно информативным такой под- ход может оказаться при оценке эффективности при- менения иммудомодуляторов и мукозальных вакцин, оказывающих преимущественное влияние на пара- метры мукозального иммунитета. Тем не менее, ана- лиз доступной нам литературы показал, что исследо- вания, посвященные проблеме изучения мукозаль- ного антиэндотоксинового иммунитета, опосредуе- мого антиэндотоксиновыми sIgA и реализуемого непосредственно на МП - т.е., там, где находится пер- вая линия иммунной защиты организма от потока разнообразных антигенов, включая ЛПС, до настоя- щего времени практически не проводились, что в первую очередь связано с отсутствием соответству- ющей методологической базы. В связи с этим целью данной работы являлось конструирование твердо- фазных иммуноферментных тест-систем, предназна- ченных для количественного определения sIgA, спе- цифичных к антигенным эпитопам ЛПС энтеробак- терий, включая высококонсервативные антигенные детерминанты внутренней области олигосахаридно- го кора молекулы ЛПС, а также общего sIgA. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Источником антител, специфичных к sIgA чело- века (анти-sIgA-АТ), служила коммерческая козья антисыворотка к sIgA человека (ООО “Микрофло- ра” при МНИИ им. Г.Н. Габричевского, Россия). Фракцию IgG, содержащую в своем составе анти- sIgA-АТ, выделяли преципитацией сульфатом аммо- ния и дополнительно очищали ионообменной хро- матографией на DEAE-целлюлозе [16]. Иммунопе- роксидазный конъюгат (анти-sIgA*HRP) получали конъюгированием очищенных анти-sIgA-АТ с перок- сидазой хрена перйодатным методом [17]. В качестве антигенов при определении анти-ЛПС- 84 ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК2009, том 12, № 3 (47) sIgA различной специфичности использовали ком- мерческие препараты ЛПС Escherichia coli K235 и Salmonella minnesota Re-595 (Sigma Chem. Co., USA). Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА) проводили по следующей общей схеме. Для получения слоя иммуносорбента при определении анти-ЛПС-sIgA и анти-Кор-sIgA в лунках полистиро- ловых планшетов (Costar 9017, USA) иммобилизова- ли соответственно ЛПС E. coli K235 и S. minnesota Re-595, используя для этого методические подходы, разработанные нами ранее [19, 20, 21]. Концентра- ция указанных антигенов в буфере для иммобилиза- ции составляла 10 мкг/мл. При определении общего sIgA слоем иммуносорбента на твердой фазе слу- жили очищенные анти-sIgA-АТ, которые иммобили- зовали физической сорбцией из 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1%-й NaCl (PBS) в те- чение 12-14 час при комнатной температуре (18- 20°С). Для удаления несвязавшихся компонентов и бло- кирования свободных центров связывания лунки промывали (4 раза по 1 мин) PBS, содержащим 0,05%- й Tween-20 (ICN, USA) (PBS-T). Затем в лунки после- довательно вносили по 100 мкл разведенной PBS-T ротовой жидкости (1:10 при определении анти-ЛПС- sIgA или 1:200 при анализе общего sIgA) или стан- дарта sIgA человека, и иммунопероксидазного ко- ньюгата анти-sIgA*HRP. Для оценки уровня неспе- цифических реакций лунки с иммобилизованными препаратами ЛПС или анти-sIgA-АТ обрабатывали только коньюгатом анти-sIgA*HRP в соответствую- щем разведении. С каждым реагентом проводили 60- минутную инкубацию при 37°С. Неспецифически связавшиеся компоненты после каждого этапа тИФА удаляли промывкой лунок PBS-T (4 раза по 1 мин). Для регистрации пероксидазной активности в лунки вносили по 100 мкл 30 мМ фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0), содержащего 0,33 мг/мл о-фенилен- диамина (Sigma Chem. Co., USA) и 0,02% H 2 O 2 , и ин- кубировали 60 мин при 37°С. Реакцию останавлива- ли прибавлением в лунки 25 мкл 3М серной кислоты. Оптическую плотность конечного продукта фермен- тативной