Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40

Виділено штам Вacillus sp. BKL40, здатний секретувати в середовище культивування α-амілазу, стабільну за високих температур і лужних значень рН. Оптимізацією умов культивування штаму-продуцента досягнено найбільшої продукції ензиму. Інтенсивність синтезу α-амілази не залежала від наявності крохмалю...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :	Біотехнологія
Дата:	2009
Автори:	Кубрак, О.І., Лущак, В.І.
Формат:	Стаття
Мова:	Українська
Опубліковано:	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 2009
Теми:	Експериментальні статті
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/28175
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40 / О.І. Кубрак, В.І. Лущак // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 69-79. — Бібліогр.: 46 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859957378221342720
author	Кубрак, О.І. Лущак, В.І.
author_facet	Кубрак, О.І. Лущак, В.І.
citation_txt	Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40 / О.І. Кубрак, В.І. Лущак // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 69-79. — Бібліогр.: 46 назв. — укр.
collection	DSpace DC
container_title	Біотехнологія
description	Виділено штам Вacillus sp. BKL40, здатний секретувати в середовище культивування α-амілазу, стабільну за високих температур і лужних значень рН. Оптимізацією умов культивування штаму-продуцента досягнено найбільшої продукції ензиму. Інтенсивність синтезу α-амілази не залежала від наявності крохмалю в середовищі культивування й стимулювалася додаванням пептону (0,3%) та дріжджового екстракту (0,2%). Ензим повністю зберігав амілолітичну активність після 30 хв інкубації при 60 і 70 0С. α-Амілаза виявляла високу активність у широкому діапазоні значень рН — від 6,0 до 11,0 і зберігала активність навіть після 24 год інкубації за цих значень рН. Досліджувана α-амілаза не активувалась іонами кальцію та іонами інших двовалентних металів (1 мМ), а також не інгібувалась EДTA та EГTA (1–10 мМ), що може свідчити про відсутність іонів кальцію у структурі її молекули. Изолирован штамм Вacillus sp. BKL40, способный секретировать в среду культивирования α-амилазу, стабильную в условиях высоких температур и щелочных значений рН. Оптимизацией условий культивирования штамма-продуцента достигнута наивысшая продукция энзима. Синтез α-амилазы не зависел от наличия крахмала в среде культивирования и стимулировался добавлением пептона (0,3%) и дрожжевого экстракта (0,2%). Энзим полностью сохранял амилолитическую активность после 30 мин инкубации при 60 и 70 ºС. α-Амилаза проявляла высокую активность в широком диапазоне значений рН — от 6,0 до 11,0 и сохраняла активность даже после 24 ч инкубации при щелочных значениях рН. Изучаемая α-амилаза не активировалась ионами кальция и других двухвалентных металлов (1 мМ), а также не ингибировалась ЭДTA и ЭГTA (1 и10 мМ), что может свидетельствовать об отсутствии ионов кальция в структуре ее молекулы. Strain BKL40 was identified as a producer of thermostable alkaline α-amylase. Maximum production of this α-amylase was achieved by optimizing culture conditions. Production of α-amylase seemed to be independent on the presence of starch in the culture medium and was stimulated by peptone (0.3%, w/v) and yeast extract (0.2%, w/v). The enzyme was thermostable and retained amylolytic activity after 30 min of incubation at 60 and 70 ºC. High activity was maintained over a broad pH range from 6.0 to 11.0 and the enzyme remained active after alkaline incubation for 24 h. Bacillus sp. BKL40 α-amylase was not stimulated by calcium and other bivalent metal cations at 1mM and was not inhibited by EGTA or EDTA at 1-10 mM, suggesting that this α-amylase does not contain calcium ions in its active site.
first_indexed	2025-12-07T16:19:48Z
format	Article
fulltext	69 α�Амілаза (1,4�α�D�глюкан глюканогід� ролаза, EC 3.2.1.1) — один з амілолітичних ензимів, який здійснює невпорядковане роз� щеплення 1,4�α�D�глікозидних зв’язків крохмалю та інших полісахаридів з утворен� ням суміші лінійних і розгалужених вугле� водів: декстринів, олігосахаридів, мальтози й глюкози в α�аномерній конфігурації [1, 2]. Ці ензими застосовують у багатьох галузях народного господарства [3, 4]. Їх використо� вують для отримання цукру та спирту, виго� товлення паперу й текстилю [1, 4], утворен� ня адгезивних речовин і оброблення стічних вод [3]. Вони незамінні у хлібопекарстві, пи� воварінні та виноробстві [2]. α�Амілази за� стосовують у біотехнологічних процесах приготування кормів для тварин та харчо� вих добавок для дітей і людей похилого віку [5]. Віднедавна α�амілази почали використо� вувати як компоненти екологічно безпечних мийних засобів [3, 6]. Оскільки більшість стадій біотехно� логічних процесів проводять за підвищених температур, термостабільність α�амілаз є не� обхідною умовою для їх практичного засто� сування [7]. Використання термостабільних α�амілаз має низку переваг порівняно із зас� тосуванням термолабільних аналогів: дозво� ляє уникати забруднення мезофільною мікрофлорою, зменшувати витрати на охо� лодження промислових реакторів і збільшу� вати загальну швидкість процесів [7, 8]. Стабільні за підвищених температур і луж� них значень рН (> 8,0) α�амілази можуть застосовуватись як компоненти екологічно безпечних мийних засобів, оскільки вони легко утилізуються живими організмами в навколишньому середовищі [3, 6, 9]. Для багатьох індустріальних процесів з використанням α�амілаз, зокрема у процесі виготовлення пива чи сиропів, бажано уни� кати додавання кальцію, оскільки він спри� чинює пошкодження обладнання оксалатом кальцію, псує якість і вигляд продукції [7], а тому потребує додаткових витрат для по� дальшого видалення [10]. Проте майже всі відомі α�амілази містять іони кальцію, задіяні у підтриманні структурної цілісності їхніх молекул [11]. Залежність активності алкалофільних α�амілаз від іонів кальцію перешкоджає використанню їх як компо� нентів мийних засобів, оскільки останні заз� вичай містять хелатуючі агенти [12]. α�Амілази містяться в організмах тва� рин, рослин, грибів і мікроорганізмів, проте тільки ензими мікробного походження