Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека
Исследован гемолиз эритроцитов человека в средах, содержащих NaCl и сахарозу разной молярности, под воздействием неионных (Твин-20 – полиоксиэтиленсорбитан монолаурат; Тритон Х-100 – октилфенол полиэтиленгликоль) и ионных (ЦТАБ – цетилтриметиламмонийбромид; ДСН – додецил-сульфат натрия) детергенто...
Saved in:
| Date: | 2009 |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2009
|
| Series: | Проблемы криобиологии |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30697 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека / К.В. Маркова, В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 3. — С. 243-253. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-30697 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-306972025-02-09T14:47:56Z Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека Osmotic effect on human erythrocyte detergent lysis Маркова, К.В. Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология Исследован гемолиз эритроцитов человека в средах, содержащих NaCl и сахарозу разной молярности, под воздействием неионных (Твин-20 – полиоксиэтиленсорбитан монолаурат; Тритон Х-100 – октилфенол полиэтиленгликоль) и ионных (ЦТАБ – цетилтриметиламмонийбромид; ДСН – додецил-сульфат натрия) детергентов различной концентрации. Изучено действие данных детергентов на лизис клеток в присутствии модификатора агрегатного состояния белка полосы 3 – ДИДС (4,4- диизотиоцианостильбен 2,2-дисульфонат динатриевая соль). Процент гемолиза эритроцитов увеличивается при повышении концентрации детергентов в растворе. В исследуемых растворах характер развития гемолиза одинаков в присутствии всех детергентов. В растворе с 0,15М NaCl; 0,5М сахарозы; 20мМ Трис (рН 7,4) установлена наибольшая сохранность клеток в присутствии всех указанных детергентов. Модификатор ДИДС в среде усиливает гемолиз в клетках, хотя не изменяет тенденцию его развития в средах, содержащих NaCl и сахарозу, в присутствии неионных и ионных детергентов. Установлено, что среда, содержащая 0,15 М NaCl и 0,5М сахарозы, обеспечивает устойчивость эритроцитов к детергентам. Интенсивность такого защитного действия и усиливающего гемолиз действия ДИДС зависит от вида детергента. Досліджено гемоліз еритроцитів людини в розчинах , які містять NaCl та сахарозу (різної молярності), під впливом неіонних (Твін-20 – поліоксиетиленсорбітан монолаурат; Тритон Х-100 – октилфенол поліетиленгліколь) та іонних (ЦТАБ – цетилтриметиламонійбромід; ДСН – додецил-сульфат натрію) детергентів з різною концентрацією. Вивчена дія цих детергентів на лізис клітин у присутності модифікатора агрегатного стану білка смуги 3 – ДІДС (4,4-діїзотіоціаностилбен 2,2-дисульфонат динатрієва сіль). Відсоток гемолізу еритроцитів збільшується при підвищенні концентрації детергентів у розчині. В досліджених розчинах характер розвитку гемолізу всіх детергентів однаковий. У розчині 0,15M NaCl; 0,5M сахарози; 20 мМ Трис (рН 7,4) виявлена найбільша збереженість клітин у присутності вказаних детергентів. Модифікатор ДІДС у середовищі підсилює гемоліз у клітинах, хоча не змінює тенденцію його розвитку в середовищах, що містять NaCl та сахарозу, в присутності неіонних та іонних детергентів. Встановлено, що розчин, який містить 0,15 М NaCl і 0,5М сахарози, забезпечує стійкість еритроцитів до детергентів. Інтенсивність захисної дії та підсилюючої гемоліз дії ДІДС залежить від виду детергенту. There was studied the human erythrocyte hemolysis in the media, containing NaCl and sucrose of different molarity under the effect of non-ionic detergents (Tween 20: polyoxyethylene sorbitan monolaurate; Triton X-100: octylphenol polyethylene glycol) and ionic ones (CTAB: cetyl trimethyl ammonium bromide; SDS: sodium dodecyl sulphate) of various concentrations. Their effect on cell lysis in the presence of aggregate state modifier of band 3 protein: DIDS (4,4-diisothiocyanostilbene-2,2-disulfonic acid) was studied. The percentage of erythrocyte hemolysis increases when augmenting detergent concentration in solution. In the solution with 0.15 M NaCl; 0.5 M sucrose; 20 mM Tris (pH 7.4) we fixed the highest cell integrity in the presence of all mentioned detergents. DIDS modifier in the medium strengthens hemolysis in cells, although does not change the tendency of its development in NaCl and sucrosecontaining media in the presence of ionic and non-ionic detergents. The medium, containing 0.15 M NaCl and 0.5 M sucrose was established to provide the erythrocyte resistance to detergents. The intensity of such a protective effect and hemolysis strengthening DIDS effect depends on a detergent type. 2009 Article Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека / К.В. Маркова, В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 3. — С. 243-253. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30697 612.111.118.221.3:547.42 ru Проблемы криобиологии application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Маркова, К.В. Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека Проблемы криобиологии |
| description |
Исследован гемолиз эритроцитов человека в средах, содержащих NaCl и сахарозу разной молярности, под воздействием
неионных (Твин-20 – полиоксиэтиленсорбитан монолаурат; Тритон Х-100 – октилфенол полиэтиленгликоль) и ионных (ЦТАБ –
цетилтриметиламмонийбромид; ДСН – додецил-сульфат натрия) детергентов различной концентрации. Изучено действие
данных детергентов на лизис клеток в присутствии модификатора агрегатного состояния белка полосы 3 – ДИДС (4,4-
диизотиоцианостильбен 2,2-дисульфонат динатриевая соль). Процент гемолиза эритроцитов увеличивается при повышении
концентрации детергентов в растворе. В исследуемых растворах характер развития гемолиза одинаков в присутствии всех
детергентов. В растворе с 0,15М NaCl; 0,5М сахарозы; 20мМ Трис (рН 7,4) установлена наибольшая сохранность клеток в
присутствии всех указанных детергентов. Модификатор ДИДС в среде усиливает гемолиз в клетках, хотя не изменяет тенденцию
его развития в средах, содержащих NaCl и сахарозу, в присутствии неионных и ионных детергентов. Установлено, что среда, содержащая 0,15 М NaCl и 0,5М сахарозы, обеспечивает устойчивость эритроцитов к детергентам. Интенсивность такого
защитного действия и усиливающего гемолиз действия ДИДС зависит от вида детергента. |
| format |
Article |
| author |
Маркова, К.В. Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. |
| author_facet |
Маркова, К.В. Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. |
| author_sort |
Маркова, К.В. |
| title |
Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека |
| title_short |
Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека |
| title_full |
Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека |
| title_fullStr |
Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека |
| title_full_unstemmed |
Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека |
| title_sort |
влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2009 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30697 |
| citation_txt |
Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис эритроцитов человека / К.В. Маркова, В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 3. — С. 243-253. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии |
| work_keys_str_mv |
AT markovakv vliânieosmotičeskogovozdejstviânadetergentnyjliziséritrocitovčeloveka AT ramazanovvv vliânieosmotičeskogovozdejstviânadetergentnyjliziséritrocitovčeloveka AT bondarenkova vliânieosmotičeskogovozdejstviânadetergentnyjliziséritrocitovčeloveka AT markovakv osmoticeffectonhumanerythrocytedetergentlysis AT ramazanovvv osmoticeffectonhumanerythrocytedetergentlysis AT bondarenkova osmoticeffectonhumanerythrocytedetergentlysis |
| first_indexed |
2025-11-27T01:01:37Z |
| last_indexed |
2025-11-27T01:01:37Z |
| _version_ |
1849903338628317184 |
| fulltext |
243 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
УДК 612.111.118.221.3:547.42
К.В. МАРКОВА1, В.В. РАМАЗАНОВ2, В.А. БОНДАРЕНКО2*
Влияние осмотического воздействия на детергентный лизис
эритроцитов человека
UDC 612.111.118.221.3:547.42
K.V. MARKOVA1, V.V. RAMAZANOV2, V.A. BONDARENKO2*
Osmotic Effect on Human Erythrocyte Detergent Lysis
Исследован гемолиз эритроцитов человека в средах, содержащих NaCl и сахарозу разной молярности, под воздействием
неионных (Твин-20 – полиоксиэтиленсорбитан монолаурат; Тритон Х-100 – октилфенол полиэтиленгликоль) и ионных (ЦТАБ –
цетилтриметиламмонийбромид; ДСН – додецил-сульфат натрия) детергентов различной концентрации. Изучено действие
данных детергентов на лизис клеток в присутствии модификатора агрегатного состояния белка полосы 3 – ДИДС (4,4-
диизотиоцианостильбен 2,2-дисульфонат динатриевая соль). Процент гемолиза эритроцитов увеличивается при повышении
концентрации детергентов в растворе. В исследуемых растворах характер развития гемолиза одинаков в присутствии всех
детергентов. В растворе с 0,15М NaCl; 0,5М сахарозы; 20мМ Трис (рН 7,4) установлена наибольшая сохранность клеток в
присутствии всех указанных детергентов. Модификатор ДИДС в среде усиливает гемолиз в клетках, хотя не изменяет тенденцию
его развития в средах, содержащих NaCl и сахарозу, в присутствии неионных и ионных детергентов. Установлено, что среда,
содержащая 0,15 М NaCl и 0,5М сахарозы, обеспечивает устойчивость эритроцитов к детергентам. Интенсивность такого
защитного действия и усиливающего гемолиз действия ДИДС зависит от вида детергента.
