Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів

Виявлено дозозалежний ефект інгібування іонами золота інтенсивності природної люмінесценції штаму Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+). Клітини цих бактерій можуть слугувати сенсорним елементом біолюмінесцентного аналізатора для визначення вмісту іонного золота, наприклад у стічних водах золотодо...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Published in:	Біотехнологія
Date:	2008
Main Authors:	Задорожняя, А.М., Грузіна, Т.Г., Дибкова, С.М., Ульберг, З.Р.
Format:	Article
Language:	Ukrainian
Published:	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 2008
Subjects:	Експериментальні статті
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/28155
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів / А.М. Задорожняя, Т.Г. Грузіна, С.М. Дибкова, З.Р. Ульберг // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 4. — С. 69-75. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859586542144585728
author	Задорожняя, А.М. Грузіна, Т.Г. Дибкова, С.М. Ульберг, З.Р.
author_facet	Задорожняя, А.М. Грузіна, Т.Г. Дибкова, С.М. Ульберг, З.Р.
citation_txt	Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів / А.М. Задорожняя, Т.Г. Грузіна, С.М. Дибкова, З.Р. Ульберг // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 4. — С. 69-75. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.
collection	DSpace DC
container_title	Біотехнологія
description	Виявлено дозозалежний ефект інгібування іонами золота інтенсивності природної люмінесценції штаму Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+). Клітини цих бактерій можуть слугувати сенсорним елементом біолюмінесцентного аналізатора для визначення вмісту іонного золота, наприклад у стічних водах золотодобувних та золотопереробних підприємств, з метою контролю додержання технологічних процесів. У результаті кон’югативного схрещування отримано клітини транскон’югату Pseudomonas fragi T2(5), що містять гібридну плазміду (ZnRlux+) і здатні високоспецифічно випромінювати світло під час контакту з іонами цинку. Це уможливлює використання їх як чутливого елемента в біолюмінесцентному високоспецифічному визначенні якісного та кількісного вмісту цього металу в об’єктах довкілля. Выявлен дозозависимый эффект ингибирования ионами золота интенсивности природной люминесценции штамма Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+). Клетки этих бактерий могут выступать в качестве сенсорного элемента для определения содержания ионного золота, например в сточных водах золотодобывающих и золотоперерабатывающих предприятий, с целью контроля соблюдения технологических процессов. В результате конъюгативного скрещивания получены клетки трансконъюгата Pseudomonas fragi T2(5), которые содержат гибридную плазмиду (ZnRlux+) и способны высокоспецифично испускать свет при контакте с ионами цинка. Это дает возможность использовать их как сенсорный элемент в биолюминесцентном определении качественного и количественного содержания этого метала в объектах окружающей среды. It has been shown the doze-dependent inhibition influence of gold ions on Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+) natural luminescence. These bacterial cells can serve as a sensor element for ionic gold content detection, for example, in waste-water of gold-mining and gold-processing manufactures for requirements compliance control. The Pseudomonas fragi T2(5) transconjugates, which contain hybrid plasmid (ZnRlux+) and which are capable of the high-specific of light emission as a result of the contact with zinc ions, have been derived by conjugate crossing method. It enables to use these transconjugates as sensor elements in the high-specific bioluminescent detection of qualitative and quantitative content of this metal in environmental objects.
first_indexed	2025-11-27T10:59:17Z
format	Article