ви� користовують у промисловості [1], оскільки вони стабільніші, ніж рослинні та тваринні α�амілази, і можуть бути відносно легко от� римані завдяки тому, що є позаклітинними УДК 57.083.13+577.152.321*1 ОДЕРЖАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ ОДЕРЖАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ αα>АМІЛАЗИ З >АМІЛАЗИ З BBacillus acillus sp.sp. BKL40BKL40 Ключові слова: α�амілаза, Вacillus sp., алкалостабільність, термостабільність, продукція. О. І. Кубрак В. І. Лущак Прикарпатський національний університет ім. В. Стефаника, Івано�Франківськ E:mail: lushchak@pu.if.ua Виділено штам Вacillus sp. BKL40, здатний секретувати в середовище культивування α�амілазу, стабільну за високих температур і лужних значень рН. Оптимізацією умов культивування штаму�продуцента досягнено найбільшої продукції ензиму. Інтенсивність синтезу α�амілази не залежала від наявності крохмалю в середовищі культивування й стимулювалася додаванням пептону (0,3%) та дріжджового екстракту (0,2%). Ензим повністю зберігав амілолітичну активність після 30 хв інкубації при 60 і 70 0С. α�Амілаза виявляла ви� соку активність у широкому діапазоні значень рН — від 6,0 до 11,0 і зберігала активність навіть після 24 год інкубації за цих значень рН. Досліджувана α�амілаза не активувалась іонами кальцію та іонами інших двова� лентних металів (1 мМ), а також не інгібувалась EДTA та EГTA (1–10 мМ), що може свідчити про відсутність іонів кальцію у структурі її молекули. Експериментальні статті БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 70 ензимами, які секретуються бактеріями в порівняно дешеві середовища культи� вування [13]. Як продуценти α�амілаз із ба� жаними властивостями у біотехнології часто використовують бактерії роду Вacillus [1, 7]. Різні види цього роду займають майже всі існуючі екологічні ніші і продукують ен� зими з різноманітними властивостями [14]. Досягнення найвищої продукції еконо� мічно важливих α�амілаз з бажаними власти� востями — одне з основних завдань наукових досліджень. Надпродукції ензиму можна досягти двома шляхами: генетичними маніпуляціями або оптимізацією умов куль� тивування штаму�продуцента. Створення рекомбінантних штамів — високовартісний і тривалий процес, і часто рекомбінантний штам з посиленою продукцією ензиму нес� табільний, тоді як збільшення синтезу ензи� му у разі зміни складу живильного середо� вища чи умов культивування ґрунтується на природній стратегії адаптації мікробів до мінливих умов довкілля [15]. Метою цієї роботи було оптимізувати ос� новні компоненти середовища культивуван� ня бактерій Вacillus sp. BKL40 для одержан� ня найвищої продукції α�амілази, стабільної за підвищених температур, лужних значень рН і в присутності хелаторів. Матеріали і методи Штами і реактиви У роботі використовували водорозчин� ний картопляний крохмаль, трис�(гідрокси� метиламінометан), хлорид кальцію, фосфат калію (однозаміщений), етилендіамінтетра� оцтову кислоту (EДTA) та етиленгліколь� N,N,N′N′�тетраоцтову кислоту (EГTA) («Sig� ma», США), пептон («Fluka», Німеччина), дріжджовий екстракт («Микроген», Росія). Решта використаних реактивів — вітчизня� ного виробництва. Усі застосовані в роботі реактиви були найвищого доступного ступе� ня чистоти. Як препарат ензиму використовували стабільну за підвищених температур і луж� них значень рН позаклітинну α�амілазу з бактерій роду Bacillus штаму BKL40, ізо� льованого та ідентифікованого нами як опи� сано раніше [16]. Оптимізація середовища культивування Культивування бактерій проводили в живильному середовищі такого складу (%, маса/об’єм): 0,1 KH2PO4; 0,25 Na2HPO4; 0,1 NaCl; 0,2 (NH4)2SO4; 0,005 MgSO4·7H2O; 0,005 CaCl2·2H2O (pH 6,5) [17]. Мінеральне середовище доповнювали органічними ком� понентами: 0,025%�м крохмалем, 0,3%�м пептоном та 0,2%�м дріжджовим екстрак� том для досягнення найбільшої продукції ензиму. Інокульоване бактеріями живильне середовище інкубували при температурі 40 0С на орбітальному шейкері Skyline (Лит� ва) при 150 об/хв протягом 24 год. Для отримання посівного матеріалу (іно� куляту) бактерії штаму�продуцента перено� сили мікробіологічною петлею у стерильних умовах у колбу Ерленмеєра місткістю 50 мл з 10 мл стерильного живильного середовища і культивували протягом 24 год у зазначе� них вище умовах. Одержаний інокулят вносили у стериль� них умовах у круглодонні колби місткістю 50, 100 чи 250 мл з 10, 20 чи 50 мл стериль� ного живильного середовища, відповідно, для отримання основних культур бактерій. Посівний матеріал додавали з розрахунку 0,5% інокуляту (об’єм/об’єм) відносно об’є� му середовища. Культивування бактерій проводили протягом 24 год при 40 0С. Під час культивування здійснювали відбір з культур частини середовища культивування для виз� начення OD600 (параметра росту бактеріаль� ної культури), концентрації позаклітинних протеїнів та активності α�амілази. Вплив крохмалю на продукцію α�аміла� зи вивчали, додаючи різні концентрації во� дорозчинного картопляного крохмалю (0–1%) до складу мінерального живильного середовища, доповненого 0,3%�м пептоном і 0,2%�м дріжджовим екстрактом. Важливість пептону для продукції α�амі� лази оцінювали, вносячи різні концентрації пептону (до 1%) до складу неорганічного живильного середовища з 0,025%�м крох� малем і 0,2%�м дріжджовим екстрактом. Роль дріжджового екстракту для синтезу і секреції α�амілази досліджували, додаючи його (до 1%) до неорганічного живильного середовища, яке містило 0,025% крохмалю і 0,2% пептону. Одержання ензиму та визначення ак: тивності α:амілази Після 24 год культивування бактеріальних культур клітини видаляли центрифугуван� ням при 8 000 g протягом 15 хв на центрифузі Опн�8 (СРСР). Отримані супернатанти вико� ристовували як препарати позаклітинної α�амілази. Для одержання вищої концентра� ції протеїну в отриманих ензимних препара� тах проводили висолювання сульфатом амонію до досягнення 90%�го насичення. Осаджені протеїни відділяли центрифугуванням Експериментальні статті 71 (8000 g, 12 хв), а осади ресуспендували в не� великих об’ємах 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,0). Амілолітичну активність визначали мо� дифікованим йодометричним методом, який