Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту

Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту

Вивченo фенотипові та генотипові властивості мікро- симбіонтів сої з різною швидкістю росту. Встановлено, що штами з інтенсивним ростом проявляють специфічність до рослини- живителя, однак істотно відрізняються від повільнорослих бульбочкових бактерій сої за серологічними, хемотаксономічними та...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2009
1. Verfasser: Крутило, Д.В.
Format: Artikel
Sprache:Ukrainian
Veröffentlicht: Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України 2009
Schriftenreihe:Сільськогосподарська мікробіологія
Schlagworte:
Загальна і ґрунтова мікробіологія
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/27131
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту / Д.В. Крутило // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвід. темат. наук. зб. — Чернігів, 2009. — Вип. 10. — С. 50-64. — Бібліогр.: 17 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-27131
record_format dspace
spelling nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-271312025-02-09T13:30:33Z Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту Биологические свойства клубеньковых бактерий сои с разной скоростью роста The biological properties of soybean nodule bacteria with the different speed of growth Крутило, Д.В. Загальна і ґрунтова мікробіологія Вивченo фенотипові та генотипові властивості мікро- симбіонтів сої з різною швидкістю росту. Встановлено, що штами з інтенсивним ростом проявляють специфічність до рослини- живителя, однак істотно відрізняються від повільнорослих бульбочкових бактерій сої за серологічними, хемотаксономічними та симбіотичними властивостями. За антигенним складом інтенсивнорослі штами об’єднані в одну серогрупу. Відмічено подібність жирнокислотних профілів штаму з інтенсивним ростом Bradyrhizobium sp. КВ1-1 та повільнорослих штамів B. japonicum 634б і B. japonicum КС2-3. Виявлено, що ЕПС штаму Bradyrhizobium sp. КВ1-1 відрізняються від ЕПС штамів B. japonicum КС2-3 і B. japonicum 634б наявністю ксилози (2,7 %) та підвищеним вмістом рамнози (18,4 %). Аналіз послідовностей генів 16S рРНК дозволив віднести штами з інтенсивним ростом до роду Bradyrhizobium. Досліджені інтенсивнорослі штами утворюють неспецифічний симбіоз із вигною китайською. Изучены фенотипические и генотипические свойства микросимбионтов сои с разной скоростью роста. Установлено, что штаммы с интенсивным ростом проявляют специфичность к растению-хозяину, однако существенно отличаются от медленнорастущих клубеньковых бактерий сои по серологическим, хемотаксономическим и симбиотическим свойствам. По антигенному составу интенсивнорастущие штаммы объединены в одну серогруппу. Отмечено сходство жирнокислотных профилей штамма с интенсивным ростом Bradyrhizobium sp. КВ1-1 и медленнорастущих штаммов B. japonicum 634б и B. japonicum КС2-3. Выявлены количественные и качественные отличия в моносахаридном составе ЭПС исследованных штаммов. ЭПС штамма Bradyrhizobium sp. КВ1-1 отличаются от ЭПС штаммов B. japonicum КС2-3 и B. japonicum 634б наличием ксилозы (2,7 %) и повышенным содержанием рамнозы (18,4 %). Анализ последовательностей генов 16S рРНК позволил отнести интенсивнорастущие штаммы к роду Bradyrhizobium. Исследованные интенсивнорастущие штаммы образуют неспецифический симбиоз с вигной китайской. The phenotypical and genotypic properties of soybean microsymbionts with the different speed of growth were studied. It was established that the strains with the intensive growth were specific to the host-plant, but had differed by their serological, chemotaxonomical and symbiotic properties. The investigated intensive-growing strains were combined into the one serogroup by their antigenic content. The similarity of fatty acids spectrum was observed for the strains with the intensive growth Bradyrhizobium sp. КВ1-1, slow-growing strains B. japonicum 634b and B. japonicum КС2-3. The quantitative and qualitative differences in monosaccharides contents of EPS of the studied strains were revealed. Presence of xylose (2,7 %) and increased contents of rhamnose (18,4 %) were shown to be different in EPS of strain Bradyrhizobium sp. КВ1- 1 and EPS of strains B. japonicum КС2-3 and B. japonicum 634b. Analysis of the sequences of the 16S rRNA genes allowed attributing the strain with the intensive growth to the Bradyrhizobium genus. Genes consistency analysis of 16S rRNA had allowed to refer the intensivegrowing strains to the Bradyrhizobium genus. It was shown that studied intensive-growing strains had formed the nonspecific symbiosis with cow pea. 2009 Article Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту / Д.В. Крутило // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвід. темат. наук. зб. — Чернігів, 2009. — Вип. 10. — С. 50-64. — Бібліогр.: 17 назв. — укр. 1997-3004 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/27131 631.847.211:633.34:631.4 uk Сільськогосподарська мікробіологія application/pdf Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
topic Загальна і ґрунтова мікробіологія
Загальна і ґрунтова мікробіологія
spellingShingle Загальна і ґрунтова мікробіологія
Загальна і ґрунтова мікробіологія
Крутило, Д.В.
Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту
Сільськогосподарська мікробіологія
description Вивченo фенотипові та генотипові властивості мікро- симбіонтів сої з різною швидкістю росту. Встановлено, що штами з інтенсивним ростом проявляють специфічність до рослини- живителя, однак істотно відрізняються від повільнорослих бульбочкових бактерій сої за серологічними, хемотаксономічними та симбіотичними властивостями. За антигенним складом інтенсивнорослі штами об’єднані в одну серогрупу. Відмічено подібність жирнокислотних профілів штаму з інтенсивним ростом Bradyrhizobium sp. КВ1-1 та повільнорослих штамів B. japonicum 634б і B. japonicum КС2-3. Виявлено, що ЕПС штаму Bradyrhizobium sp. КВ1-1 відрізняються від ЕПС штамів B. japonicum КС2-3 і B. japonicum 634б наявністю ксилози (2,7 %) та підвищеним вмістом рамнози (18,4 %). Аналіз послідовностей генів 16S рРНК дозволив віднести штами з інтенсивним ростом до роду Bradyrhizobium. Досліджені інтенсивнорослі штами утворюють неспецифічний симбіоз із вигною китайською.
format Article
author Крутило, Д.В.
author_facet Крутило, Д.В.
author_sort Крутило, Д.В.
title Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту
title_short Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту
title_full Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту
title_fullStr Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту
title_full_unstemmed Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту
title_sort біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту
publisher Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
publishDate 2009
topic_facet Загальна і ґрунтова мікробіологія
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/27131
citation_txt Біологічні властивості бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту / Д.В. Крутило // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвід. темат. наук. зб. — Чернігів, 2009. — Вип. 10. — С. 50-64. — Бібліогр.: 17 назв. — укр.
series Сільськогосподарська мікробіологія
work_keys_str_mv AT krutilodv bíologíčnívlastivostíbulʹbočkovihbakteríjsoízríznoûšvidkístûrostu
AT krutilodv biologičeskiesvojstvaklubenʹkovyhbakterijsoisraznojskorostʹûrosta
AT krutilodv thebiologicalpropertiesofsoybeannodulebacteriawiththedifferentspeedofgrowth
first_indexed 2025-11-26T05:38:43Z
last_indexed 2025-11-26T05:38:43Z
_version_ 1849830175026446336
fulltext 50 УДК 631.847.211:633.34:631.4 БІОЛОГІчНІ ВЛАСТИВОСТІ БУЛЬБОчКОВИХ БАКТЕРІЙ СОЇ З РІЗНОЮ ШВИДКІСТЮ РОСТУ Крутило Д.В. Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, вул. Шевченка, 97, м. Чернігів, 14027, Україна E-mail: krutilod@mail.ru Вивченo  фенотипові  та  генотипові  властивості  мікро- симбіонтів сої з різною швидкістю росту. Встановлено, що штами  з  інтенсивним  ростом  проявляють  специфічність  до  рослини- живителя,  однак  істотно  відрізняються  від  повільнорослих  бульбочкових бактерій сої за серологічними, хемотаксономічними  та симбіотичними властивостями.  За  антигенним  складом  інтенсивнорослі  штами  об’єднані  в одну серогрупу. Відмічено подібність жирнокислотних профілів  штаму з інтенсивним ростом Bradyrhizobium sp. КВ1-1 та повіль-  норослих штамів B. japonicum 634б і B. japonicum КС2-3. Виявлено,  що  ЕПС  штаму  Bradyrhizobium sp. КВ1-1  відрізняються  від  ЕПС  штамів  B. japonicum  КС2-3  і  B. japonicum  634б  наявністю  ксилози  (2,7 %)  та  підвищеним  вмістом  рамнози  (18,4 %).  Аналіз  послідовностей  генів  16S рРНК дозволив  віднести штами  з  інтенсивним  ростом  до  роду  Bradyrhizobium.  Досліджені  інтенсивнорослі  штами  утворюють  неспецифічний  симбіоз  із  вигною китайською.  Ключові слова: антисироватка,  бульбочкові  бактерії  сої,  полісахариди, жирні кислоти, 16S рРНК. Біологічна фіксація молекулярного азоту з атмосфери є одним з основних джерел азоту в агроценозах. Важливу роль у цьому процесі відіграють бульбочкові бактерії, які здатні індукувати утворення азотфіксувальних бульбочок на коренях бобових рос- лин. Завдяки цій здатності бульбочкові бактерії розглядають як важливий генетичний ресурс для біотехнологій у сільському господарстві [1]. Вирощування бобових культур сприяє формуванню у ґрунті численних стабільних популяцій специфічних бульбочкових бактерій. Представники цих популяцій можуть як сприяти засвоєнню молекулярного азоту з