fulltext	Експериментальні статті 69 Усіх цих недоліків позбавлені біосенсорні аналітичні системи для визначення вмісту важких металів, у яких сенсорним елемен� том слугує бактеріальна біолюмінесценція. До основних переваг клітинних біосенсор� них аналізаторів слід віднести високу чут� ливість, здатність до визначення біотоксич� ної частки забруднювача, специфічність, швидкість реакції�відповіді, простоту вико� ристання, економічність [8]. Окрім використання як аналітичного си� гналу природної здатності бактерій до біо� люмінесценції, останнім часом набуває стрімкого розвитку напрям зі створення ви� сокоспецифічних генетично модифікованих штамів, здатних до індукованої біолюмінес� ценції певними важкими металами [9–12]. З огляду на вищезазначене метою роботи було розроблення сенсорних елементів для визначення іонів важких металів в об’єктах довкілля на основі природних та генетично модифікованих біолюмінесцентних штамів бактерій. Матеріали і методи Для створення сенсорних елементів було використано бактеріальний штам Photo7 bacterium phosphoreum В7071 (lux+) із ко� лекції морських люмінесцентних бактерій Однією з основних проблем швидкої індустріалізації є значне підвищення вмісту важких металів та їхніх сполук у ґрунтах, природних водоймах і стічних водах про� мислових підприємств. Залучення цих заб� руднювачів до трофічної ланки може стати причиною виникнення тяжких захворювань людини [1–3]. Той факт, що важкі метали здатні, навіть у мікроконцентраціях, приз� водити до локальних порушень цілісності ДНК, робить їх особливо небезпечними [4]. Відомо декілька «рядів небезпеки» іонів важких металів. До одного з найбільш не� безпечних для біосфери належать: Au, Ag, Zn, Cd, Cr, Hg, Mn, Pb, Sb, Sn, Te, W [5]. Тож за сучасних умов розвитку промисловості та стану очисних споруд постійний моніторинг об’єктів довкілля, зокрема водного середо� вища, з метою контролю вмісту цих забруд� нювачів є вкрай актуальним завданням. Найпоширенішими методами визначен� ня важких металів є атомна абсорбція, рент� генівська та емісійна спектроскопія [6, 7]. Однак ці методи є високовартісними, потре� бують багато часу й, окрім цього, не спро� можні визначити саме токсичну частку за� бруднювача, оскільки відомо, що важкі метали можуть утворювати стійкі комплекси з природними сполуками, які, у свою чергу, не виявляють токсичної дії на біосистеми. УДК 541.13:577.112.087 БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНІ БАКТЕРІЇ БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНІ БАКТЕРІЇ ЯК СЕНСОРНІ ЕЛЕМЕНТИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯЯК СЕНСОРНІ ЕЛЕМЕНТИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ ВМІСТУ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ Ключові слова: бактерії, природна біолюмінесценція, індукована біолюмінесценція, визначення, золото, цинк, кон’югативне схрещування. А. М. Задорожняя Т. Г. Грузіна Інститут біоколоїдної хімії ім Ф. Д. Овчаренка НАН України, Київ С. М. Дибкова З. Р. Ульберг E7mail: tgruzina@mail.ru Виявлено дозозалежний ефект інгібування іонами золота інтенсивності природної люмінесценції штаму Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+). Клітини цих бактерій можуть слугувати сенсорним елементом біолюмінесцентного аналізатора для визначення вмісту іонного золота, наприклад у стічних водах золотодобув� них та золотопереробних підприємств, з метою контролю додержання технологічних процесів. У результаті кон’югативного схрещування отримано клітини транскон’югату Pseudomonas fragi T2(5), що містять гібридну плазміду (ZnRlux+) і здатні високоспецифічно випромінювати світло під час контакту з іонами цинку. Це уможливлює використання їх як чутливого елемента в біолюмінесцентному високоспецифічному визначенні якісного та кількісного вмісту цього металу в об’єктах довкілля. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №4, 2008 70 тимальним для прояву інгібуючого впливу ксенобіотиків на біолюмінесценцію [13]. Для дослідження кінетики інгібування люмінесценції важкими металами 10 мл суспензії клітин у середовищі А, що містять відповідні концентрації металу, інкубували в колбах на магнітній мішалці. При цьому через певні проміжки часу відбирали проби по 1 мл і вимірювали інтенсивність їхньої біолюмінесценції. Штам Pseudomonas fragi T2(5) було виді� лено з дерново�підзолистого ґрунту, забруд� неного важкими металами (промисловий район м. Києва), охарактеризовано за куль� турально�біохімічними ознаками та рівнем стійкості до важких металів з використан� ням методу посіву на агаризованому трис� мінімальному глюконатвмісному середо� вищі з концентрацією металів: Zn — 0,8–2 мМ, Co — 1–2 мМ, Ni — 0,8–2мМ, Cu — 0,8–1 мМ, Cd — 0,8 мМ, CrO4 2– — 0,20–0,25 мМ; а та� кож на багатому середовищі з концент� рацією металів: Zn — 3–10 мМ, Co — 3–4 мМ, Ni — 3–5мМ, Cu — 1–2 мМ, Cd — 1 мМ. Аналітично чисті солі важких металів — ZnSO4·7H2O, CoCl2·6H2O, NiCl2·6H2O, Cu(NO3)2, CdCl2·6H2O, K2CrO4 (Merck, Німеччина) го� тували у вигляді 1М стокових розчинів, сте� рилізували автоклавуванням та додавали у середовища після їх стерилізації. Аналіз плазмідної ДНК штамів бактерій проводили за методом Екгардта [14]. Виді� лення плазмідної ДНК здійснювали лужним лізисом за методом Бірнбойма–Долі [15]. RAPD�аналіз плазмідних ДНК виконували за методом [16] з використанням праймерів OPA�06 та OPP�12. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) тривала 45 циклів (94 0С — 40 с; 35 0С — 40 с; 72 0С — 1 хв 30 с). Електрофо� рез плазмідних ДНК здійснювали в 0,8%�му агарозному гелі відповідно до методики [17]. Як стандарт для визначення розміру плазмід використовували нативну ДНК фага λ. З метою кон’югативного схрещування застосовували прекультури штамів Ps. fragi T2(5) та Ph. phosphoreum В7071, які вирощу� вали протягом 14 год у 5 мл рідкого живиль� ного середовища Luria–Bertani (LB�бульйо� ну). Клітини кожної культури осаджували центрифугуванням (6 000 об/хв, 10 хв), ре� суспендували в 5 мл 0,01 М розчині MgSO4. Схрещування проводили на LB�агарі, змі� шуючи по 100 мкл суспензій донора та ре� ципієнта з густиною 108 кл/мл. Культивували протягом 5 год при 28 0С, після чого висіва� ли на селективне трис�мінімальне глюконат� вмісне середовище з додаванням 20 мкг/мл тетрацикліну, 0,3 мМ Zn та 3% NaCl. Як Кримського медичного інституту ім. С. І. Геор� гієвського та штам Pseudomonas fragi T2(5) із колекції Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф. Д. Овчаренка НАН України. Вплив іонів важких металів на інтен� сивність природної біолюмінесценції клітин вивчали на штамі Photobacterium phospho7 reum В7071 (lux+). Бактеріальні клітини цьо� го штаму культивували протягом 16–18 год при 22 0С у живильному середовищі такого складу (г/дм3): пептон — 5; дріжджовий екстракт — 5; NaCl — 30; K2HPO4⋅7H2O — 15; (NH4)2HPO4 — 0,5; MgSO4 — 0,1; CaCO3 — 0,2; гліцерол — 3 мл/л. Концентрацію клітин контролювали спектрофотометрично (спектрофотометр СФ� 46, «Ломо», Росія) за довжини хвилі 640 нм. Для аналізу було використано три мета� ли у різних концентраціях: цинк, кобальт та золото. Цинк та кобальт застосовували у вигляді солей: ZnSO4·7H2O та CoCl2·6H2O кваліфікації ч.д.а. виробництва Merck (Ні� меччина), готуючи вихідні 1 М розчини. Зо� лото використовували у формі золотохло� ристоводневої кислоти (HAuCl4) (Sigma, США), з вихідною концентрацією 60 мкг/мл за металом. Клітини бактерій перед аналізом осад� жували із середовища росту центрифугуван� ням (6 000 об/хв, 10 хв) та ресуспендували в середовищі А такого складу: 50 мМ трис� амінометанмалат�NaOH буфер, 2,5% NaCl, pH 7 до кінцевої концентрації (D640 = 0,5), що відповідає 1⋅106 кл/мл або 0,5 мг/мл су� хої маси. Інтенсивність біолюмінесценції бактерій Ph. phosphoreum В7071 реєстрували на екс� периментальному хемілюмінометрі при температурі 23 0С. Хемілюменометр являє собою комп’ютер, у корпус якого вмонтова� но вимірювальну комірку, яка контактує з фотопомножувачем (вимірювальний мо� дуль). Реєстрацію біолюмінесценції та оброб� ку отриманих даних проводили за допомогою спеціально розробленої програми. Прилад дозволяє визначати біолюмінесценцію в кі� нетичному режимі з реєстрацією відгуку че� рез кожні 5–10 с. Контролем слугували сус� пензії клітин, які не містили важких металів. Для вивчення впливу іонів важких ме� талів на інтенсивність біолюмінесценції бактерій Ph. phosphoreum В7071 у кюветі хемілюменометра змішували 0,8 мл сус� пензії вихідних клітин у середовищі А та відповідні аліквоти металів. Об’єм проби становив 1 мл, час інкубації — 30 хв, час виміру — 10 с. Обраний час інкубації був оп� Експериментальні статті 71 ливість до дії іонів Zn та Co у максимально діючій концентрації — 100 мкМ (рис. 1). Дослідження особливостей впливу іон� ного золота на біолюмінесцентний штам Ph. phosphoreum В7071 дозволили встанови� ти, що вже при концентрації 0,12 мкг/мл (0,6 мкМ) за металом відбувалося інгібуван� ня бактеріальної люмінесценції більш ніж утричі порівняно з контролем (рис. 2). Це свідчить про значний токсичний вплив іонів Au на процеси життєдіяльності клітин досліджуваного штаму. Висока концентраційно�залежна чут� ливість штаму Ph. phosphoreum В7071 до впливу іонного золота свідчить про мож� ливість використання його як сенсорного елемента при створенні біосенсорів для виз� начення вмісту іонів золота у водних