Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках
Изучено состояние нормальных и апоптотических яйцеклеток мышей с помощью метода сканирующей конфокальной лазерной микроскопии. Использование микроскопа Carl Zeiss LSM 510 Meta и предложенного набора метчиков дает возможность выявить отличия в состоянии нормально функционирующих и находящихся в состо...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Международный медицинский журнал |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30583 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках / Н.Г. Грищенко // Международный медицинский журнал. — 2010. — Т. 16, № 3. — С. 63-66. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860118593305313280 |
|---|---|
| author | Грищенко, Н.Г. |
| author_facet | Грищенко, Н.Г. |
| citation_txt | Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках / Н.Г. Грищенко // Международный медицинский журнал. — 2010. — Т. 16, № 3. — С. 63-66. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Международный медицинский журнал |
| description | Изучено состояние нормальных и апоптотических яйцеклеток мышей с помощью метода сканирующей конфокальной лазерной микроскопии. Использование микроскопа Carl Zeiss LSM 510 Meta и предложенного набора метчиков дает возможность выявить отличия в состоянии нормально функционирующих и находящихся в состоянии экспериментального либо спонтанного апоптоза яйцеклеток на ранних стадиях.
Вивчено стан нормальних і апоптотичних яйцеклітин мишей за допомогою метода скануючої конфокальної лазерної мікроскопії. Використання мікроскопу Carl Zeiss LSM 510 Meta і запропонованого набору мітчиків дає можливість виявити відмінності у стані нормально функціонуючих і таких, що перебувають у стані експериментального або спонтанного апоптозу, яйцеклітин на ранніх стадіях.
The state of normal and apoptotic ova of mice was investigated using scanning confocal laser microscopy. The use of Carl Zeiss LSM 510 Meta microscope and the suggested kit of labels allow early revealing the difference in the state of normally functioning and in the state of the ova with experimental or spontaneous apoptosis.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:37:44Z |
| format | Article |
| fulltext |
63© Н. Г. ГРИщЕНКо, 2010
МеЖдУНАРОдНый МедиЦиНСКий ЖУРНАЛ, 2010, № 3
Оплодотворение in vitro (iVf) является ши-
роко распространенной репродуктивной техно-
логией. Причины ее неуспеха часто связывают
с неудовлетворительным качеством яйцеклеток и,
в частности, с процессами апоптоза в них [1–4].
Метод люминесцентной микроскопии с ис-
пользованием зондов, отражающих состояние апоп-
тоза в клетках, известен давно [5]. его техническая
база постоянно развивается, предоставляя исследо-
вателям все более современное и многофункцио-
нальное оборудование. В настоящее время распро-
странение получила лазерная сканирующая кон-
фокальная микроскопия (lsCM — laser scanning
Confocal Microscopy) [6]. благодаря устройству
современных lsCM-микроскопов используется
широкий набор спектральных линий когерентного
освещения и становится возможной параллельная
регистрация флюоресценции с различными дли-
нами волн, одновременно разделяющая сигналы
нескольких флюоресцентных красителей на одном
образце. Метод позволяет визуализировать объект
в объеме, наблюдать процессы непосредственно
внутри клетки. Высокая скорость сканирования
обеспечивает получение данных в динамике по
времени, что важно для регистрации физиологи-
ческих процессов в клетках.
Целью работы было изучение состояния нор-
мальных и апоптотических яйцеклеток мышей
с помощью метода конфокальной сканирующей ла-
зерной микроскопии* для потенциального исполь-
зования в прогнозировании успешности iVf.
было проведено тестирование 150 яйце-
клеток экспериментальных животных (мышей)
* Автор благодарит за помощь: е. и. Смольянинову
и Л. г. Чернышенко — в методических разработках,
е. и. гончарук — в планировании и обсуждении результатов
работы, В. C. Холодного и и. Ф. Коваленко — в работе на
конфокальном микроскопе (институт проблем криобио-
логии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков).
с помощью маркеров апоптоза. исследования про-
водились на ооцитах мышей f1 (Cba × C57bl) на
стадии метафазы ІІ мейоза (Мii), которые были
получены от самок возраста 6–8 нед. изучались
как нормальные яйцеклетки, так и яйцеклетки,
переведенные в состояние апоптоза [7].