атмосфери, так і перешкоджати інтродукованим високоефективним штамам-інокулянтам інфіку- 51 вати рослини та проявляти свій симбіотичний потенціал повною мірою. Вивчення різноманітності бульбочкових бактерій за остан- ні тридцять років пройшло декілька етапів – морфологічний, фізіологічний, а також молекулярно-генетичний [2]. У зв’язку з цим істотних змін зазнала таксономія ризобій. На сьогодні бульбочкові бактерії об’єднані в шість родів (клас alpha-Proteobacteria): Allorhizobium,  Mezorhizobium, Rhizobium,  Ensifer  (Sinorhizobium),  Azorhizobium та Bradyrhizobium [3]. Виявлені також азотфіксуваль- ні симбіотичні бактерії, які належать до філогенетично віддалених від ризобій родів: Methylobacterium,  Devosia, Ochrobactrum та Phyllobacterium (клас alpha-Proteobacteria), а також Burkholderia, Ralstonia та Cupriavidus (клас beta-Proteobacteria) [4]. За швидкістю росту на живильних середовищах вони утворюють дві великі групи – швидко- і повільнорослі, які значно розрізняються між собою за низкою ознак [5, 6]. Відомо, що таксономічно віддалені ризобії можуть інфікува- ти один і той же вид бобових. Так, наприклад, соя вступає в симбіоз із бульбочковими бактеріями чотирьох видів: B. japonicum, B. elkanii,  B. liaoningense  та  Ensifer  fredii. У ґрунтах України типовими мікросимбіонтами культурної сої виступають повільнорослі ризобії виду B. japonicum. Для дикої сої (не трапляється на території країни) характерним є утворення бульбочок із швидкорослими ризобіями E. fredii [4, 5]. Раніше нами було показано, що в агроценозах України представники місцевих популяцій бульбочкових бактерій сої розрізняються за морфолого-культуральними властивостями, зокрема, за інтенсивністю росту на живильному середовищі. За цією ознакою досліджувані штами були поділені на дві групи: штами з повільним та інтенсивним ростом [7, 8]. Інтенсивнорослі штами виділені з популяцій ризобій сої вперше. Різнобічне вивчення бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту дозволить виявити особливості їх існування у ґрунті та в симбіозі з рослиною- живителем. Враховуючи вищезазначене, метою нашої роботи було вив- чити біологічні властивості та провести аналіз послідовностей гена 16S рРНК у бульбочкових бактерій сої з різною швидкістю росту. Матеріали і методи. Об’єктами досліджень слугували ви- лучені нами з місцевих популяцій ризобій різних агроценозів Укра- 52 їни штами мікросимбіонтів сої, типовий штам Bradyrhizobium  japonicum В-209Т = VKM 1967 = ATCC 10324, стандартний штам B. japonicum 634б (В-167 = VKM = VNIAM 2490) та штам ризобій вигни Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1 (В-200), які зберігаються в Колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів ІСГМ УААН. Штами ризобій сої (180 штамів) виділені з шести типів ґрунтів методом інокуляції стерильних проростків сої. Антисироватки до бактеріальних штамів отримували за ме- тодикою ВНДІСГМ [9] у нашій модифікації. Антигенні властивості штамів ризобій вивчали за допомогою реакції аглютинації (метод Грубера-Відаля) [10]. Для виділення сумарної ДНК штамів ризобій використовували набір «ДНК-сорб-В» згідно протоколу виробника. Матриці для сиквенування генів 16S рРНК синтезували за допомогою ПЛР, використовуючи універсальні для більшості еубактерій праймери fD1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) та rP2 (5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’) [11]. ПЛР проводили із застосуванням ампліфікатора GeneAmp PCR System 2720. Сиквенування здійснювали на автоматичному ДНК сиквенаторі ABI PRISM 3130 Genetic Analyser. Послідовності аналізували за допомогою програми BLAST шляхом порівняння з послідовностями з міжнародної бази даних GenBank NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/). Жирнокислотний склад загальних клітинних ліпідів та моносахаридний склад екзополісахаридів (ЕПС) вивчали у трьох штамів бульбочкових бактерій сої: B. japonicum 634б і B. japonicum КС2-3 – з повільним ростом, Bradyrhizobium sp. КВ1-1 – з інтенсивним ростом. Культури вирощували на агаризованому бобовому середо- вищі при 28 оС. У пізню логарифмічну фазу росту бактеріальну масу змивали фізіологічним розчином, осаджували центрифугуванням за 10000 об./хвилину протягом 20 хвилин і двічі відмивали у такому ж режимі. Бактеріальні клітини висушували ацетоном та діетиловим ефіром. Супернатант