реакции определяли с помощью иммуно- ферментного анализатора Stat Fax 2100 (Awareness Tech. Inc., USA) при длине волны 492 нм. Для постро- ения калибровочной кривой при определении кон- центрации sIgA в образцах ротовой жидкости исполь- зовали коммерческий стандарт sIgA человека (ООО “Микрофлора” при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевс- кого, Россия). Все эксперименты проводили в 3-кратной по- вторности. Каждая точка кривых на рисунках, приве- денных в разделе “Результаты и обсуждение”, пред- ставляет собой среднее значение, полученное для 3 параллельных опытов. При этом величина стандарт- ной ошибки не превышала 7% от среднего значения измеряемого показателя. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ По данным литературы, содержание общего sIgA в слюне практически здоровых людей достаточно высоко и в среднем составляет 70-110 мг/л [21]. Это обстоятельство значительно упрощает конструиро- вание иммуноферментного диагностикума, предназ- наченного для количественного определения концен- трации общего sIgA в биологических жидкостях, по- скольку в данном случае нет необходимости доби- ваться предельной чувствительности анализа, доста- точно обеспечить его специфичность и воспроизво- димость. Из всего многообразия известных на сегод- няшний день различных вариантов тИФА, отличаю- щихся по характеру используемых реагентов и пос- ледовательности отдельных этапов [22], для решения поставленной задачи был выбран двухцентровый метод тИФА (или так называемый “sandwich”-метод), который включает две последовательные стадии. На первой стадии анти-sIgA-АТ, иммобилизованные на поверхности твердой фазы, взаимодействуют с нахо- дящимся в тестируемом образце sIgA, образуя спе- цифический комплекс {антитело-антиген}. На второй стадии твердую фазу отмывают от несвязавшихся компонентов и инкубируют с анти-sIgA-АТ, конью- гированными с ферментативной меткой. После про- мывки, необходимой для удаления непрореагировав- шего с нерастворимым носителем коньюгата вторич- ных антител с ферментом, регистрируют фермента- тивную активность на твердофазном носителе, кото- рая будет пропорциональна концентрации исследу- емого антигена. Для выявления антиэндотоксиновых sIgA различ- ной специфичности за основу был взят непрямой вариант тИФА, также состоящий из двух этапов. На первом этапе специфические sIgA, присутствующие в анализируемом биологическом материале, форми- руют иммунные комплексы с иммобилизованным на твердой фазе антигенами, которыми в данном слу- чае служили ЛПС E. coli K235 и S. minnesota Re-595. На втором этапе образовавшиеся иммунные комп- лексы {ЛПС-sIgA} выявляют с помощью вторичных антител к sIgA, несущих ферментативную метку. Таким образом, в основе выбранных вариантов тИФА лежат специфическое иммунохимическое вза- имодействие (СпИВ) и неспецифическое адсорбци- онное взаимодействие (НсАВ). СпИВ между имму- нологически активными компонентами определяет специфичность тест-системы, тогда как роль НсАВ неоднозначна: с одной стороны, НсАВ типа “твердая фаза-белок” или “твердая фаза-ЛПС” позволяют сфор- мировать слой иммуносорбента на поверхности твер- дой фазы; с другой стороны – НсАВ типа “белок- белок” и/или “ЛПС-белок” ведут к появлению фоно- вого сигнала, лимитирующего чувствительность тест- системы. Поскольку СпИВ и НсАВ зависят от целого ряда физико-химических факторов (температура, ионная сила и рН реакционной среды; концентраци- 85 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ онные соотношения компонентов и продолжитель- ность их взаимодействия), при конструировании со- ответствующих тест-систем необходим эмпиричес- кий подбор оптимальных параметров проведения реакции для конкретной пары {антиген-антитело} [22]. 