Ключевые слова: эритроциты, гемолиз, детергенты, осмотический фактор.
Досліджено гемоліз еритроцитів людини в розчинах , які містять NaCl та сахарозу (різної молярності), під впливом
неіонних (Твін-20 – поліоксиетиленсорбітан монолаурат; Тритон Х-100 – октилфенол поліетиленгліколь) та іонних (ЦТАБ –
цетилтриметиламонійбромід; ДСН – додецил-сульфат натрію) детергентів з різною концентрацією. Вивчена дія цих детергентів
на лізис клітин у присутності модифікатора агрегатного стану білка смуги 3 – ДІДС (4,4-діїзотіоціаностилбен 2,2-дисульфонат
динатрієва сіль). Відсоток гемолізу еритроцитів збільшується при підвищенні концентрації детергентів у розчині. В досліджених
розчинах характер розвитку гемолізу всіх детергентів однаковий. У розчині 0,15M NaCl; 0,5M сахарози; 20 мМ Трис (рН 7,4)
виявлена найбільша збереженість клітин у присутності вказаних детергентів. Модифікатор ДІДС у середовищі підсилює
гемоліз у клітинах, хоча не змінює тенденцію його розвитку в середовищах, що містять NaCl та сахарозу, в присутності
неіонних та іонних детергентів. Встановлено, що розчин, який містить 0,15 М NaCl і 0,5М сахарози, забезпечує стійкість
еритроцитів до детергентів. Інтенсивність захисної дії та підсилюючої гемоліз дії ДІДС залежить від виду детергенту.
Ключові слова: еритроцити, гемоліз, детергенти, осмотичний фактор.
There was studied the human erythrocyte hemolysis in the media, containing NaCl and sucrose of different molarity under the
effect of non-ionic detergents (Tween 20: polyoxyethylene sorbitan monolaurate; Triton X-100: octylphenol polyethylene glycol) and
ionic ones (CTAB: cetyl trimethyl ammonium bromide; SDS: sodium dodecyl sulphate) of various concentrations. Their effect on cell
lysis in the presence of aggregate state modifier of band 3 protein: DIDS (4,4-diisothiocyanostilbene-2,2-disulfonic acid) was studied.
The percentage of erythrocyte hemolysis increases when augmenting detergent concentration in solution. In the solution with 0.15 M
NaCl; 0.5 M sucrose; 20 mM Tris (pH 7.4) we fixed the highest cell integrity in the presence of all mentioned detergents. DIDS
modifier in the medium strengthens hemolysis in cells, although does not change the tendency of its development in NaCl and sucrose-
containing media in the presence of ionic and non-ionic detergents. The medium, containing 0.15 M NaCl and 0.5 M sucrose was
established to provide the erythrocyte resistance to detergents. The intensity of such a protective effect and hemolysis strengthening
DIDS effect depends on a detergent type.
Key-words: erythrocytes, hemolysis, detergents, osmotic factor.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-41-35, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 4135, fax: +380 57
373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
1V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, Ukraine
2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
1Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина
2Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
Известно, что при лизисе эритроцитов, вызван-
ном детергентами, разрушается липидный бислой
мембраны [4]. Детергенты способны связываться
с мембранным белком гидрофобными связями,
одновременно взаимодействуя полярными груп-
There is known that under erythrocyte lysis, caused
by detergents, the disorder in lipid bilayer of membrane
occurs [4]. Detergents are capable to bind with a
membrane protein via hydrophobic bonds, by polar
group simultaneous interaction with water [4]. A
ÒÅÎÐÅÒÈ×ÅÑÊÀß
È ÝÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜÍÀß
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈß
THEORETICAL
AND EXPERIMENTAL
CRYOBIOLOGY
244 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
пами с водой [4]. Установлено существенное раз-
личие действия на мембрану ионных и неионных
детергентов. В работе мы использовали детер-
генты: ионные (цетилтриметиламмонийбромид –
ЦТАБ; додецилсульфат натрия – ДСН) и неионные
(полиоксиэтиленсорбитан монолаурат – Твин-20;
октилфенол полиэтиленгликоль – Тритон Х-100;).
Установлено, что Твин-20 и Тритон Х-100 солюби-
лизируют меньшее количество белков из мемб-
раны, чем ДСН [15], ЦТАБ в отличие от ДСН
денатурирует белки, образуя с ними отрицательно
заряженные комплексы [10].
В настоящее время существует большое коли-
чество теорий воздействия детергентов, однако
механизм повреждения мембраны детергентами
полностью не изучен. При осмотическом гемолизе
изменяется структура белка полосы 3, который
формирует канал анионного транспорта и является
главным интегральным белком, так как в эритроци-
тарной мембране он составляет примерно половину
от общего содержания интегральных белков [9].
Белок полосы 3 высокоструктурирован, много-
кратно пронизывает эритроцитарную мембрану и
существует в димерной и тетрамерной формах [9].
При связывании с ДИДС диссоциация тетрамеров
на димеры приводит к увеличению площади
гидрофобного контакта белка полосы 3 с липидами,
что не влияет на деформацию и стабильность
мембраны [18].
В связи с этим представляло интерес исследо-
вать влияние осмотического воздействия и моди-
фикации гидрофобных взаимодействий белка
полосы 3 в мембране на гемолитическое действие
ионных и неионных детергентов в средах, содер-
жащих NaCl и сахарозу.
Цель работы – исследование влияния осмоти-
ческого воздействия и модификатора белка поло-
сы 3 ДИДС на чувствительность эритроцитов к
действию ионных и неионных детергентов в средах,
содержащих NaCl и сахарозу.