розводили фізіологічним розчином у співвід- ношенні 1:1 і повторно центрифугували за 10000 об./хвилину протягом 20 хвилин. Повноту видалення бактеріальних клітин контролювали під мікроскопом. Екзополісахариди виділяли з супернатанту шляхом одноразового осадження сірчанокислим 53 амонієм (50 % насичення). Отримані препарати діалізували проти дистильованої води до повного видалення іонів SO4 2– та ліофільно висушували. Визначення  жирнокислотного  складу  загальних  клітинних  ліпідів. Бактеріальну масу гідролізували в 1,5 % розчині хлористого ацетилу на метанолі при температурі 100 оС протягом 4 годин [12]. Метилові ефіри жирних кислот екстрагували тричі гексаном (по 3 мл). Фракцію н-гексану відбирали і висушували на вакуумному випаровувачі. Аналіз метилових ефірів жирних кислот проводили на хромато-мас-спектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert. Колонка HP-5MS, довжина 30 м, внутрішній діаметр 0,25 мм, товщина фази 0,25 мкм. Температурний режим 150-250 оС, градієнт температури 4 оС/хвилину, газ-носій – гелій, швидкість потоку через колонку 1,2 мл/хвилину. Температура випаровувача – 250 оС, з поділом потоку 1:100. Метилові ефіри жирних кислот ідентифіку- вали за тривалістю утримання їх порівняно зі стандартами. Як стандарти використовували метилові ефіри жирних кислот фірми «Supelco». Вміст жирних кислот у відсотках загальної площі піків визначали за допомогою програмного забезпечення ChemStation. Ідентифікація нейтральних моносахаридів ЕПС. Препарати ЕПС гідролізували у 2н НС1 протягом 5 годин при 100 оС. Обробку зразків проводили за методом P. Albershein із співавт. [13]. Суміш нейтральних моносахаридів у вигляді ацетатів поліолів розділяли на хромато-мас-спектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert, колонка DВ-225 mS 30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм, газ носій – гелій, потік через колонку 1 мл/хвилину. Температура випаровувача – 250 оС, інтерфейсу – 280 оС, термостату – 220 оС (режим ізотермічний). Пробу вводили з діленням потоку 1:100. Ідентифікацію моносахаридів проводили шляхом порівняння часу утримання ацетатів поліолів досліджуваних зразків і стандартних, а також з використанням комп’ютерної бази даних ChemStation. Кількісне співвідношення окремих моносахаридів визначали у відсотках від сумарної їх кількості за співвідношенням площ всіх піків моносахаридів [14]. Симбіотичні властивості отриманих нами штамів мікросимбіонтів сої вивчали у вегетаційному досліді згідно із загальноіснуючими правилами. В досліді використовували культурну (Glycine  max (L.) Merr.) та дику (Glycine  soya) сою, а також вигну китайську (Vigna inguiculata). Активність симбіотич- 54 ної азотфіксації визначали ацетиленовим методом на газовому хроматографі «Chrom-4»[15]. Статистичну обробку експериментальних даних проводили за загальноприйнятими методами [16] та застосовували комп’ютерну програму Statistica 6.0. Результати та їх обговорення. Порівняльний аналіз 45 культуральних та фізіолого-біохімічних властивостей тридцяти досліджуваних штамів бульбочкових бактерій сої з повільним та інтенсивним ростом показав, що вони істотно відрізняються за морфологією колоній, швидкістю росту, чутливістю до анти- біотиків і використанням сполук вуглецю. Інтенсивнорослі штами проявляють високу специфічність до рослини-живителя і при повторному пасажі через рослину їх властивості не змінюються [17]. Повільнорослі бульбочкові бактерії сої трапляються в усіх п’яти досліджених регіонах України, тоді як штами з інтенсивним ростом виявлені лише в ґрунтах північного, центрального та схід- ного Лісостепу. Кількісне співвідношення штамів – представників двох груп змінюється в залежності від ґрунтово-кліматичної зони. Достатньо інформативним при вивченні різноманітності бульбочкових бактерій є серологічний метод. Із застосуванням модифікованої схеми імунізації кролів нами отримано імунні сиро- ватки до штаму з інтенсивним ростом Bradyrhizobium sp. КВ1-1 та штамів із повільним ростом B. japonicum 634б та B. japonicum 46. У своїх дослідженнях ми також використовували антисироватку до повільнорослого штаму B. japonicum М8, люб’язно надану нам співробітниками лабораторії трансформації азоту і фосфору ІСГМ УААН. За допомогою методу аглютинації вивчено серологічну спорідненість мікросимбіонтів сої з різною швидкістю росту (45 штамів). Встановлено, що п’ятнадцять інтенсивнорослих штамів ризобій сої, які виділені з різних агроценозів України, позитивно реагували виключно з антисироваткою до штаму Bradyrhizobium sp. КВ1-1 і не взаємодіяли з сироватками до повільнорослих штамів B. japonicum 634б, B. japonicum М8 та B. japonicum 46. Отримані дані засвідчують, що штами з інтенсивним ростом, різного еколого- географічного походження, чітко відокремлені від повільнорослих ризобій сої за серологічними ознаками і можуть бути об’єднані в одну серогрупу. 