2,5 5 10 20 1 2 3 4 - 1:2000 - 1:4000 - 1:8000 - 1:16000 Разведение коньюгата анти-sIgA*HRP Анти-sIgA-АТ, мкг/мл О тн о ш е н и е [ cи гн ал /ф о н ] Рис. 1. Оптимизация условий проведения двухцентрового тИФА для количественного определения sIgA человека. Иммуноферментная тест-система для количе- ственного определения общего sIgA В случае тест-системы, предназначенной для ко- личественного определения общего sIgA, оптими- зируемыми параметрами были концентрация анти- sIgA-АТ в буфере для иммобилизации на первой стадии тИФА и разведение иммунопероксидазного коньюгата анти-sIgA*HRP на второй стадии тИФА. Критерием оптимизации служило получение макси- мальной величины полезного сигнала при мини- мальном уровне неспецифического связывания для фиксированной концентрации стандарта sIgA чело- века (0,5 мкг/мл), поскольку известно, что высокая чувствительность и воспроизводимость тИФА дос- тигается при как можно более высоком значении это- го показателя [22]. Слой иммуносорбента для sIgA на твердой фазе получали наиболее простым, но в тоже время достаточно эффективным методом - физической сорбцией анти-sIgA-АТ из 0,01 М фос- фатного буфера (рН 7,4), содержащего 1%-й NaCl и 0,05%-й азид натрия. Сорбцию проводили при ком- натной температуре (18-22 С) в течение 12-14 час; при этом концентрация анти-sIgA-АТ в буфере для иммобилизации изменяли от 20 мкг/мл до 0,31 мкг/ мл с 2-кратным шагом. Разведение иммуноперокси- дазного коньюгата анти-sIgA-HRP также варьирова- ло с 2-кратным шагом от 1:2000 до 1:16000. Графи- ческий анализ результатов "шахматного титрования" показал (Рис. 1), что при указанных выше условиях максимальное отношение полезный сигнал/фон до- стигается в том случае, если концентрация анти-sIgA- АТ в буфере для иммобилизации составляет 5 мкг/ мл, а разведение анти-sIgA*HRP - 1:8000. Эти пара- метры и были приняты в качестве рабочих при раз- работке иммуноферментного диагностикума для определения общего sIgA человека (Рис. 2). Сконструированная твердофазная иммунофер- ментная тест-система для количественного опреде- ления общего sIgA (Табл. 1) имеет высокую чувстви- тельность, специфичность и хорошую воспроизво- димость и может быть использована для анализа со- держания общего sIgA в слюне и других биологи- ческих жидкостях. Типичная калибровочная кривая зависимости экстинкции конечного продукта фер- ментативной реакции от логарифма концентрации sIgA (Рис. 3) в диапазоне концентраций от 0,1 до 5 мкг/мл имеет линейную форму и может быть с вы- сокой степенью точности аппроксимирована с по- мощью процедуры [Добавить линию тренда…], встроенной в Microsoft Excel. С этой же целью могут быть использованы и другие программные продук- ты, включая их бесплатные и/или условно бесплат- ные версии, достаточно широко представленные в Интернете. Применение соответствующего про- граммного обеспечения значительно упрощает и ускоряет расчет содержания sIgA в исследуемых кли- нических образцах. Иммуноферментная тест-система для определе- ния уровней антиэндотоксиновых sIgA различной специфичности В качестве антигенов при определении антиэн- дотоксиновых sIgA, специфичных к антигенным де- терминантам, ассоциированным преимущественно с О-полисахаридной цепью молекулы ЛПС (анти- ЛПС-sIgA), а также антител, специфичных к антиген- ным эпитопам эндотоксинового кора молекулы ЛПС (анти-Кор-sIgA) были соответственно использованы высокоочищенные препараты ЛПС E. coli K235 и S. minnesota Re-595 (Sigma Chem. Co., USA). Обоснова- ние выбора этих антигенов, а также разработанные нами эффективные способы их иммобилизации на поверхности полистироловых планшетов приведены в работах, опубликованных ранее [19, 20, 21]. Концен- трация ЛПС E. coli K235 и S. minnesota Re-595 в бу- фере для иммобилизации составляла 10 мкг/мл. При проведении экспериментов