Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре
Исследована динамика формирования клеточных агрегатов в культурах Dunaliella viridis Teod. (Chlorophyta), чувствительных (CuS) и резистентных (CuR) к ионам меди после внесения в среду 20 и 50 мг/л CuSO4•5H2O. Сразу после внесения сернокислой меди в среду клетки теряют подвижность, изменяют форму и а...
Saved in:
| Published in: | Альгология |
|---|---|
| Date: | 2010 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України
2010
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/29991 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре / А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама // Альгология. — 2010. — Т. 20, № 2. — С. 151-166. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860267003237892096 |
|---|---|
| author | Божков, А.И. Голтвянский, А.В. Ростама, Ш. |
| author_facet | Божков, А.И. Голтвянский, А.В. Ростама, Ш. |
| citation_txt | Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре / А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама // Альгология. — 2010. — Т. 20, № 2. — С. 151-166. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Альгология |
| description | Исследована динамика формирования клеточных агрегатов в культурах Dunaliella viridis Teod. (Chlorophyta), чувствительных (CuS) и резистентных (CuR) к ионам меди после внесения в среду 20 и 50 мг/л CuSO4•5H2O. Сразу после внесения сернокислой меди в среду клетки теряют подвижность, изменяют форму и агрегируют. Проявление этих изменений зависит от функционального состояния культур. Так, в культуре CuR D. viridis, проявляющей устойчивость к ионам меди, достаточно быстро восстанав ливалась подвижность клеток, целостность клеточных мембран, а клеточные агрегаты распадались на отдельные клетки. Установлено, что для большей части клеток потеря подвижности, образование клеточных агрегатов и нарушение плазмалеммы являются временными. Клетки восстанавливают свои морфофункциональные характеристики, что выражено в гораздо большей степени у CuR D. viridis. Показано, что образование клеточных агрегатов является первичной реакцией культуры D. viridis на высокое содержание ионов меди в среде.
The dynamics of cell aggregates forming in Dunaliella viridis Teod. were studied. Two cultures of D. viridis, sensitive to CuSO4 (CuS) and resistant to CuSO4 (CuR), were studied. Almost immediately after the addition of CuSO4 to the culture medium the cells became immobile and formed cell aggregates. The manifestation of these changes depends on the cell culture functional state. Cell recovery after CuSo 4 treatment was investigated. In CuR-culture cell aggregates become separated and cell mobility and cell membrane integrity recov ered relatively early. It is demonstrated that cell aggregation is a primary reaction of cells to high concentration of copper ions in the cell culture medium.
|
| first_indexed | 2025-12-07T19:01:45Z |
| format | Article |
| fulltext |
Физиология, биохимия,
биофизика
ISSN 0868-8540 Альгология. 2010. Т. 20. № 2 Algologia. 2010. V. 20. N 2 151
УДК 574.64.08:57.017.6
А.И. БОЖКОВ, А.В. ГОЛТВЯНСКИЙ, Ш. РОСТАМА
НИИ биологии Харьковcкого национального ун -та им. В.Н. Каразина,
пл. Свободы, 4, 61077 Харьков, Украина
ИНДУЦИРОВАННОЕ АГРЕГИРОВАНИЕ КЛЕТОК
DUNALIELLA VIRIDIS TEOD. ПОЛУЛЕТАЛЬНЫМИ
КОНЦЕНТРАЦИЯМИ ИОНОВ МЕДИ В КУЛЬТУРЕ
Исследована динамика формирования клеточных агрегатов в культурах Dunaliella
viridis Teod. (Chlorophyta), чувствительных (CuS) и резистентных (CuR) к ионам меди после
внесения в среду 20 и 50 мг/л CuSO 4·5H2O. Сразу после внесения сернокислой меди в среду
клетки теряют подвижность, изменяют форму и агрегируют. Проявление этих изменений
зависит от функционального состояния культур. Так, в культуре CuR D. viridis,
проявляющей устойчивость к ионам меди, достаточно быстро восстанав ливалась
подвижность клеток, целостность клеточных мембран, а клеточные агрегаты распадались на
отдельные клетки. Установлено, что для большей части клеток потеря подвижности,
образование клеточных агрегатов и нарушение плазмалеммы являются временными. Кле тки
восстанавливают свои морфофункциональные характеристики, что выражено в гораздо
большей степени у CuR D. viridis. Показано, что образование клеточных агрегатов является
первичной реакцией культуры D. viridis на высокое содержание ионов меди в среде.
К л ю ч е в ы е с л о в а : Dunaliella viridis, сернокислая медь, клеточные агрегаты,
пальмеллы.
Введение
Известно, что клетки микроводоросл и Dunaliella viridis могут
адаптироваться не только к изменению концентрации солей в среде ( Azachi
et al., 2002; Katz et al., 2007), перепадам температуры (Dunaliella, 1992;
Седова, 2003), но и к различным концентрациям ионов меди (Bozhkov,
Mogilyanskaya, 1994; Божков, Голтвянский, 2000). Механизмы адаптации
клеток микроводорослей к экстремальным воздействиям среды достаточно
разнообразны. Так, показано, что адаптация микроводорослей к гипер -
галинным условиям связана с изменением в экспрессии специфических
белков (Fisher, 1997), синтезе глицерина (Brown, 1992), при этом
изменяется морфология клеток (Масюк, 1973).