для получения яйцеклеток у самок вызывали
суперовуляцию путем внутрибрюшинного введения
гонадотропных гормонов: 5 Ме гонадотропина сы-
воротки жеребых кобыл (гСЖК) (folligon, Нидер-
ланды) и через 48 ч 7,5 Ме хорионического гонадо-
тропина человека (ХгЧ) (сhorulon, Нидерланды).
Ооциты были получены по стандартной ме-
тодике [8]. Самок забивали путем дислокации
шейных позвонков. Нормальные яйцеклетки вы-
деляли через 12–14 ч, апоптотические яйцеклет-
ки — через 18 ч после введения ХгЧ. Ооциты
на стадии Мii мейоза извлекали путем разрыва
ампулы яйцепроводов, предварительно отпре-
парированных в питательной среде дюльбекко
с добавкой 10 %-ной сыворотки эмбрионов коров
(fbs, sigma). для очищения ооцитов от клеток
кумулюса использовали раствор гиалуронидазы
(150 ед./мл) (sigma, Сшa). Выделенные ооциты
трижды отмывали в фосфатно-буферной среде
дюльбекко (sigma) с 10 %-ным содержанием fbs.
У полученных ооцитов прижизненно оценивалась
морфология, а также учитывались состояние ци-
топлазмы (прозрачность и плотность) и периви-
теллинового пространства, наличие первого по-
лярного тельца.
Эксперименты проводились по регламен-
ту, который разработан в соответствии с Общи-
ми принципами экспериментов на животных,
одобренными І Национальным конгрессом по
биоэтике (Киев, Украина, 2001 г.), и согласован
с положениями европейской конвенции защиты
позвоночных животных, которые используются
для экспериментальных и других научных целей
(Страсбург, Франция, 1985 г.).
УДК 618.177-089.888.11:618.112-091.8-076
возМожности конфокальной сканирующей
лазерной МикроскоПии ПриМенительно к оценке
Процессов аПоПтоза в яйцеклетках
доц. Н. г. гРищеНКО
Харьковский национальный медицинский университет
изучено состояние нормальных и апоптотических яйцеклеток мышей с помощью метода скани-
рующей конфокальной лазерной микроскопии. использование микроскопа carl zeiss lsm 510
meta и предложенного набора метчиков дает возможность выявить отличия в состоянии нормально
функционирующих и находящихся в состоянии экспериментального либо спонтанного апоптоза
яйцеклеток на ранних стадиях.
Ключевые слова: оплодотворение in vitro, яйцеклетка, апоптоз, конфокальная сканирующая лазерная
микроскопия.
64
АКУшеРСТВО и гиНеКОЛОгия
использовали следующие красители: JC-1,
JC-9 (Molecular probes), pi (sigma), АО (sigma),
hoechst 33342 (sigma-aldrich), dapi (sigma),
CfsE (sigma-aldrich), annCy3/6-Cfda (sigma-
aldrich).
данный набор люминесцентных зондов позво-
лил оценить жизнеспособность клеток, изменения
функционального состояния митохондрий, нару-
шения структуры хроматина, выявить проницае-
мость мембран. Все красители добавляли в среду
в конечной концентрации 10–5M/л.
Окрашивание проводилось по стандартной для
каждого зонда методике. Оценивали люминесцен-
цию с помощью конфокального лазерного скани-
рующего микроскопа Сarl zeiss lsM 510 Meta, све-
чение образцов зависело от длины волн (табл. 1).
использование лазерного сканирующего кон-
фокального микроскопа благодаря его высоко-
му разрешению и контрасту позволило изучить
структуры клеток и их органелл, а также одно-
временно разделять сигналы нескольких флюо-
ресцентных красителей на одном образце внутри
яйцеклетки (рис. 1).
Компьютерная запись серий оптических сре-
зов позволила наблюдать окрашивание зондами
в объеме яйцеклетки, не используя трудоемкую
методику изготовления и фотографирования се-
рийных гистологических срезов (рис. 2).
Отчетливо просматривалось взаимное про-
странственное расположение структур и органелл
клетки.
исследованные яйцеклетки мышей характе-
ризовались средним размером 70±10 мкм и ха-
рактерной морфологией. Нормальные клетки
были округлой формы, имели прозрачную цито-
плазму средней плотности, одно полярное тельце.
Они равномерно окрашивались CfsE, что сви-
детельствовало об их жизнеспособности. Нор-
мальные ооциты, маркированные JC-1 и JC-9,
характеризовались свечением преимущественно
в оранжевой области спектра, что указывало на
высокую активность митохондрий. hoechst 33342
и dapi окрашивали ядерный материал в синий
цвет, позволяя оценить его морфологические ха-
рактеристики. ядерный материал акридин оранж
(АО) в красный цвет не прокрашивался.
