Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень
Розроблено ефективні методи отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі (ВАМК) з високим ступенем чистоти та підвищеним виходом вiрусу (до 280 мг/кг), які можуть бути використані для виготовлення антигену ВАМК при отриманні специфiчних антисироваток та проведенні імунохімічних реакцій. Разра...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Сільськогосподарська мікробіологія |
|---|---|
| Дата: | 2009 |
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
2009
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/26543 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень / О.О. Дмитрук, О.Є. Мамчур, Л.П. Коломієць // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвід. темат. наук. зб. — Чернігів, 2009. — Вип. 9. — С. 172-178. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859739464294727680 |
|---|---|
| author | Дмитрук, О.О. Мамчур, О.Є. Коломієць, Л.П. |
| author_facet | Дмитрук, О.О. Мамчур, О.Є. Коломієць, Л.П. |
| citation_txt | Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень / О.О. Дмитрук, О.Є. Мамчур, Л.П. Коломієць // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвід. темат. наук. зб. — Чернігів, 2009. — Вип. 9. — С. 172-178. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Сільськогосподарська мікробіологія |
| description | Розроблено ефективні методи отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі (ВАМК) з високим ступенем чистоти та підвищеним виходом вiрусу (до 280 мг/кг), які можуть бути використані для виготовлення антигену ВАМК при отриманні специфiчних антисироваток та проведенні імунохімічних реакцій.
Разработаны эффективные методы получения препаратов вируса аукуба мозаики картофеля (ВАМК) с высокой степенью чистоты и повышенным выходом вируса (до 280 мг/кг), который могут быть использованы для изготовления антигена ВАМК при производстве специфических антисывороток и проведении иммунохимических реакций.
The efficient methods for the reception of potato aucuba mosaic virus preparations with high purity degree and the increased virus output (up to 280 mg/kg) were elaborated. They can be used for antigen production for the specific antiserums and conducting of immunochemical reactions.
|
| first_indexed | 2025-12-01T16:03:17Z |
| format | Article |
| fulltext |
172
�� 57.�083.�3:578.�083.�24
ОТРИМАННЯ ПРЕПАРАТІВ ВІРУСУ АУКУБА
МОЗАЇКИ КАРТОПЛІ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА
ДІАГНОСТИЧНОЇ СИРОВАТКИ ТА
ІМУНОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дмитрук О�О�, Мамчур О�Є�, Коломієць Л�П�
Інститут сiльськогосподарської мiкробiологiї УААН
вул.� Шевченка, 97, м.� Чернігів, 14027, Україна
E-mail: dmitruk.�oo@mail.�ru
Розроблено ефективні методи отримання препаратів вірусу
аукуба мозаїки картоплі (ВАМК) з високим ступенем чистоти
та підвищеним виходом вiрусу (до 280 мг/кг), які можуть бути
використані для виготовлення антигену ВАМК при отриманні
специфiчних антисироваток та проведенні імунохімічних реакцій.
�лючові слова: вірус аукуба мозаїки картоплі, очищення і
концентрація вірусу.
�ахист рослин є важливою ланкою сучасного землеробства,
сталий розвиток якого не можливий без вирішення проблем,
пов’язаних з розвитком та розповсюдженням вірусних хвороб
рослин в агроценозах.� Розробка методів імунодіагностики для
контролю вірусного ураження насаджень картоплі потребує
досліджень, спрямованих на оптимізацію умов отримання
біологічних компонентів тест-систем.� Невід’ємною частиною цих
досліджень є виділення, очищення й концентрування вірусних
антигенів та контроль їх якості.� Очищений вірусний препарат
має містити віріони певного вірусу або його штаму, ідентичного
за морфологією, розміром, біологічною активністю та фізико-