Высокую адаптивность микроводорослей рода Dunaliella под-
тверждают результаты получения культуры D. viridis, устойчивой к
высоким концентрациям (полулетальным – 20-50 мг/л) сернокислой меди
© А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама, 2010
А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама
152
(Божков, Голтвянский, 1998). Мех анизмы индуцированной устойчивости к
ионам меди представляют большой интерес и требуют дальнейшего
изучения. Высокая резистентность к ионам меди объясняется не только
связыванием ионов меди со специфическими белками клеток D. viridis
(металлотионеинами и др.) и депонированием ионов металла в клетках, но
и функционированием системы экскреции ионов меди из клеток (Божков,
Могилянская, 1996). В процессе исследования механизма резистентности к
ионам меди было обнаружено формирование агрегатов клеток микро -
водорослей сразу после внесения токсических концентраций ионов
металла (Божков и др., 2002). Высказана рабочая гипотеза, согласно
которой молекулярно-биохимические изменения, обеспечивающие
резистентность, в случае высоких концентраций токсиканта могут сопро -
вождаться специфическим агрегированием клеток. Такое агрегирование
клеток может быть следствием молекулярно-генетических перестроек
метаболизма этих клеток.
Впервые потерю подвижности и образование скоплений клеток у
D. salina описал Е.К. Теодореску (Teodoresco, 1906), назвав это пальмел-
левидным состоянием. В 1916 г. А.П. Артари определил подобное
состояние у другого вида – D. viridis, а в 1973 г. Н.П. Масюк описала
пальмеллы и для D. minuta. Е.К. Теодореску писал, что переход в
пальмеллевидное состояние является реакцией клеток Dunaliella на не-
благоприятные условия среды (бессолевые или, наоборот, очень
концентрированные среды) (Teodoresco, 1906). Однако исследованию
механизма и самого процесса формирования пальмелл не уделялось
должного внимания.
При переходе в пальмеллевидное состояние микроводоросли
Dunaliella втягивают жгутики, округляются и выделяют слизь, в которой
могут многократно делиться (Масюк, 1973). В цикле развития D. viridis var.
palmelloides пальмеллевидная стадия является доминирующей. Па льмел-
левидное состояние может быть обратимым, т.е. при благоприятных
условиях клетки водорослей вос станавливают обычную форму и
подвижность (Масюк, 1973). Пальмеллевидное состояние клеток можно
рассматривать как особую форму в жизненном цикле микроводорослей
рода Dunaliella.
Очевидно, в основе таких клеточных образований , как «агрегаты
клеток», «пальмеллеобразование» и «индуцированное агрегирование
клеток» токсическими факторами среды , лежат различные механизмы и
эти состояния выполняют различные функциона льные нагрузки.
Исследование процесса «индуцированного агрегирования клеток» может
стать важным этапом в понимании механизмов адаптации клеток к ионам
металлов.
Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod.
153
Исследование индуцированного агрегирования клеток представляет
интерес еще и потому, что клетки D. viridis способны к индуцированному
агрегированию и при внесении в среду культивирования столь
специфических компонентов , как цитотоксические факторы сыворотки
крови людей, больных миастенией, т.е. при воздействии фактора, с
которым они ранее не сталкивались (Божков и др., 2002). В настоящее
время остаются недостаточно исследованными не только механизмы
индуцированного агрегирования клеток Dunaliella, но и кинетика этого
процесса, т.е. время его формирования после появления стресс -фактора,
время его «жизни». Уникальной моделью при определении роли
индуцированного агрегирования клеток в адаптации к токсическим
концентрациям ионов меди могу т служить стандартная, т.е. медь -
чувствительная культура D. viridis (CuS D. viridis) и резистентная к 20 мг/л
сернокислой меди культура D. viridis (CuR D. viridis).
Нам предстояло определить время индуцированного агрегирования
клеток, продолжительность его существования, нативность плазмалеммы
клеток D. viridis при внесении в культуры полулетальных концентраций
сернокислой меди (20 и 50 мг/л) в случае контрольных ( CuS) и пред-
варительно адаптированных к ионам меди культур ( CuR D. viridis).
Материалы и методы
Исследовали контрольную культуру Dunaliella viridis var. viridis f.
euchlora Teod., штамм IBASU-A № 29 и медьрезистентную, полученную в
лаборатории биологических моделей НИИ биологии Харьковского
национального ун-та им. В.Н. Каразина из исходного штамма IBASU -AN29
(Божков, Голтвянский, 1998).
Альгологически чистую культуру D. viridis, штамм № 29 выращи-
вали на среде Артари (г/л): NaCl – 116; MgSO4 – 50; KNO3 – 2,5; K2HPO4 –
0,2, в люминостате при температуре 26-28 ºС, в колбах объемом 250 см 3,
при круглосуточном освещении 6 клк на поверхности культуральной
среды. При посеве исследуемых культур использовали 24 -суточную
культуру (стационарная фаза роста), исходная концентрация клеток пр и
посеве составляла 1,3-1,4 млн кл/мл.
Это стандартное культивирование клеток . Клетки такой культуры
были названы CuS D. viridis, т.е. чувствительными к ионам меди.