середо� вищах. контроль на це саме середовище висівали клітини донора та реципієнта. Результати кон’югативного схрещування аналізували після культивування культур протягом 24 год при 28 0С. Для підтвердження наявності генів (ZnRlux+) у гібридній плазміді одержаних транскон’югатів проводили її елімінацію з використанням інтеркалюючого барвни� ка — бромистого етидію [18, 19], кінцева концентрація якого в середовищі становила 100 мкг/мл. Тестування елімінантів на чутливість до іонів цинку здійснювали шляхом висівання на трис�мінімальне середовище з концент� рацією цинку 0,1–1,0 мМ. Інтенсивність металіндукованої біолюмі� несценції клітин штаму�транскон’югату оці� нювали за описаною раніше методикою [20]. У роботі було використано трис�гідро� ксиметиламінометан (Gibco BRL, Шотлан� дія); LB�середовище, пептон, глюконат Na, дріжджовий екстракт, агарозу, бромистий етидій (Sigma, США); праймери: OPA�06 и OPP�12 (Operon LTD, США). Інші реакти� ви були вітчизняного виробництва, кваліфі� кації х. ч. та ч. д. а. Статистичну обробку результатів експе� рименту здійснювали згідно [21] з викорис� танням критерію Стьюдента (p < 0,05). Результати та обговорення Можливість розроблення сенсорних еле� ментів з використанням природної та інду� кованої здатності бактеріальних клітин реа� гувати на присутність забруднювачів зміною інтенсивності люмінесценції інтен� сивно вивчається останнім часом [22]. Нами було проведено комплексні дослі� дження щодо можливостей розроблення сенсорних елементів з використанням як аналітичного сигналу зміни інтенсивності біолюмінесценції мікроорганізмів під дією важких металів в іонному стані. Було вивчено вплив іонів важких ме� талів на інтенсивність природної люмінес� ценції штаму Ph. phosphoreum В7071. Показано, що іони важких металів (Zn, Co та Au) справляють інгібуючий вплив на біолюмінесценцію клітин досліджуваного штаму. При цьому встановлено, що най� більш виражена концентраційно�залежна здатність інгібувати інтенсивність люмінес� ценції бактеріальних клітин притаманна іонам золота: чутливість штаму до дії золота в іонному стані у концентрації 1 та 2,5 мкМ була значно більш вираженою, ніж чут� Рис. 1. Ступінь інгібування природної люмінесценції клітин Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+) іонами важких металів: 1 — іони Au концентрацією 0,2 мкг/мл (1,0 мкМ); 2 — іони Au концентрацією 0,5 мкг/мл (2,5 мкМ); 3 — іони Zn концентрацією 100 мкМ; 4 — іони Со концентрацією 100 мкМ Рис. 2. Вплив іонного золота на інтенсивність біолюмінесценції штаму Ph. phosphorum B7071 1 432 БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №4, 2008 72 Встановлено, що клітини досліджувано� го штаму містять плазміду розміром близь� ко 50 т.п.н. (рис. 4, доріжка 2). Як маркер розміру плазмід було використано препарат ДНК фага λ (рис. 4, доріжка 1). Причетність виділеної плазмідної ДНК до детермінації стійкості до іонів цинку бу� ло виявлено в результаті експериментів з елімінації цієї плазміди з подальшою пе� ревіркою резистентності клітин�елімінантів штаму Ps. fragi T2(5) до цинку. Для цього 15�ту генерацію культури бактерій, культи� вування якої проводили на багатому середо� вищі без вмісту іонів цинку (виключений се� лективний тиск на бактерії з боку металу), ресуспендували у 10 мМ розчині MgSO4 та висівали, використовуючи десятикратні розведення, на агаризовані багаті та міні� мальні середовища, що містили іони цинку різної концентрації. У результаті було вста� новлено, що культура втрачала здатність до росту в присутності 0,6 мМ іонів цинку на мінімальному глюконатвмісному середо� вищі та 1 мМ — на багатому LB�середовищі. Таким чином, виявлена плазміда є генетич� ною детермінантою стійкості штаму Ps. fragi T2(5) до іонів цинку. На користь такої можливості вказують також результати, що їх одержано під час вивчення особливостей кінетики процесу взаємодії іонного золота з клітинами штаму Ph. phosphoreum В7071. Кінетичні криві гасіння інтенсивності бактеріальної люміне� сценції іонами золота за двох різних значень концентрації (рис. 3) показують «швидку» кінетику цього процесу: протягом 10 хв рі� вень гасіння біолюмінесценції досягав мак� симального значення і подальше збільшен� ня часу інкубації не впливало на його хід. Таким чином, отримані результати під� тверджують можливість застосування ефек� ту інгібування іонами золота інтенсивності природної біолюмінесценції штаму