Материалы и методы
Эритроциты получали из свежеконсервирован-
ной донорской крови человека, которая была заго-
товлена на глюгицировом консерванте и доставле-
на из областной станции переливания крови г. Харь-
кова. С целью унификации объекта использовали
кровь мужчин II группы. После удаления плазмы
эритромассу трижды отмывали путем центрифу-
гирования при 3000 об/мин в течение 3 мин в
10-кратном объеме физиологического раствора
(0,15 моль/л NaCl; 0,02 моль/л Трис-буфер, pH 7,4).
Лейкоцитарную пленку и супернатант удаляли
аспирацией. Эритроциты в виде плотного осадка
хранили при 4°С и использовали в течение 2 ч.
В работе применяли NaCl (х. ч.), сахарозу
(ч. д.а.), ДИДС (Sigma), детергенты: ЦТАБ
considerable difference in the effect on a membrane
of ionic and non-ionic detergents was established. In
the research we used the following detergents: ionic
(cetyltrimethyl ammonium bromide – CTAB; sodium
dodecyl sulphate – SDS) and non-ionic ones (polyoxy-
ethylene sorbitan monolaurate – Tween 20; octyl phe-
nol polyethylene glycol – Triton X-100). Tween 20 and
Triton X-100 were established to solubilise less number
of proteins from a membrane than SDS [15], CTAB
in contrast to SDS denatures proteins by forming with
them negatively charged complexes [10].
Nowadays there is a huge number of theories about
detergent effect, but the mechanisms of membrane
damage by detergents is not completely studied. Under
osmotic hemolysis there is a change in the structure of
band 3 protein, forming anion transport channel and
being the main integral protein, since in erythrocyte
membrane it makes about a half of total content of
integral proteins [9]. Being highly structured, the band
3 protein penetrates in a manifold way the erythrocyte
membrane and exists in dimer and tetramer forms [9].
When binding with DIDS the tetramer dissociation into
dimers results in an increase of hydrophobic contract
area of band 3 protein with lipids, that does not affect
membrane deformation and stability [18].
Due to this fact of interest was to study the influence
of osmotic effect and modification of hydrophobic
interactions of band 3 protein in membrane on hemo-
lytic action of ionic and non-ionic detergents in the
media, containing NaCl and sucrose.
The research aim is to study the effect of osmotic
influence and modifier of band 3 protein, DIDS, on
erythrocyte sensibility to the action of ionic and non-
ionic detergents in the media, containing NaCl and sucrose.
Materials and methods
Erythrocytes were derived from freshly preserved
human donor blood, prepared with Glugicir preservative
and delivered from the Kharkov Regional Hemotrans-
fusion Station. Male group A blood was used for unifi-
cation of the experiments. After plasm removal the
erythromass was thrice washed with centrifugation at
3,000 rpm during 3 min in 10-fold volume of physio-
logical solution (0.15 mol/l NaCl; 0.02 mol/l Tris buffer,
pH 7.4). Buffy coat layer and supernatant were remo-
ved by aspiration. Erythrocytes in the form of dense
sediment were stored at 4°C and used within 2 hrs.
In the research we used NaCl (chemically pure),
sucrose (pure for analysis), DIDS (Sigma), detergents:
CTAB (Sigma); SDS (Sigma); Triton X-100 (Serva);
Tween 20 (Ferak).
Detergent lysis was carried-out at 22±1°C within
10 min. Cell concentration in experimental media was
0.35% in 1 ml suspension volume. The rest cells were
precipitated by centrifugation within 3 min at 3,000 rpm.
DIDS solution was prepared with distilled water in
2 mmol/l concentration and added into an experimental
245 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
(Sigma); ДСН (Sigma); Тритон Х-100 (Serva);
Твин-20 (Ferak).
Детергентный лизис проводили при темпера-
туре 22±1°С в течение 10 мин. Концентрация кле-
ток в экспериментальных средах составляла 0,35%
в объёме суспензии 1мл. Оставшиеся клетки
осаждали центрифугированием в течение 3 мин при
3000 об/мин.
Раствор ДИДС готовили на дистиллированной
воде в концентрации 2 мМ/л и добавляли в экспе-
риментальную среду за 2 мин до внесения детер-
гентов с конечной концентрацией 20 мкМ/л.
В работе использовали комбинированные среды
с 0,15 М NaCl и сахарозой разной концентрации (0;
0,3; 0,5; 0,7; 0,9 М), приготовленные на 20 мМ Трис-
буфера, рН 7,4. Перед добавлением ДИДС и детер-
гентов эритроциты инкубировали в средах в тече-
ние 2 мин.
После проведения детергентного лизиса клетки
осаждали центрифугированием. Процент гемолиза
эритроцитов определяли по содержанию гемогло-
бина в надосадочной жидкости спектрофотомет-
рическим методом (λ = 543 нм). Выход гемоглоби-
на из клеток рассчитывали в процентах по отноше-
нию к 100%-му гемолизу эритроцитов в присутст-
вии Тритон Х-100 (0,1 %) по формуле: [A1/A2]×100,
где А1 – оптическая плотность надосадочной жид-
кости экспериментального образца; А2 – оптичес-
кая плотность при полном гемолизе эксперимен-
тального образца.
Среднее значение рассчитывали с учетом ре-
зультатов, полученных на эритроцитах от пяти до-
норов ± стандартная ошибка. Для определения
статистической достоверности результатов исполь-
зовали t-критерий Стьюдента при Р<0,05.
Результаты и обсуждение
Исследовано влияние осмотического фактора
на детергентный лизис эритроцитов в средах, со-
держащих NaCl и сахарозу. На рис. 1 представлены
кривые гемолиза эритроцитов человека под воз-
действием ионных и неионных детергентов. В ре-
зультате исследования лизиса эритроцитов под
воздействием детергентов установлено, что при
повышении в растворе концентрации последних пов-
реждаемость клеток возрастает, а характер разви-
вающегося процесса сходен в средах с различным
содержанием детергентов. Наибольшая сохран-
ность клеток при воздействии всех использованных
в работе детергентов наблюдается в растворе, со-
держащем 0,15 M NaCl; 0,5 M сахарозы, 20 мМ
Трис рН 7,4. Данная среда является оптимальной
для эритроцитов, поскольку оказывает на них про-
тектирующее действие при детергентном лизисе.
Анализируя гемолиз эритроцитов под действием
ЦТАБ (рис. 1, а), можно заметить, что при уве-
medium 2 min prior to detergent introduction with
20 µmol/l final concentration.
In the research we used the combined media with
0.15 M NaCl and sucrose with different concentrations
(0; 0.3; 0.5; 0.7; 0.9 M), prepared with 20 mM Tris-
buffer, pH 7.4. Before adding DIDS and detergents
the erythrocytes were incubated in media during 2 min.
After performing detergent lysis the cells were
precipitated by centrifugation. Percentage of erythro-
cyte hemolysis was spectrophotometrically (λ = 543 nm)
determined by hemoglobin content in supernatant.
Hemoglobin release out of cells was calculated in
percentage in respect to 100% erythrocyte hemolysis
in Triton X-100 presence by the following formula: [A1/
A2]×100, where A1 is optical density of experimental
sample’s supernatant; A2 is optical density under a
complete hemolysis of experimental sample.
The mean value was calculated considering the
results, obtained with erythrocytes from 5 donors ± the
standard error. To determine statistical significance of
the results there was used the Student’s t-criterion at
P<0.05.
Results and discussion
There was investigated the effect of osmotic factor
on detergent lysis of erythrocytes in the media,
containing NaCl and sucrose. Fig. 1 shows hemolysis
curves of human erythrocytes under the effect of ionic
and non-ionic detergents. As a result of studying the
erythrocyte lysis under detergent effect there was
established that with increasing concentration of the
latter in solution, the cell damage augments, and a
character of developing process is similar with that in
the media with different content of detergents. The
highest cell integrity under the effect of all detergents,
used in the research, is observed in the solution with
0.15 M NaCl; 0.5 M sucrose; 20 mM Tris pH 7.4.
This medium is the optimal for erythrocytes because
of its protective effect on them during detergent lysis.