Культивирование резистентных к ионам меди клеток осуществляли
при тех же условиях, что и CuS D. viridis, с той лишь разницей, что при
новых пересадках в их среду вносили сернокислую медь до конечной
концентрации 20 мг/л. В таких условиях CuR D. viridis поддерживается
А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама
154
более 10 лет. Эти две культуры практически не различались интен-
сивностью роста и морфологией . Небольшое отставание CuR D. viridis от
CuS D. viridis в скорости накопления биомассы проявлялось в отдельных
экспериментах.
Выбор концентрации 20 мг/л сернокислой ме ди для индукции
резистентности клеток Dunaliella к ионам меди был обусловлен
следующим. С одной стороны, это достаточно большая концентрация
ионов меди в водной среде (соответствует ПДК), при которой содержание
ионов меди в клетках увеличивается в 40-50 раз по сравнению с
контрольной культурой CuS D. viridis. С другой, CuR D. viridis способна
к формированию резистентности и пост оянному росту на такой среде. В
предварительных экспериментах обнаружена дозовая зависимость между
концентрацией ионов меди в среде и индуцированным агрегированием
клеток. При этом использовали такие концентрации сернокислой меди: 0,1;
0,5; 1; 5; 10; 20; 50; 75 и 100 мг/л.
Для определения влияния сернокислой меди на индуцированное
агрегирование клеток Dunaliella viridis использовали две культуры – CuS и
CuR D. viridis. После завершения экспоненциальной фазы роста и перехода
в стационарную фазу, что соответствовало 21-22 суткам роста, их
переводили на свежую среду Артари (при этом количество клеток всегда
составляло 1,3-1,4 млн мл) и вносили сернокислую медь до конечных
концентраций 20 и 50 мг/л, т.е. концентрация ионов меди на клетку всегда
была одинаковой.
Контролем служили культуры CuS и CuR D. viridis, которые также
пересевали на свежую среду Артари, но не вносили сернокислую медь . На
протяжении эксперимента все варианты культивировали в стандартных
условиях, как было описано ранее.
Спустя 5, 20, 40 мин и 1, 2, 3, 4, 24 и 25 ч из всех культур отбирали
аликвоты и определяли количество клеток, подвергшихся индуци -
рованному агрегированию на 1,3-1,4 млн клеток, количество подвижных
клеток и нативность плазматической мембраны по окрашиванию клеток
трипановым синим.
Индуцированное агрегирование и морфологию клеток устанав-
ливали визуально под микроскопом при увеличении х150; х 200 в камере
Горяева.
Нативность клеточной мембраны определяли по окрашиванию
клеток трипановым синим, которое осуществляли по методике Сеглена
(Seglen, 1976). Для этого 150 мг трипанового синего растворяли в растворе
NaCl (125 мг соли NaCl в 25 мл дистиллированной H 2O). Полученную
смесь фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и
Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod.
155
доводили до общего объема 2 мл. Для окрашивания клеток 100 мкл этого
раствора добавляли к 100 мкл культуры клеток водорослей и сразу вносили
в камеру Горяева. Отсчитывали 1 00 клеток и определяли процент
окрашенных клеток.
Все эксперименты повторяли 3 -5 раз, результаты обрабатывали
статистически, используя непараметрические методы анализа ( Гублер,
Генкин, 1973).
Результаты
Влияние высоких концентраций сернокислой меди на культуры
D. viridis, чувствительные к ионам меди (CuS D. viridis)
В первой серии экспериментов определяли количество подвижных
клеток, наличие агрегатов и нативно сть плазмалеммы через 5, 20, 40 мин,
1, 2, 3 и 4 ч после пересева CuS D. viridis. Через 5, 20 и 40 мин количество
подвижных клеток составляло 93 -97 %, т.е. 2-3 % клеток были не-
подвижными. Их количество незначительно увеличивалось через 3 -4 ч и
составляло 8-9 %.
Клетки контрольной культуры CuS D. viridis не окрашивались
трипановым синим на протяжении всего периода наблюдений, что
свидетельствует о сохранении плазмалеммы в нативном состоянии и
отсутствии некротических клеток.
В контрольной культуре CuS D. viridis клеточных агрегатов не
наблюдалось, в некоторых случаях появлялись «комплексы» из 2-4 клеток.
Уже через 5 мин после внесения во вновь пересаженную культуру
CuS D. viridis сернокислой меди в концентрации 20 мг/л все клетки теряли
подвижность (рис. 1). Через 1 ч после внесения токсиканта около 3 -5 %
клеток восстанавливали подвижность, а че рез 2 ч подвижными были уже
10-14 % клеток. Спустя сутки количество подвижных клеток в культуре
CuS D. viridis составляло 19-20 % (см. рис. 1).
На 2-3-и сутки в культуре оставалось не более 10 -15 %
неподвижных клеток, т.е. их количество почти соответствовало контролю.
Потеря подвижности, по крайней мере, для части клеток, сопровождалась
втягиванием жгутиков. Часть обездвиженных клеток разрушалась, а
большая их часть через несколько часов приобретала подвижность.
Гибель клеток микроводорослей в присутствии 20 мг/л серно-
кислой меди происходила по механизму некроза, о чем свидетельствует
нарушение нативности их плазмалеммы, которую оценивали по тесту с
трипановым синим.
А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама
156
Так, определение количества окрашенных клеток после внесения в
культуру 20 мг/л сернокислой меди показало, что этот процесс начинается
после обездвиживания клеток и завершается через 20 мин после начала
эксперимента. Так, если через 5 мин окрашенные клетки в культуре не
выявлялись, то через 20 мин 35 % клеток были окрашены трипановым
синим. В контрольном варианте окрашенных клеток не было (рис. 2).