по оптимизации условий проведения тИФА источником антиэндотоксиновых sIgA служил пул предварительно отобранных образ- цов ротовой жидкости больных хроническим гене- рализованным пародонтитом, протекающим на фоне травматической болезни спинного мозга [23]. Опти- мальное рабочее разведение конъюгата анти- sIgA*HRP находили следующим образом. После иммобилизации соответствующих антигенов в лун- ках полистироловых планшетов и блокирования сво- 86 ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК2009, том 12, № 3 (47) Двухцентровый тИФА для количественного определения общего sIgA Получение слоя иммуносорбента Анти-sIgA-АТ (5 мкг/мл) в PBS – сорбция 12-14 час при 18-22°С Блокирование центров неспецифического связывания Промывка PBS-T – 4 раза по 1 мин Анализ клинических образцов Построение калибровочной кривой Клинический образец 100 мкл; разведение 1:200 PBS-T Стандарт sIgA человека 100 мкл; диапазон концентраций 0,1-5 мкг/мл Инкубация в течение 60 мин при 37°С Удаление неспецифически связавшихся компонентов Промывка PBS-T; 4 раза по 1 мин Инкубация с иммунопероксидазным коньюгатом анти-sIgA*HRP 100 мкл в разведении 1:8000; 60 мин при 37°С Выявление пероксидазной активности, ассоциированной с твердой фазой Инкубация с субстратно-буферным раствором в течение 60 мин при 37°С Удаление неспецифически связавшихся компонентов Промывка PBS-T; 4 раза по 1 мин Измерение оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции при длине волны 492 нм Иммуноферментный анализатор Stat Fax 2100 или другой аналогичный прибор Расчет концентрации sIgA в клинических образцах по калибровочной кривой Рис. 2. Блок-схема двухцентрового тИФА для количественного определения sIgA в слюне и других биологических жидкостях. Параметр Характеристика Принцип анализа Двухцентровый тИФА (“sandwich”-метод) на основе поликлональных козьих антител, специфичных к sIgA человека Общая продолжительность анализа* 3,5 часа Ферментативная метка Пероксидаза хрена Тип калибровочной кривой Линейная Диапазон определяемых концентраций sIgA 0,1 – 5 мкг/мл Чувствительность 50 нг/мл Воспроизводимость ± 6 % Объем пробы (при проведении анализа в двух повторностях 2 х 5 мкл Таблица 1 Основные параметры твердофазной иммуноферментной тест-системы для количественного определения sIgA человека Примечание: * - без учета времени, необходимого для получения слоя иммуносорбента на поверхности твердой фазы. 87 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ 0,156 0,625 2,50 5,00 0.0 0.1 0.2 0.3 sIgA, мкг/мл Э кс ти н кц и я бодных центров связывания в опытный ряд лунок вносили по 100 мкл пулированной ротовой жидко- сти, разведенной в 10 раз с помощью PBS-T; в конт- рольный – по 100 мкл PBS-T. После 60-мин инкуба- ции при 37єС и промывки PBS-T (4 раза по 1 мин) в опытные и контрольные лунки добавляли по 100 мкл коньюгата анти-sIgA*HRP, разведенного PBS-T в со- отношении 1:125 и раститрованного далее с 2-крат- ным шагом, и затем снова инкубировали 60 мин при 37°С. Неспецифически связавшийся конъюгат анти- sIgA*HRP отмывали PBS-T (4 раза по 1 мин). Перок- сидазную активность регистрировали, как указано в разделе “Материалы и методы”. Эксперименты показали (Рис. 4), что получен- ный иммунопероксидазный конъюгат анти- sIgA*HRP характеризуется низким уровнем неспе- цифического связывания с иммобилизованными на Рис. 3. Типичная калибровочная кривая для определения общего sIgA методом двухцентрового тИФА. 1:125 1:500 1:2000 1:16000 2 3 4 5 - ЛПС E. coli K235 - ЛПС S. minnesota Re-595 Антигены: Ln (1/[разведение анти-sIgA*HRP]) О тн о ш е н и е [ cи гн ал /ф о н ] Рис. 4. Выбор оптимальной концентрации иммунопероксидазного коньюгата анти- sIgA*HRP для определения антиэндотоксиновых sIgA различной специфичности. Параметр Характеристика