55 Тридцять досліджених штамів повільнорослих бульбочкових бактерій сої (представників географічно віддалених популяцій ризобій) виявилися серологічно гетерогенними і були віднесені нами до чотирьох серогруп. Для підтвердження видового статусу повільнорослих штамів ризобій сої і з’ясування таксономічного положення інтенсивнорос- лих мікросимбіонтів сої нами була проведена ПЛР з універсальними бактеріальними праймерами fD1 та rP2. Порівнювали індивідуальні 16S рРНК послідовності цих штамів з сиквенсами, що містяться у базі даних GenBank (табл. 1). Таблиця 1. Результати сиквенування фрагментів 16s рРНК бульбочкових бактерій сої Номер досліджуваного штаму Назва виду і номер референс- штаму у нуклеотидній базі GenBank Д ов ж ин а фр аг ме нт у 16 S рР Н К , щ о по рі вн ю єт ьс я Ід ен ти чн іс ть по сл ід ов но ст ей , % 1 2 3 4 П ов іл ьн ор ос лі ш та ми В-209Т = VKM 1967 = ATCC 10324 Bradyrhizobium japonicum ATCC 10324 U 69638 1080 99,9 Bradyrhizobium japonicum CCBAU 23019 DQ 993279 1075 99,9 Bradyrhizobium lupini  X 87273 1079 99,8 46 Bradyrhizobium japonicum ATCC 10324 U 69638 1053 99,6 Bradyrhizobium japonicum USDA 4 AF 208515 1056 99,9 Bradyrhizobium yuanmingense CCBAU 53119 EF 394145 1053 99,8 КС2-3 Bradyrhizobium japonicum ATCC 10324 U 69638 1025 99,6 Bradyrhizobium japonicum  USDA 4 AF 208515 1028 99,9 Bradyrhizobium liaoningense  2281 AF 363132 998 99,8 56 1 2 3 4 Ін те нс ив но ро сл і ш та ми КВ1-1 Bradyrhizobium japonicum ATCC 10324 U 69638 1164 99,7 Bradyrhizobium japonicum USDA 123 AF 363151 1167 99,9 Bradyrhizobium canariense АВ 195986 1158 98,9 Bradyrhizobium lupini  U 69637 1165 99,7 КС1-9 Bradyrhizobium japonicum ATCC 10324 U 69638 920 99,6 Bradyrhizobium japonicum  SEMIA 6153 FJ 025097 921 99,8 Bradyrhizobium yuanmingense  R10m EU 364715 920 99,6 Mesorhizobium loti  AB 367700 921 99,8 Значні відмінності інтенсивнорослих штамів від повільнорослих за морфолого-культуральними та фізіолого- біохімічними ознаками, а також високий ступінь ідентичності (99,6-99,9 %) їх послідовностей генів 16S рРНК з послідовностями різних видів ризобій не дозволяють остаточно визначити їх видову належність. Важливим критерієм при диференціації окремих видів мікроорганізмів є така їх хемотаксономічна ознака як своєрідність жирнокислотного складу загальних клітинних ліпідів. Аналіз жирнокислотних спектрів бульбочкових бактерій сої показав, що штами з інтенсивним (Bradyrhizobium sp. КВ1-1) і повільним (B. japonicum 634б и B. japonicum КС2-3) ростом схожі, але не ідентичні, за жирнокислотними профілями (рис. 1). У загальних клітинних ліпідах цих штамів виявлено типові для бактерій виду B. japonicum насичені та ненасичені жирні кислоти з довжиною ланцюга від 12 до 18 вуглецевих атомів. Домінуючими жирними кислотами є гексадеканова (15,25- 28,03 %), октадеценова (46,02-78,80 %) та октадеканова (19,43- 21,52 %) кислоти. Однак слід відмітити, що ліпіди штаму з інтенсивним ростом Bradyrhizobium sp. КВ1-1 містили більшу кількість 3-оксидодеканової (3-ОН−С12:0) і 3-окситетрадеканової 57 (3-ОН−С14:0) кислот, а також не ідентифікованих нами жирних кислот (Х1 и Х2) у порівнянні з референтним та повільнорослими штамами. Рис. 1. Жирнокислотні спектри різних штамів бульбочкових  бактерій сої (A – штам з інтенсивним ростом Bradyrhizobium sp.  КВ1-1, B – повільнорослий штам B. japonicum КС2-3,   C – повільнорослий стандартний штам B. japonicum 634б). Відомо, що багатоступінчастий процес формування бульбо- чок у бобових рослин ініціюють екзополісахариди бульбочкових бактерій. Раніше нами було показано, що інтенсивнорослі штами продукують більшу кількість цих сполук порівняно із повільнорослими. Виявлено, що штами з інтенсивним і повільним ростом мають кількісні та якісні відмінності у моносахаридному складі екзополісахаридів (табл. 2). Домінуючими моносахаридами ЕПС всіх досліджених штамів є глюкоза, маноза та галактоза. ЕПС інтенсивнорослого штаму Bradyrhizobium sp. КВ1-1 відрізняються від ЕПС повільнорослих штамів B. japonicum КС2-3 та B. japonicum 634б наявністю ксилози (2,7 %) і значної кількості (18,4 %) рамнози. 