Однако уже через 1 ч их количество уменьшалось практически линейно в
течение 4 ч, и в дальнейшем они составляли 10 -15 % (см. рис. 2).
Рис. 1. Количество подвижных клеток
Dunaliella viridis в CuS-культуре после
внесения в среду 20 (1) и 50 мг/л (2)
CuSO4·5H2O (процент общего коли-
чества подвижных клеток)
Уменьшение количества окрашенных клеток по истечении такого
короткого периода времени можно объяснить их разрушением или
направленным восстановлением нарушенной структуры мембран
(клеточной регенерацией), так как общее количество клеток оставалось
постоянным, а деление клеток не могло завершиться за этот период.
Однако наиболее яркой и интересной реакцией на внесение в
культуру CuS D. viridis 20 мг/л сернокислой меди был переход части
клеток к индуцированному агрегированию (рис. 3). Практически сразу
после внесения сернокислой меди в среду клетки CuS D. viridis
образовывали достаточно большое количество индуцировано агре -
гированных клеток. В состав таких клеточных агрегатов входило от 10 до
15 клеток (мелкие агрегаты) и от 20 до 50 и более клеток (крупные
агрегаты). В составе индуцировано агрегированных клеток они все были
жизнеспособными (не окрашивались трипановым синим). Спустя 20 мин
от начала эксперимента выявляли только крупные агрегаты, имеющие в
своем составе 20-30 клеток с нарушенной плазматической мембраной.
Такое состояние индуцировано агрегированных клеток сохранялось на
протяжении 2 ч. По истечении этого срока количество крупных агрегатов и
окрашенных клеток в них уменьшалось до 10 -15 (40 клеток в начале
эксперимента).
Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod.
157
Рис. 2. Количество клеток Dunaliella viridis,
окрашенных 0,3 %-ным трипановым синим, в
CuS-культуре после внесения в среду 20 ( 1) и
50 мг/л (2) CuSO4 ·5H2O
Рис. 3. Клеточные агрегаты в культуре CuS Dunaliella viridis после внесения в
среду 20 мг/л CuSO4 · 5H2O (х200)
Через 24-25 ч после внесения ионов меди в культуральную среду
клеточные агрегаты не обнаруживались, появлялись подвижные клетки, по
форме и размерам характерные для исходной контрольной культуры
(рис. 4). Учитывая, что эти изменения происходили достаточно быстро и за
это время клетки не могли завершить цикл пролиферации, можно
предположить, что индуцированное агрегирование клеток являет ся
обратимым состоянием.
Следовательно, наиболее выраженной и быстрой реакцией, наряду
с потерей подвижности клеток, на присутствие в среде 20 мг/л серно -
кислой меди является индуцированное агрегирование клеток.
А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама
158
Рис. 4. Состояние культуры
CuS Dunaliella viridis после
распада клеточных агрегатов
(х150)
Определение количества индуцированных агрегатов спустя 20 мин
после внесения в среду разных концентраций сернокислой меди от 0,1 до
100 мг/л показало, что они выявлялись при концентрации 20 мг/л и их
количество увеличивалось до 100 мг/л (рис. 5). Следовательно, процесс
индуцированного агрегирования клеток является дозозависимым в
интервале концентраций от 20 до 100 мг/л сернокислой меди и проявляется
через 20 мин от начала эксперимента.
В следующей серии экспериментов определяли влияние полу -
летальной концентрации ионов меди (50 мг/л) на первичные изменения в
культуре CuS D. viridis. Спустя 5 мин после внесения в среду 50 мг/л
сернокислой меди все клетки теряли подвижность, однако через 1 ч в
культуре появлялось до 9 % подвижных клеток, что в 3 раза больше, чем в
присутствии сернокислой меди в концентрации 20 мг/л (см. рис. 1). Через
2-4 ч 10-13 % клеток были подвижными в присутствии 20 и 50 мг/л
сернокислой меди. Однако через 1 сут в культуре, соде ржащей 50 мг/л
сернокислой меди, количество подвижных клеток увеличивалось до 30 -
34 %, в то время как в присутствии 20 мг/л их доля составляла 19 -20 % (см.
рис. 1).
Следовательно, увеличение концентрации ионов меди в куль -
туральной среде более чем в 2 раз а не влияет на подвижность клеток.
Оценка нативности плазмалеммы по тесту с трипановым синим показ ала,
что через 5 мин после внесения 50 мг/л сернокислой меди клетки оста ются
нативными, однако уже через 20 мин они все окрашиваются (см. рис. 2) и
остаются такими на протяжении первых суток эксперимента.
Сразу после внесения 50 мг/л сернокислой меди выявлялось
индуцированное агрегирование клеток в культуре CuS D. viridis, которое
сохранялось на протяжении всего эксперимента (25 ч). Через 25 ч после
Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod.
159
добавления 20 мг/л сернокислой меди появлялось небольшое количество
мелких агрегатов, а при внесении 50 мг/л сернокислой меди через 25 ч в
культуре присутствовали как крупные, так и мелкие агрегаты в достаточно
большом количестве. Следовательно, чем выше концентрация , тем больше
агрегатов и они дольше сохраня ются во времени.