If analysing erythrocyte hemolysis under CTAB
effect (Fig. 1, a) we may note, that under an increased
CTAB concentration from 13 to 26 µmol/l in the solution
the erythrocyte hemolysis does not significantly
augment in all the media, meanwhile in the solution
with 0.5 M sucrose, 0.15 M NaCl it remains at the
same level. Under 39 µmol/l CTAB concentration the
erythrocyte hemolysis is similar in all media (Fig. 1, a).
In the experiments with Tween-20 (Fig. 1, b), SDS
(Fig. 1, c) and Triton X-100 (Fig. 1, d) there was
established the same tendency of hemolysis develop-
ment as for CTAB effect, but the curves have more
flattened form, compared to the CTAB-induced lysis.
Of note is the fact, that in the experiments with Tween
20 and Triton X-100 the hemolysis level in the medium
with 0.5 M sucrose, 0.15 M NaCl is higher, than at
erythrocyte treatment with CTAB and SDS. Moreover,
246 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Концентрация сахарозы, моль/л
Sucrose concentration, mol/l
Концентрация сахарозы, моль/л
Sucrose concentration, mol/l
Концентрация сахарозы, моль/л
Sucrose concentration, mol/l
Концентрация сахарозы, моль/л
Sucrose concentration, mol/l
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
1
Рис. 1. Лизис эритроцитов человека в средах, содержащих 0,15М NaCl+ 20 мМ Трис (рН 7,4) и сахарозу разной
молярности (0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 моль/л), под воздействием различных детергентов: а – ЦТАБ; б – Твин-20; в – ДСН; г –
Тритон Х-100; 255 – концентрация детергента, мкмоль/л.
Fig. 1. Lysis of human erythrocytes in media, containing 0.15 M NaCl+20 mM Tris (pH 7.4) and sucrose of different molarity
(0; 0.3; 0.5; 0.7; 0.9 mol/l) under detergent effect: a – CTAB; b – Tween 20; c – SDS; d – Triton X-100; 255 – detergent
concentration, µmol/l.
личении концентрации ЦТАБ в растворе от 13 до
26 мкмоль/л гемолиз эритроцитов существенно
возрастает во всех средах, тогда как в растворе,
содержащем 0,5 М сахарозы, 0,15 М NaCl, он
остается на том же уровне. При концентрации
ЦТАБ 39 мкмоль/л гемолиз эритроцитов сходен во
всех средах (рис. 1, а).
В экспериментах с Твин-20 (рис. 1, б), ДСН
(рис. 1, в) и Тритон Х-100 (рис. 1, г) установлена
аналогичная тенденция развития гемолиза, как и
при воздействии ЦТАБ, однако кривые имеют
более сглаженный вид по сравнению с лизисом,
вызванным ЦТАБ. Отметим, что в экспериментах
с Твин-20 и Тритон Х-100 уровень гемолиза в среде
с 0,5 М сахарозы, 0,15 М NaCl выше, чем при
обработке эритроцитов ЦТАБ и ДСН. Причём в
in the experiments with CTAB the hemolysis level in
this medium is lower than under SDS treatment of cells.
Fig. 2 shows a detergent hemolysis of DIDS-
treated human erythrocytes. In all the experiments with
DIDS the number of damaged cells was established
to increase, moreover in the experiment with CTAB it
was the highest. Hemolysis of DIDS treated erythro-
cytes and untreated ones differs by 35–80%. Under
detergent lysis with SDS and Tween 20 the differences
achieve 20–30% and 20–40%, correspondingly. Under
DIDS effect on erythrocytes, placed in media with
Triton X-100 the DIDS effect, strengthening hemolysis,
is the lowest. The data on hemolysis of DIDS treated
erythrocytes are not statistically and significantly
different from untreated ones (Fig. 2, d). Thus, the
binding of Triton X-100 with DIDS, modifying band 3
a a б b
в c г d
39
26
19
13
100
60
4
30
340
255
85
34
800
640
576
480
247ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
экспериментах с ЦТАБ уровень гемолиза в данной
среде ниже, чем при обработке клеток ДСН.
На рис. 2 показан детергентный гемолиз эрит-
роцитов человека, обработанных ДИДС. Установ-
лено, что во всех экспериментах с ДИДС увеличи-
вается количество повреждённых клеток, причём
в эксперименте с ЦТАБ оно наибольшее. Гемолиз
эритроцитов, обработанных и необработанных
ДИДС, отличается на 35–80%. При детергентном
лизисе с ДСН отличия достигают 20–30%, с
Твин-20 – 20–40%. При воздействии ДИДС на
эритроциты, помещённые в среды с Тритон Х-100,
влияние ДИДС, который усиливает гемолиз, наи-
меньшее (рис. 2, г). Данные гемолиза эритроцитов,
обработанных ДИДС, статистически не отлича-
protein, does not significantly affect hemolysis curves.
There was also established, that under DIDS effect
on detergent lysis the most optimal medium for
erythrocytes is that, containing 0.5 M sucrose, 0.15 M
NaCl (Fig. 2).
Hypertonic hemolysis is used as the method,
enabling to model damages during bioobject cryopre-
servation. A universal approach to achieve cell cryore-
sistance is assumed to be in providing the conditions,
when a cell is maximally stable under osmotic dehyd-
ration. At the same time the dehydration of cells is the
factor, controlling cytoskeletal state [3].
Due to dehydration there is a change in surface-
volume cell ratio. Modification of cell volume at preli-
minary stages is the simplest way to increase cell resis-
Рис. 2. Влияние ДИДС (20 мкмоль/л; ● – среда с ДИДС; ▲ – среда без ДИДС) на детергентный лизис эритроцитов
человека в средах, содержащих 0,15 М NaCl + 20 мМ Трис (рН 7,4) и сахарозу разной молярности (0; 0,3; 0,5; 0,7;
0,9 моль/л) под воздействием: а – 26 мкмоль/л ЦТАБ; б – 30 мкМ/л Твин-20; в – 85 мкмоль/л ДСН; г – 640 мкмоль/л Тритон
Х-100.
Fig. 2. DIDS effect (20 µmol/l; ● – medium with DIDS; ▲ – medium without DIDS) on detergent lysis of human erythrocytes
in media, containing 0.15 M NaCl + 20 mM Tris (pH 7.4) and sucrose of different molarity (0; 0.3; 0.5; 0.7; 0.9 mol/l) under
detergent effect: a – 26 µmol/l CTAB; b – 30 µmol/l Tween 20; c – 85 µmol/l SDS; d – 640 µmol/l Triton X-100.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Концентрация сахарозы, моль/л
Sucrose concentration, mol/l
Концентрация сахарозы, моль/л
Sucrose concentration, mol/l
Концентрация сахарозы, моль/л
Sucrose concentration, mol/l
Концентрация сахарозы, моль/л
Sucrose concentration, mol/l
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
г dв c
a a б b
248 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
ются от необработанных (рис. 2, г). Таким обра-
зом, связывание Тритон Х-100 с ДИДС, модифи-
цирующего белок полосы 3, существенно не влияет
на кривые гемолиза. Также установлено, что и при
действии ДИДС на детергентный лизис наиболее
оптимальная для эритроцитов среда, содержащая
0,5М сахарозы, 0,15М NaCl (рис. 2).