58 У штамів із повільним ростом остання присутня в мінорних кількостях (0,6-0,9 %). Таблиця 2. Моносахаридний склад екзополісахаридів бульбочкових бактерій сої Штами Моносахариди рамноза ксилоза маноза галактоза глюкоза B. japonicum 634б 0,9 − 34,2 14,5 50,4 B. japonicum КС2-3 0,6 − 34,6 17,5 47,3 Bradyrhizobium sp. КВ1-1 18,4 2,7 28,9 9,3 40,7 Примітка:  кількість моносахаридів наведено у процентах від загальної площі піків; «−» − моносахарид не виявлено. Зважаючи на те, що повільно- та інтенсивнорослі штами бульбочкових бактерій сої розрізняються за багатьма ознаками, нами було проведено вивчення специфічності їх взаємодії з різними бобовими рослинами. За умов вегетаційного досліду вивчали особливості функціонування симбіотичних систем культурної (Glycine max (L.) Merr.) і дикої (Glycine soya) сої та вигни китайської (Vigna inguiculata) із штамами бульбочкових бактерій сої з повільним (B. japonicum 634б, B. japonicum 46) і інтенсивним (Bradyrhizobium sp. КВ1-1, Bradyrhizobium sp. КС1-9) ростом та штамом ризобій вигни (Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1). Активність та ефективність симбіозу бактерій з рослинами оцінювали порівняно до стандартного штаму ризобій сої B. japonicum 634б. Слід зазначити, що при проведенні вегетаційного досліду у стерильний субстрат (вермикуліт) висівали поверхнево стери- лізоване насіння, тому у контрольних варіантах на коренях рослин бульбочки були відсутні (табл. 3). Внесені штами бульбочкових бактерій сої та вигни формували численні бульбочки на коренях рослин різних видів, що засвідчує наявність прямого та перехресного інфікування. Особливої різниці між повільно- та інтенсивнорослими штамами ризобій сої за впливом на показник кількості бульбочок нами не виявлено. З даних табл. 3 видно, що в симбіозі з культурною та дикою соєю бульбочкові бактерії сої як з повільним, так і з інтенсивним ростом активно фіксували молекулярний азот. 59 Таблиця 3. Активність симбіозу бульбочкових бактерій сої та вигни з різними видами бобових культур (вегетаційний дослід) Варіанти досліду К іл ьк іс ть б ул ьб оч ок , од ./р ос ли ну М ас а бу ль бо чо к, г /р ос ли ну А кт ив ні ст ь си мб іо ти чн ої аз от фі кс ац ії, мк г N /р ос ли ну за го д. В мі ст с ух ої р еч ов ин и в на дз ем - ні й ма сі р ос ли н, г /р ос ли ну КУЛЬТУРНА СОЯ Контроль (без інокуляції) 0 0 0 0,99 Інокуляція B. japonicum 634б 47,50 0,36 15,89 1,25 Інокуляція B. japonicum 46 56,92 0,41 30,46 1,34 Інокуляція Bradyrhizobium sp. КВ1-1 55,00 0,36 20,31 1,29 Інокуляція Bradyrhizobium sp. КС1-9 62,50 0,40 16,11 1,26 Інокуляція Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1 57,25 0,30 16,11 1,26 НІР05 4,13 0,02 2,81 0,06 ДИКА СОЯ Контроль (без інокуляції) 0 0 0 0,30 Інокуляція B. japonicum 634б 26,42 0,13 1,11 0,35 Інокуляція B. japonicum 46 31,75 0,13 1,45 0,39 Інокуляція Bradyrhizobium sp. КВ1-1 37,08 0,15 2,05 0,39 Інокуляція Bradyrhizobium sp. КС1-9 29,50 0,14 1,27 0,36 Інокуляція Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1 31,00 0,13 1,51 0,37 НІР05 3,99 0,02 0,24 0,04 ВИГНА КИТАЙСЬКА Контроль (без інокуляції) 0 0 0 0,49 Інокуляція B. japonicum 634б 86,25 0,91 12,79 1,26 Інокуляція B. japonicum 46 98,08 0,94 21,85 1,44 Інокуляція Bradyrhizobium sp. КВ1-1 78,17 0,87 3,85 0,97 Інокуляція Bradyrhizobium sp. КС1-9 85,17 0,82 4,17 0,74 Інокуляція Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1 104,08 1,00 25,82 1,67 НІР05 5,36 0,04 2,26 0,05 60 Проте рівень активності нітрогенази у представників обох груп штамів на культурній сої був вищим (16,11-30,46 мкг N/рослину за год.), ніж на дикій (1,11-2,05 мкг N/рослину за год.), що пов’язано з більшою масою бульбочок. Кращими за впливом на симбіотичні показники обох культур виявилися повільнорослий штам ризобій сої B. japonicum 46, інтенсивнорослий штам Bradyrhizobium sp. КВ1-1 та штам ризобій вигни Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1. Найбільші відмінності між повільно- та інтенсивнорослими штамами спостерігали при взаємодії їх із вигною китайською. Якщо досліджувані штами практично не відрізнялися