Принцип анализа Непрямой тИФА с использованием в качестве вторичных антител иммунопероксидазного коньюгата на основе поликлональных козьих антител, специфичных к sIgA человека ЛПС Escherichia coli K235 Анти-ЛПС-sIgA И с п о л ь зу ем ы е а н ти ге н ы ЛПС Salmonella minnesota Re-595 О п р ед е л яе м ы е а н ти те л а Анти-Кор-sIgA Общая продолжительность анализа* 3,5 часа Воспроизводимость ± 8 % Объем пробы (при проведении анализа в двух повторностях 2 х 10 мкл Таблица 2 Основные параметры твердофазной иммуноферментной тест-системы для количественного определения антиэндотоксиновых sIgA различной специфичности Примечание: * - без учета времени, необходимого для получения слоя иммуносорбента на поверхности твердой фазы. твердой фазе ЛПС E. coli K235 и S. minnesota Re-595 и может быть с успехом применен при определении антиэндотоксиновых sIgA в непрямом варианте тИФА. При использовании в качестве антигена для сенсибилизации твердой фазы ЛПС E. coli K235 наи- большее соотношение [полезный сигнал/фон] дос- тигалось при разведении конъюгата анти-sIgA*HRP 1:4000; ЛПС S. minnesota Re-595 – 1:2000. С учетом 88 ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК2009, том 12, № 3 (47) полученных данных была сконструирована чувстви- тельная и селективная твердофазная иммунофермен- тная тест-система, предназначенная для количествен- ного определения sIgA, специфичного к антигенным детерминантам О-полисахаридной цепи ЛПС E. coli К235 (анти-ЛПС-sIgA), а также внутренней области олигосахаридного кора ЛПС энтеробактерий (анти- Кор-sIgA) в слюне и других биологических жидко- стях (Рис. 5). Уровни анти-ЛПС-sIgA и анти-Кор-sIgA выражают в условных единицах оптической плотно- сти конечного продукта ферментативной реакции для стандартных условий проведения тИФА и фиксиро- ванного (1:10) разведения ротовой жидкости. Основ- ные аналитические характеристики данной тест-сис- темы приведены в таблице 2. Непрямой тИФА для количественного определения антиэндотоксиновых sIgA различной специфичности Выявление пероксидазной активности, ассоциированной с твердой фазой Инкубация с субстратно-буферным раствором в течение 60 мин при 37°С Получение слоя иммуносорбента Антиген – ЛПС E. coli K235 Иммобилизация по методу [18, 19] Блокирование центров неспецифического связывания Промывка PBS-T – 4 раза по 1 мин Клинический образец 100 мкл; разведение 1:10 PBS-T Инкубация в течение 60 мин при 37°С Удаление неспецифически связавшихся компонентов Промывка PDS-T; 4 раза по 1 мин Инкубация с иммунопероксидазным коньюгатом анти-sIgA*HRP 100 мкл разведение: 1:4000 для анти-ЛПС-sIgA и 1:2000 для анти-Кор-sIgA 60 мин при 37°С Удаление неспецифически связавшихся компонентов Промывка PBS-T; 4 раза по 1 мин Измерение оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции при длине волны 492 нм Иммуноферментный анализатор Stat Fax 2100 или другой аналогичный прибор Анти-ЛПС-sIgA Анти-Кор-sIgA Получение слоя иммуносорбента Антиген - S. minnesota Re-595 Иммобилизация по методу [20] Рис. 5. Блок-схема непрямого тИФА для количественного определения антиэндотоксиновых sIgA в слюне и других биологических жидкостях. Основной областью применения сконструиро- ванных иммуноферментных тест-систем являются исследования, направленные на дальнейшее изуче- ние роли мукозального иммунитета в патогенезе широкого круга заболеваний человека. Кроме того, данные тест-системы могут быть использованы для оценки эффективности применения мукозальных вакцин и полибактериальных иммуностимуляторов, оказывающих преимущественное воздействие на MALT-систему. ЛИТЕРАТУРА 1. Kerr MA. The structure and function of human IgA //Biochem. J.- 1990.- 271, N2.- P. 285-296 89 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ 2. Woof J.M., Kerr M.A. The function of immunoglobulin A in immunity //J. Pathol.