Гипертонический гемолиз используют как
метод, позволяющий моделировать повреждения
при криоконсервировании биообъектов. Предпо-
лагают, что универсальный подход к достижению
криоустойчивости клеток заключается в обеспече-
нии условий, при которых клетка обладает макси-
мальной стабильностью при осмотической дегид-
ратации. При этом дегидратация клеток является
фактором, управляющим состоянием цитоскелета
[3].
Вследствие дегидратации изменяется поверх-
ностно-объёмное отношение клетки. Модификация
объёма клеток на предварительных этапах– наи-
более простой способ повышения устойчивости
клеток к гипертоническому шоку и замораживанию
[3]. Следовательно, можно направленно контро-
лировать и управлять осмотической чувствитель-
ностью клеток [3]. В работе [1] показано, что пора,
образующаяся в эритроцитарной мембране при
осмотическом гемолизе, способна увеличиваться
или уменьшаться в зависимости от эксперимен-
тальных условий, т.е. она представляет собой
динамическую структуру.
В работе [1] рассматривается возможная де-
формация плазматической мембраны при частич-
ном обезвоживании клетки. При определенных
значениях тоничности среды и времени инкубации
клеток изгибание плазматической мембраны мо-
жет быть причиной латерального перераспреде-
ления мембранных компонентов и не приводить к
лизису клетки.
Полученные результаты позволяют предпо-
ложить, что плазматическая мембрана эритро-
цитов, помещённых в среду, содержащую 0,15М
NaCl и 0,5М сахарозы, претерпевает модификации
в результате латерального перераспределения
компонентов. Это приводит к уменьшению объёма
клеток на предварительных этапах обработки и
обуславливает высокую устойчивость к дальней-
шему гипертоническому воздействию [6]. В резуль-
тате этого наблюдается осмотически-индуциро-
ванная устойчивость клеток к стрессу. Возможно,
повышение уровня сохранности эритроцитов при
обработке растворами, содержащими 0,5М саха-
розы или 0,45М NаCl, связано с включением ос-
мотического механизма нарастания устойчи-
вости. Данный процесс заключается в модифика-
ции взаимодействий цитоскелета с липидным бисло-
ем мембраны в области связей белок полосы 3 –
tance to hypertonic stress and freezing [3]. Conse-
quently, a directed control for cell osmotic sensitivity
is possible [3]. As demonstrated in the paper [1], the
pore, forming in erythrocyte membrane under osmotic
hemolysis is capable of increasing or reducing depend-
ing on experimental conditions, i. e. it represents a
dynamic structure.
A possible deformation of plasmatic membrane
under partial cell dehydration is envisaged in the paper
[1]. Under the certain values of medium tonicity and
cell incubation time, the flexure of plasmatic membrane
may be the cause of lateral redistribution of membrane
components without leading to cell lysis.
The results obtained allow to assume plasmatic
membrane of erythrocytes, placed into the medium,
containing 0.15 M NaCl and 0.5 M sucrose, as under-
going modifications as a result of lateral redistribution
of components. This results in cell volume decrease at
preliminary stages of treatment and stipulates a high
resistance to further hypertonic effect [6]. As a result
there is observed an osmotically-induced cell resistance
to stress. The augmentation of erythrocyte preser-
vation level during cell treatment with solutions,
containing 0.5 M sucrose and 0.45 M NaCl, is possibly
associated to the triggering of osmotic mechanism of
resistance increase. This process consists in the
modification of cytoskeletal interaction with membrane
lipid bilayer in the area of band 3 protein-ankyrin-
cytoskeleton bonds [8]. As a result, the maximum cell
stability under hypertonic stress is achieved. One be-
lieves, that sucrose is capable to manifest cryoprotec-
tive properties by affecting protein components of
membrane and to stabilise the protein-lipid interaction
[7]. The sucrose presence in the medium is known to
reduce the solubility of non-ionic and zwitterionic
detergents and correspondingly to decrease the critical
concentrations of micelle-formation (CCM) [19].
One of the approaches in membrane studying is
the effect on it by different modifiers, in particular
detergents: the group of amphiphilic compounds, ca-
pable for hydrophilic and hydrophobic interactions [4].
There are known two models of solubilisation and
fragmentation of membranes by detergents: the first
one is a cooperative binding of detergent molecule with
membrane during following transfer inside a cell and
binding with internal monolayer; the second one is the
lipid extraction from external membrane monolayer by
direct transfer in detergent micelles. In both cases the
membranes are fragmented with formation of mixed
vesicles, containing molecules of detergents and lipids
or detergents and proteins. According to the hypothesis
[11] the membrane solubilisation comprises three
stages. At the first stage the detergents are bound
without solubilisation with membrane fractions, mean-
while at the third one the membrane components are
completely solubilized, by aggregating in mixed mi-
249 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
анкирин-цитоскелет [8]. В результате достигается
максимальная стабильность клеток при гиперто-
ническом шоке. Существует мнение, что сахароза
способна проявлять криопротекторные свойства,
действуя на белковые компоненты мембраны, и
стабилизировать белково-липидные взаимодейст-
вия [7]. Известно, что присутствие в среде саха-
розы снижает растворимость неионных и цвитте-
рионных детергентов и соответственно уменьшает
критические концентрации мицеллообразования
(ККМ) [19].
Одним из подходов к исследованию мембраны
является воздействие на неё различными моди-
фикаторами, в частности детергентами – группой
амфифильных соединений, которые способны к
гидрофильным и гидрофобным взаимодействиям
[4]. Известны две модели солюбилизации и фраг-
ментации мембран детергентами: первая – коопе-
ративное связывание молекул детергента с мемб-
раной при последующем переносе внутрь клетки
и связывании с внутренним монослоем; вторая –
экстракция липидов из внешнего монослоя мемб-
раны прямым переносом в детергентные мицеллы.
В обоих случаях мембраны фрагментируются с
образованием смешанных везикул, содержащих
молекулы детергентов и липидов или детергентов
и белков. Согласно гипотезе [11] солюбилизация
мембраны включает три стадии. На стадии I
детергенты связываются без солюбилизации с
мембранными фракциями, тогда как на стадии III
мембранные компоненты полностью солюбили-
зируются, объединяясь в смешанные мицеллы.
Полагают, что на стадии II насыщение мембран
детергентом осуществляется со смешанными ми-
целлами при термодинамическом взаимодейст-
вии, близком к ККМ [11].
Скорость и тип солюбилизации биологических
мембран зависит от состояния и природы детер-
гента, мембраны [10].
При немицеллярном связывании детергента с
мембраной насыщение мембраны происходит
кооперативным способом в концентрации, которая
ниже ККМ. Этот процесс сопровождается медлен-
ным связыванием и солюбилизацией мембраны
[11]. При действии детергента в концентрации
выше его ККМ наблюдаются полная солюбилиза-
ция мембранных структур и включение компонен-
тов мембраны в собственные мицеллы детерген-
та. Если используемая концентрация не достигает
ККМ, происходит модификация мембраны без
полного разрушения структур бислоя [4].
Катионный детергент ЦТАБ лизирует клетки и
ядра, денатурирует белки и образует с ними поло-
жительно заряженные комплексы [2]. Указанный
детергент в водных растворах образует мицеллы,
размер которых увеличивается при повышении его
celles. One believes, that at the second stage the
membrane saturation with detergent is realised with
mixed micelles under thermodynamic interaction, close
to CCM [11].
The rate and type of biological membrane solubili-
sation depend on the state and nature of detergent,
membrane [10].
During non-micelle binding of detergent with
membrane its saturation occurs by a cooperative way
in the concentration lower than CCM. This process is
accompanied by a slow binding and solubilisation of
membrane [11]. Under detergent effect in the concent-
ration higher than its CCM, there are observed a
complete solubilisation of membrane structures and the
inclusion of membrane components into the own
micelles of detergent. If the used concentration does
not achieve CCM, there is occurred the membrane
modification without complete destruction of bilayer
structures [4].