яйцеклетки, находящиеся в состоянии апоп-
тоза, на ранних стадиях были округлой, но слег-
ка неправильной формы, имели прозрачную ци-
топлазму средней плотности, характеризовались
средним размером 70±10 мкм, на стадии конденса-
ции — размером 50±10 мкм, неправильной формы,
часто вогнутой с краю, с цитоплазмой повышенной
плотности. На стадии фрагментации происходил
распад яйцеклетки на отдельные фрагменты.
Cледует отметить, что все клетки дали поло-
жительный ответ на окрашивание прижизненным
красителем CfsE, что свидетельствует об отсут-
ствии мертвых клеток среди исследованных. Этот
краситель, переходя во флюоресцирующую форму
при наличии эстеразной активности в клетке, по-
зволял оценивать жизнеспособность яйцеклетки
на момент окрашивания. Маркируя содержимое
живых клеток, он также дал возможность опре-
делить морфологию ооцита (рис. 3).
было проведено исследование нормальных
и апоптотических яйцеклеток с помощью карбо-
цианиновых зондов JC-1 и JC-9. являясь сходны-
ми, но несколько отличаясь по динамике реагиро-
вания и критическому потенциалу, эти красители
характеризовали состояние потенциала мембран
митохондрий. Окрашивание показало, что значение
отношения оранжевого/зеленого свечения в апоп-
тотических клетках по сравнению с нормальными
падает. Таким образом, происходит уменьшение
количества J-агрегатов, что отображает снижение
энергетического статуса апоптотических клеток
(рис. 4, 5).
Таблица 1
длины волн возбуждения/испускания флюоресцентных красителей
Зонд Возбуждение, нм Испускание, нм
Пропидий йодид (PI) 536 623
АО, комплекс с NA 480 520
АО, комплекс с RNA 440–470 650
Xехст 33342 (Hoechst 33342) 340 450
DAPI (4'6-диамидино-2-фенилиндол-цигидрохлорид) 358 461
CFSE 495 (492) 519 (517)
JC-1 520
Мономерная форма 530±15
J-агрегаты в митохондриях
590±7,5
JC-9 520
Мономерная форма 530±15
J-агрегаты в митохондриях
590–635
AnnCy3/6-CFDA 543
494
max 570
518
65
АКУшеРСТВО и гиНеКОЛОгия
Процессы апоптоза в классическом представле-
нии сопровождаются характерными изменениями
морфологии ядра клетки, отражающими последо-
вательно происходящие процессы кариопикноза,
кариорексиса и кариолизиса.
Флюоресцентные красители dapi и hoechst
33342 прокрашивали ядерный материал как нор-
мальных клеток, так и апоптотических, позво-
ляя оценить его морфологию (рис. 6, 7). Так, на
рис. 6 (3) четко определяется пронуклеус (iii),
находящийся в стадии кариолизиса.
Наличие разрывов дНК при отсутствии яркой
морфологической картины может помочь в объ-
яснении снижения способности к оплодотворению
ооцитов с визуально неизмененной морфологией,
оцененной при световой микроскопии. Образую-
щиеся одно- и двунитевые разрывы, выявляемые
при окрашивании АО, позволяют констатировать
наличие характерных для апоптоза изменений еще
до появления морфологических признаков в виде
распада ядра на фрагменты и появления апоп-
тотических телец. Окрашивание в красный цвет
АО пронуклеусов изученных с помощью этого
красителя клеток указывало на наличие однони-
тевых и двунитевых разрывов дНК (рис. 8 б, в).
В нормальной яйцеклетке отсутствует свечение
пронуклеуса в красной области (рис. 8 а).
С помощью флюоресцентного красителя pi —
пропидиума йодида — определялась целостность
мембран яйцеклеток, так как известно, что он про-
никает только через поврежденные клеточные мем-
браны и окрашивает ядерный материал (рис. 9).
С помощью двойной метки — annexin
V-Cy3.18 (annCy3) и 6-сarboxyfluorescein diacetate
(6-Cfda) — можно было различить живые нор-
мальные, апоптотические и некротические клетки.