- 2006.- 208, N2.- P. 270-282 3. Woof J.M., Mestecky J. Mucosal immunoglobulins //Immunological Reviews.- 2005.- 206.- P. 64-82 4. Snoeck V., Peters I.R., Cox E. The IgA system: a comparison of structure and function in different species //Vet. Res.- 2006.- 37, N3.- P. 455-467 5. Brandtzaeg P., Baekkevold E.S., Farstad I.N. et al. Regional specialization in the mucosal immune system / /Immunology Today.- 1999.- 20, N3.- P. 141-151 6. Fujihashi K., Kato H., van Ginkel F.W., Koga T. et al. A revisit of mucosal IgA immunity and oral tolerance //Acta Odontol. Scand.- 2001.- 59, N5.- P. 301-308 7. Macpherson A.J., Hunziker L., McCoy K., Lamarre A. IgA responses in the intestinal mucosa against pathogenic and non-pathogenic microorganisms //Microbes Infect.- 2001.- 3, N12.- P. 1021-1035 8. Wines B.D., Hogart P.M. IgA receptors in health and disease //The Authors J. compilation.- 2006.- 68.- P. 103-114 9. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и при патологии // Иммунология.- 1997.- №5.- С. 4-7 10. Fagarasan S., Honjo T. Regulation of IgA synthesis at mucosal surfaces //Curr. Opin. Immunol.- 2004.- 16, N3.- P. 277-283 11. Ludwig K., Grabhorn E., Bitzan M., Bobrowski C. et al. Saliva IgM and IgA are a sensitive indicator of the humoral immune response to Escherichia coli O157 lipopolysaccharide in children with enteropathic hemolytic uremic syndrome //Pediatr. Res.- 2002.- 52, N2.- P. 307-313 12. Джикидзе Э.К., Стасилевич З.К., Саламатова С.А. Стимуляция секреторной IgA-системы обезьян при парентеральной иммунизации рибосомальной дизентерийной вакциной Зонне //Журн. микробиол.- 1988.- №9.- С. 66-70 13.Liebers V., Bruning T., Raulf-Heimsoth M. Occupational endotoxin-exposure and possible health effects on humans //Am. J. Ind. Med.- 2006.- 49, N6.- P. 474-491 14. Radon K. The two sides of the «endotoxin coin» //Occup. Environ. Med.- 2006.- 63, N1.- P. 73-78 15. Ouwehand A., Isolauri E., Salminen S. The role of the intestinal microflora for the development of the immune system in early childhood //Eur. J. Nutr.- 2002.- 41, Suppl 1.- P. I32-137 16. Методы исследований в иммунологии /Под ред. И.Лефковитса, Б. Перниса.- М.: Мир, 1981.- С. 428-467 17. Антитела. Методы. В 2-х кн. Кн. 2 /Под ред. Д. Кэтти.- М.: Мир, 1991.- 384 с. 18. Гордієнко А.І., Білоглазов В.О. Патент 70193 А. Спосіб визначення антитіл до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій. - Заявл. 29.12. 2003; Опубл.15.09. 2004. - Бюл. №9 19. Гордиенко А.И. Новый подход к повышению специфичности определения антител к липополиса- харидам грамотрицательных бактерий методом твер- дофазного иммуноферментного анализа //Укр. біохім. журн.- 2004.- 76, №6.- С. 130-135 20. Гордиенко А.И. Методические аспекты опре- деления антител, специфичных к внутренней облас- ти олигосахаридного кора липополисахаридов энте- робактерий //Таврический медико-биологический вестник.- 2006.- 9, №1.- С. 131-137 21. Клиническая оценка лабораторных тестов / под ред. Н.У. Тица.- М.: Мир, 1986.- С. 176-178 22. Теория и практика иммуноферментного ана- лиза.- М.: Высшая школа, 1991.- 288 с. 23. Горобец С.М., Гордиенко А.И., Бакова А.А., Белоглазов В.А., Химич Н.В., Нагорный П.А., Меш- кова И.Е. Состояние местного антиэндотоксинового иммунитета ротовой полости, цитокиновый профиль ротовой жидкости и гуморальный антиэндотоксино- вый статус у больных хроническим генерализован- ным пародонтитом, протекающим на фоне травма- тической болезни спинного мозга /Проблемы, дос- тижения и перспективы развития медико-биологичес- ких наук и практического здравоохранения. Труды Крымского государственного медицинского универ- ситета.- Симферополь: Изд. центр КГМУ, 2005.- т. 141.- Ч. 5.- С. 37-44.

Ähnliche Einträge