ґрунтується на зниженні інтенсивності забарв� лення комплексу крохмаль — йод унаслідок зменшення концентрації крохмалю за дії α�амілази [18, 19]. Поглинання цього комп� лексу реєстрували при довжині хвилі 600 нм на спектрофотометрі Specol 211 (Німеччи� на). Активність α�амілази визначали в сумі� ші (0,5 мл), яка містила 0,25 мл 1%�го роз� чину крохмалю і 50 мМ фосфатний буфер (рН 7,0). Перед додаванням препаратів ензимів суміш для реакції нагрівали до температури 40 0С протягом 5 хв. Одночасно з дослідними готували 10 проб калібрувального графіка з різною кількістю 1%�го розчину крохма� лю, але без додавання ензиму. Ензимні пре� парати у дослідні проби додавали з розра� хунку, щоб загальний об’єм буфера і препарату ензиму дорівнював 0,25 мл. Після 30 хв гідролізу за температури 40 0С суміш охолоджували протягом 3 хв на льоду для зупинення реакції. Для проведення ви� мірювання в лінійному діапазоні спектрофо� тометра всі проби розводили. При цьому з кожної проби відбирали 0,04 мл суміші, змішували з 0,4 мл розчину йоду–йодиду калію (0,025% J2 в 0,025% KJ) в 0,2 н. HCl і доводили об’єм проби до 2 мл охолодженою дистильованою водою. Активність α�амілази розраховували за формулою: де Свих — вихідна концентрація крохмалю у пробах перед реакцією, мг/мл (0,1 мг/мл після розведення проб); Скін — кінцева кон� центрація крохмалю у пробах, обчислена за рівнянням калібрувального графіка, мг/мл; Vпр — загальний об’єм проби, мл (2 мл після розведення проб); n — розведення проб пе� ред вимірюванням (12,5 раза); t — час гідро� лізу, хв (30 хв); Vпреп — об’єм ензимного препа� рату, мл; [протеїн] — концентрація загального протеїну в ензимному препараті, мг/мл. За одиницю (1 Од) активності α�амілази приймали кількість крохмалю (мг), розщеп� леного за 1 хв у даних умовах. Питому ак� тивність виражали в перерахунку на 1 мг за� гального протеїну (Од/мг протеїну). Визначення активності та стабіль: ності α:амілази за різних значень рН Вплив величини рН на активність α�амі� лази досліджували, визначаючи активність ензиму за різних значень рН. З метою уник� нення небажаного впливу аніонів різних бу� ферів використовували 50 мМ суміш цитрат� ного (15 мМ), фосфатного (20 мМ) і трис�(15 мМ) буферів, доведену до різних значень рН (від 4,0 до 12,0) методом титрування соляною кислотою чи гідроксидом калію. З метою підтримання рН суміші для визначення ак� тивності α�амілази 1%�ні розчини крох� малів готували на відповідних буферах для кожного значення рН. Ці ж самі буфери та розчини крохмалів використовували для приготування проб калібрувальних графіків для розрахунку активності α�амілази за до� сліджуваних значень рН відповідно до опи� саного вище. Визначаючи стабільність α�амілази за різних значень рН, препарати ензиму змі� шували з відповідними буферами (аналогіч� ними до буферів, використаних для визна� чення рН�залежності) та інкубували за кімнатної температури (25 0С) протягом 24 год. Одночасно з дослідними пробами інкубували відповідні кількості кожного бу� фера у пробах калібрувальних графіків, ок� ремих для кожного значення рН. Перед виз� наченням залишкової активності α�амілази всі проби попередньо інкубували протягом 5 хв при 40 0С, а потім змішували з попе� редньо нагрітими до температури 40 0С 1%�ми розчинами крохмалів, приготовани� ми на цих буферах. Подальші етапи визна� чення активності проводили згідно з описа� ною вище методикою. Дослідження термостабільності Для дослідження термостабільності ен� зимні препарати α�амілази (середовища культивування після видалення бактерій) інкубували на водяній бані за температур 60 і 70 0С упродовж 30 хв. Після інкубації дена� туровані термолабільні протеїни відділяли центрифугуванням (8000 g, 15 хв) і в отри� маних супернатантах визначали концент� рацію загального протеїну та активність α� амілази відповідно до описаного вище. Вплив хелаторів До суміші для визначення α�амілазної активності (0,5 мл), яка містила 1%�й роз� чин крохмалю (0,25 мл) і 50 мМ фосфатний буфер (рН 7,0), додавали розчин EДTA та EГTA до досягнення кінцевих концент� рацій 1 і 10 мМ. Визначення залишкової (C C ) V n Акт t V вих кін пр преп , [протеїн] − ⋅ ⋅ = ⋅ ⋅ БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 72 активності α�амілази проводили відповідно до вищенаведеного. Вплив катіонів двовалентних металів У суміш для визначення активності α�амі� лази, яка містила 1%�й розчин крохмалю і 50 мМ фосфатний буфер (рН 7,0), вносили розчини відповідних солей двовалентних металів до досягнення кінцевої концент� рації іонів 1 мМ. Визначення залишкової ак� тивності α�амілази проводили згідно з опи� саним вище. Для дослідження впливу іонів Ca2+, Zn2+, Ba2+, Co2+, Mg2+, Mn2+ і Cu2+ вико� ристовували хлориди металів, а іони Fe2+ і Ni2+ додавали у вигляді сульфатів. Визначення концентрації загального протеїну Концентрацію загального протеїну виз� начали методом Бредфорда [20]. Для побудо� ви калібрувального графіка використовува� ли сироватковий бичачий альбумін. Статистична обробка результатів Статистичну обробку результатів прово� дили, застосовуючи програму MYNOVA [20]. Дані наведено як середні значення ± похибка середнього. Результати та обговорення Культивування бактерій Бактерії вирощували при температурі 40 0С, оскільки ця температура була оптимальною для росту бактеріальної культури і синтезу α�амілази у більшості відомих продуцентів α�амілази з роду Bacillus [17, 21, 22]. Сек� рецію α�амілази бактеріями�продуцентами реєстрували з настанням експоненційної фа� зи росту бактеріальної культури. Вміст ен� зиму в середовищі культивування зростав протягом логарифмічної фази росту та дося� гав максимального значення на 24�й год культивування. При подальшому культиву� ванні бактерій (до 48�ї год) активність α�амі� лази у середовищі культивування не змінюва� лась (рис. 1). Концентрація позаклітинних протеїнів збільшувалася протягом усього часу культивування. Проте оптична густина суспензії бактерій (OD600) — параметр росту бактеріальної культури — різко знижува� лась, починаючи з 9�ї год культивування, оскільки бактеріальні клітини злипалися, незважаючи на інтенсивне перемішування середовища культивування. Слід зауважити, що такі результати було