за впливом на формування кореневих бульбочок, то азотфіксувальна активність у варіантах з інокуляцією інтенсивнорослими штамами була у 3,1-5,7 раза нижчою, порівняно із штамами з повільним ростом. Урожайні дані також засвідчують той факт, що інтенсивнорослі штами (Bradyrhizobium sp. КВ1-1 та Bradyrhizobium sp. КС1-9) утворюють неспецифічний симбіоз із вигною. Вміст сухої речовини в надземній масі рослин у варіантах з інокуляцією цими штамами був у 1,3-1,9 раза нижчим порівняно до повільнорослих штамів B. japonicum 634б та B. japonicum 46. Ефективність симбіозу повільнорослих штамів ризобій сої із вигною китайською підтверджується підвищеним вмістом хлорофілів а та b в біомасі листя вигни як у фазу бутонізації, так і у фазу цвітіння (табл. 4). Таблиця 4. Вплив інокуляції бульбочковими бактеріями сої та вигни на вміст хлорофілів у біомасі листя вигни китайської (вегетаційний дослід) Варіанти досліду Фаза бутонізації Фаза цвітіння кількість хлорофілу, мг/100 г а b а+b а b а+b Контроль (без інокуляції) 11,18 3,38 14,56 10,71 2,32 13,03 Інокуляція B. japonicum 634б 62,03 14,49 76,52 71,28 16,30 87,58 Інокуляція B. japonicum 46 70,30 15,19 85,49 91,98 21,00 112,98 Інокуляція Bradyrhizobium sp. КВ1-1 27,45 5,92 33,37 32,77 7,26 40,03 Інокуляція Bradyrhizobium sp. КС1-9 21,31 4,37 25,68 25,06 3,28 28,34 Інокуляція Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1 89,91 22,87 112,68 102,96 24,49 127,45 НІР05 1,61 1,49 2,43 2,24 3,77 5,22 61 У варіантах із інокуляцією штамами з інтенсивним ростом сума хлорофілів (фаза цвітіння) була у 2,2-4,0 рази нижчою порівняно із штамами B. japonicum 634б та B. japonicum 46. Найбільший вміст хлорофілів відмічено в листках вигни за інокуляції специфічним штамом Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1 (112,68 та 127,45 мг/100 г). Найбільш комплементарними за симбіотичною ефектив- ністю є пари: культурна соя – повільнорослий штам B. japonicum 46, дика соя – штами B. japonicum 46 та Bradyrhizobium sp. КВ1- 1, вигна китайська – штами Bradyrhizobium sp. (Vigna) В1 та B. japonicum 46. Таким чином, в агроценозах України сформувалися місцеві популяції бульбочкових бактерій сої, гетерогенність яких підтверджується наявністю в них двох груп штамів: з інтенсивним та повільним ростом. Вилучені штами мають комплекс характер- них ознак і суттєво розрізняються за серологічними, хемотаксо- номічними та симбіотичними властивостями. Подальші дослідження бульбочкових бактерій сої із засто- суванням сучасних молекулярно-генетичних методів (аналіз симбіотичних генів, ДНК-ДНК гібридизація, RAPD, t-RFLP та AFLP) дозволять уточнити видову належність інтенсивнорослих штамів, а також виявити фактори, що визначають різноманітність бактерій у ґрунтових популяціях брадіризобій. 1. Zahran H.H. Rhizobia from wild legum: diversity, taxonomy, ecology, nitrogen fixation and biotechnology /H.H. Zahran //J. Biotechnol. – 2001. – Vol. 91, № 2-3. – P. 143-153. 2. Broughton W.J. Roses by other names: taxonomy of the Rhizobiaceae /W.J. Broughton //J. Bacteriol. – 2003. – Vol. 185, № 10. – P. 2975-2979. 3. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. The Proteobacteria. Part A+B+C //eds. D.J. Brenner, N.R. Krieg, J.T. Staley; editor-in-chief G.M. Garrity. – New York: Springer SBM, 2005. – Vol. 2. – 2800 p. 4. Willems А. The taxonomy of rhizobia: an overview /А. Willems //Plant and Soil. – 2006. – Vol. 287. – P. 3-14. 5. Spaink H. Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria /Spaink H., Kondorosi A., Hooykaas P.; пер. с англ. И.А. Тихоновича, Н.А. Проворова. – СПб., 2002. – 568 с. 6. Новикова Н.И. Современные представления о филогении и систематике клубеньковых бактерий /Н.И. Новикова //Микробиол. – 1996. – Т. 65, Вып. 4. – С. 437-450. 7. Крутило Д.В. Поширення та екологічні особливості бульбочко- 62 вих бактерій сої в різних регіонах України: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. біол. наук: спец. 03.00.16 «Екологія» /Крутило Д.В. – Київ, 2006. – 22 с. 8. Крутило Д.В. Бульбочкові бактерії сої як складова мікробіоти грунтів України /Д.В. Крутило, Т.М. Ковалевська //Живлення рослин: теорія і практика: зб. наук. пр. – К.: Логос, 2005. – С. 346-355. 9. Берестецкий О.А. Методические рекомендации по получению новых штаммов клубеньковых бактерий и оценке их эффективности /О.