хімічними властивостями без сторонніх домішок [1].�
Вірус аукуба мозаїки картоплі (Potato aucuba mosaic virus),
представник роду Potexvirus родини Flexiviridae, є +РН�-вмісним
вірусом з одноланцюговою нуклеїновою кислотою, послідовність
нуклеотидів якої повністю визначена.� Вірус має нитковидні віріони
з модальною довжиною 580 нм та діаметром 11-13 нм [2-4].� ВАМ�
відносно стабільний та накопичується в рослинах у значних
кількостях [4, 5], але перешкодою для одержання очищених
препаратів є схильність вірусу до агрегації та деградація білка
під дією протеолітичних ферментів [6, 7].� Розробка специфічних,
173
високочутливих і простих у використанні методів імунодіагностики
вірусу аукуба мозаїки картоплі вимагає високоочищених та
сконцентрованих вірусних антигенів, що дає змогу уникнути
неспецифічних реакцій при проведенні аналізів.�
Метою нашої роботи була розробка ефективних методів
отримання чистих препаратів ВA�� для виробництва антисиро-
ватки та імунологічних досліджень.�
Матеріали і методи. У роботі використовували штам віру-
су аукуба мозаїки картоплі (ВАМ�-об), виділений з рослин картоп-
лі сорту Обелікс в агроценозах Полісся України.�
ВA�� накопичували на рослинах-індикаторах Nicotiana
rustica L.�, які вирощували в умовах вегетаційної камери при 20-
22 оС i фотоперіоді 16 годин.� �аражали рослини у фазу 3-4 справ-
жніх листків методом механічної інокуляції.� Листки махорки
відбирали на 14-18 добу після інфікування, коли концентрація
вірусу у рослинах сягала максимуму.�
Очищення та концентрування ВАМ� проводили за двома
схемами, які передбачали:
схема 1 – без застосування органічних розчинників, осад-
ження вірусу ПЕГ згідно з відомими методиками [7-10] та препа-
ративний електрофорез із застосуванням сахарозної подушки
(40 %) [11, 12]; електрофорез проводили у лужній системi буферiв
протягом 3 годин за температури 16-20 оС, сили струму 8-10 мА та
напруги 400-550 В;
схема 2 – використання органічних розчинників з наступ-
ним осадженням сульфатом амонію та подальшим очищенням
препарату методом гель-хроматографії на колонці з сефадексом G-
50 в електричному полі [13].�
�онтроль етапів отримання чистих препаратів ВАМ� про-
водили методами спектрофотометрії, крапельної аглютинацiї та
електронної мікроскопії нативних препаратів, контрастованих
2 %-ним розчином фосфорно-вольфрамової кислоти.� �ослiджували
препарати в електронних мікроскопах Tesla-540 та ЕМ-125 при
інструментальному збільшенні 20 тис.� Вихід очищеного вірусу
визначали за допомогою коефіцієнта екстинції ВАМ� Е260
0,1%=2,6.�
Результати та їх обговорення. Ефективність отримання
препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі оцінювали по загальному
виходу вірусу (мг вірусу з 1 кг рослинної маси), ступеню агрегації
вірусних часток та чистоти вірусних препаратів.�
174
�ля підвищення ефективності екстракції вiрусу та блоку-
вання дії ферментів рослинного соку проводили iнфiльтрацiю
інфекційного матеріалу в 0,3 М трис-глiциновому буферному
розчині рН 8,3 з додаванням як стабілізаторів 0,1 % 2-мер-
каптоетанолу та 0,01 М етилендіамінотетраоцтової кислоти.�
�астосування трис-глiцинового буферного розчину, на відміну від
фосфатного чи цитратного, зменшувало вміст у препараті пігменту,
що значно поліпшувало наступні етапи очистки (особливо етап
препаративного електрофорезу).�
�гідно з першою схемою очищення для первинного
освітлення інфекційного екстракту не використовували органічних
розчинників, які різко знижують вихід вірусу.� �ля освітлення
екстрактів з інфікованих ВA�� рослин Nicotiana rustica L.�
ефективним виявилося застосування 20 % розчину Тритона Х-100,
який сприяє десорбції вірусу від клітинних мембран і хлоропластів,
що значно прискорює подальше очищення вірусного препарату.�
�ля осадження вірусу використали поліетиленгліколь
(ПЕГ) з молекулярною масою 40000, який додавали до екстракту
з розрахунку 8 % (маса/об’єм).� При цьому спостерігається значна
агрегація вірусних часток.� �ля вивільнення вірусу із осаду
необхідно було провести цикл (5-6 екстракцій) диференцiйного
центрифугування сконцентрованого ПЕГ препарату [7, 10].� Агрега-
ти вiрусних часток при низькошвидкісному центрифугуванні
неминуче втрачаються, внаслідок чого знижується загальний вихід
вірусу.� Тому, за розробленою нами методикою, на цьому етапі було
використано препаративний електрофорез із застосуванням 40 %
сахарозної подушки.� Отримано препарати ВАМ� з виходом вірусу
до 280 мг/кг листя махорки.�
�а схемою 2 первинне освітлення інфекційного соку
проводили з використанням суміші хлороформ-бутанолу (1:1)
у пропорції 1/8, що дозволяє звільнити екстракт ВАМ� від
білок-хлорофілового комплексу.� Після центрифугування при
3000 об.�/хв протягом 15 хвилин до надосаду додавали сульфат
амонію до кінцевої концентрації 30 %, ретельно перемішували і
центрифугували при 6000 об.�/хв протягом 30 хвилин.� Осад ресус-
пендували у мінімальній кількості 0,01 М трис-гліцинового буферу
рН 8,3.� Подальше очищення проводили, застосовуючи метод
гель-хроматографії на колонці з сефадексом G-50 в електричному
полі, використовуючи ефект електрофоретичного гальмування,
175
що дозволяє уникнути розбавлення вірусного препарату.� Елюцію
проводили у лужній системі буферів, силі струму 10 мА та напрузі
280 В.� Фракції починали відбирати після входження проби у сефа-
декс та переполюсовки системи.� Відібрані фракції аналізували
серологічно та спектрофотометрично при 280 нм.� Проби, які місти-
ли ВАМ�, об’єднували та концентрували ультрацентрифугуван-
ням 2 год.� за 35000 об.�/хв Осад ресуспендували у мінімальній
кількості фізрозчину і використовували як антиген.� Отримано
препарати ВАМ� з виходом вірусу до 145 мг/кг листя махорки.�
Електронномікроскопічні дослідження вірусного антигену,
сконцентрованого та очищеного за першою схемою показали, що
у препараті спостерігається велика кількість агрегатів ВA��;
залишків клітинних компонентів та фрагментів деградації вірусних
часток не виявлено.� У препаратах, очищених за схемою 2, виявлено
характерні за морфологічними ознаками частки та їх уламки,
агрегованих часток не спостерігали (рис.� 1).�
Рис. 1. Препарати ВAMК, очищені за схемою 1(А) та
схемою 2(Б), інструментальне збільшення 20 тис.
Очищені вірусні препарати ВАМ� були прозорими з лег-
кою опалесценцією.� Спектр поглинання очищених препаратів,
отриманих за схемою 1, мав характерний максимум при довжині
хвилі 265 нм, мінімум – при 247 нм (рис.� 2).� Співвідношення
Е260/Е280 становило 1,1, що можна пояснити підвищеним ступенем
агрегації вірусних часток.� Максимум поглинання УФ-світла
вірусним препаратом, очищеним відповідно схеми 2, реєстрували
при 270 нм, мінімум – при 245 нм (рис.� 2), величина співвідношення
Е260/Е280 становила 1,2, що відповідає характеристикам очищеного
176
препарату ВАМ� [4, 7].�
Рис. 2. Поглинання УФ-світла очищеними препаратами
ВАМК
Очищені препарати ВАМ� у подальшому були використані
як антигени для імунізації тварин та проведення імунологічних
досліджень.�
�а нашими даними, очищення ВАМ� за схемами 1 та 2 дозво-
лило отримати препарати вірусу, які характеризуються високим
ступенем чистоти, що є важливим при проведенні імунохімічних
реакцій.� �ля виготовлення антигену ВАМ� при отриманні
специфiчних антисироваток більш ефективною є схема 1 з підви-
щеним виходом вiрусу, яка включає iнфiльтрацiю інфекційного
матеріалу в 0,3 М трис-глiциновому буферному розчині, рН 8,3
з додаванням 0,1 % МЕ та 0,01М Е�ТА, освітлення 20 %-ним