Ph. phos7 phoreum В7071, використаного як сенсор� ний елемент біолюмінесцентного аналізато� ра для визначення вмісту іонного золота у водному середовищі. Для подальших досліджень щодо розроб� лення сенсорних елементів значний інтерес становить штам Ps. fragi T2(5). Вивчення стійкості клітин цих бактерій до низки іонів важких металів (Zn — 0,8–2 мМ, Co — 1–2 мМ, Ni — 0,8–2 мМ, Cu — 0,8–1 мМ, Cd — 0,8 мМ, CrO4 2– — 0,20–0,25 мМ) виявило, що штам Ps. fragi T2(5) характеризувався високим рівнем резистентності тільки до іонів цинку (таблиця). Звичайні концентраційні межі біодоступ� них металів становлять 0,5–20 мМ [23, 24], тож рівень стійкості штаму Ps. fragi T2(5) на мінімальному (2,0 мМ) та багатому (10,0 мМ) середовищах є досить високим. З метою визначення генетичної детермі� нації стійкості до іонів цинку штаму Ps. fragi T2(5) проведено експерименти з виді� лення та аналізу плазмідної ДНК. Рис. 3. Кінетика гасіння біолюмінесценції Ph. phosphorum B7071 іонами золота за концентрацій (мкг/мл): 0,12 ( ) та 0,3 ( • ) Ріст бактерій Pseudomonas fragi T2(5) у присутності іонів цинку Живильне середовище Вміст Zn Трис�мінімальне глюконатвмісне середовище 0,8 мМ 1,0 мМ 2,0 мМ ++ ++ +– LB�середовище 3,0 мМ 5,0 мМ 10,0 мМ ++ ++ +– Примітка: «++» — інтенсивний ріст; «+–» — помірний ріст. Рис. 4. Розділення плазмід штамів бактерій у 0,8%\му агарозному гелі: 1 — маркер молекулярної маси — нативна ДНК фа� га λ (47 т.п.н.); 2 — плазміда штаму Ps. fragi Т2(5) (ZnR); 3 — плазміда штаму Ph. phosphoreum В7071; 4 — плазміда штаму Ps. fragi Т2(5) (ZnR lux+) 1 432 Експериментальні статті 73 лись високою чутливістю до іонів цинку та не виявляли біолюмінесцентних властивостей. Створені селективні умови експерименту сприяли відбору таких модифікацій, де ре� гуляція експресії lux�генів відбувається промоторно�операторною ділянкою спільно з генами стійкості до цинку. У кінцевому підсумку в гібридному lux�опероні цинк виступає як регулятор синтезу бактеріаль� ної люциферази, яка каталізує окиснення аліфатичного альдегіду та відновлення фла� вінмононуклеотиду молекулярним киснем, унаслідок чого випромінюється світло. Інтенсивність біолюмінесценції у цьому процесі є функцією концентрації цинку, з яким контактують клітини такої генетич� ної конструкції. Це дає змогу використову� вати клітини отриманого транскон’югату як сенсорний елемент для кількісного та якіс� ного визначення іонів цинку. Аналіз характеру впливу іонів важких ме� талів на інтенсивність біолюмінесценції клі� тин генетично модифікованого штаму Ps. fragi T2(5) (ZnRlux+) засвідчив чітко виражену дію іонів цинку (рис. 6, крива 1). Прямолінійна залежність інтенсивності люмінесценції від концентрації цинку зберігається в діапазоні 1–100 мкМ за металом. Хід кривих 2–6 свід� чить про незначний рівень чутливості клі� тин транскон’югату до інших важких металів. Плазмідний характер резистентності цьо� го штаму до іонів цинку уможливлює вико� ристання його в експериментах з генетичної модифікації з метою отримання транскон’ю� гатів з гібридними плазмідами (ZnRlux+). Як донори lux�генів було використано клітини штамів Ph. phosphoreum В7071. За даними електрофорезу носієм lux�генів у цьо� му штамі є плазміда розміром 50 т. п. н. (рис. 4, доріжка 3). Фенотиповою ознакою цього штаму є здатність до росту в присут� ності 3%�го розчину NaCl. Контрольні посіви виявили, що клітини штаму Ps. fragi T2(5) не здатні рости на сере� довищі, яке містить 3%�й NaCl, а присут� ність іонів цинку в концентрації 0,3 мМ при� гнічувала ріст клітин Ph. phosphoreum В7071. Для одержання lux�фенотипу штаму з ін� дукованою іонами цинку біолюмінесцен� цією застосовували класичний метод кон’ю� гативного схрещування між бактеріями штамів Ph. phosphoreum В7071 та Ps. fragi T2(5) з подальшою селекцією отриманих транскон’югатів за ознаками стійкості до іонів цинку та високої концентрації NaCl. Одержаним у результаті процесу кон’ю� гативного схрещування клітинам транс� кон’югату була притаманна набута здатність до люмінесценції, що є доказом наявності lux�генів у гібридній плазміді. Дослідження вектора переносу генетич� ного матеріалу свідчать про те, що перене� сення lux�генів відбулось у клітини Ps. fragi T2(5): ріст клітин транскон’югату спос� терігався на середовищі, яке містить 0,3 мМ цинку, але не містить 3%�го NaCl. Для підтвердження цього факту було проведено скринінг плазмід клітин отрима� ного