Рис. 5. Содержание индуцированно агрегированных клеток CuS D. viridis на 1,3-1,4 млн
клеток через 20 мин после внесения в среду разных концентраций ионов меди
Очевидно, индуцированное агрегирование клеток при добавлении
полулетальных концентраций сернокислой меди (50 мг/л) обеспечивает
«защиту» клеток культуры от токсиканта, о чем свидетельств ует высокая
степень восстановления подвижности клеток по сравнению с меньшей
концентрацией сернокислой меди (20 мг/л). Следовательно, при инкубации
культуры CuS D. viridis с разными, достаточно высокими концентрациями
ионов меди, клетки микроводорослей используют различные стратегии
адаптации, что проявляется в разных соотношениях исследуемых
показателей. Первичным и, вероятно, центральным звеном адаптации к
высоким концентрациям ионов меди является агрегация клеток
микроводорослей.
По всей видимости, исходная устойчивость и выбор стратегии
адаптации в культуре клеток микроводорослей зависит не только от дозы
токсиканта, но и от их функционального состояния и предадаптации к
исследуемому токсиканту. Если полагать, что клетки микроводо рослей
способны адаптироваться к высоким концентрациям ионов меди, а
индуцированное агрегирование клеток является проявлением одного из
механизмов такой адаптации, можно ожидать, что влияние ионов меди на
процессы агрегирования может быть различным в клеточных культурах
уже адаптированных (CuR D. viridis) и неадаптированных (CuS D. viridis).
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0,1 1 5 10 20 50 75 100
концентрация CuSO4, мг/л
К
ол
ич
ес
тв
о
ин
ду
ци
ро
ва
нн
о
аг
ре
ги
ро
ва
нн
ы
х
кл
ет
ок
н
а
1,
3-
1,
4
мл
н.
к
ле
то
к,
%
А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама
160
Влияние высоких концентраций сернокислой меди на культуры
D. viridis, резистентных к ионам меди (CuR D. viridis)
Внесение в культуру CuR D. viridis 20 мг/л сернокислой меди
приводило к кратковременной потере подвижности клеток. Так, через
5 мин после начала эксперимента 15 % клеток сохраняли подвижность, а
через 20-40 мин уже 30 % клеток были подвижными. Спустя 1 -2 ч
количество подвижных клеток составляло 50 %, а к 4 ч после внесения
сернокислой меди подвижность их полностью восста навливалась (рис. 6).
Количество подвижных клеток определяли под микроскопом в 10 полях
зрения и выражали в процентах общего количества одиночных клеток.
Следовательно, полученная нами CuR D. viridis характеризовалась
способностью части клеток сохранять обычную подвижность (15 %), а
подвижность остальных клеток достаточно быстро восстановилась по
сравнению с CuS D. viridis (см. рис. 1 и 6).
Рис. 6. Количество подвижных клеток в
культуре Dunaliella viridis CuR после
внесения в среду 20 (1) и 50 мг/л (2)
CuSO4 ∙ 5H2O
Количество окрашенных клеток в культуре CuR D. viridis было
значительно меньшим по сравнению с CuS D. viridis. Так, через 20 мин их
было в 2 раза меньше, а к 4 ч они пр актически восстанавливались (рис. 7).
Динамика восстановления подвижности и уменьшение количества
окрашенных трипановым синим клеток во времени свидетельствует о том,
что клетки CuR D. viridis способны к быстрому восстановлению
нарушенных плазматических м ембран и это осуществляется с б óльшей
скоростью, чем в культуре CuS D. viridis.
Определение способности CuR D. viridis к индуцированному
агрегированию клеток сразу после внесения 20 мг/л сернокислой меди
показало, что через 5 мин после внесения токсиканта часть клеток
округлялась и они формировали мелкие агрегаты. Крупных агрегатов у них
Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod.
161
не выявлено, в отличие от CuS D. viridis. Через 20 мин в агрегатах по -
являлось по 10-15 клеток, окрашенных трипановым синим. Клетки CuR
D. viridis не образовывали крупных агрегатов, и спустя 4 ч количество
клеточных агрегатов значительно уменьшалось. Оставшиеся единичные
агрегаты сохранялись в течение 25 ч и в их составе не было клеток с
нарушенной плазмалеммой.
Рис. 7. Количество клеток, окрашенных трипа -
новым синим (0,6 %), в культуре CuR D. viridis
после внесения в среду 20 (1) и 50 мг/л (2)
CuSO4 ∙ 5H2O
Следовательно, индуцированное агрегирование является одной из
первичных реакций клеток D. viridis на внесение высоких концентраций
ионов меди и зависит не только от дозы токсиканта, но и от структурно -
функционального состояния клеток, в частности от их предадаптации к
этому фактору.
В следующей серии экспериментов определяли влияние полу -
летальных концентраций (50 мг/л) сернокислой меди на культуру CuR D.
viridis. При увеличении концентрации сернокислой меди до 50 мг/л ее
токсический эффект по сравнению с концентрацией 20 мг/л не увели -
чивался. Так, через 5 мин после внесения 50 мг/л сернокислой меди в
культуральную среду CuR D. viridis 20 % клеток оставались подвижными,
а остальные восстанавливали подвижность и уже к 4 -му часу 95 % клеток
были подвижными (см. рис. 6). Количество окрашенных клеток в случае
внесения в культуру 50 мг/л сернокислой меди через 20 мин было больше
(20 %), чем в случае внесения 20 м г/л сернокислой меди (12 %, см. рис. 7).