Cationic detergent CTAB lyses cells and nuclei,
denatures proteins and forms with them the positively-
charged complexes [2]. The mentioned detergent in
aqueous solutions forms the micelles, which size
augments with its concentration increase [5]. Non-ionic
detergents Tween 20 and Triton X-100 are polyoxy-
ethylene derivatives. Tween 20 is applied to treat
membranes for peripheral protein removal. The anionic
detergent SDS lyses cells and nuclei, denatures proteins
and forms with them negatively charged complexes,
destroys nucleoproteids [2]. It is usually used when
preparing proteins for electrophoresis [5]. This deter-
gent denatures proteins, by destroying non-covalent
bonds. The SDS is known to bind with the main chain
of peptide in the ratio of one SDS molecule for two
residues of aminoacid, thereby changing protein charge
for negative, proportional to this protein mass (appr.
1.4 g SDS/g of protein). The obtained charge is signifi-
cantly bigger than the initial one. Electrostatic tension,
forming during binding with SDS, contributes to protein
repulsion from each other and a change in membrane
protein structures [11].
During lipid solubilisation by detergent with
concentration lower than CCM, the isolated membrane
proteins are known as capable to preserve their
enzymatic or transport functions [20]. Triton X-100 is
applied to obtain band 3 protein, preserving its transport
functions after inclusion into liposomes [13].
SDS and Tween 20 were established to solubilise
lipid membranes in concentrations equal or exceeding
CCM [11]. Under Triton X-100 effect, which concen-
tration corresponds to CCM, there are occurred the
protein extraction and liquefaction of membrane lipid
bilayer with no change in polarity of membrane
hydrophobic areas [21]. Lipid bilayer destruction with
lipid and protein separation begins after Triton X-100
monomer inclusion into membranes [15]. At the same
250 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
концентрации [5]. Неионные детергенты Твин-20
и Тритон Х-100 являются производными полиокси-
этилена [11]. Твин-20 используют для обработки
мембран с целью удаления периферических бел-
ков. Анионный детергент ДСН лизирует клетки и
ядра, денатурирует белки и образует с ними отри-
цательно заряженные комплексы, разрушает нук-
леопротеиды [2]. Он обычно используется при под-
готовке белков для электрофореза [5]. Этот детер-
гент денатурирует белки, разрушая нековалентные
связи. Известно, что ДСН связывается с основной
цепью пептида в соотношении одна молекула ДСН
на два остатка аминокислоты, что изменяет заряд
белка на отрицательный, который пропорционален
массе этого белка (приблизительно 1,4 г ДСН/г
белка). Полученный заряд значительно больше,
чем первоначальный. Электростатическое напря-
жение, которое создаётся при связывании с ДСН,
способствует отталкиванию белков друг от друга
и изменению белковых структур мембраны [11].
Известно, что при солюбилизации липидов де-
тергентом с концентрацией, ниже его ККМ, выде-
ляемые мембранные белки могут сохранять свои
энзиматические или транспортные функции [20].
Тритон Х-100 используют для получения белка
полосы 3, который сохраняет свои транспортные
функции после включения в липосомы [13].
Установлено, что ДСН и Твин-20 солюбили-
зируют липиды мембран в концентрациях, равных
или превышающих ККМ [11]. При действии Тритон
Х-100, концентрация которого соответствует ККМ,
происходят экстракция белков и разжижение липид-
ного бислоя мембраны без изменения полярности
гидрофобных областей мембраны [21]. Разруше-
ние липидного бислоя с разделением липидов и
белков начинается после включения в мембраны
мономеров Тритон Х-100 [14]. При этом наблю-
дается немицеллярный механизм взаимодействия
детергента с белками [12]. Показано, что Тритон
Х-100 и Твин-20 солюбилизируют меньшее коли-
чество белков из мембран эритроцитов, чем ДСН
[14]. В работе [10] показано, что неионные детер-
генты (Твин-20, Тритон Х-100) взаимодействуют
преимущественно с липидными компонентами
мембран, содержащими Са-АТФазу, в концентра-
циях ниже их ККМ, тогда как ионные детергенты
(в частности ДСН) экстрагируют Са-АТФазу пе-
ред солюбилизацией липидов [10]. Солюбилизация
мембран неионными детергентами, в отличие от
ДСН, происходит в результате кооперативного
связывания преимущественно с липидными компо-
нентами белоксодержащих мембран [10].
Вышеизложенные данные согласуются с ре-
зультатами, полученными нами. Показано, что
высокая устойчивость эритроцитов к гипертони-
ческому шоку и замораживанию контролируется
time a non-micelle mechanism of detergent interaction
with proteins is observed [12]. Triton X-100 and Tween
20 were shown to solubilise less proteins from erythro-
cyte membranes, than SDS [14]. As shown in the paper
[10], the non-ionic detergents (Tween 20, Triton X-100)
mostly interact with lipid components of membranes,
containing Ca-ATPase in concentrations lower than
their CCM, meanwhile the ionic detergents (particularly
SDS) extract Ca-ATPase before lipid solubilisation
[10]. Membrane solubilisation by non-ionic detergents
in contrast to SDS occurs as a result of cooperative
binding mostly with lipid components of protein-
containing membranes [10].
The mentioned above data conform to our results.
Erythrocyte high resistance to hypertonic stress and
freezing was shown as controlled by their volume [6].
Detergent action was established as stipulated by the
capability to bind by hydrophobic bonds with protein
membrane components [4]. Due to such building of
detergent the bond between membrane components
destroys, and finally the biomembrane solubilisation
occurs. Osmotic effect as the factor, capable to sharply
increase the erythrocyte resistance to cooling and
transfer into hypertonic solutions, is associated to
strengthening hydrophobic bonds in membrane [6].
Therefore an osmotic pressure prevents the occurren-
ce of detergentcaused damages in the medium, con-
taining 0.5 M sucrose and 0.15 M NaCl (Fig. 2) [6].
Hemolysis curves with Triton X-100 and Tween
20 (see Fig. 1, b, d) look like more flattened compared
to the data about lysis at SDS and CTAB presence
(see Fig. 1, a, b). This testifies to the fact, that SDS
and CTAB cause more significant effect on erythrocyte
membranes, than Triton X-100 and Tween 20.
Different intensity of damaging effect is stipulated by
the effect character on membrane of ionic and non-
ionic detergents. Non-ionic detergents (Tween-20, Tri-
ton X-100) result in the rupture of protein-lipid bonds,
without damaging protein membrane components [14].
Ionic detergents act not only on the protein-lipid
boundary, but cause protein denaturation as well [14].
Osmotic lysis is accompanied by modifications in
membrane, associated to the changes in band 3 protein
structure [16]. In our research we used DIDS: band 3
protein modifier [17].
DIDS binding with a membrane results in a disorder
of bonds between cytoskeletal and band 3 protein [16],
reducing a protective effect of osmotic action at
preliminary stages of cell incubation. Of knowledge is
the fact that during DIDS binding with band 3 protein
there is an increase in contact area of this protein with
lipid membrane components. This is the reason of an
increase in the number of damaged cells during DIDS
modifier effect on detergent lysis [17].