транскон’югату за методом Екгардта. В результаті експерименту в генетично мо� дифікованих бактерій було виявлено плаз� міду з більшою електрофоретичною рухли� вістю, ніж плазміди батьківських штамів (рис. 4, доріжка 4). Характеристику гібрид� ної плазміди (ZnRlux+), а також плазмід бать� ківських штамів одержано з використанням RAPD�аналізу. Суть цього методу полягала в ампліфікації поліморфних ділянок ДНК, які визначають видову належність. Було по� казано, що плазміди акцепторного (ZnR), до� норного (lux+) та генетично модифікованого штамів (ZnRlux+) мають різні генетичні профілі (рис. 5). Утворення гібридної плазміди, яка є но� сієм генів стійкості до цинку та lux�генів, у процесі взаємодії плазмід батьківських штамів підтверджується даними щодо її елі� мінації. Отримані елімінанти характеризува� Рис. 5. Розділення продуктів ПЛР, одержаних на плазмідах штамів бактерій за допомогою прай\ мерів ОРА\06 (1–4) та ОРР\12 (5–8) у 1,5%\му агарозному гелі: 1 — маркер молекулярної маси pUC19/MspI; 2 — Ps. fragi Т2(5) (TeR ZnR); 3 — Ph. phosphoreum В7071; 4 — Ps. fragi Т2(5) (ZnR lux+); 5 — маркери молекулярної маси pUC19/MspI і pUC19/Hind III; 6 — Ps. fragi Т2(5) (TeR ZnR); 7 — Ph. phosphoreum В7071; 8 — Ps. fragi Т2(5) (ZnR lux+) 1 432 5 876 БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №4, 2008 74 Фоновий рівень біолюмінесценції (сере� довище виміру) відображено на кривій 7. Відношення максимального сигналу (рис. 6, крива 1) до фонового (рис. 6, крива 7) становить близько трьох порядків. Таким чином, у результаті проведених комплексних досліджень встановлено: по� перше, ефект інгібування іонами золота інтенсивності природної люмінесценції штаму Ph. рhosphoreum В7071. Тому кліти� ни цього штаму можуть слугувати сенсор� ним елементом для визначення вмісту іон� ного золота, наприклад у стічних водах золотодобувних та золотопереробних під� приємств з метою контролю додержання технологічних процесів. По�друге, клітини транскон’югату, отримані в результаті кон’югативного схрещування, здатні висо� коспецифічно випромінювати світло під час контакту з іонами цинку. Це уможливлює використання їх як сенсорного елемента в біолюмінесцентному визначенні якісного та кількісного вмісту цього металу в об’єктах довкілля. Отже, можна констатувати високу спе� цифічність клітин одержаного транс� кон’югату. Крива 1 може розглядатися як калібрувальна для іонів цинку у разі його кількісного визначення. Рис. 6. Інтенсивність специфічної біолюмінес\ ценції (CPS\кількість фотонів за секунду) клітин штаму\біосенсора Ps. fragi Т2(5) (ZnR lux+) у присутності іонів важких металів: 1 — Zn; 2 — Ni; 3 — Co; 4 — Cd; 5 — Cu; 6 — Ag 1. Подгорский В. С., Касаткина Т. П., Лозо7 вая О. Г. Дрожжи — биосорбенты тяжелых металлов // Мікробіол. журн. — 2004. — Т. 66, №1. — С. 91–103. 2. Лозовая О. Г., Касаткина Т. П., Подгорс7 кий В. С. Влияние хрома (VI) на физиологию роста и сорбционную способность дрожжей // Там же. — 2004. — Т. 66, №3. — С. 43–50. 3. Губський Ю. І., Ерстенюк Г. М. Вивчення компонентів системи гемоглобіну та антиок� сидантних ферментів за кадмієвої інтокси� кації // Укр. біохім. журн. — 2002. — Т. 74, №5. — С. 124–127. 4. Благой Ю. П. Взаимодействие ДНК с биоло� гически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образовательный журнал. — 1998. — №10. — С. 18–24. 5. Давыдова С. Л. О токсичности ионов метал� лов. — М.: Знание, 1991. — 32с. 6. Методы анализа объектов окружающей среды: Сб. научн. тр. АН СССР / Под ред. В. В. Малахова. — Новосибирск: Наука. Сиб. Отделение, 1988. — 141 с. 7. Хроматографический анализ окружающей среды / Под ред. З. Л. Гроба. Перевод с англ. — М.: Химия, 1979. — 606 с. 8. Yu Lei, Wilfred Chen, Ashok Mulchandani. Microbial biosensors // Anal. Chim. Acta. — 2006. — 568. — P. 200–210. 9. Расторгуев С. М., Завильгельский Г. Б. Lux� биосенсор для детекции ионов мышьяка// Биотехнология. — 2001. — №2. — С. 77–82. 10. Асриэли Т. В., Власова И. И., Гаврилова Е. М., Данилов В. С. Влияние антибиотиков на люминесценцию рекомбинантных клеток Escherichia coli, активированных сыворот� кой крови // Там же. — 2002. — №2. — С. 85–93. 11. Corbisier P., Ji G., Nuyts G. et. al. luxAB gene fusion with the arsenic and cadmium resis� tance operons of Staphylococcus aureus plas� mid p128 // FEMS Microbiol. Lett. — 1993. — V. 110. — P. 231–238. 