В дальнейшем количество окрашенных клеток уменьшалось и к 24 ч они
не выявлялись, как и в случае внесения 20 мг/л сернокислой меди (см.
рис. 7). При внесении в культуру 50 мг/л сернокислой меди уже через
5 мин появлялись крупные и мелкие клеточные агрегаты, в состав котор ых
входили интактные клетки, т. е. не окрашенные трипановым синим. Через
20 мин в агрегатах появлялось по 20 -30 окрашенных клеток, а спустя 2-3 ч
– 10-15 клеток. К 4-му часу их было только 2-3 на клеточный агрегат, т.е.
количество клеток с нарушенной плазмалеммой быстро уменьшалось в
А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама
162
составе агрегатов. Крупные агрегаты появлялись и довольно быстро
распадались. Так, через 1 ч после внесения сернокислой меди при -
сутствовали только мелкие агрегаты.
Следовательно, в культуре CuR D. viridis время жизни индуци-
ровано агрегированных клеток зависит от концентрации токсиканта и
времени экспозиции с ним. Если при внесении сернокислой меди в
концентрации 20 мг/л образовывались только мелкие клеточные агрегаты,
то при 50 мг/л сернокислой меди выявлялись как мелкие, так и крупные
клеточные агрегаты. Если при внесении 20 мг/л сернокислой меди через
24 ч в культуре выявлялись только единичные агрегаты, то при 50 мг/л их
количество было большим.
Обсуждение
Впервые способность клеток видов рода Dunaliella образовывать
агрегаты была описана более 100 лет назад как реакция клеток этих
водорослей на резкие изменения концентрации солей в среде. Переход
D. viridis и D. salina в пальмеллевидное состояние индуцировано как
резким снижением, так и резким повышением концентрации солей . Клетки
втягивают жгутики, округляются, интенсивно выделяют полисахариды
(слизь) и в таких образованиях многократно дел ятся. Такие состояния
сохраняются достаточно долго, пока соленость среды не становится
оптимальной для этих водорослей. За это время клетки многократно
успевают поделиться, что приводит к большому их скоплению. При
оптимальных условиях клетки Dunaliella вновь формируют жгутики,
восстанавливают обычную форму, подвижность и переход ят в состояние
единичных (Масюк, 1973).
Следовательно, пальмеллевидное состояние – временная стадия
размножения, которая реализуется в неблагоприятных условиях для
данного вида водорослей. Встречается у эвгленовых, некоторых видов
зеленых, золотистых и пирофитовых водорослей. Характеризуется пере-
ходом клеток в неподвижное состояние и образованием слизистых скоп -
лений.
Наряду с пальмеллевидным состоянием описаны и другие формы
ассоциатов клеток водорослей – пальмеллоидные структуры. Это доста -
точно крупные, чаще всего прикрепленные к субстрату слизистые тела ,
внутри которых содержится большое количество коккоидных клеток. В
отличие от пальмеллевидного состояния, которое является временной
стадией развития, пальмеллоидные структуры – постоянная форма
вегетативного размножения.
Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod.
163
Скопления, или агрегаты клеток, могут образовываться и в случае
вегетативного деления клеток, когда такой способ деления сочетается с
коккоидным габитусом. В результате вегетативного деления, которое
осуществляется в различных плоскостях, могут образовываться пакето -
видные, тетраэдрические или иные формы скопления клеток, получившие
название сарциноидный тип структуры. Такой тип структуры образуют
одноклеточные или колониальные организмы с полярным строением
клеток и прочной клеточной оболочкой (Водоросли, 1989).
Внесение в среду культивирования D. viridis сернокислой меди в
концентрации 20 мг/л и более приводи т к быстрому (в течение нескольких
минут) агрегированию клеток, характер которого отличается от описанных
способов образования клето чных агрегатов. Для индуцированного
агрегирования клеток характерно:
– приобретение клетками округлой и неподвижной формы; коли-
чество клеток в таких агрегатах может быть небольшим (10 -
15 клеток, мелкие агрегаты) и большим (40 -50, крупные
агрегаты);
– такие скопления клеток не имеют общей углеводной оболочки, или
капсулы;
– непродолжительное существование таких агрегированных состоя-
ний (от нескольких часов до суток);
– формирование и распад индуцирован но агрегированных клеток не
является спонтанным процесс ом типа самосборки, а
представлен этапом формирования – созревания и распада;
– время образования индуцирова нно агрегированных состояний
зависит от концентрации ионов меди в среде и функ -
циональных характеристик клеток;
– в культуре клеток D. viridis, устойчивых к токсическим кон-
центрациям ионов меди (CuR D. viridis), также происходит
агрегирование клеток сразу после внесения новой порции
сернокислой меди, однако количество агрегатов и их размер
значительно менее выражены, они быстро распадаются по
сравнению с контрольной культурой CuS D. viridis;
– в агрегированном состоянии наблюдаются клетки с нарушенной
структурой плазмалеммы, которая восстанавливается в
течение нескольких часов.
Известно, что некоторые ионы металлов в больших концентрациях
могут приводить к коагуляции клеток. Так, внесение в среду культи -
ирования хрома в конечной концентрации 1 мг/л индуцировал о
формирование агрегатов Scenedesmus acutus (Corradi, Gordi, 1993). Такие
агрегаты сохранялись в течение семи дней. Данный процесс был связан с
ранними стадиями полового размножения. Эти агрегаты состояли из
А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама
164
четырех клеток, окруженных общей оболочкой, и были идентифицированы
как гаметы.