А. Берестецкий. – Л., 1979. – 33 с. 10. Кэбот Э. Экспериментальная иммунология /Э. Кэбот, Б. Мейер. – М.: Медицина, 1968. – 677 с. 11. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study /W.G. Weisburg, S.M. Barns, D.A. Pelletier, D.J. Lane //J. Bacteriol. – 1991. – Vol. 173. – P. 697-703. 12. Васюренко З.П. Особенности состава жирных кислот липидов у Providencia  alcalifaciens  и Providencia  stuartii  II /З.П. Васюренко, Е.Н. Чернявская, Л.В. Опенько //Микробиол. – 1982. – Т. 51, № 1. – С. 54- 59. 13. A method for analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gasliquid chromatography /P. Albershein, D.J. Nevis, P.D. English, A. Karr //Carbon. Res. – 1976. – Vol. 5, № 3. – P. 340-345. 14. Варбанец Л.Д. Методы исследования эндотоксинов /Л.Д. Вар- банец, Г.М. Здоровенко, Ю.А. Книрель. – К.: Наук. думка, 2006. – 237 с. 15. The acetylene-ethylene assay for N2-fixation: laboratory and field evaluation /R.W.F. Hardy, R.D. Holsten, E.K. Jackson, R.C. Burns //Plant Physiol. – 1968. – Vol. 43, № 8. – P. 1185-1207. 16. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта /Б.А. Доспехов. – М.: Агропромиздат, 1985. – 352 с. 17. Біологічна різноманітність бульбочкових бактерій сої в ґрунтах України /Д.В. Крутило, О.В. Надкернична, Т.М. Ковалевська, В.П. Патика //Мікробіол. журн. – 2008. – Т. 70, № 6. – С. 27-34. 63 БИОЛОГИчЕСКИЕ СВОЙСТВА КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ С РАЗНОЙ СКОРОСТЬЮ РОСТА Крутило Д.В. Институт сельскохозяйственной микробиологии УААН, г. Чернигов Изучены  фенотипические  и  генотипические  свойства  микросимбионтов  сои  с  разной  скоростью  роста.  установлено,  что штаммы с интенсивным ростом проявляют специфичность  к  растению-хозяину,  однако  существенно  отличаются  от  медленнорастущих клубеньковых бактерий сои по серологическим,  хемотаксономическим и симбиотическим свойствам.  По  антигенному  составу  интенсивнорастущие  штаммы  объединены в одну серогруппу. Отмечено сходство жирнокислот- ных профилей штамма с интенсивным ростом Bradyrhizobium sp.  КВ1-1  и  медленнорастущих  штаммов  B. japonicum  634б  и  B. japonicum  КС2-3.  Выявлены  количественные  и  качественные  отличия  в  моносахаридном  составе  ЭПС  исследованных  штаммов.  ЭПС  штамма  Bradyrhizobium sp.  КВ1-1  отличаются  от  ЭПС  штаммов  B. japonicum  КС2-3  и  B. japonicum  634б  наличием  ксилозы  (2,7 %)  и  повышенным  содержанием  рамнозы  (18,4 %).  Анализ  последовательностей  генов  16S рРНК  позволил  отнести  интенсивнорастущие  штаммы  к  роду  Bradyrhizobium.  Исследованные  интенсивнорастущие  штаммы  образуют  неспецифический симбиоз с вигной китайской.  Ключевые слова:  антисыворотка,  клубеньковые  бактерии  сои, полисахариды, жирные кислоты, 16S рРНК. 64 THE BIOLOGICAL PROPERTIES OF SOyBEAN NODULE BACTERIA wITH THE DIFFERENT SPEED OF GROwTH Krutуlo D.V. Institute of Agricultural Microbiology, UAAS, Chernihiv The  phenotypical  and  genotypic  properties  of  soybean  microsymbionts with the different speed of growth were studied. It was  established that the strains with the intensive growth were specific to the  host-plant, but had differed by their serological, chemotaxonomical and  symbiotic properties.  The  investigated  intensive-growing  strains  were  combined  into  the  one  serogroup  by  their  antigenic  content.  The  similarity  of  fatty  acids spectrum was observed for the strains with the intensive growth  Bradyrhizobium sp.  КВ1-1,  slow-growing  strains  B. japonicum  634b  and B. japonicum КС2-3. The quantitative and qualitative differences in  monosaccharides contents of EPS of the studied strains were revealed.  Presence of xylose (2,7 %) and increased contents of rhamnose (18,4 %)  were shown to be different  in EPS of strain Bradyrhizobium sp. КВ1- 1  and  EPS  of  strains  B. japonicum  КС2-3  and  B. japonicum  634b.  Analysis  of  the  sequences  of  the  16S rRNA genes  allowed  attributing  the strain with the intensive growth to the Bradyrhizobium genus. Genes  consistency  analysis  of  16S rRNA had  allowed  to  refer  the  intensive- growing strains to the Bradyrhizobium genus. It was shown that studied  intensive-growing  strains  had  formed  the  nonspecific  symbiosis  with  cow pea.  Key words: antiserum, soybean nodule bacteria, polysaccharides,  fatty acids, 16S rRNA.

Ähnliche Einträge