12. Van der Lelie D., Corbisier P., Mergeay M. The use of biosensors for environmental monitoring // Res. Microbiol. — 1994. — V. 145. — P. 67–74. 13. Kацев А. М., Стародуб Н. Ф. Влияние поверх� ностно�активных веществ на интенсивность люминесценции бактерий // Укр. биохим. журн. — 2003. — Т. 75, №2. — С. 94–99. 14. Eckhardt T. A rapid method for the identifi� cation of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria // Plasmid. — 1978. — V. 1, N4. — Р. 584–588. ЛІТЕРАТУРА Експериментальні статті 75 phosphoreum В7071 (lux+) для определения концентрации ионов цинка // Укр. биохим. журн. — 2006. — Т. 78, №1. — С. 143–148. 21. Лакин Г. Ф. Биометрия: учебное пособие для биологических специальностей ВУЗов. — М.: Высш. школа, 1990. — 352 с. 22. Решетилов А. Н. Микробные, ферментные и иммунные биосенсоры для экологичес� кого мониторинга и контроля биотехноло� гических процессов// Прикл. биохим. микробиол. — 2005. — Т. 41, №5. — С. 504–513. 23. Gerhardt P., Murray R., Wood W. Plasmids// Methods for general and molecular bacteri� ology. Amer. Soc. of Microbiol. — Washing� ton DC, 1993. — P. 124–128 24. Сатаева Л. В., Малахов С. Г. Загрязнения почв металлами в зависимости от типа пре� обладающей промышленности // Труды ин�та эксперимент. метеорол. — 1991. — Вып. 18. — С. 3–8. 15. Birnboim H., Doly J. A rapid alkaline extrac� tion procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids. Res. — 1979. — V. 7, N6. — P. 1513–1523. 16. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. –1990. — V. 18, N24. — Р. 7213–7218. 17. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Молеку� лярное клонирование. — М.: Мир, 1984. — 480 с. 18. Bouanchaud D., Scauizzi M., Chabbert Y. Elimination by ethidium bromide of antibi� otic resistance in Enterobacteria and Sta� phylococci // J. Gen. Microbiol. — 1969. — V. 54. — P. 417–425. 19. Trevors T. Plasmid curing in bacteria // FEMS Microbiol. Rev. — 1986. — V. 32. — P. 149–157. 20. Грузина Т . Г., Дыбкова С. Н., Чеховская Т. П. и др. Получение биолюминесцентного бактериального штамма Photobacterium БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ БАКТЕРИИ КАК СЕНСОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ А. М. Задорожняя, Т. Г. Грузина С. Н. Дыбкова, З. Р. Ульберг Институт биоколлоидной химии им. Ф. Д. Овчаренко НАН Украины, Киев, Е7mail: tgruzina@mail.ru Выявлен дозозависимый эффект ингибиро� вания ионами золота интенсивности природной люминесценции штамма Photobacterium phos7 phoreum В7071 (lux+). Клетки этих бактерий мо� гут выступать в качестве сенсорного элемента для определения содержания ионного золота, например в сточных водах золотодобывающих и золотоперерабатывающих предприятий, с целью контроля соблюдения технологичес� ких процессов. В результате конъюгативного скрещивания получены клетки трансконъюгата Pseudomonas fragi T2(5), которые содержат гибридную плаз� миду (ZnRlux+) и способны высокоспецифично испускать свет при контакте с ионами цинка. Это дает возможность использовать их как сенсор� ный элемент в биолюминесцентном определении качественного и количественного содержания этого метала в объектах окружающей среды. Ключевые слова: бактерии, природная биолюминес� ценция, индуцированная биолюминесценция, опре� деление, золото, цинк, конъюгативное скрещивание. BIOLUMINESCENT BACTERIA AS SENSOR ELEMENTS FOR THE HEAVY METALS IONS’ CONTENT DETECTION A. M. Zadorozhnyaya T. G. Gruzina S. M. Dibkova Z. R. Ulberg Ovcharenko Institute of Biocolloidal Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv E7mail: tgruzina@mail.ru It has been shown the doze�dependent inhibi� tion influence of gold ions on Photobacterium phos7 phoreum В7071 (lux+) natural luminescence. These bacterial cells can serve as a sensor element for ionic gold content detection, for example, in waste� water of gold�mining and gold�processing manu� factures for requirements compliance control. The Pseudomonas fragi T2(5) transconju� gates, which contain hybrid plasmid (ZnRlux+) and which are capable of the high�specific of light emission as a result of the contact with zinc ions, have been derived by conjugate crossing method. It enables to use these transconjugates as sensor elements in the high�specific biolumi� nescent detection of qualitative and quantitative content of this metal in environmental objects. Key words: bacteria, natural bioluminescence, induced bioluminescence, detection, gold, zinc, conju� gate crossing.