одержано у разі внесення різної кількості посівного матеріалу (0,5 і 5%, об’єм/об’єм) в основні культури. Наші результати добре узгоджуються з даними, отриманими іншими дослідниками, які додавали 1% (об’єм/об’єм) [23], 2% (об’єм/об’єм) [9, 22, 24], 5% (ма� са/об’єм) [17] або 10% (об’єм/об’єм) [25] іно� куляту відносно об’єму основних культур, проте у всіх випадках (незалежно від складу середовища) спостерігали найбільший вміст α�амілази після 24–48 год культивування бактерій�продуцентів. Оптимізація концентрації крохмалю Продукція α�амілази, подібно до інших позаклітинних ензимів, потребує відповід� ного джерела вуглецю та азоту. Оскільки крохмаль є природним субстратом α�аміла� зи, секрецію деяких відомих α�амілаз сти� мулювали з використанням крохмалю у складі живильного середовища як єдиного джерела вуглецю [26, 27]. Для отримання найбільшої продукції α�амілази бактеріями роду Bacillus використовували живильні се� редовища з високою концентрацією крохмалю (1%) [21, 22, 25, 28]. У наших експериментах крохмаль концентрацією 1% у середовищі культивування Bacillus sp. BKL40 стимулю� вав ріст бактеріальної культури і секрецію позаклітинних протеїнів, проте забезпечу� вав надзвичайно низький вміст α�амілази серед цих протеїнів (низьку питому актив� ність). Зате α�амілаза інтенсивно виділялася бактеріями за низької концентрації крохма� лю —0,025%. Продукція α�амілази бакте� ріями штаму Bacillus sp. BKL40 мала конс� титутивний характер, ензим виділявся навіть у разі відсутності крохмалю в середо� вищі культивування (рис. 2). Подібні ре� зультати були отримані Z. Konsoula і M. Lia� kopoulou�Kyriakides [17], найбільшої К он ц ен тр ац ія п р от еї н у , м г/ м л А к ти вн іс ть α �а м іл аз и , О д /м г п р от еї н у Час культивування, год Рис. 1. Ріст бактеріальної культури, накопичення зовнішньоклітинних протеїнів та активність α>амілази упродовж культивування бактерій Bacillus sp. BKL40. Наведено дані типового експерименту Експериментальні статті 73 продукції α�амілази бактеріями Bacillus sub: tilis досягали в присутності 0,05%�го крох� малю, а також без додавання крохмалю в живильне середовище. Оптимізація концентрації пептону Синтез α�амілази залежить від наявності джерела азоту в середовищі культивування [29, 30]. Незважаючи на спроби знайти аль� тернативні джерела азоту для продукції α�амі� лази, як, зокрема, соєва мука [15, 24, 31], м’ясний екстракт [9] та пшеничні висівки [22], найчастіше дослідники використову� ють пептон і дріжджовий екстракт у різних концентраціях та комбінаціях [9, 32, 33]. З метою отримання найбільшої про� дукції α�амілази в живильне середовище до� давали різні концентрації пептону (0–1%). У разі культивування бактерій у плоскодон� них колбах активність α�амілази в середо� вищі культивування зростала зі збільшен� ням концентрації пептону в ньому від 0 до 0,2%. Подальше збільшення концентрації пептону призводило до зниження вмісту α� амілази серед інших позаклітинних про� теїнів, хоча при цьому досягали найвищих показників росту бактеріальної культури і секреції позаклітинних протеїнів (рис. 3, А). Ці результати відрізняються від результатів C. Teodoro і M. Martins [33] та B. Dettori� Campus зі співавт. [34], які отримали найбільшу продукцію α�амілази, додаючи 1%�й пептон у середовище культивування бактерій роду Bacillus. В аналогічних експе� риментах, але із застосуванням круглодон� них колб для культивування бактерій нега� тивний ефект високих концентрацій пептону послаблювався, і максимальний вміст α�амілази спостерігався при концент� раціях пептону в середовищі культивування 0,3–0,7%. Однак за наявності 1%�го пепто� ну в живильному середовищі активність α�амілази була на 35% нижчою, ніж у при� сутності 0,3%�го пептону (рис. 3, Б). Колби Ерленмеєра дослідники найчасті� ше використовують для культивування мік� роорганізмів, проте вони не забезпечують належної аерації та перемішування живиль� ного середовища, а ці параметри надзвичай� но важливі для продукції позаклітинних ен� зимів. Подібні небажані ефекти у разі застосування плоскодонних колб були зау� важені S. Narang і T. Satyanarayana [35] та J. Uma Maheswar Rao і T. Satyanarayana [10], особливо зі збільшенням відношення об’єму середовища культивування до за� гального об’єму колби. Тому всі наступні Концентрація крохмалю, % А к ти вн іс ть α �а м іл аз и , О д /м г п р от еї н у К он ц ен тр ац ія п р от еї н у , м г/ м л Рис. 2. Вплив різних концентрацій крохмалю на ріст бактеріальної культури, секрецію зовнішньоклітинних протеїнів та активність α>амілази (n = 3) К он ц ен тр ац ія п р от еї н у , м г/ м л К он ц ен тр ац ія п р от еї н у , м г/ м л Концентрація пептону, % Концентрація пептону, % А к ти вн іс ть α �а м іл аз и , О д /м г п р от еї н у А к ти вн іс ть α �а м іл аз и , О д /м г п р от еї н у А Б Рис. 3. Вплив різних концентрацій пептону на ріст бактеріальної культури, секрецію зовнішньоклітинних протеїнів та активність α>амілази. Культивування проводили в плоскодонних (А) і круглодонних (Б) колбах. А — наведено усередне� ні дані трьох експериментів, Б — наведено резуль� тати типового експерименту БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 74 експерименти ми проводили, використову� ючи круглодонні колби. Оптимізація концентрації дріжджового екстракту Дріжджовий екстракт найчастіше допов� нює пептон у складі живильних середовищ для культивування різних мікроорганізмів. Він є важливим фактором синтезу α�амілази мікробними продуцентами [36]. Дріжджо� вий екстракт слугував єдиним джерелом азоту для отримання максимальної про� дукції α�амілази з Bacillus sp. IMD434 [37]. Проте у деяких випадках дріжджовий екстракт не впливав на продукцію α�амілази бактеріями Bacillus sp. [23]. Ми виявили залежний від концентрації ефект дріжджового екстракту на продукцію α�амілази бактеріями Bacillus sp. BKL40 (рис. 4). Збільшення концентрації дріжджо� вого екстракту до 0,2% стимулювало про� дукцію α�амілази, проте подальше зростання його концентрації в середовищі культиву� вання мало протилежний ефект. Подібні ре� зультати одержали R. Saxena зі співавт. [9], які спостерігали максимальну продукцію α� амілази бактеріями Bacillus sp. PN5 у