Некоторые авторы предлагают использовать в качестве коагулянта
для осаждения клеток водорослей MnO2 (Chen at al., 2009). Ионы кальция
усиливают эффект MnO2 за счет удерживания на поверхности клеток
отрицательного заряда. В этих и подобных условиях при коагуляции
клеток они инактивируются (Chen at al., 2008).
Эти данные свидетельствуют о том, что агрегирование клеток
может осуществляться различными способами . Это зависит от факторов
индукции, вида водорослей и их функционального состояния. В
агрегированном состоянии клетки могут размножаться, переживать
неблагоприятные условия, инактивироваться. Такие состояния могут быть
обратимыми и необратимыми. Однако эти состояния остаются недоста -
точно изученными.
Выводы
Внесение в культуру Dunaliella viridis 20 мг/л сернокислой меди
индуцирует изменение формы, потерю подвижности и агрегирование
клеток. Индуцированное агрегирование клеток проявляется с первых
минут, а завершается спустя 30-40 мин. Через 2-4 ч начинается распад
индуцированно агрегированных клеток .
Этот процесс выражен в гораздо меньшей степени и реализуется во
времени быстрее в культуре, ус тойчивой к сернокислой меди, т.е. пред
адаптированной к ионам меди .
Индуцированное агрегирование клеток не связано с их
размножением, не имеет общей оболочки, а клетки с нарушенной
плазмалеммой могут восстанавливать ее.
A.I. Bozhkov, А.V. Goltvyanskij, Sh. Rostama
Research Institute of Biology of V.N. Karazin National University,
4, Sq. Svobody, 61077 Kharkov, Ukraine
CELL AGGREGATES FORMING IN DUNALIELLA VIRIDIS TEOD. CULTURE:
A PRIMARY REACTION TO STRESS INDUCED BY HIGH COPPER ION
CONCENTRATION
The dynamics of cell aggregates forming in Dunaliella viridis Teod. were studied. Two
cultures of D. viridis, sensitive to CuSO4 (CuS) and resistant to CuSO 4 (CuR), were studied.
Almost immediately after the addition of CuSO4 to the culture medium the cells became immobile
and formed cell aggregates. The manifestation of these changes depends on the cell culture
functional state. Cell recovery after CuSo 4 treatment was investigated. In CuR -culture cell
Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod.
165
aggregates become separated and cell mobility and cell membrane integrity recov ered relatively
early. It is demonstrated that cell aggregation is a primary reaction of cells to high concentration of
copper ions in the cell culture medium.
K e y w o r d s : Dunaliella viridis, copper sulfate, cell aggregates .
Артари А.П. Исследования над простейшими организмами соленых озер. – М., 1916. –
Вып. 1/2.
Божков А.И., Голтвянский А.В. Индукция резистентности к сернокислой меди у Dunaliella
viridis Teod. // Альгология. – 1998. – 8, № 2. – С. 162-169.
Божков А.И., Голтвянский А.В. Функциональная гетерогенность клеток Dunaliella viridis
Teod. (Chlorophyta) и чувствительность к действию сернокислой меди // Там же. –
2000. – 10, № 1. – С. 22-31.
Божков А.И., Климова Е.М., Бойко В.В., Мензянова Н.Г., Дроздова Л.А. Связь клинических
форм миастении с частотой встречаемости HLA-DR-фенотипа и разработка
клеточного биосенсора для оценки этой патологии // Доп. НАНУ. – 2002. – 3. –
С. 161-166.
Божков А.И., Могилянская С.М. Адаптация Dunaliella viridis Teod. к различным
концентрациям сернокислой меди. Роль системы экскреции ионов меди в среду //
Альгология. – 1996. – 6. – № 2. – C. 122-132.
Водоросли: Справочник / С.П. Вассер, Н.В. Кондратьева, Н.П. Масюк и др. – Киев: Наук.
думка, 1989. – 608 с.
Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев стат истики в медико-
биологических исследованиях. – М.: Медицина, 1973. – С. 21-25; 53-56.
Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода
Dunaliella Teod. – Киев: Наук. думка, 1973. – 244 с.
Седова К.В. Влияние высокой температуры на состав и содержание белков в клетках
Dunaliella viridis Teod., резистентных к ионам меди // Биол. вестн. – 2003. – 7,
№ 1/2. – С. 88-91.
Azachi M., Sadka A., Fisher M. et al. Salt induction of fatty acid elongase and membrane lipid
modifications in the extreme halotolerant alga Dunaliella salina // Plant Physiol. – 2002.
– 129, N 3. – P. 1320-1329.
Bozhkov A.I., Mogilyanskaya S.M . Relationship betbeen Cu 2+ ion concentration in medium,
bioaccumulation and toxicity for the microalgae Dunaliella viridis Teod. // Ibid. –
1994. – 4, N 3. – С. 22-29.
Dunaliella: physiology, biochemistry and biotechnology / M. Avron, A. Ben-Amotz (Eds.). –
Boca Raton, etc.: CRC Press, 1992. – 240 p.
Сhen J.J., Yen H.H., Tseng I.C. Potassium permanganate as an alternative preoxidant for
enhancing algal coagulation -pilot and bench scale studies // Environ Technol. – 2008. –
29, N 7. – P. 721-729.