розчином Тритон Х-100, первинне концентрування вiрусу 8 %
полiетиленгликолем, препаративний електрофорез із застосуванням
40 % сахарозної подушки.�
1.� Мельничук М.��.� Фітовірусологія: Навчальний посібник
/М.��.� Мельничук.� – �.�: Поліграф �онсалтинг, 2005.� – 200 с.�
2.� Adams �.�J.� The new plant virus familyAdams �.�J.� The new plant virus family Flexiviridae and assessment
of molecular criteria for species demarcation /Adams �.�J.�, Antoniw J.�F.�, �ar-�ar-
Joseph �.� et al.� //Arch.� Virol.� – 2004.� – Vol.� 149, et al.� //Arch.� Virol.� – 2004.� – Vol.� 149,.� – 2004.� – Vol.� 149,Vol.� 149,149, № 5.� – P.� 1045-1060.�
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
240 245 247 250 255 260 265 270 275 280 285 290
,
1
2
177
3.� �u H.� The entire nucleotide sequence and genomic organization
of potato aucuba mosaic potexvirus /�u H.�, Leclerc D.�, Leung �.� and
Abou Haidar �.�G.� //Arch.� Virol.� – 1994.� – Vol.� 135, № 3-4.� – P.� 461-//Arch.� Virol.� – 1994.� – Vol.� 135, № 3-4.� – P.� 461-Arch.� Virol.� – 1994.� – Vol.� 135, № 3-4.� – P.� 461-Vol.� 135, № 3-4.� – P.� 461-135, № 3-4.� – P.� 461-3-4.� – P.� 461-
469.�
4.� Kassanis �.� Potato aucuba mosaic virus /Kassanis �.�, Govier D.�A.�
//�.��.�I.� /A.�A.�� /Descriptions of plant viruses.� – 1972.� – № 98.� – P.� 4.�
5.� Рейфман В.�Г.� Возбудители вирусных болезней картофеля на �а-
льнем востоке /Рейфман В.�Г.�, �рылов А.�В.�, Степаненко В.�И.�, �остин В.��.�
//Вирусные болезни с.�-х.� растений �альнего востока.� – Владивосток, 1971.�
– Т.� 4.� – С.� 31-49.�
6.� Пархоменко Н.�И.� Изучение F-вируса на Украине /Пархомен-
ко Н.�И.� //Микробиология и научно-технический прогресс.� – �.�: Наук.�
думка, 1983.� – С.� 115.�
7.� Сапоцкий М.�В.� Выделение F-вируса картофеля и некоторые
свойства его структурного белка /Сапоцкий М.�В.� //Вирусные болезни
растений и меры борьбы с ними.� – Владивосток, 1980.� – С.� 50-58.�
8.� �aat D.�Z.� Potato aucuba mosaic virus purification, preparation of
antisera and testing of greenhouse-groving potato plants /�aat D.�Z.� //Potato
Res.� – 1973.� – Vol.� 16, № 4.� – P.� 302-305.�
9.� Juo P.�S.� Purification of potato aucuba mosaic virus /Juo P.�S.�,
Rich A.�E.� //Phytopatol.� – 1969.� – Vol.� 59, № 11.� – P.� 1816-1819.�
10.� Новиков В.��.� Метод получения препарата �-вируса картофеля
и приготовление диагностических антисывороток /Новиков В.��.�,
Атабеков И.�Г.�, Агур М.�О.� и др.� //С.�-х.� биология.� – 1982.� – Т.� 17, № 5.� –
С.� 706-711.�
11.� Пат.� 64377А Україна, МП�7 � 12 N 7/00.� Пристрiй для пре-
паративного електрофорезу в гранульованому середовищi /О.�Є.� Мамчур,
О.�О.� �митрук, М.�М.� �арицький.� – заявл.� 22.�05.�2003; опубл.� 16.�02.�2004,
Бюл.� № 2.�
12.� Мамчур О.�Є.� Метод отримання очищених препаратів вірусів
рослин /Мамчур О.�Є.�, �митрук О.�О.�, �оломiєць Л.�П.�, �арицкий М.�М.�
//С.�-г.� мікробіол.�: міжвід.�темат.�наук.�зб.� – Чернігів: ЦНТЕІ, 2005.� – Вип.� 1-
2.� – С.� 165-170.�
13.� Гааль �.� �лектрофорез в разделении биологических макро-
молекул /�.� Гааль, Г.� Медьеши, Л.� Верецкеи.� – М.�: Мир, 1982.� – С.� 50-52.�
178
ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ВИРУСА АУКУБА
МОЗАИКИ КАРТОФЕЛЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА
ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ И
ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Дмитрук О�А�, Мамчур А�Е�, Коломиец Л�П�
Інститут сельскохозяйственной микробиологии УААН, г.� Чернигов
Разработаны эффективные методы получения препаратов
вируса аукуба мозаики картофеля (ВАМК) с высокой степенью
чистоты и повышенным выходом вируса (до 280 мг/кг), который
могут быть использованы для изготовления антигена ВАМК
при производстве специфических антисывороток и проведении
иммунохимических реакций.