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-28155
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	1995-5537
language	Ukrainian
last_indexed	2025-11-27T10:59:17Z
publishDate	2008
publisher	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
record_format	dspace
spelling	Задорожняя, А.М. Грузіна, Т.Г. Дибкова, С.М. Ульберг, З.Р. 2011-10-29T22:19:27Z 2011-10-29T22:19:27Z 2008 Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів / А.М. Задорожняя, Т.Г. Грузіна, С.М. Дибкова, З.Р. Ульберг // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 4. — С. 69-75. — Бібліогр.: 24 назв. — укр. 1995-5537 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/28155 541.13:577.112.087 Виявлено дозозалежний ефект інгібування іонами золота інтенсивності природної люмінесценції штаму Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+). Клітини цих бактерій можуть слугувати сенсорним елементом біолюмінесцентного аналізатора для визначення вмісту іонного золота, наприклад у стічних водах золотодобувних та золотопереробних підприємств, з метою контролю додержання технологічних процесів. У результаті кон’югативного схрещування отримано клітини транскон’югату Pseudomonas fragi T2(5), що містять гібридну плазміду (ZnRlux+) і здатні високоспецифічно випромінювати світло під час контакту з іонами цинку. Це уможливлює використання їх як чутливого елемента в біолюмінесцентному високоспецифічному визначенні якісного та кількісного вмісту цього металу в об’єктах довкілля. Выявлен дозозависимый эффект ингибирования ионами золота интенсивности природной люминесценции штамма Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+). Клетки этих бактерий могут выступать в качестве сенсорного элемента для определения содержания ионного золота, например в сточных водах золотодобывающих и золотоперерабатывающих предприятий, с целью контроля соблюдения технологических процессов. В результате конъюгативного скрещивания получены клетки трансконъюгата Pseudomonas fragi T2(5), которые содержат гибридную плазмиду (ZnRlux+) и способны высокоспецифично испускать свет при контакте с ионами цинка. Это дает возможность использовать их как сенсорный элемент в биолюминесцентном определении качественного и количественного содержания этого метала в объектах окружающей среды. It has been shown the doze-dependent inhibition influence of gold ions on Photobacterium phosphoreum В7071 (lux+) natural luminescence. These bacterial cells can serve as a sensor element for ionic gold content detection, for example, in waste-water of gold-mining and gold-processing manufactures for requirements compliance control. The Pseudomonas fragi T2(5) transconjugates, which contain hybrid plasmid (ZnRlux+) and which are capable of the high-specific of light emission as a result of the contact with zinc ions, have been derived by conjugate crossing method. It enables to use these transconjugates as sensor elements in the high-specific bioluminescent detection of qualitative and quantitative content of this metal in environmental objects. uk Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Біотехнологія Експериментальні статті Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів Биолюминесцентные бактерии как сенсорные элементы для определения содержания ионов тяжелых металлов Bioluminescent bacteria as sensor elements for the heavy metals ions' content detection Article published earlier
spellingShingle	Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів Задорожняя, А.М. Грузіна, Т.Г. Дибкова, С.М. Ульберг, З.Р. Експериментальні статті
title	Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів
title_alt	Биолюминесцентные бактерии как сенсорные элементы для определения содержания ионов тяжелых металлов Bioluminescent bacteria as sensor elements for the heavy metals ions' content detection
title_full	Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів
title_fullStr	Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів
title_full_unstemmed	Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів
title_short	Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів
title_sort	біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів
topic	Експериментальні статті
topic_facet	Експериментальні статті
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/28155
work_keys_str_mv	AT zadorožnââam bíolûmínescentníbakterííâksensorníelementidlâviznačennâvmístuíonívvažkihmetalív AT gruzínatg bíolûmínescentníbakterííâksensorníelementidlâviznačennâvmístuíonívvažkihmetalív AT dibkovasm bíolûmínescentníbakterííâksensorníelementidlâviznačennâvmístuíonívvažkihmetalív AT ulʹbergzr bíolûmínescentníbakterííâksensorníelementidlâviznačennâvmístuíonívvažkihmetalív AT zadorožnââam biolûminescentnyebakteriikaksensornyeélementydlâopredeleniâsoderžaniâionovtâželyhmetallov AT gruzínatg biolûminescentnyebakteriikaksensornyeélementydlâopredeleniâsoderžaniâionovtâželyhmetallov AT dibkovasm biolûminescentnyebakteriikaksensornyeélementydlâopredeleniâsoderžaniâionovtâželyhmetallov AT ulʹbergzr biolûminescentnyebakteriikaksensornyeélementydlâopredeleniâsoderžaniâionovtâželyhmetallov AT zadorožnââam bioluminescentbacteriaassensorelementsfortheheavymetalsionscontentdetection AT gruzínatg bioluminescentbacteriaassensorelementsfortheheavymetalsionscontentdetection AT dibkovasm bioluminescentbacteriaassensorelementsfortheheavymetalsionscontentdetection AT ulʹbergzr bioluminescentbacteriaassensorelementsfortheheavymetalsionscontentdetection

Біолюмінесцентні бактерії як сенсорні елементи для визначення вмісту іонів важких металів

Institution

Similar Items