А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама
166
Сhen J.J., Yen H.H., Tseng I.C. Effect of ozone and permanganate on algae coagulation
removal-pilot and bench scale test // Chemosphere. – 2009. – 74, N 6. – P. 840-846.
Corradi M.G., Gorbi G. Chromium toxicity on two linked trophic levels. II. Morphophysiologi cal
effects on Scenedesmus acutus // Ecotoxicol Saf. – 1993. – 25, N 1. – P. 72-78.
Fisher M., Gokhman I., Pick U., Zamir A. A structurally novel transferrin -like protein accumulates
in the plasma membrane of the unicellular green alga Dunaliella salina grown in high
salinities // J. Biol Chem. – 1997. – 272, N 3. – P. 1565-1570.
Katz A., Waridel P., Shevchenko A., Pick U. Salt-induced changes in the plasma membrane
proteome of the halotolerant alga Dunaliella salina as revealed by blue native gel
electrophoresis and nano-LC-MS/MS analysis // Mol. Cell Proteom. – 2007. – 6, N 9. –
P. 1459-1472.
Seglen P. Preparation of isolated rat liver cells // Meth. Cell Biol. – 1976. – 13. – P. 29-83.
Teodoresco E.C. Observations morphologiques et biologiques sur le genre Dunaliella // Rev. Gén.
Bot. – 1906. – 18. – P. 353-371; 409-427.
Получена 10.04.09
Рекомендовала к печати Е.И. Шнюкова
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-29991 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0868-8540 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T19:01:45Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Божков, А.И. Голтвянский, А.В. Ростама, Ш. 2012-01-16T09:54:11Z 2012-01-16T09:54:11Z 2010 Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре / А.И. Божков, А.В. Голтвянский, Ш. Ростама // Альгология. — 2010. — Т. 20, № 2. — С. 151-166. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. 0868-8540 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/29991 574.64.08:57.017.6 Исследована динамика формирования клеточных агрегатов в культурах Dunaliella viridis Teod. (Chlorophyta), чувствительных (CuS) и резистентных (CuR) к ионам меди после внесения в среду 20 и 50 мг/л CuSO4•5H2O. Сразу после внесения сернокислой меди в среду клетки теряют подвижность, изменяют форму и агрегируют. Проявление этих изменений зависит от функционального состояния культур. Так, в культуре CuR D. viridis, проявляющей устойчивость к ионам меди, достаточно быстро восстанав ливалась подвижность клеток, целостность клеточных мембран, а клеточные агрегаты распадались на отдельные клетки. Установлено, что для большей части клеток потеря подвижности, образование клеточных агрегатов и нарушение плазмалеммы являются временными. Клетки восстанавливают свои морфофункциональные характеристики, что выражено в гораздо большей степени у CuR D. viridis. Показано, что образование клеточных агрегатов является первичной реакцией культуры D. viridis на высокое содержание ионов меди в среде. The dynamics of cell aggregates forming in Dunaliella viridis Teod. were studied. Two cultures of D. viridis, sensitive to CuSO4 (CuS) and resistant to CuSO4 (CuR), were studied. Almost immediately after the addition of CuSO4 to the culture medium the cells became immobile and formed cell aggregates. The manifestation of these changes depends on the cell culture functional state. Cell recovery after CuSo 4 treatment was investigated. In CuR-culture cell aggregates become separated and cell mobility and cell membrane integrity recov ered relatively early. It is demonstrated that cell aggregation is a primary reaction of cells to high concentration of copper ions in the cell culture medium. ru Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України Альгология Физиология, биохимия, биофизика Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре Cell aggregates forming in Dunaliella viridis Teod. culture: a primary reaction to stress induced by high copper ion concentration Article published earlier |
| spellingShingle | Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре Божков, А.И. Голтвянский, А.В. Ростама, Ш. Физиология, биохимия, биофизика |
| title | Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре |
| title_alt | Cell aggregates forming in Dunaliella viridis Teod. culture: a primary reaction to stress induced by high copper ion concentration |
| title_full | Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре |
| title_fullStr | Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре |
| title_full_unstemmed | Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре |
| title_short | Индуцированное агрегирование клеток Dunaliella viridis Teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре |
| title_sort | индуцированное агрегирование клеток dunaliella viridis teod. полулетальными концентрациями ионов меди в культуре |
| topic | Физиология, биохимия, биофизика |
| topic_facet | Физиология, биохимия, биофизика |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/29991 |
| work_keys_str_mv | AT božkovai inducirovannoeagregirovaniekletokdunaliellaviridisteodpoluletalʹnymikoncentraciâmiionovmedivkulʹture AT goltvânskiiav inducirovannoeagregirovaniekletokdunaliellaviridisteodpoluletalʹnymikoncentraciâmiionovmedivkulʹture AT rostamaš inducirovannoeagregirovaniekletokdunaliellaviridisteodpoluletalʹnymikoncentraciâmiionovmedivkulʹture AT božkovai cellaggregatesformingindunaliellaviridisteodcultureaprimaryreactiontostressinducedbyhighcopperionconcentration AT goltvânskiiav cellaggregatesformingindunaliellaviridisteodcultureaprimaryreactiontostressinducedbyhighcopperionconcentration AT rostamaš cellaggregatesformingindunaliellaviridisteodcultureaprimaryreactiontostressinducedbyhighcopperionconcentration |