When binding with erythrocyte membrane, DIDS
causes the dissociation of band 3 protein tetramers
251 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
их объёмом [6]. Установлено, что действие детер-
гентов обусловлено способностью связываться
гидрофобными связями с белковыми компонен-
тами мембраны [4]. За счет такого встраивания
детергентов разрушается связь между компонен-
тами мембраны и, в конечном итоге – биомембра-
ны солюбилизируются. Осмотическое действие
как фактор, способный резко повышать устойчи-
вость эритроцитов к охлаждению и переносу в ги-
пертонические растворы, связан с усилением гид-
рофобных связей в мембране [6]. Поэтому осмоти-
ческое действие препятствует возникновению пов-
реждений, вызванных детергентами, в среде, со-
держащей 0,5 М сахарозы, 0,15 М NaCl (рис. 2) [6].
Кривые гемолиза с Тритон Х-100 и Твин-20 (см.
рис. 1, б, г) имеют более сглаженный вид по срав-
нению с данными лизиса в присутствии ДСН и
ЦТАБ (см. рис. 1, а, в). Это свидетельствует о том,
что ДСН и ЦТАБ оказывают более значительное
действие на мембраны эритроцитов, чем Тритон
Х-100 и Твин-20. Различная интенсивность пов-
реждающего действия обусловлена характером
действия на мембрану ионных и неионных детер-
гентов. Неионные детергенты (Твин-20,Тритон Х-
100) приводят к разрыву белково-липидных связей,
не повреждая белковые компоненты мембраны
[15]. Ионные детергенты действуют не только на
границе белок-липид, но и вызывают денатурацию
самих белков [15].
Осмотический лизис сопровождается модифи-
кациями в мембране, связанными с изменениями
структуры белка полосы 3 [16]. В нашей работе
был использован ДИДС – модификатор белка по-
лосы 3 [17].
Связывание ДИДС с мембраной приводит к на-
рушению связей цитоскелета с белком полосы 3
[16], что снижает защитный эффект осмотического
действия на предварительных этапах инкубации
клеток. Известно, что при связывании ДИДС с
белком полосы 3 увеличивается площадь контак-
тов данного белка с липидными компонентами
мембраны. Это является причиной увеличения ко-
личества поврежденных клеток при воздействии
на детергентный лизис модификатора ДИДС [17].
При связывании с мембранами эритроцитов
ДИДС вызывает диссоциацию тетрамеров белка
полосы 3 на димеры [17], что способствует ослаб-
лению взаимодействия цитоскелета с мембраной.
Такое влияние приводит к усилению действия
ионных детергентов (как в случае с ЦТАБ и ДСН),
которые солюбилизируют мембранные белки [14].
Однако при увеличении площади контактов белок-
липид [14] действие неионных детергентов (Твин-
20, Тритон Х-100) на мембрану ослабляется.
Поэтому влияние ДИДС на лизис с ЦТАБ и ДСН
(рис. 2, а, в) проявляется в большей степени, чем
into dimers [17], contributing to the weakening of
cytoskeletal interaction with membrane. Such an effect
results in strengthening of ion detergent effect (as in
case with CTAB and SDS), which solubilise membrane
proteins [14]. However when increasing the area of
protein-lipid contacts [14] the effect of non-ionic deter-
gents (Tween 20, Triton X-100) on membrane is
weakened. Therefore the DIDS effect on lysis with
CTAB and SDS (Fig. 2, a, c) is manifested in a greater
extent, than on a detergent one, caused by Tween 20
and Triton X-100 (Fig. 2, b, d).
The results obtained enable suggesting an osmotic
factor at preliminary stages before different detergents
effect as contributing to an increase in erythrocyte
resistance, by strengthening the interaction of cyto-
skeleton with band 3 protein. This proves the correct-
ness of the approach to search the way for cell resis-
tance increase by modifying their states at preliminary
incubation stages.
Conclusions
The medium, containing 0.15 M NaCl; 0.5 M suc-
rose protectively affects erythrocytes under detergent
lysis, caused by both ionic and non-ionic detergents.
DIDS presence in the medium results in a rise of
cell sensitivity to detergent effect and reduces the
erythrocyte integrity under osmotic effect.
Modifier DIDS is capable in a different extent to
strengthen the erythrocyte sensitivity to ionic and non-
ionic detergents.
References
Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology.– Kiev: Naukova
dumka, 1994.– 331 p.
Bogatov V.V. DNA and RNA isolation for pharmacy. Methods
for DNA and RNA isolations, envisaged in terms of industrial
pharmacy // Bull. Eksp. Biol. Med.– 1983.– Vol. 50, N4.– P. 41–47.
Bondarenko V.A., Bondarenko T.P., Rudenko S.V. Dehydration
effects in controlling the cold and osmotic sensitivity of cells //
Problems of Cryobiology.– 1992.– N4.– P. 14–25.
Introduction into biomembranology: Manual / Ed. by A.A. Bol-
dyrev.– Moscow: Publishing House of Moscow State Univer-
sity, 1990.– P. 87–98.
Idiyatullin Z.Sh., Arkhipov V.P., Babkina Ya.A., Ryzhkina I.S.
Study of aggregation behaviour of aminomethylated phenols
and calix(4)resorcinarenes in DMFA-CTAB medium by NMR
FT PMFG method // Chemistry and Computational Stimulation.
Butlerov Communications.– 2002.– N6, suppl.– [web site]
http: / /chem.kstu.ru/but lerov_comm/vol2/cd-a3/data/
jchem&cs/russian/n6/appl6/yal2001/1sdms97/1sdms97.htm
(15.09.2008).
Pozdnyakov V.V., Bondarenko V.A. Volume shift as the factor,
controlling erythrocyte osmotic resistance in solutions of low
molecular cryoprotectants // Physico-chemical and biological
effect of cryoprotectants.– Kiev: Naukova dumka, 1990.–
P. 115–123.
Ramazanov V.V., Bondarenko V.A. Cryoprotectant effect on
erythrocyte resistance to detergents under band 3 protein
aggregate state modification stress // Problems of Cryo-
biology.– 2007.– Vol. 17, N4.– P. 335–345.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
252 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
на детергентный лизис, вызванный Твин-20 и
Тритон Х-100 (рис. 2, б, г).
Полученные результаты позволяют предпо-
ложить, что осмотический фактор на предвари-
тельных этапах перед действием различных видов
детергентов способствует повышению устойчи-
вости эритроцитов, усиливая взаимодействия
цитоскелета с белком полосы 3. Это доказывает
правильность подхода к поиску пути повышения
устойчивости клеток посредством модификации их
состояний на предварительных этапах инкубации.
Выводы
Среда, содержащая 0,15М NaCl; 0,5М сахарозы,
оказывает защитное действие на эритроциты при
детергентном лизисе, вызванном как ионными, так
и неионными детергентами.
Присутствие в среде ДИДС приводит к повыше-
нию чувствительности клеток к действию детер-
гентов и уменьшает сохранность эритроцитов при
осмотическом воздействии.
Модификатор ДИДС в разной мере способен
усиливать чувствительность эритроцитов к ионным
и неионным детергентам.
Ramazanov V.V. Effect of osmotic stress and cytoskeletal
modifiers on development of cold and hypertonic stress of
erythrocytes: Thesis of candidate of biol. sciences.– Kharkov,
1993.– P. 100.
Chernitsky E.A., Vorobey A.B. Structure and function of
erythrocyte membranes.– Minsk: Nauka i tekhnika, 1981.–
216 p.
Kragh-Hansen U., le Maire M., Moller J.V. The mechanism of
detergent solubilization of liposomes and protein-containing
membranes // Biophys. J.– 1998. –Vol. 75, N6.– Р. 2932–2946.
le Maire M., Champeil P., Moller J.V. Interaction of membrane
proteins and lipids with solubilizing detergents // Biochim.