Жизнеспособные нормальные клетки окра-
шивались только 6-Cfda в зеленый цвет. Среди
исследованных яйцеклеток не обнаружены некро-
тические, которые должны были окрашиваться
annCy3 в желтый цвет. Апоптотические клетки
маркировались обоими красителями (рис. 10).
В результате проведенных исследований вы-
яснилось, что апоптотические яйцеклетки харак-
теризовались следующим набором признаков: зна-
чение отношения оранжевого/зеленого свечения
по сравнению с нормальными падало (JC-1, JC-9)
даже на ранних стадиях, когда форма еще не изме-
нялась; окрашивание в красный цвет пронуклеусов
ооцитов АО указывало на наличие однонитевых
и двунитевых разрывов дНК; ядерный материал
у клеток с поврежденными мембранами окраши-
вался pi; морфология ядер претерпевала характер-
ные изменения, что четко выявлялось с помощью
зондов dapi и hoehst 33342. Форма апоптотиче-
ских клеток на ранних стадиях не отличалась от
нормальной, а на поздних ее изменения были вы-
явлены с помощью CfsE. Апоптотические клетки
окрашивались двойной меткой annCy3/6-Cfda
в зеленый и желтый цвета.
Таким образом, яйцеклетки мышей, введен-
ные в состояние экспериментального апоптоза,
имели характеристики, типичные для его стадий
(от начальной до развернутой). Выбранный на-
бор красителей позволил охарактеризовать мор-
фофункциональное состояние клетки, а именно:
жизнеспособность, форму, активность энергети-
ческой системы, состояние ядерного материала.
На основании проведенных экспериментов можно
сделать вывод о том, что при использовании ска-
нирующего конфокального микроскопа Carl zeiss
lsM 510 Meta и примененного набора метчиков
представляется возможным выявить отличия яй-
цеклеток, находящихся в состоянии нормального
функционирования и экспериментального либо
спонтанного апоптоза.
Обнаружение процессов апоптоза в ооцитах на
ранних этапах, когда еще отсутствуют морфологи-
ческие критерии, позволит диагностировать пато-
логическое состояние ооцитов при минимальных
изменениях и прогнозировать результаты эмбрио-
логического этапа iVf. Наличие же выраженных
признаков апоптоза в неоплодотворенных ооцитах
может быть ценной информацией с точки зрения
объяснения причин отсутствия оплодотворения
в программе iVf.
Следует отметить, что в последние годы боль-
шой интерес практиков вызывает проблема се-
лекции эмбрионов для переноса в полость матки
с целью минимизации их количества и снижения
риска многоплодия в результате iVf. Оценка про-
цессов апоптоза в неоплодотворенных ооцитах
и заблокировавшихся эмбрионах, а также экс-
периментальные исследования на модели в пер-
спективе дадут возможность определить новые
неморфологические критерии оценки жизнеспо-
собности, метаболизма, а следовательно, качества
яйцеклетки и эмбриона.
Л и т е р а т у р а
Antczak M., Van Blerkom J. 1. temporal and spatial aspects
of fragmentation in early human embryos: possible ef-
fects on developmental competence and association with
the differential elimination of regulatory proteins from
polarized domains // hum. reprod.— 1999.— Vol. 14
(2).— p. 429–447.
apoptosis in the pre-implantation embryo / r. levy, 2.
M. benchaib, h. Cordonier, J. f. guerin // Contracept.
fertil. sex.— 1998.— Vol. 26 (7–8).— p. 536–541.
hyperglycemia induces apoptosis in pre-implantation 3.
embryos through cell death effector pathways /
K. h. Moley, M. M. Chi, C. M. Knudson et al. // nat.
Med.— 1998.— Vol. 4 (12).— p. 1421–1424.
Expression of 11 members of the bCl-2 family of 4.
apoptosis regulatory molecules during human preim-
plantation embryo development and fragmentation /
a. d. Metcalfe, h. r. hunter, d. J. bloor et al. // Mol.
reprod. dev.— 2004.— Vol. 68 (1).— p. 35–50.
66
АКУшеРСТВО и гиНеКОЛОгия
Владимиров Ю. А., Добрецов Г. Е. 5. Флюоресцентные
зонды в исследованиях биологических мембран.— М.:
Наука, 1980.— 320 с.
Methods in cell biology. Vol. 70. Cell biological ap-6.
plications of confocal microscopy.— 2-nd ed. / Ed.
b. Matsumoto.— n. y.: acad. press, 2002.— 507 p.