разі додавання 0,5%�го пептону і 0,3%�го дріжджового екстракту. Слід зазначити, що в наших експериментах дріжджовий екстракт справляв позитивний ефект на ріст бактеріальної культури та продукцію α� амілази, проте при цьому він майже не впли� вав на синтез і секрецію позаклітинних про� теїнів, концентрація яких не змінювалася за різних концентрацій дріжджового екстрак� ту (за винятком 1%�го). рН:залежність і рН:стабільність Незважаючи на наявність багатьох про� дуцентів α�амілази серед бактерій роду Bacillus, розвиток біотехнології вимагає по� шуку нових продуцентів α�амілаз із бажани� ми властивостями. Зокрема, відносно новим напрямом використання α�амілаз є вклю� чення їх до складу мийних засобів. Проте для цих потреб можна застосовувати тільки алкалофільні та алкалостабільні ензими [6]. Більшість відомих термостабільних α�амі� лаз характеризуються найвищою активніс� тю за нейтральних чи слабокислих значень з рН�оптимумами при рН 5,5 [25], 6,0 [38] або в межах 5,0–7,0 [24]. Досліджувана нами α�амілаза з Bacillus sp. BKL40 мала однаково високу активність у широкому діапазоні рН — від 6,0 до 11,0 без явного рН�оптимуму (рис. 5, А). Подіб� ний характер рН�залежності виявляла α�амі� лаза з термофільного штаму Bacillus sp. SMIA�2 [39]. Висока активність за лужних значень рН дозволяє характеризувати α�амі� лазу з Bacillus sp. BKL40 як алкалофільний ензим. Алкалофільні α�амілази знайдено в окремих представників роду Bacillus. Зок� рема, Bacillus sp. TS�23 продукував α�аміла� зу з рН�оптимумом близько рН 9,0 [8], Bacillus sp. PN5 виділяв α�амілазу, яка ви� являла найвищу активність при рН 10,0 [9], а Bacillus sp. GM8901 секретував α�амілазу з рН�оптимумом між 10,0 і 11,0 [6]. Для ензимів, які можуть бути потенційно використані для промислових цілей, украй важливо не тільки мати високу активність за лужних значень рН, але й підтримувати активність упродовж інкубації за цих зна� чень рН. Так, активність α�амілази з Bacil: lus sp. PN5 не змінювалася після 6 год інку� бації за різних значень рН — від 5,0 до 11,0 [9], а активність α�амілази з G. thermodenitri: ficans HRO10 не зазнавала змін після 24 год інкубації при рН 4,0–9,0 [25]. Використана у наших дослідженнях α�амілаза з Bacillus sp. BKL40 повністю зберігала амілолітичну активність після 24 год інкубації в діапазоні значень рН 7,0–12,0 (рис. 5, Б). Проте досліджуваний ензим втрачав активність під час інкубації за кислих значень рН. Після 24 год перебування при рН 4,0–5,0 ак� тивність α�амілази знижувалася до 6–7% відносно максимального значення. Подіб� ний характер стабільності за різних значень рН типовий для більшості досліджених ал� костабільних α�амілаз, які нездатні довго підтримувати свою ензимативну активність при рН, нижчих ніж 6,0 [40]. Рис. 4. Вплив різних концентрацій дріжджового екстракту на ріст бактеріальної культури, секрецію зовнішньоклітинних протеїнів та вміст α>амілази (n = 3) К он ц ен тр ац ія п р от еї н у , м г/ м л Концентрація дріжджового екстрату, % А к ти вн іс ть α �а м іл аз и , О д /м г п р от еї н у Експериментальні статті 75 Термостабільність є критично важли� вою характеристикою для можливого про� мислового використання α�амілаз [7]. Біль� шість індустріальних процесів проводять при температурах, вищих за 50 0С, оскільки при цьому досягається вища швидкість ре� акції і знижується ризик бактеріального забруднення продукції [1, 7]. Значну части� ну наукових робіт присвячено пошукові про� дуцентів термостабільних α�амілаз, у тому числі серед бактерій роду Bacillus [8, 9, 25, 39, 41]. Однак для амілолітичних ензимів над� звичайно важливо не тільки виявляти, але й підтримувати високу активність за підви� щених температур якомога довше. Зазвичай молекули протеїнів не здатні довго витриму� вати температуру близько 100 0С у зв’язку з незворотними змінами у структурі їхніх молекул. Тому α�амілази, які мають найвищу активність за високих температур, швидко втрачають її вже після кількох хвилин пере� бування за цих температур унаслідок тер� мічної денатурації протеїнових молекул. Наприклад, α�амілази з Bacillus sp. I�3 і G. thermodenitrificans HRO10 виявляли найвищу швидкість гідролізу крохмалю при 70 і 80 0C відповідно, проте втрачали 30 і 100% своєї активності після 30 хв інкуба� ції за цих температур [24, 25]. Досліджуючи стабільність α�амілази з Bacillus sp. BKL40 після 30 хв інкубації при 60 і 70 0С, ми встановили, що її питома активність навіть збільшувалась у 3 й 4 рази (рис. 6). Зростання питомої активності про� тягом інкубації за підвищених температур частково може пояснюватися денатурацією термолабільних протеїнів у неочищеному препараті досліджуваної α�амілази (рис. 6). Вплив хелаторів Застосування більшості відомих α�амі� лаз потребує додавання іонів кальцію, які стабілізують структуру цих ензимів [11]. За� лежність активності та стабільності α�амі� лаз від іонів кальцію є небажаною у разі ви� користання їх у складі мийних засобів, оскільки останні часто містять сполуки, що здатні хелатувати метали [12]. Окрім цього іони Са2+, додані під час процесу розріджен� ня крохмалю за участю α�амілази, слід вида� ляти з продуктів гідролізу за допомогою іонообмінників [10], аби перешкодити фор� муванню і накопиченню кристалів оксалату кальцію у продуктах та складових частинах ензимерів [7]. Тому на сучасному етапі нау� кових досліджень у цій царині значний інте� рес становить виявлення нових продуцентів термостабільних α�амілаз, здатних функціо� нувати в умовах лужних значень рН без до� давання іонів кальцію. Рис. 5. Вплив величини рН на активність (А) і стабільність (Б) α>амілази з Bacillus sp. BKL40 (n = 3–5) А к ти вн іс ть α �а м іл аз и , О д /м г п р от еї н у pH А к ти вн іс ть α �а м іл аз и , О д /м г п р от еї н у pH Б А В ід н ос н і зн ач ен н я , % Активність α�амілази Концентрація протеїну Рис. 6. Термостабільність α>амілази з Bacillus sp. BKL40. Значення подано як відносні величини щодо відповідних максимальних значень. Наведено дані типового експерименту БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 76 Більшість відомих Ca2+�вмісних α�амілаз надзвичайно чутливі до дії EДTA [24, 42, 43] та EГTA [25]. На відміну від них α�амілаза з