Biophys. Acta.– 2000.– Vol. 1508, N1–2.– P. 86–111.
le Maire M., Kwee S., Andersen J.P., Moller J.V. Mode of
interaction of polyoxyethyleneglycol detergents with mem-
brane proteins // Eur. J. Biochem.– 1983.– Vol. 129, N3.–
P. 525–532.
Lukacovic M.F., Feinstein M.B., Shaafi R.I., Perrie S.
Purification of stabilized band 3 protein of the human erythro-
cyte membrane and its reconstitution into liposomes // Bioche-
mistry.–1981.– Vol. 20, N11.– P. 3145–3151.
Macarulla J.M., Alonso A., Arrondo J.L. et al. Membrane
solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A
comparative study including model and cell membranes //
Rev. Esp. Fisiol.– 1989.– Vol. 45.– P. 1–8.
Matson R.S., Goheen S.C. Use of high-performance size
exclusion chromatography to determine the extent of deter-
gent solubilization of human erythrocyte ghosts // J. Chro-
matogr.– 1986.– Vol. 359.– P. 285–295.
Sato Y., Yamakose H., Suzuki Y. Participation of band 3 in hy-
potonic hemolysis of human erythrocytes // Biol. Pharm. Bull.–
1993.– Vol. 16, N2.– P. 188–194.
Van Dort H.M., Knowless D.W., Chasis J.A. et al. Analysis
of integral membrane protein contributions to the deformability
and stability of the human erythrocyte membrane // J. Biol.
Chem. Chem.– 2001.– Vol. 276, N50.– P. 46968–46974.
Van Dort H.M., Moriyama R., Low P.S. Effect of band 3
subunit equilibrium on the kinetics and affinity of ankyrin
binding to erythrocyte membrane vesicles // J. Biol. Chem.–
1998.–Vol. 273, N24.– P. 14819–14826.
Walter A., Kuehl G., Barnes K., Van der Waerdt G. The
vesicle to micelle transition of phosphatildylcholine vesicle
induced by nonionic detergents: effects of sodium chloride,
sucrose and urea // Biochim. Biophys. Acta.– 2000.– Vol.
1508, N1–2.– P. 20–33.
Womack M.D., Kendal D.A., Macdonald R.C. Detergent
effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer
membranes // Biochim. Biophys. Acta.– 1983.– Vol. 733, N2.–
P. 210–215.
Yegutkin G.G. Effects of increasing concentration of nonionic
detergent triton X-100 on solubilization and structure of rat
liver and adipose plasma membranes // Membr. Cell. Biol.–
1997.– Vol. 10, N5.– P. 515–520.
Accepted in 18.11.2008
Литература
Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.– Киев: Наук.
думка, 1994.– 431 с.
Богатов В.В. Выделение ДНК та РНК для фармации //
Труды Одес. политехн. ун-та.– 1998.– №1(5).– С. 41-47.
Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П., Руденко С.В. Эффекты
дегидратации в контроле холодовой и осмотической
чувствительности клеток // Пробл. криобиологии.–
1992.– №4.– С. 14–25.
Введение в биомембранологию: Учеб. пособие / Под ред.
А.А. Болдырева.– М.: Изд-во МГУ, 1990. – С.87–98.
Идиятуллин З.Ш., Архипов В.П., Бабкина Я.А., Рыжкина И.С.
Исследование агрегационного поведения аминометили-
рованных фенолов и каликс(4)резорциноренов в среде
вода-ДМФА-ЦТАБ методом ЯМР ФП ИГМП [Электронный
ресурс] // Химия и компьютерное моделирование.
Бутлеровские сообщения.– 2002.– №6, приложение.–
[web-сайт] http://chem.kstu.ru/butlerov_comm/vol2/cd-a3/
data/ jchem&cs/russian/n6/appl6/yal2001/1sdms97/
1sdms97.htm (15.09.2008).
Поздняков В.В., Бондаренко В.А. Объёмный сдвиг как
фактор, контролирующий осмотическую устойчивость
эритроцитов в растворах низкомолекулярных криопро-
текторов // Физико-химическое и биологическое
действие криопротекторов: Сб. науч. трудов.– Киев:
Наук. думка, 1990.– С. 115–123.
Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Влияние криопротек-
торов на устойчивость эритроцитов к детергентам при
модификации агрегатного состояния белка полосы 3 //
Пробл. криобиологии.– 2007.– Т. 17, №4.– С. 335–345.
Рамазанов В.В. Влияние осмотического стресса и
модификаторов цитоскелета на развитие холодового и
гипертонического шока эритроцитов: Дис. ... канд. биол.
наук.– Харьков, 1993.– 138 с.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
253 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹3
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹3
Черницкий Е.А., Воробей А.Б. Структура и функция
эритроцитарных мембран.– Минск: Наука и техника,
1981.– 216 c.
Kragh-Hansen U., le Maire M., Moller J.V. The mechanism of
detergent solubilization of liposomes and protein-containing
membranes // Biophys. J.– 1998. –Vol. 75, N6.– Р. 2932–2946.
le Maire M., Champeil P., Moller J.V. Interaction of membrane
proteins and lipids with solubilizing detergents // Biochim.
Biophys. Acta.– 2000.– Vol. 1508, N1–2.– P. 86–111.
le Maire M., Kwee S., Andersen J.P., Moller J.V. Mode of
interaction of polyoxyethyleneglycol detergents with mem-
brane proteins // Eur. J. Biochem.– 1983.– Vol. 129, N3.–
P. 525–532.
Lukacovic M.F., Feinstein M.B., Shaafi R.I., Perrie S.
Purification of stabilized band 3 protein of the human erythro-
cyte membrane and its reconstitution into liposomes // Bioche-
mistry.–1981.– Vol. 20, N11.– P. 3145–3151.
Macarulla J.M., Alonso A., Arrondo J.L. et al. Membrane
solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A
comparative study including model and cell membranes //
Rev. Esp. Fisiol.– 1989.– Vol. 45.– P. 1–8.
Matson R.S., Goheen S.C. Use of high-performance size
exclusion chromatography to determine the extent of deter-
gent solubilization of human erythrocyte ghosts // J. Chro-
matogr.– 1986.– Vol. 359.– P. 285–295.
Sato Y., Yamakose H., Suzuki Y. Participation of band 3 in hy-
potonic hemolysis of human erythrocytes // Biol. Pharm. Bull.–
1993.– Vol. 16, N2.– P. 188–194.
Van Dort H.M., Knowless D.W., Chasis J.A. et al. Analysis
of integral membrane protein contributions to the deformability
and stability of the human erythrocyte membrane // J. Biol.
Chem. Chem.– 2001.– Vol. 276, N50.– P. 46968–46974.
Van Dort H.M., Moriyama R., Low P.S. Effect of band 3
subunit equilibrium on the kinetics and affinity of ankyrin
binding to erythrocyte membrane vesicles // J. Biol. Chem.–
1998.–Vol. 273, N24.– P. 14819–14826.
Walter A., Kuehl G., Barnes K., Van der Waerdt G. The
vesicle to micelle transition of phosphatildylcholine vesicle
induced by nonionic detergents: effects of sodium chloride,
sucrose and urea // Biochim. Biophys. Acta.– 2000.– Vol.
1508, N1–2.– P. 20–33.
Womack M.D., Kendal D.A., Macdonald R.C. Detergent
effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer
membranes // Biochim. Biophys. Acta.– 1983.– Vol. 733, N2.–
P. 210–215.
Yegutkin G.G. Effects of increasing concentration of nonionic
detergent triton X-100 on solubilization and structure of rat
liver and adipose plasma membranes // Membr. Cell. Biol.–
1997.– Vol. 10, N5.– P. 515–520.
Поступила 18.11.2008
Рецензент О.И. Гордиенко
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
|