�лючевые слова: вирус аукуба мозаики картофеля, очистка
и концентрирование вируса
THE RECEPTION OF POTATO AUKUBA MOSAIC
VIRUS PREPARATIONS FOR THE PRODUCTION
OF DIAGNOSTIC SERUMS AND IMMUNOLOGICAL
STUDIES
Dmitruk O�A�, Mamchur A�E�, Kolomiets L�P�
Institute of Agriculture �icrobiology, UAAS, �hernihiv
The efficient methods for the reception of potato aucuba
mosaic virus preparations with high purity degree and the increased
virus output (up to 280 mg/kg) were elaborated. They can be used
for antigen production for the specific antiserums and conducting of
immunochemical reactions.
Key words: potato aucuba mosaic virus, purification and
concentration of virus.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-26543 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1997-3004 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-01T16:03:17Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Дмитрук, О.О. Мамчур, О.Є. Коломієць, Л.П. 2011-09-04T21:35:21Z 2011-09-04T21:35:21Z 2009 Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень / О.О. Дмитрук, О.Є. Мамчур, Л.П. Коломієць // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвід. темат. наук. зб. — Чернігів, 2009. — Вип. 9. — С. 172-178. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. 1997-3004 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/26543 57.083.3:578.083.24 Розроблено ефективні методи отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі (ВАМК) з високим ступенем чистоти та підвищеним виходом вiрусу (до 280 мг/кг), які можуть бути використані для виготовлення антигену ВАМК при отриманні специфiчних антисироваток та проведенні імунохімічних реакцій. Разработаны эффективные методы получения препаратов вируса аукуба мозаики картофеля (ВАМК) с высокой степенью чистоты и повышенным выходом вируса (до 280 мг/кг), который могут быть использованы для изготовления антигена ВАМК при производстве специфических антисывороток и проведении иммунохимических реакций. The efficient methods for the reception of potato aucuba mosaic virus preparations with high purity degree and the increased virus output (up to 280 mg/kg) were elaborated. They can be used for antigen production for the specific antiserums and conducting of immunochemical reactions. uk Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України Сільськогосподарська мікробіологія Вірусологія Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень Получение препаратов вируса аукуба мозаики картофеля для производства диагностической сыворотки и иммунологических исследований The reception of potato aukuba mosaic virus preparations for the production of diagnostic serums and immunological studies Article published earlier |
| spellingShingle | Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень Дмитрук, О.О. Мамчур, О.Є. Коломієць, Л.П. Вірусологія |
| title | Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень |
| title_alt | Получение препаратов вируса аукуба мозаики картофеля для производства диагностической сыворотки и иммунологических исследований The reception of potato aukuba mosaic virus preparations for the production of diagnostic serums and immunological studies |
| title_full | Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень |
| title_fullStr | Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень |
| title_full_unstemmed | Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень |
| title_short | Отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень |
| title_sort | отримання препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі для виробництва діагностичної сироватки та імунологічних досліджень |
| topic | Вірусологія |
| topic_facet | Вірусологія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/26543 |
| work_keys_str_mv | AT dmitrukoo otrimannâpreparatívvírusuaukubamozaíkikartoplídlâvirobnictvadíagnostičnoísirovatkitaímunologíčnihdoslídženʹ AT mamčuroê otrimannâpreparatívvírusuaukubamozaíkikartoplídlâvirobnictvadíagnostičnoísirovatkitaímunologíčnihdoslídženʹ AT kolomíêcʹlp otrimannâpreparatívvírusuaukubamozaíkikartoplídlâvirobnictvadíagnostičnoísirovatkitaímunologíčnihdoslídženʹ AT dmitrukoo polučeniepreparatovvirusaaukubamozaikikartofelâdlâproizvodstvadiagnostičeskoisyvorotkiiimmunologičeskihissledovanii AT mamčuroê polučeniepreparatovvirusaaukubamozaikikartofelâdlâproizvodstvadiagnostičeskoisyvorotkiiimmunologičeskihissledovanii AT kolomíêcʹlp polučeniepreparatovvirusaaukubamozaikikartofelâdlâproizvodstvadiagnostičeskoisyvorotkiiimmunologičeskihissledovanii AT dmitrukoo thereceptionofpotatoaukubamosaicviruspreparationsfortheproductionofdiagnosticserumsandimmunologicalstudies AT mamčuroê thereceptionofpotatoaukubamosaicviruspreparationsfortheproductionofdiagnosticserumsandimmunologicalstudies AT kolomíêcʹlp thereceptionofpotatoaukubamosaicviruspreparationsfortheproductionofdiagnosticserumsandimmunologicalstudies |