Bacillus sp. BKL40 не інгібувалася з дода� ванням 1 і 10 мМ цих хелаторів (рис. 7). Ефект катіонів двовалентних металів Ми досліджували вплив катіонів різних двовалентних металів з метою виявити ко� фактори, які впливають на активність α�амі� лази з Bacillus sp. BKL40 (табл.). Активність ензиму не змінювалась у присутності 1 мМ всіх досліджуваних катіонів і, зокрема, з до� даванням кальцію, на відміну від актив� ності α�амілаз, отриманих з інших проду� центів [6, 11, 24]. Недоліком Ca2+�вмісних α�амілаз є зни� ження їхньої активності у присутності пев� них катіонів через конкурентну взаємодію між доданими катіонами та зв’язаними з протеїновими молекулами [44]. Так, зок� рема, α�амілаза Bacillus sp. SMIA�2 інгібува� лась у разі додавання 1 мМ Co2+, Cu2+ і Ba2+ [39], а α�амілаза з Bacillus sp. KSM�1378 — з додаванням 1 mM Ni2+, Cd2+, Zn2+ і Hg2+ [45]. Відсутність ефекторного впливу іонів двова� лентних металів на активність досліджува� ної нами α�амілази може свідчити про відсутність іонів кальцію у структурі її мо� лекули. На сьогодні вже відомі α�амілази, наприклад α�амілаза з Bacillus sp. KSM�К38 [46], які не містять іонів кальцію у своїй структурі, а тому потенційно можуть бути використані як компоненти мийних засобів. У результаті проведених досліджень оп� тимізовано умови культивування Bacillus sp. BKL40 для одержання найвищого вихо� ду α�амілази, стабільної за підвищених тем� ператур і лужних значень рН. Найбільшої продукції α�амілази досягали, використову� ючи низькі концентрації крохмалю в середо� вищі культивування. Продукцію ензиму стимулювали, додаючи у середовище куль� тивування пептон і дріжджовий екстракт; найбільший вихід ензиму спостерігався, ко� ли застосовували 0,3%�й пептон і 0,2%�й дріжджовий екстракт. α�Амілаза з Bacillus sp. BKL40 мала значну термостабільність і повністю зберігала свою активність після 30 хв інкубації при 60–70 0С. Досліджувана α�амілаза виявляла високу активність за лужних значень рН (9,0–11,0) і зберігала її навіть після 24 год інкубації за цих значень рН. Ензим не інгібувався з додаванням 1 і 10 мМ EГTA та EДTA і не активувався іонами кальцію. Одержані результати уможливлю� ють припущення щодо відсутності іонів кальцію у структурі досліджуваної α�аміла� зи, що дає переваги цьому ензиму порівняно з більшістю схожих термо� і алкалостабіль� них, проте Ca2+�вмісних α�амілаз. А к ти вн іс ть α �а м іл аз и , О д /м г п р от еї н у Концентрація хелаторів, мМ Рис. 7. Вплив хелаторів на активність α>амілази з Bacillus sp. BKL40 (n = 3) Вплив катіонів двовалентних металів на активність α>амілази з Bacillus sp. BKL40 А к ти вн іс ть α� ам іл аз и , О д /м г п р от еї н у Катіони двовалентних металів (1 мМ) Конт� роль Са2+ Fe2+ Ba2+ Ni2+ Zn2+ Сu2+ Сo2+ Mg2+ Mn2+ 4,95 5,61 5,42 5,81 5,02 5,05 4,62 5,19 5,55 5,54 Експериментальні статті 77 ЛІТЕРАТУРА 1. Pandey A., Nigam P., Soccol C. R. et al. Advances in microbial amylases // Biotechnol. Appl. Biochem. — 2000. — V. 31, N 2. — P. 135–152. 2. Van der Maarel M. J. E. C., van der Veen B., Uitdehaag J. C. M. et al. Properties and appli� cations of starch�converting enzymes of the α�amylase family // J. Biotechnol. — 2002. — V. 94. — P. 137–155. 3. Vihinen M., Mantsala P. Microbial amylolytic enzymes // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. — 1989. — V. 24, N4. — P. 329–418. 4. Somers W., Visser J., Rombouts F. M., Riet K. Developments in downstream processing of (poly)saccharide converting enzymes // J. Biotechnol. — 1989. — V. 11, N2–3. — P. 199–222. 5. Kandra L. α�Amylases of medical and indus� trial importance // J. Mol. Structure (Theochem). — 2003. — V. 666–667. — P. 487–498. 6. Kim T. U., Gu B. G., Jeong J .Y. et al. Purification and characterization of a mal� totetraose�forming alkaline α�amylase from an alkalophilic Вacillus strain GM8901 // Appl. Environ. Microbiol. — 1995. — V. 61, N8. — P. 3105–3112. 7. Haki G. D., Rakshit S. K. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review // Bioresour. Technol. — 2003. — V. 89, N1. — P. 17–34. 8. Lin L. L., Chyau C. C., Hsu W. H. Production and properties of a raw starch�degrading amylase from the thermophilic and alka� lophilic Вacillus sp. TS�23 // Biotechnol. Appl. Biochem. — 1998. — V. 28, N1. — P. 61–68. 9. Saxena R. K., Dutt K., Agarwal L., Nayyar P. A highly thermostable and alkaline amylase from a Bacillus sp. PN5 // Bioresour. Tech� nol. — 2007. — V. 98, N 2. — P. 260–265. 10. Uma Maheswar Rao J. L., Satyanarayana T. Enhanced secretion and low temperature sta� bilization of a hyperthermostable and Ca2+� independent α�amylase of Geobacillus ther: moleovorans by surfactants // Lett. Appl. Microbiol. — 2003. — V. 36. — P. 191–196. 11. Vallee B. L., Stein E. A., Sumerwell W. N., Fisher E. H. Metal content of amylases of various origins // J. Biol. Chem. — 1959. — V. 234. — P. 2901–2905. 12. Nielsen J. E., Borchert T. V. Protein engi� neering of bacterial α�amylases // Biochim. Biophys. Acta. — 2000. — V. 1543, N2. — P. 253–274. 13. Gupta R., Gigras P., Mohapatra H. et al. Microbial α�amylases: a biotechnological perspective // Process Biochem. — 2003. — V. 38, N11. — P. 1599–1616. 14. Priest F. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus // Bacteriol. Rev. — 1977. — V. 41, N3. — P. 711–753. 15. Dey G., Mitra A., Banerjee R., Maiti B. R. Enhanced production of amylase by opti� mization of nutritional constituents using response surface methodology // Biochem. Eng. — 2001. — V. 7. — P. 227–231. 16. Кубрак О. І., Лущак В. І. Скринінг штамів Bacillus sp. — продуцентів термостабільної амілази // Мікробіол. журн. — 2007. — Т. 69, №5. — С. 26–34. 17. Konsoula Z., Liakopoulou:Kyriakides M. Hydrolysis of starches by the action of an α�amylase from Вacillus subtilis // Process Biochem. — 2004. — V. 39, N11. — P. 1745–1749. 18. Fuwa H. A new method for microdetermina� tion of amylase activity by use of amylose as the substrate // J. Biochem. — 1954. — V. 41, N5. — P. 583–603. 19. Xiao Z., Storms R., Tzang A. A quantitative starch�iodine method for measuring alpha� amylase and glucoamylase activities // Anal. Biochem. — 2006. — V. 351, N 1. — P. 146–148. 20. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein�dye binding // Anal. Biochem. — 1976. — V. 72. — P. 248–254. 21. Mendu D. R., Ratnam B. V. V., Purnima A., Ayyanna C. Affinity chromatography of α� amylase from Вacillus licheniformis // Enz. Microb. Technol. — 2005. — V. 37, N7. — P. 712–717. 22. Haq I., Ashraf H., Iqbal J., Qadeer M. A. Production of alpha amylase by Bacillus licheniformis using an economical medium // Bioresour. Technol. — 2003. — V. 87, N1. — P. 57–61. 23. Tanyildizi M. S., Ozer D., Elibol M. Optimi� zation of α�amylase production by Bacillus sp. using response surface methodology // Process Biochem. — 2005. — V. 40, N7. — P. 2291–2296. 24. Goyal N., Gupta J. K., Sony S. K. A novel raw starch digesting thermostable α�amylase from Bacillus sp. I�3 and its use in the direct hydrolysis of raw potato starch // Enz. Microb. Technol. — 2005. — V. 37, N7. — P. 723–734. 25. Ezeji T., Bahl H. Purification, characteriza� tion, and synergistic action of phytate�resis� tant α�amylase and α�glucosidase from Geobacillus thermodenitrificans HRO10 // J. Biotechnol. — 2006. — V. 125, N1. — P. 27–38. 26. Lin L. L., Tsau M. R., Chu W. S. General cha� racteristics of thermostable amylopullu� lanases and amylases from the alkalophilic БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 78 Bacillus sp. TS�23 // Appl. Microbiol. Bio� technol. — 1994. — V. 42, N 1. — P. 51–56. 27. Bajpai P., Bajpai P. High�temperature alka� line α�amylase from Вacillus licheniformis TCRDC�B13 // Biotechnol. Bioeng. — 1989. — V. 33. — P. 72–78. 28. Mitsuiki S., Mukae K., Sakai M. et al. Comparative characterization of raw starch hydrolyzing α�amylases from various Bacillus strains // Enzyme Microb. Technol. — 2005. — V. 37, N4. — P. 410–416. 29. Hewitt C. J., Solomons G. L. The production of α�amylase (E.C.3.2.1.1) by Bacillus amy: loliquefaciens, in a complex and a totally defined synthetic culture medium // J. Ind. Microbiol. — 1996. — V. 17, N2. — P. 96–99. 30. Hillier P., Wase D. A. J., Emery A. N. Produc� tion of α�amylase (E.C.3.2.1.1) by Bacillus amyloliquefaciens in batch and continuous culture using a defined synthetic medium // Biotechnol. Lett. — 1996. — V. 18, N7. — P. 795–800. 31. Soni S. K., Kaur A., Gupta J. K. A solid state fermentation based bacterial α�amylase and fungal glucoamylase system and its suitabi� lity in the hydrolysis of wheat starch // Process Biochem. — 2003. — V. 39, N2. — P. 185–192. 32. Santos E., Martins M. L. L. Effect of the medium composition on formation of amy� lase by Bacillus sp. // Braz. Arch. Biol. Technol. — 2003. — V. 46, N 1. — P. 129–134. 33. Teodoro C. E. D., Martins M. L. L. Culture conditions for the production of thermo� stable amylase by Bacillus sp. // Braz. J. Microbiol. –2000. — V. 31. — P. 298–302. 34. Dettori:Campus B. G., Priest F. G., Stark J. R. Hydrolysis of starch granules by the amylase from Bacillus stearothermophilus NCA 26 // Process Biochem. — 1992. — V. 27, N1. — P. 17–21. 35. Narang S., Satyanarayana T. Thermostable α�amylase production by an extreme ther� mophile Bacillus thermoleovorans // Lett. Appl. Microbiol. — 2001. — V. 32, N1. — P. 31–35. 36. Alam S., Hong J., Weigand W. A. Effect of yeast extract on α�amylase synthesis by Ba: cillus amyloliquefaciens // Biotechnol. Bioeng. — 1989. — V. 33, N6. — P. 780–785. 37. Hamilton L. M., Kelly C. T., Fogarty W. M. Purification and properties of the raw starch degrading α�amylase of Bacillus sp. IMD 434 // Biotechnol. Lett. — 1999. — V. 21, N2. — P. 111–115. 38. Bessler C., Schmitt J., Maurer K:H., Schmid R. D. Directed evolution of bacterial α�amy� lase: Toward enhanced pH�performance and higher specific activity // Prot. Sci. — 2003. — V. 12, N 10. — P. 2141–2149. 39. Cordeiro C. A. M., Martins M. L. L., Luciano A. B. Production and properties of α�amylase from thermophilic Вacillus sp. // Braz. J. Microbiol. — 2002. — V. 33, N1. — P. 57–61. 40. Crabb W., Mitchinson E. C. Enzymes involved in the processing of starch to sugars // Trends Biotechnol. — 1997. — V. 5. — P. 349–352. 41. Mamo G., Gashe B. A., Gessesse A. A highly thermostable amylase from a newly isolated thermophilic Вacillus sp. WN11 // J. Appl. Microbiol. — 1999. — V. 86, N4. — P. 557–560. 42. Shaw J. F., Lin F. P., Chen S. C., Chen H. C. Purification and properties of an extracellu� lar α�amylase from Thermus sp. // Bot. Bull. Acad. Sin. — 1995. — V. 36. — P. 195–200. 43. Nielsen A. D., Pusey M. L., Fuglsang C. C., Westh P. A proposed mechanism for the ther� mal denaturation of a recombinant Bacillus halmapalus α�amylase — the effect of calcium ions // Biochim. Biophys. Acta. — 2003. — V. 1652, N1. — P. 52–63. 44. Levenque E., Janecek S., Haye B., Belarbi A. Thermophilic archaeal amylolytic enzymes // Enzyme Microbiol. Technol. — 2000. — V. 26, N1. — P. 3–14. 45. Igarashi K., Hatada Y., Hagihara H. et al. Enzymatic properties of a novel liquefying α� amylase from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid sequences // Appl. Environ. Microbiol. — 1998. — V. 64, N9. — P. 3282–3289. 46. Nonaka T., Fujihashi M., Kita A., Hagihara H. et al. Crystal structure of calcium�free α� amylase from Bacillus sp. strain KSM�K38 (AmyK38) and its sodium binding sites // J. Biol. Chem. — 2003. — V. 278, N27. — P. 24818–24824. Експериментальні статті 79 ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА α>АМИЛАЗЫ ИЗ Bacillus sp. BKL40 О. И. Кубрак, В. И. Лущак Прикарпатский национальный университет им. В. Стефаныка, Ивано�Франковск E:mail: lushchak@pu.if.ua Изолирован штамм Вacillus sp. BKL40, способный секретировать в среду культивиро� вания α�амилазу, стабильную в условиях вы� соких температур и щелочных значений рН. Оптимизацией условий культивирования штамма�продуцента достигнута наивысшая продукция энзима. Синтез α�амилазы не зави� сел от наличия крахмала в среде культивиро� вания и стимулировался добавлением пептона (0,3%) и дрожжевого экстракта (0,2%). Энзим полностью сохранял амилолитическую актив� ность после 30 мин инкубации при 60 и 70 0С. α�Амилаза проявляла высокую активность в широком диапазоне значений рН — от 6,0 до 11,0 и сохраняла активность даже после 24 ч