Takase K., Ishikawa M., Hoshiai H. 7. apoptosis in the
degeneration process of ufertilized mouse ova // tohoku
J. Exp. Med.— 1995.— Vol. 175.— p. 69–76.
биология развития млекопитающих. Методы / Под 8.
ред. М. Манк.— М.: Мир, 1990. — 406 с.
Можливості конфокальної скануючої лазерної МікроскоПії
щодо оцінки Процесів аПоПтозу в яйцеклітинах
М. г. гРищеНКО
вивчено стан нормальних і апоптотичних яйцеклітин мишей за допомогою метода скануючої
конфокальної лазерної мікроскопії. використання мікроскопу carl zeiss lsm 510 meta і запропо-
нованого набору мітчиків дає можливість виявити відмінності у стані нормально функціонуючих
і таких, що перебувають у стані експериментального або спонтанного апоптозу, яйцеклітин на
ранніх стадіях.
Ключові слова: запліднення in vitro, яйцеклітина, апоптоз, конфокальна скануюча лазерна мікро
скопія.
caPabilities of confocal scanning laser microscoPy
in assessment of aPoPtosis Processes in ova
n. g. grisChEnKo
the state of normal and apoptotic ova of mice was investigated using scanning confocal laser microscopy.
the use of carl zeiss lsm 510 meta microscope and the suggested kit of labels allow early revealing
the difference in the state of normally functioning and in the state of the ova with experimental or
spontaneous apoptosis.
Key words: in vitro fertilization, ovum, apoptosis, confocal scanning laser microscopy.
Поступила 19.05.2010
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-30583 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | XXXX-0090 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:37:44Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Грищенко, Н.Г. 2012-02-08T17:31:00Z 2012-02-08T17:31:00Z 2010 Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках / Н.Г. Грищенко // Международный медицинский журнал. — 2010. — Т. 16, № 3. — С. 63-66. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. XXXX-0090 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30583 618.177-089.888.11:618.112-091.8-076 Изучено состояние нормальных и апоптотических яйцеклеток мышей с помощью метода сканирующей конфокальной лазерной микроскопии. Использование микроскопа Carl Zeiss LSM 510 Meta и предложенного набора метчиков дает возможность выявить отличия в состоянии нормально функционирующих и находящихся в состоянии экспериментального либо спонтанного апоптоза яйцеклеток на ранних стадиях. Вивчено стан нормальних і апоптотичних яйцеклітин мишей за допомогою метода скануючої конфокальної лазерної мікроскопії. Використання мікроскопу Carl Zeiss LSM 510 Meta і запропонованого набору мітчиків дає можливість виявити відмінності у стані нормально функціонуючих і таких, що перебувають у стані експериментального або спонтанного апоптозу, яйцеклітин на ранніх стадіях. The state of normal and apoptotic ova of mice was investigated using scanning confocal laser microscopy. The use of Carl Zeiss LSM 510 Meta microscope and the suggested kit of labels allow early revealing the difference in the state of normally functioning and in the state of the ova with experimental or spontaneous apoptosis. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Международный медицинский журнал Акушерство и гинекология Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках Можливості конфокальної скануючої лазерної мікроскопії щодо оцінки процесів апоптозу в яйцеклітинах Capabilities of confocal scanning laser microscopy in assessment of apoptosis processes in ova Article published earlier |
| spellingShingle | Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках Грищенко, Н.Г. Акушерство и гинекология |
| title | Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках |
| title_alt | Можливості конфокальної скануючої лазерної мікроскопії щодо оцінки процесів апоптозу в яйцеклітинах Capabilities of confocal scanning laser microscopy in assessment of apoptosis processes in ova |
| title_full | Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках |
| title_fullStr | Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках |
| title_full_unstemmed | Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках |
| title_short | Возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках |
| title_sort | возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии применительно к оценке процессов апоптоза в яйцеклетках |
| topic | Акушерство и гинекология |
| topic_facet | Акушерство и гинекология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30583 |
| work_keys_str_mv | AT griŝenkong vozmožnostikonfokalʹnoiskaniruûŝeilazernoimikroskopiiprimenitelʹnokocenkeprocessovapoptozavâicekletkah AT griŝenkong možlivostíkonfokalʹnoískanuûčoílazernoímíkroskopííŝodoocínkiprocesívapoptozuvâiceklítinah AT griŝenkong capabilitiesofconfocalscanninglasermicroscopyinassessmentofapoptosisprocessesinova |