инкубации при щелочных значениях рН. Изу� чаемая α�амилаза не активировалась ионами кальция и других двухвалентных металлов (1 мМ), а также не ингибировалась ЭДTA и ЭГTA (1 и10 мМ), что может свидетельство� вать об отсутствии ионов кальция в структуре ее молекулы. Ключевые слова: α�амилаза, Вacillus sp., алкало� стабильность, термостабильность, продукция. PRODUCTION AND PROPERTIES OF α>AMYLASE FROM Bacillus sp. BKL40 O. I. Kubrak, V. I. Lushchak Vassyl Stefanyk Precarpathian National University, Ivano�Frankivsk E:mail: lushchak@pu.if.ua Strain BKL40 was identified as a producer of thermostable alkaline α�amylase. Maximum pro� duction of this α�amylase was achieved by opti� mizing culture conditions. Production of α�amy� lase seemed to be independent on the presence of starch in the culture medium and was stimulated by peptone (0.3%, w/v) and yeast extract (0.2%, w/v). The enzyme was thermostable and retained amylolytic activity after 30 min of incubation at 60 and 70 0C. High activity was maintained over a broad pH range from 6.0 to 11.0 and the enzyme remained active after alkaline incuba� tion for 24 h. Bacillus sp. BKL40 α�amylase was not stimulated by calcium and other bivalent metal cations at 1mM and was not inhibited by EGTA or EDTA at 1�10 mM, suggesting that this α�amylase does not contain calcium ions in its active site. Key words: α�amylase, Bacillus sp., alkalostability, thermostability, production.
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-28175
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	1995-5537
language	Ukrainian
last_indexed	2025-12-07T16:19:48Z
publishDate	2009
publisher	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
record_format	dspace
spelling	Кубрак, О.І. Лущак, В.І. 2011-10-31T21:32:42Z 2011-10-31T21:32:42Z 2009 Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40 / О.І. Кубрак, В.І. Лущак // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 69-79. — Бібліогр.: 46 назв. — укр. 1995-5537 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/28175 57.083.13+577.152.321*1 Виділено штам Вacillus sp. BKL40, здатний секретувати в середовище культивування α-амілазу, стабільну за високих температур і лужних значень рН. Оптимізацією умов культивування штаму-продуцента досягнено найбільшої продукції ензиму. Інтенсивність синтезу α-амілази не залежала від наявності крохмалю в середовищі культивування й стимулювалася додаванням пептону (0,3%) та дріжджового екстракту (0,2%). Ензим повністю зберігав амілолітичну активність після 30 хв інкубації при 60 і 70 0С. α-Амілаза виявляла високу активність у широкому діапазоні значень рН — від 6,0 до 11,0 і зберігала активність навіть після 24 год інкубації за цих значень рН. Досліджувана α-амілаза не активувалась іонами кальцію та іонами інших двовалентних металів (1 мМ), а також не інгібувалась EДTA та EГTA (1–10 мМ), що може свідчити про відсутність іонів кальцію у структурі її молекули. Изолирован штамм Вacillus sp. BKL40, способный секретировать в среду культивирования α-амилазу, стабильную в условиях высоких температур и щелочных значений рН. Оптимизацией условий культивирования штамма-продуцента достигнута наивысшая продукция энзима. Синтез α-амилазы не зависел от наличия крахмала в среде культивирования и стимулировался добавлением пептона (0,3%) и дрожжевого экстракта (0,2%). Энзим полностью сохранял амилолитическую активность после 30 мин инкубации при 60 и 70 ºС. α-Амилаза проявляла высокую активность в широком диапазоне значений рН — от 6,0 до 11,0 и сохраняла активность даже после 24 ч инкубации при щелочных значениях рН. Изучаемая α-амилаза не активировалась ионами кальция и других двухвалентных металлов (1 мМ), а также не ингибировалась ЭДTA и ЭГTA (1 и10 мМ), что может свидетельствовать об отсутствии ионов кальция в структуре ее молекулы. Strain BKL40 was identified as a producer of thermostable alkaline α-amylase. Maximum production of this α-amylase was achieved by optimizing culture conditions. Production of α-amylase seemed to be independent on the presence of starch in the culture medium and was stimulated by peptone (0.3%, w/v) and yeast extract (0.2%, w/v). The enzyme was thermostable and retained amylolytic activity after 30 min of incubation at 60 and 70 ºC. High activity was maintained over a broad pH range from 6.0 to 11.0 and the enzyme remained active after alkaline incubation for 24 h. Bacillus sp. BKL40 α-amylase was not stimulated by calcium and other bivalent metal cations at 1mM and was not inhibited by EGTA or EDTA at 1-10 mM, suggesting that this α-amylase does not contain calcium ions in its active site. uk Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Біотехнологія Експериментальні статті Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40 Получение и свойства α-амилазы из Bacillus sp. BKL40 Production and properties of α-amylase from Bacillus sp. BKL40 Article published earlier
spellingShingle	Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40 Кубрак, О.І. Лущак, В.І. Експериментальні статті
title	Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40
title_alt	Получение и свойства α-амилазы из Bacillus sp. BKL40 Production and properties of α-amylase from Bacillus sp. BKL40
title_full	Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40
title_fullStr	Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40
title_full_unstemmed	Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40
title_short	Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40
title_sort	одержання і властивості α-амілази з bacillus sp. bkl40
topic	Експериментальні статті
topic_facet	Експериментальні статті
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/28175
work_keys_str_mv	AT kubrakoí oderžannâívlastivostíαamílazizbacillusspbkl40 AT luŝakví oderžannâívlastivostíαamílazizbacillusspbkl40 AT kubrakoí polučenieisvoistvaαamilazyizbacillusspbkl40 AT luŝakví polučenieisvoistvaαamilazyizbacillusspbkl40 AT kubrakoí productionandpropertiesofαamylasefrombacillusspbkl40 AT luŝakví productionandpropertiesofαamylasefrombacillusspbkl40

Одержання і властивості α-амілази з Bacillus sp. BKL40

Репозитарії

Схожі ресурси